NO862144L

NO862144L - Ras oncogen peptider og antistoff.

Info

Publication number: NO862144L
Application number: NO862144A
Authority: NO
Inventors: Richard A Chizzonite; Arthur M Felix; Mark E Furth
Original assignee: Hoffmann La Roche
Priority date: 1985-05-30
Filing date: 1986-05-29
Publication date: 1986-12-01
Also published as: ES8802457A1; ES8900246A1; ES555435A0; ES557387A0; ES557385A0; JPS61289099A; EP0203587A3; DK253386D0; ES557386A0; ES8800274A1; EP0203587A2; AU5805886A; ES8801729A1; AU600439B2; DK253386A

Description

Mange mammale tumorceller inneholder et mutert oncogen i stand til å indusere neoplastisk transformasjon av fibroblaster fra gnagere, når tilført ved DNS-mediert genoverføring. De aktiverte oncogener oftest påtruffet av dette assay tilhører så© ledes familien ras H , ras K og ras N (Shimizu, K., et al, Proe. Nati. Acad, Sei, USA 80 2112-2116 [1983]). Hver av disse

gener koder for et protein med 188 eller 189 aminosyrer, tilsvarende ca. 21.000 dalton, kaltp21ras. Proteinene binder guaninnukleotider og ras proteinet har GTPase aktivitet (Gibbs, J.B., et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 81, 5704-5708 [1984]). Aminosyresekvensene spesifisert av de tre ras gener er bemerkelsesverdig like. Villtype-proteinene er iden-tiske over de første 86 aminosyreresidier og par av ras proteiner er ca. 85 % homologe over de neste 75 residier. Imidlertid er proteinene dramatisk forskjellige i et segment på 15 aminosyrer (residier 171-185) lokalisert nær karboksylenden (for oversikt se Van Beveren, C. and Verma, I.M., Current Topics in Microbiology and Immunology, bind 12 3, s. 73-9 8

[1986]). Den C-terminale variable region til hver ras familiemedlem er sterkt konservert mellom gnagere og mennesker. Det er blitt foreslått at det variable domene gir spesifi-sitet for en eller annen fysiologisk funksjon til p21ras proteinene. En potensiell funksjonell rolle for det variable doméne imøtegås av bevis som antyder at karboksylterminalen til p21ras blir proteolytisk spaltet under post-translasjo-nel prosessering (Shimizu, K. et al., Nature 304, 497-500

[1983]). Imidlertid er det senere blitt funnet at C-terminalen til ras proteiner forblir kovalent intakt under prosessering. Ytterligere data antyder at det samme gjelder for ras proteinet i tillegg.

Andre grupper har bemerket tilstedeværelsen av et antatt endo-peptidase målsete like oppstrøms for det variable domene i hvert ras protein. De antydet at proteinet spaltes ved dette sete, men at en disulfidbro innbefattende en konservert cy-steinresiduum ved posisjon 186 holder C-terminalfragmentet til resten av molekylet (Willumsen, B.M. et al., EMBO j. 3, 2581-2585 [1984]). Denne modell forutsier at reduksjonen av endelig p21ras ville frigi et peptid på ca. 2.000 dalton. Igjen indikerer senere data ingen påvisning av frigivelse av et slikt peptid fra ras^ proteiner. Således er det nå sterke positive bevis for kovalentintegritet av det C-terminale doméne av p21ras proteiner. Siden det er tydelig at den variable region forblir intakt i ras proteinfamilien , burde det være mulig å anvende sekvensforskjellen blant de forskjellige p21ras familieproteiner, dvs. ras , ras N , ras og ras , for. å gi selektive reaktanter som kan differensiere mellom disse proteiner og som så kan anvendes for å overvåke om onco-genene er slått på eller av i pasienten. På denne måte vil det være mulig å bestemme om personen er i høyrisikogruppene for neoplastiske lidelser og også for å overvåke nivåene ved neoplastiske lidelser i pasienter som allerede har disse. I tillegg vil det være mulig å bekrefte utviklingstrinnet til svulster og å overvåke pasienter i løpet av terapi (Niman, H.L., Hybridoma, bind 4, nr. 1, 1985, s. 75).

Foreliggende oppfinnelse omhandler fremstillinaen av nye polypeptider med en aminosyresekvens avledet fra de variable regioner i de forskjellige medlemmer av p21ras protein-familien, anvendelsen av slike polypeptider for å fremstille immunogene blandinger under anvendelse av slike polypeptider kovalent bundet til immunogene bærematerialer, fremstillingen av antistoff utvalgt av slike polypeptider hvor antistoffene er spesifikke til ras oncogenet fra hvilket polypeptidse k vensen ble avledet og overfor immunoassay metoder som anvender slike antistoff for å bestemme tilstedeværelsen av hvert individuelt p21ras oncogen familiemedlem.

En første apsekt ved foreliggende, oppfinnelse omhandler fremstillingen av en serie polypeptider avledet fra den variable region i karboksyterminaldelen til human p21ras protein. Polypeptidene ifølge foreliggende oppfinnelse omfatter følgen-de spesifikke sekvenser:

og derivater derav.

Sekvensene I og II representerer henholdsvis p21ras (171-189) og p21ras<H>(170-189) polypeptider. Sekvens III representerer p21ras N(170-186) polypeptidet. Sekvens IV represen-K4A

terer p21ras (171-186) polypeptidet. Endelig representerer sekvens V p21ras<K4B>(170-185)olypeptidet.

De foran spesifiserte sekvenser kan syntetiseres ved å bruke vanligepeptidsynteseprosedyrer velkjente på området. Slike prosedyrer innbefatter opløsningsfasesyntese og fastfasesyntese ved å anvende metodene utviklet av R.B. Merrifield som beskrevet i J. Am. Chem. Soc. , 85. 2149-2154 (1963). Den foretrukne metode for syntetisering aveptidene ifølge foreliggende oppfinnelse er fastfasemetoden som anvender cykliske tilsetninger av aminosyrer til karboksyterminal-aminosyren av peptidet som er ønsket syntetisert, kovalent bundet til et vanlig fastfasesynteseresin. Passende resiner for dette formål er artikler som er i handelen og innbefatter for eksempel fornettede polystyrenresiner. Slike resiner kan nå erholdes kommersielt med den ønskete karboksyterminal aminosyre allerede kovalent bundet til resinet.

De tilatte aminosyrer kan beskyttes med vanlig anvendte sidekjedebeskyttende grupper. Passende sidekjedebeskyttende grupper for dette formål innbefatter benzyl, benzyloksokarbonyl, klorbenzyl, p-klor-benzyloksykarbonyl og p-toluensulfonyl eller dimetylbenzyl.

I siste steg av en slik fastfasesyntese ble peptidet de-blokkert og frigjort fra resinet ved fremgangsmåter som er velkjente i faget f.eks. ved metoder som beskrevet detaljert i eksempel 1.

Likeledes, dersom flytende fasesyntese benyttes erholdes polypeptidet ved fjerning av de blokkerende grupper via kon-vensjonelle metoder, f.eks. ved metoder som beskrevet i Houben-Weyl, "Methoden der organischen Chemie", bind XV "Synthese von Peptiden".

Således, på denne måte ble polypeptidene I-V definert ovenfor fremstilt og består av foretrukne utførelsesformer av foreliggende oppfinnelse.

De ovenfor beskrevne polypeptider kan anvendes som immuno-gener for å fremstille antistoff.

Ytterligere aspekter ved foreliggende oppfinnelse forholder seg derfor til immunogene blandinger og deres fremstilling, til antistoff utvalgt ved disse immunogene blandinger og til immunometriske assay for humane p21ras polypeptidene nevnt ovenfor.

Slike immunogene blandinger kan lett erholdes ved kovalent

å binde hver av de ovenfor beskrevne polypeptider til et konvensjonelt immunogent bæremateriale. Uttrykket"immunogent bæremateriale" er ment å innbefatte de materialer som har egenskapen å uavhengig fremstille en immunogen respons i et vertsdyr og som kan kovalent kobles til tidligere nevnte polypeptider enten direkte ved dannelsen av peptid eller eterbindinger mellom fri karboksyl, amino eller hydroksy-grupper i tidligere nevnte polypeptider og tilsvarende gru<p->per på det immunogene bæremateriale eller alternativt ved

binding gjennom en konvensjonell bifunksjonell "linking"-gruppe.

Den kovalente kobling av polypeptidene ifølge oppfinnelsen til det immunogene bæremateriale kan utføres på en måte som er velkjent i faget. Således: er det f. eks. for direkte kovalent kobling mulig å anvende et karbodiimid, mest foretrukket dicykloheksylkarbodiimid eller l-etyl-3-(3-dimetylamino-propyl)karbodiimid som koblingsmiddel. I slik direkte kobling er det ønskelig å anvende et lett surt reaksjonsmedium for dette trinn, såsom et medium med en pH i området fra ca.

3 til 6,5, mest foretrukket i området fra ca. 4 til 6,5.

En passende bifunksjonell linking gruppe for å få i stand kobling er et C2_7dialkanol såsom glutaraldehyd. Slik kobling i denne alternative utførelsesform kan passende utføres ved å bruke betingelsene beskrevet av S. Avrameas i Immuno-chemistry 6 , 43-52 (1969) .

Enda et annet foretrukket reagens for bruk i koblingen av polypeptidene ifølge foreliggende oppfinnelse til det immunogene bæremateriale er m-maleimidobenzoyl-N-hydroksysuccinimid (MBS) som kan anvendes ved romtemperatur i et vandig oppløselig løsningsmiddel såsom f.eks. N,N-dimetylformamid (DMF). Det er foretrukket å anvende det immunogene bæremateriale oppløst i en passende fosfatbuffer ved pH 7,2.

De resulterende immunogene blandinger kan anvendes uten ytterligere opprensking, eller om ønsket etter opprenskning ved fremgangsmåter som er velkjente på området, slik som f. eks. dialyse for å fjerne ethvert ureagert peptid og koblings-reagenser eller alternativt ved bruk av kolonnekromatografi på en passende kolonne (f.eks. Sephadex G-25 gel-kromato-grafi).

Egnete bærematerialer som kan anvendes ved fremstillingen av de immunogene blandinger ifølge foreliggende oppfinnelse innbefatter proteiner, naturlige eller syntetiske polymere forbindelser såsom polypeptider, f.eks. polylysin eller ko-polymerer av aminosyrer; polysakkarider, og lignende. Spesielt er foretrukne bærematerialer proteiner og polypeptider, spesielt proteiner.

Identiteten til de anvendte proteiner i fremstillingen av

en immunogen blanding ifølge foreliggende oppfinnelse er ikke begrensende kritisk. Eksempler på passende proteiner innbefatter mammaliske serumproteiner, såsom f.eks. humant gamma-globulin, humant serumalbumin, bovinserumalbumin, metylert bovinserumalbumin, kaninserumalbumin, bovingammaglobulin, bovintyroglobulin og hestegammaglobulin eller ikke mammaliske proteiner såsom hemocyanin, mest foretrukket kaiigle-hemocyanin. Andre passende proteiner vil antydes for fagmannen.

De immunogene blandinger ifølge foreliggende oppfinnelse

kan anvendes for å indusere dannelse av antistoff som er spesifikke overfor henholdsvis H-ras, N-ras og K-ras p21 proteiner i vertsdyr ved å injisere de immunogene blandinger i en slik vert, fortrinnsvis ved å bruke et tilsetningsmiddel. Forbedrete titere kan erholdes ved gjentatte injeksjoner over en tid. Passende vertsdyr for dette formål innbefatter patte-dyr, slik som kaniner, marsvin, hester, geiter, rotter, mus, kyr, sauer, etc. De resulterende antisera inneholder antistoff som selektivt vil kompleksbinde med de respektive oncogene proteiner. Slike sera kan anvendes i og for seg ved ut-føring av assay for slike oncogene proteiner, eller, om ønsket, kan antistoffet konsentreres ved å anvende prosedyrer som er velkjente i faget, f.eks. ved ammoniumsulfatutfel-ling fulgt av gelkromatografi. I en alternativ utførelses-form av foreliggende oppfinnelse kan monoklonale antistoff anvendelige ved påvisning av de antydete p21ras oncogenpro-teiner erholdes ved velkjente metoder som er tilgjengelige i faget, såsom f.eks. dem beskrevet C. Milstein og G. Kohler i Nature, 256, 495-497, (1975). I slike fremgangsmåter injiseres de immunogene blandinger ifølge foreliggende oppfinnelse

i en mus eller en rotte. Vertsdyret avlives derpå og celler tatt fra milten fuseres med myelomceller. Resultatet er en hybridcelle, referert til som et "hybridom" som reproduserer in vitro. Populasjonen av hybridomer skjermes for å isolere individuelle kloner hvor hver utskiller et enkelt antistoff mot antigenpolypeptidet som ble brukt i den immunogene blanding. De individuelle antistoff erholdt på denne måte er hvert produktet av en enkelt B celle fra det immuniserte dyr, dannet i respons mot et spesifikt antigensete gjenkjent på den immunogene substans. I dette tilfelle vil, siden subse-kvensen til p21 proteiner ble anvendt, antistoffet også være spesifikt overfor det fullstendige p21 protein inneholdende denne subsekvens.

De forskjellige hybridom cellelinjer ble så avskjermet for

å identifisere dem som danner antistoff mot det ønskete anti-gen. De dannete antistoff av de forskjellige hydridomcelle-linjer blir fortrinnsvis skjermet for å identifisere dem med best affinitet og aktivitet overfor den immunogene substans brukt for dannelsen av hydridom cellelinjene.

De polyklonale eller monoklonale antistoff dannet i samsvar

med foreliggende oppfinnelse kan anvendes i ethvert konvensjonelt immunometrisk assay for bruk ved påvisning av tilstedeværelsen av de respektive p21ras proteiner i forsøksprøver. Ved én slik prosedyre, hvor kjente mengder av en prøve skal undersøkes, blir det spesifikke antistoff ifølge foreliggende oppfinnelse og merket p21ras polypeptid eller protein blandet sammen og tillatt å stå. Antistoff-antigen-komplek-set separeres fra de ubunne reagenser ved fremgangsmåter som er kjent i faget, f.eks. ved behandling med ammoniumsul-fat, polyetylenglykol, andre antistoff enten i overskudd eller bundet til en ikke oppløselige støttesubstans. Egnete uoppløselige støttesubstanser inneholder polymerer slik som Kynar TM,dekstran-belagt kull og lignende. Konsentrasjonen til det merkete ras polypeptid eller protein bestemmes i enten bundet eller ubundet fase og det spesifikkke21ras pro-

teininnhold til prøven kan deretter bestemmes ved å sammen-ligne nivået av den merkete komponent som ble observert til en standard kurve på i og for seg kjent måte. En passende standardkurve kan erholdes ved å blande kjente mengder p21ras protein med faste mengder merket p21ras protein og det spesifikke p21ras antistoff ifølge foreliggende oppfinnelse og bestemme bindingsgraden til hver slik kjent mengde. Siden antistoffene ifølge foreliggende oppfinnelse kan skjel-ne mellom de respektive H, N, K4A og K4B former for p21ras proteinet er det mulig å bestemme tilstedeværelsen av hver av disse individuelle former til ras oncogen proteinet selv i nærvær av blandinger.

To forskjellige monoklonale antistoff til et spesifikt p21ras oncogen protein, hvor antistoffene ikke innvirker på bindin-gen til hverandre overfor antigenet, kan anvendes i en to-sete immunometrisk assay prosedyre. Passende homogene og heterogene to-sete immunometriske assayprosedyrer er beskrevet i US-patent nr. 4.376.110.

Ytterligere en annen immunometrisk metode som kan anvendes ved utførelse av foreliggende oppfinnelse innbefatter bruken av immunoblot - teknikken (såkalt Western blot analyse). I denne teknikk blir prøver inneholdende p21ras proteinet blandet med SDS prøvebuffer (Laemmli U.K., Nature 227 680-685

[1970]) med eller uten 2-merkaptoetanol som sulfhydryl-redu-serende middel, kokt og underkastet elektroforese på polyakrylamidgeler. Proteiner ble elektroforetisk overført til nitrocellulosefiltre ved å bruke en "Transblot" apparatur ved å følge fremgangsmåten beskrevet av H. Towbin et al., Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 76'4350-4354 (1979). Etter preinkubering med bufret bovinserumalbumin inkuberes filtrene over natten med antisera for det ønskete humane p21ras polypeptid. Filtrene vaskes deretter og inkuberessekvensielt med passende merkete antisera merket mot igG til artene i hvilke det ras spesifikke antistoff ble utviklet. Slike andre antistoff ble merket med enhvert konvensjonell merking såsom en radioisotop eller fortrinnsvis med et enzym, såsom med peroksydase. Filtrene kan så vaskes igjen og enten autora-diograferes eller inkuberes med et passende substrat for enzymet slik som f.eks. med diaminobenzidin til proteinbånd observeres. Fraværet av fargebånd med ethvert spesifikt antistoff til humant p21ras protein vil indikere fraværet av slikt protein i forsøksprøven. Hvis man kun ønsker å vite om ras oncogenproduktproteiner var tilstede i forsøksprøven eller ikke, så kan kombinasjoner av de spesifikke antistoff anvendes. Hvis på den annen side tilstedeværelse eller fravær av et spesifikt p21ras protein skal bestemmes ville et panel av de individuelle antistoff spesifikke for de individuelle ras proteiner kunne anvendes på gjentatte forsøksprøver.

Antistoffene ifølge foreliggende oppfinnelse kan også anvendes i heterogene "sandwich" type assay. I et slikt heterogent assay anvendes et umerket antistoff, fortrinnsvis et monoklonalt antistoff, for å ekstrahere forsøksproteinsub-stansen fra prøven, hvor slikt antistoff immobiliseres på ethvert konvensjonelt støttemateriale brukt i immunometriske assay. Blant slike støttematerialer er det innbefattet filtrerpapir, plastkuler eller forsøksrør laget av polyety-len, polystyren, polypropylen eller andre passende materialer. Også anvendelig for dette formål er spesielle materialer såsom agarose, fornettet dekstran og andre polysakkarider. Teknikkene for slik binding er velkjente for fagmannen. F.eks. kan antistoff bindes til polysakkaridpolymerer ved å bruke fremgangsmåten beskrevet i US-patent nr. 3. 645. 852.

Merkete spesifikke antistoff brukt i foreliggende oppfinnelse kan fremskaffes med samme merkingen som er brukt i immunometriske assay kjent i faget. Blant disse kan nevnes fluo-rogene markører for påvisning av fluorimetri som beskrevet i US-patent nr. 3.940.475 og enzymatiske markører som beskrevet i US-patent nr. 3.654.090. Det er også mulig å anvendes et radiomerket antistoff såsom f.eks.<125>I under bruk av f.eks. fremgangsmåten tilW.M. Hunter og F.C. Green- wood i Nature (london) 194, 495-496 (1962) eller den til G.S. David og R. A. Reisfeld i Biochemis try, 13_, 1014-

1021, (1974).

I et typisk heterogent sandwich assay bestemmes mengden av merket antistoff assosiert med det uløselige sandwich-kompleks ved bestemmelse av det uoppløselige bæremateriale ved passende anordninger. Imidlertid er det også mulig å rela-tere tilstedeværelsen eller fraværet av forsøksproteinet i væskeprøven som undersøkes til mengden av merket antistoff som ikke reagerer under assay'et og som forblir i oppløst form.

I enda en ytterligere utførelsesform av foreliggende oppfinnelse kan antistoffene ifølge oppfinnelsen anvendes for antistoff-affinitetkromatografiopprenskning av de respektive p21ras proteiner for hvilke de er spesifikke bindingspartnere. For dette formål immobiliseres antistoffene på en matrise

på i og for seg velkjent måte passende kovalent bundet til en passende antistoff-affinitetkromatografimatrise, såsom fornettet agarose (f.eks. Sepharose TM4B, kommersielt til-gjengelig fra Pharmacia). Antistoffaffinitetkromatografi-opprenskning av humant p21ras protein inneholdende oppløs-ninger kan utføres i henhold til enhver velkjent metode enten porsjonsvis, eller fortrinnsvis under anvendelse av det matrise-immoniliserte antistoff anbragt på en kolonne.

EKSEMPEL 1

Syntese av H- ras T- 24 oncogen- kodet nonadekapeptid

p21ras<H>( 171- 189)

Fast-fase peptidsyntese ble utført i en opprett beholder festet til en model S-500 ryster utstyrt med et RD-20 ryste-hode (Kraft Apparatus, Inc., Minneola, N.Y.) ved å bruke en manuell prosedyre. Ser(Bzl)-l% fornettet polystyren (200 - 400 mesh) resin [3,0 g, 0,21 mmol/g-resin, 0,63 mmol (kjøpt fra BACHEM, Torrance, CA)] ble underkastet 18 sykler fast peptidsyntese ved å følge sekvensen til p21ras fra posisjon 186 til 171 ved å bruke den predannete symmetriske anhydrid-metoden (Merrifield, R.B., supra). a-aminogruppene be beskyttet med t-butyloksykarbonylgruppen, mens sidekjedegrup-pene ble beskyttet som følger: Asp, Glu,Ser (benzyl): Cys (3,4-dimetylbenzyl); Lys (2-klorbenzyloksykarbonyl). 4,4 g (0,63 mmol) av det beskyttede nonadekapeptid [p21ras (171-189)] resin ble erholdt. 1,0 g (0,143 mmol) av dette beskyttede peptid-resin ble behandlet med vannfritt flytende hydrogenfluorid (HF) (10 ml inneholdende 10% 1,2-etan-ditiol) ved 0°C i 1 time og fordampet (høyvakuum, CaO felle). Det rå peptid og resinblandingen ble triturert med etylacetat (EtOAc), ekstrahert med trifluoreddiksyre (TFA), fordampet og residiet triturert med eter og tørket. Råmaterialet (0,515 g) ble oppløst i 10 ml destillert H^O filtrert og tilført en whatman Partisil TM1 M-20 ODS-3 kolonne (2 x 50 cm).

Kolonnen ble eluert (6,0 ml/min) med et løsningsmiddelsystem bestående av (A) H20 (inneholdende 0,1 % TFA) og (B) aceto-nitril (inneholdende 0,1% TFA) i en liniær gradient på 10-35% (B) over 180 minutter. Fraksjoner ble samlet (2 min./fraksjon) og deler analysert ved å bruke et analytisk hplc sy-stem. Produktet som kom ut i fraksjoner 61-65 ble slått sammen, dampet inn og frysetørket for å gi det rene nonadekapeptid p21ras<H>(171-189). Utbytte: 42 mg (15,2 %). Produktet ble vist å være homogent ved analytisk hplc og ga den forventede aminosyresammensetning (hydrolyse i 6N vandig HC1, 110°C, 24 timer): Asp, 1,98; Ser, 2.71; Glu, 1,03; Pro, 3,15; Gly, 2,08; Val, 1,02; Leu, 1,93; Lys, 1,10;

Met, 0,9 5; Cys, 2.74.

EKSEMPEL 2

Syntese av H- ras T- 24 oncogen- kodet eicosapeptid

p21ras<H>( 170- 189)

2,17 g (0,310 mmol) av det beskyttede nonadekapeptid [p21 ras H (171-189)]-resin erholdt i eksempel 1 ble underkastet én syklus peptidsyntese med Na<->Boc-Ne<->2-kloro-benzyloksykarbonyl-Lys, En 1 g's del (0,143 mmol) av produktet ble spaltet med flytende HF (som i eksempel 1). Utbytte: 525,6 mg. Råproduktet ble underkastet hplc opprenskning (som i eksempel 1) og 24,4 mg av eicosapeptid p21ras<H>(170-189) (utbytte 8,3%) ble erholdt.

Produktet var homogent ved analytisk hplc og ga den forventede aminosyresammensetning (hydrolyse: 6N vandig HC1, inneholdende 1% tioglykolsyre (TGA); 150°C; 1 time):Aps, 1,90; Ser, 2,30; Glu, 1,09; Pro, 2.81; Gly, 2.00; Val, 0,94; Leu 1,80; Met, 1,02; Lys, 1,97; Cys, 2.71.

EKSEMPEL 3

Syntese av N- ras T- 24 oncogen- kodet heptadekapeptid p21ras<N>( 170- 186)

Cys(DMB)-l% fornettet polystyrenresin (2,0 g; 0,48 mmol/g-resin; 0,96 mmol) ble underkastet 16 sykler av fastfasepep-o N

tidsyntese ved a følge sekvensen til p21ras fra posisjon 185-170. En del av det resulterende beskyttede peptid-resin (1 g; 0,26 mmol) ble behandlet med vannfritt flytende HF (som i eksempel 1). Utbytte: 385 mg. Råpeptidet ble underkastet hplc opprenskning (som i eksempel 1). Gradienttid: 150 min.; det ønskete produkt kom ut i fraksjoner 50-51. Disse fraksjoner ble slått sammen, fordampet og frysetørket. Utbytte: 20 mg (4,4 %) av heptadekapeptidet p21ras<N>(170-186), som ble vist å være i hovedsak homogent ved analytisk

hplc. Aminosyresammensetning (hydrolyse i 6N vandig HCl/1% TGA; 150°C; 1 time: Asp, 2,00; Thr, 1,08; Ser, 1,65; Glu, 2,06; Pro, 1,09; Gly, 3,00; Met, 1,02; Leu, 1,99; Lys,

1,00. Cys (Ellman forsøk), 2,05.

EKSEMPEL 4

Syntese av K- ras T- 24 oncogen[ exon IVa]- kodet heksadekapeptid p21ras<K4A>( 171- 186).

Cys (DMB)-1% fornettet polystyren-resin (2,0 g; 0,48 mmol/g-resin; 0,96 mmol) ble underkastet 15 sykler fastfase-peptid-4 KA

syntese med å følge sekvensen til p21ras fra posisjon 185-171, behandlet med TFA og. tørket for å gi 6,52 g (våt-vekt) av det sidekjedebeskyttede peptid-resin. En del (1 g; 0,147 mmol) ble spaltet med HF (som i eksempel 1) og etter-følgende opparbeidelse ga 374,6 mg av det grove heksadekapeptid p21ras K4A (171-186). Grovmaterialet ble underkastet hplc opprenskning [som i eksempel 1]; gradient: 5-30% (B) /180 min.]. Produktet kom ut i fraksjoner 43-49 som ble slått sammen, inndampet og frysetørket. Utbytte: 101 mg (38,4 %) heksadekapeptid p21rasK A (171-186), som ble ansett for å være i hovedsak homogent ved analytisk hplc. Aminosyresammensetning (hydrolyse i 6N vandig HCl/4% TGA; 150°C; 1 time): Thr, 0,99; Ser, 0,87; Glu, 2,07; Pro, 1,03; Gly, 1,07; Val, 0,97; Ile, 1,89; Lys, 5,10; Cys (som cysteinsyre), 1,72.

Cys (Ellman forsøk, 196).

EKSEMPEL 5

Syntese av K- ras T- 24 oncogen[ exon IVb]- podet heksadekapeptid p21ras<K4B>( 170- 185)

Cys(DMB)-l% fornettet polystyren-resin (2,0 g; 0,48 mmol/ g-resin; 0,96 mmol) ble underkastet 15 sykler fastfasepeptid-syntese ved å følge sekvensen til p21ras 4KB fra posisjonen 184 til 170, behandlet med TFA og tørket for å gi 4,71 g av det sidekjedebeskyttede peptidresin. Vannfri HF spalt-ning (som i eksempel 2) av en 1 g's (0,20 mmol) del, og påfølgende opparbeidelse ga 300,5 mg grovt heksadekapeptid p 21ras<K4B>(170-185). Grovmaterialet ble underkastet hplc opprenskning [som i eksempel 1; gradient: 5-20% (B)/150 min.] og fraksjonene (20-30) inneholdende produktet ble slått sammen, inndampet og frysetørket. Utbytte: 64 mg (17,3%)

av heksadekapeptidet p21ras<K>4B(170-185). Produktet ble vist å være i hovedsak homogent ved analytisk hplc. Aminosyresammensetning (hydrolyse i 6N vandig HC1/1% TGA; 150°C; 1 time): Asp, 0,99; Thr, 1,02; Ser, 1,83; Cys (som cysteinsyre), 0,88; Gly, 0,99; Met, 1,05; Lys, 9,33. Cys (Ellman). 1,04.

EKSEMPEL 6

TJ

Konjugering av nonadekapeptid p21ras ( 171- 189) via KLH- MBS- prosedyren

Kaiigle-hemocyanin (KLH) (16 mg i 50%, glyceroloppløsning) ble tilsatt bufferoppløsningen (pH 7,2; 1,2 ml) laget av 0,3 ml hver av Na2HP04(8 mM); KC1 (1,6 mM); NaCl (140 mM)

og KH2P0^(1,1 mM) og omrørt magnetisk ved romtemperatur.

En oppløsning av m-maleimidobenzoyl-N-hydroksysuccinimid (MBS) i DMF (0,6 ml) ble sakte tilsatt (dråpevis) og den turbide reaksjonsblanding ble omrørt i 30 minutter ved romtemperatur. Reaksjonsproduktet, KLH-MB, ble deretter ført gjennom en Sephadex TM G-25 kolonne (1,2 x 50 cm) som var blitt ekvilibrert på forhånd med 0,05 M natriumfosfatbuffer (pH 6,0). Kolonnen ble eluert med den samme buffer (strøm-ningshastighet: 1 ml/min) og fraksjoner samlet opp (1 min/ fraksjon). Fraksjonene inneholdende KLH-MB kompleks (fraksjoner 20-44) ble slått sammen (20 ml; 10,3 OD enheter ved en bølgelengde = 2 80nm) . En del av KLH-MB produktet (5 itiL, 2,06 OD) ble omsatt med 5 mg nonadekapeptid p21ras (171-189) oppløst i 2 ml 0,05M natriumfosfatbuffer. pH ble ju-stert til 7-7,5 med IN NaOH og reaksjonen ble omrørt i 3 timer ved romtemperatur. Oppløsningen ble dialysert mot fosfatbufret saltoppløsning (pH 7,2) med hyppige skift over en 40 timers periode og deretter frysetørket. Utbytte av den immunogene blanding 37 mg (inneholdende fosfatbufret salin-salter).

EKSEMPEL 7

K onjugering av nonadekapeptid p21ras ( 171- 189) med tyroglobulin

Bo vintyroglobulin (6,60 mg, 10 nanomol) ble oppløst i 10 ml 0,1M NaH2P04, pH 7,2 og 9,6 mg (5^umol) nonadekapeptid p21ras<H>(171-189) ble tilsatt. Etter at alt peptidet var

oppløst ble C)2 ml av en oppløsning av glutaraldehyd [Sigma Grade I, 25% (vandig)] tilsatt og reaksjonen kontinuer-lig omrørt ved 25°C i 2 timer. Blandingen ble utførlig dialysert mot 0,001M NaH2P04(pH 7,2) buffer og frysetørket. Utbyttet av immunogen blanding 17 mg (inneholdende fosfat-salter).

EKSEMPEL 8

Fremstilling av antistoff spesifikke for C- terminalen

til p21ras proteiner eller polypeptider.

Peptider svarende til karboksylterminalene til p21ras TJ,

K N

p21ras og p21ras syntetisert som ovenfor ved fastfasetek-nikker ble koblet til bovintyroglobulin ved glutaraldehyd-prosedyren som beskrevet i eksempel 7 eller til kaiigle-hemocyanin ved MBS prosedyren (Liu, F.-T. et al., Bioche-mistry 1_8, 690-697, [1979]) som beskrevet i eksempel 6.

Konjugatene ble frysetørket og resuspendert ved en konsen-trasjon på 3 mg konjugat pr. ml fosfatbufret salin (20 mM natriumfosfat, pH 7,4, 0,15 M NaCl) før anvendelse. Konjugatene inneholdt mellom 550 og 606 yug peptid pr. mg konjugat.

Balb/C mus og Lewis-rotter ble immunisert i henhold til følgende skjema:

Immuniserinqsprotokol

Dag 0 0,2 mg konjugat

(1:1 blanding med Freund's fullstendig tilsetning)

intraperitoneal injeksjon (i.p.)

Uke 8 2. immunisering (booster)

0,2 mg konjugat

(1:1 blanding med Freund's fullstendig tilsetning - Injisert i.p.

Uke 11 Blodtapping

Uke 27 3. immunisering (booster)

0,1 mg konjugat

(1:1 blanding med Freund's ufullstendige tilsetning) - injisert i.p.

Uke 30 Blodtapping.

Dyrene ble tappet ved de indikerte tider for å bestemme sir-kulerende titre av anti-p21ras-antistoff. Titrene og spesi-fisitetene til antisera ble bestemt ved direkte bindende ELISA og ved en imrauno-blot teknikk (såkalt Western blot analyse). Resultatene er vist i tabell 1 og 2.

EKSEMPEL 9

Immunoblotting av ras-proteiner med anti-peptidsera og Y13-259 (et ras monoklonalt antistoff med bred spesifisi-tet brukt som en positiv kontrol) ble utført mot lysater fremstilt fra en rekke celle-linjer, hvor hver uttrykker ras gener ved et nøyt nivå. Umerkete, eksponensielt voksne celler ble lysert ved inkubering i 10 minutter ved 4°C i TNE-buffer (20 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, pH

TM

7,4) inneholdende 1% (v/v) Triton X-100, 0,5% (vekt/vo-lum) Na-deoksykolat, og 2 mM fenylmetylsulfonylfluorid. Prøver ble sentrifugert ved 100.000 x g i 30 minutter og supernatantene ble samlet opp og lagret ved -80°C. Relative proteinkonsentrasjoner ble bestemt ved et kolorimetrisk assay ved å bruke et BioRad assay kit, med bovinserum albu-min (BSA) som standard. Deler av lysat inneholdende 0,05 mg totalt protein ble blandet med like volumer av 2 x SDS prøvebuffer med eller uten 2-merkaptoetanol som sulfhy-drylreduserende middel, kokt i 3 minutter, og underkastet elektroforese på 12% polyakrylamidgeler. Proteiner ble elektroforetisk overført til nitrocellulosefiltere (0,22 pm porestørrelse) under anvendelse av en "Transblot" apparatur i hovedsak som beskrevet av H. Towbin et al., (supra). Etter preinkubering i 3 timer ved 4°C med 3% BSA i TNE buffer ble filtrene inkubert over natten ved 4°C med monoklonalt antistoff Y13-259 ved 10 pg/ml eller med anti-peptid-serum fortynnet 1:10 i TNE buffer med 3% BSA. Filtrene ble vasket og inkubert sekvensielt i 2 timer med antiserum mot rotte IgG fortynnet 1:2000 og med peroksydase-konju-gerte, affinitet-rensete antistoff mot kanin IgG, fremstilt i geiter (Boehringer-Mannheim) fortynnet 1:800. Filtrene ble vasket og inkubert med diaminobenzidinsubstrat inntil brune proteinbånd ble observert.

Det brede spesifisitets ras monoklonale antistoff Y13-259 reagerer med alle de undersøkte ras proteiner. Rotteanti-serum mot humant p21ras TTreagerer med p21 kodet av v-ras genet av HaMSV og av human p21ras TJ, men ikke med p21 kodet av v-ras K genet til KiMSV, humant p21ras K eller humant p21-N

. ras .

Resultater fra iimiunoblotting med et murint antiserum for ras K4B C-terminal peptid viser at serumet reagerer med de-naturert og redusert p21ras fra den murine hemopoietiske cellelinje 416B, som uttrykker meget høye nivå av rasj£ proteinet, ras proteinet uttrykt i 416B celler synes å være en blanding av 4A og 4B typer. Det murine antiserum

K4B K

mot ras C-terminalpeptid reagerer med humant ras protein, men reagerer ikke påviselig med p21 ras kodet av KiMSV. Antiserumet reagerte ikke med p21 proteiner kodet

H N

av ras og ras .

Claims

1. Polypeptid, karakterisert ved at det er valgt fra gruppen bestående av:

og derviater derav.

2. Polypeptidderivat, karakterisert ved at det omfatter en forbindelse ifølge krav 1 i sidekjede og en N-terminalbeskyttet form med karboksylterminalen kovalent bundet til et polystyren fastfasesynteseresin.

3. Antistoff, karakterisert ved at det er selektivt for humant p21ras polypeptid og ikke- i i 4. • ^ j u n N ~, K4A 01 , K4B kryssreaktivt med humane p21ras , p21ras <K> 4A og p21ras polypeptider.

4. Antistoff ifølge krav 3, karakterisert ved at det er frembragt med en immunogen blanding som er passende for dannelse av antistoff som er spesifikke for et p21ras polypeptid eller protein i en vertsorganisme, hvor den immunogene blanding omfatter et polypeptid som angitt i krav 1 og som eventuelt er kovalent til et immunogent bæremateriale, hvor den immunogene blanding omfatter et polypeptid med sekvensen:

eller sekvensen

5. Antistoff, karakterisert ved at det er selektivt for humant p21ras <N> polypeptid og ikke- H K4A K4B kryssreaktivt med humane p21ras , p21ras og p21ras polypeptider.

6. Antistoff ifølge krav 5, karakterisert ved at det er fremstilt med en immunogen blanding som er passende for dannelse av et antistoff spesifikt for et p21ras. polypeptid eller protein i en vertsorganisme, hvor den immunogene blanding omfatter et polypeptid ifølge krav 1 kovalent bundet til et immunogent bæremateriale, og hvor den immunogene blanding omfatter et polypeptid med sekvensen:

7. Antistoff, karakterisert ved K4A at det er selektivt for humant p21ras polypeptid og ikke-kryssreaktivt med humant p21ras , p21ras N og p21ras polypeptider.

8. Antistoff ifølge krav 7, karakter i- sert ved at det er frembragt med en immunogen blanding passende for å frembringe dannelse av antistoff spesifikke for et p21ras polypeptid eller protein i en vertsorganisme hvor den immunogene blanding omfatter et polypeptid ifølge krav 1 kovalent bundet til et immunogent bæremateriale, og hvor den immunogene blanding omfatter et polypeptid med sekvensen:

9. Antistoff, karakterisert ved K4B at det er selektivt for humant p21ras polypeptid og ikke-kryssreaktivt med humane p21ras <H> , p21ras <N> og p21ras A polypeptider.

10. Antistoff ifølge krav 9, karakterisert ved at det er fremstilt med en immunogen blanding passende for å fremskaffe dannelse av antistoff spesifikke for et p21ras polypeptid eller protein i en vertsorganisme hvor den immunogene blanding omfatter et polypeptid ifølge krav 1 kovalent bundet til et immunogent bæremateriale, og hvor den immunogene blanding omfatter et polypeptid med sekvensen:

11. Antistoff ifølge ethvert av kravene 3 til 10, karakterisert ved at det er et monoklonalt antistoff.

12. Fremgangsmåte for fremstilling av et polypeptid iføl-ge krav 1, karakterisert ved konvensjo-nelle polypeptidsyntesemetoder anvendes.

13. Fremgangsmåte ifølge krav 12, karakterisert ved at fastfasesyntesemetoder anvendes.

14. Fremgangsmåte for fremstilling av en immunogen blanding som er anvendelig for å fremskaffe dannelse av antistoff spesifikke for et p21ras polypeptid eller protein i en vertsorganisme hvor den immunogene blanding omfatter et polypeptid ifølge krav 1 kovalent bundet til et immunogent bæremateriale, karakterisert ved at polypeptidet ifølge krav 1 er direkte kovalent bundet til et immunogent bæremateriale.

15. Fremgangsmåte for fremstilling av en immunogen blanding passende for å fremskaffe dannelse av antistoff spesifikke for et p21ras polypeptid eller protein i en vertsorganisme hvor den immunogene blanding omfatter et polypeptid ifølge krav 1 kovalent bundet til et immunogent bæremateriale, karakterisert ved at poly ep-tidet ifølge krav 1 er koblet til det immunogene bæremateriale via en konvensjonell bifunksjonell koblingsgruppe.

16. Fremgangsmåte for fremstilling av et antistoff ifølge ethvert av kravene 3-10, karakterisert ved at en immunogen blanding som er passende for å fremskaffe dannelse av antistoff spesifikke for et p21ras polypeptid eller protein i en vertsorganisme hvor den immunogene blanding omfatter et polypeptid ifølge krav 1 kovalent bundet til et immunogent bæremateriale, injiseres i en vertsorganisme i stand til å danne en 'immunrespons mot ras polypeptidet av den immunogene blanding.

17. Immunometrisk assay for kombinaring av to eller flere humane p21ras proteiner valgt fra gruppen bestående av H N K4A K4B p21ras , p21ras , P21ras og p21ras i en forsøks røve, karakterisert ved å anvende antistoff selektive for de humane p21ras proteiner som skal under-søkes, hvor antistoffene er ikke-kryssreaktive med de andre humane p21ras proteiner.

18. Immunometrisk assay for humant p21ras protein valgt fra gruppen bestående av p2lras <H> , p21ras <N> , p21ras <K> 4A og K4B p21ras i en forsøksprøve, karakterisert ved å anvende et antistoff selektivt for det selektive humane p21ras protein som skal undersøkes, hvor antistoffet er ikke-kryssreaktivt med de andre humane p21ras proteiner.

19. Immunometrisk assay ifølge krav 18, karakterisert ved at det er et heterogent assay. 2G.

Immunometrisk assay ifølge krav 19, karakterisert ved at det anvendes en immunoblot fremgangsmåte hvori tilstedeværelsen av immunkomplekset dannet mellom et humant p21ras protein som skal undersøkes i forsøksprøven og et selektivt antistoff bestemmes ved å sette immunkomplekset i kontakt med et merket andre antistoff.

21. Immunometrisk assay ifølge krav 20, karakterisert ved at det andre antistoff er merket med et enzym og et substrat for et slikt enzym tilsettes, hvor substratet konverteres av enzymet fra en ufarget til en farget tilstand.

22. Immunometrisk assay ifølge krav 18, karakterisert ved at det er et homogent assay.

23. Immunometrisk assay ifølge krav 22, karakterisert ved at det er et kompetitivt inhibe-ringsassay som anvender en kjent mengde av et merket humant p21ras protein eller karboksyterminal fragment derav tilsvarende det humane p21ras protein som skal undersøkes.

24. Fremgangsmåte for opprenskning av et spesifikt humant p21ras protein valgt fra gruppen bestående av p21ras , p21ras <N> , p21ras <K4A> og p21ras <K4B> , karakter i- sert ved at opprenskningen foretas ved å anvende et antistoff selektivt for det humane p21ras protein som skal renses og ikke-kryssreaktivt overfor andre medlemmer av den humane p21ras proteinfamilie bundet til en^ affinitets kromatograferingsmåtrise.

25. Anvendelse av en immunogen blanding passende for å fremskaffe dannelse av antistoff spesifikke for et p21ras polypeptid eller protein i en vertsorganisme, hvor den immunogene blanding omfatter et polypeptid ifølge krav 1 kovalent bundet til et immunogent bæremateriale passende for å fremskaffe en immunrespons i en vertsorganisme.

26. Anvendelse av antistoff ifølge ethvert av kravene 3-11 ved et immunometrisk assay.

27. Anvendelse av antistoff ifølge ethvert av kravene 3-11 for opprenskning av et humant p21ras protein eller polypeptid omfattende en aminosyresekvens ifølge krav 1.

2 8 Anvendelse av et immunometrisk assay ifølge ethvert av kravene 17 - 23 for undersøkelse av et spesifikt humant p21ras protein eller polypeptid omfattende en aminosyresekvens ifølge krav 1.

29. , Immunogen blanding passende for å fremskaffe dannelse av antistoff spesifikke for et p21ras polypeptid eller protein i en vertsorganisme, hvor den immunogene blanding omfatter et polypeptid ifølge krav 1 kovalent bundet til et immunogent bæremateriale, karakterisert ved at den er passende for å fremskaffe en immunrespons i en vertsorganisme .

30. Antistoff ifølge ethvert av kravene 3-11, karakterisert ved at det er anvendelig for bruk i et immunometrisk assay for et humant p21ras protein.

31. Oppfinnelsen som tidligere beskrevet.