JPS61289099A - ポリペプチドおよびその誘導体 - Google Patents

ポリペプチドおよびその誘導体

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JPS61289099A
JPS61289099A JP61124628A JP12462886A JPS61289099A JP S61289099 A JPS61289099 A JP S61289099A JP 61124628 A JP61124628 A JP 61124628A JP 12462886 A JP12462886 A JP 12462886A JP S61289099 A JPS61289099 A JP S61289099A
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p21ras
human
polypeptide
antibody
protein
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JP61124628A
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リチヤード　エイ・チゾニテ
アーサー　エム・フエリツクス
マーク　イー・フアース
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F Hoffmann La Roche AG
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F Hoffmann La Roche AG
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Publication date
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/32—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against translation products of oncogenes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/5748—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving oncogenic proteins

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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 多くの哺乳類動物腫瘍細胞は、ＤＮＡを介する遺伝子移
入が行われた場合に、１ｉ歯類線維芽細胞の悪性転換を
誘導できる突然変異腫瘍遺伝子を含有する。この定量法
によってとくに頻繁に検出される一部の活性化腫瘍遺伝
子には、ｒ　ａ　ｓ　”、ｒａｓ　　およびｒａｓＨの
３種がある［５ｈｉｌｉｚｕ。
に に、ほか：　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓ
ｃｉ、　ＵＳＡ、　８０　。
２１１２〜２１１６（１９８３）］。これらの遭伝子は
それぞれ、約２１．０００ダルトンに相当する１８８ま
たは１８９個のアミノ酸を有する蛋白質をコードし、ｐ
２１　ｒａｓと呼ばれている。
これらの蛋白質はグアニンヌクレオチドを結合し、ｒａ
ｓＨ蛋白質はＧＴＰａｓｅ活性を有する［　Ｇｉｂｂｓ
、　Ｊ、　Ｂ、ほか：　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃ
ａｄ、　Ｓｃｉ。
ＬＩＳＡ　、８１．５７ｏ４〜５７ｏｅ、（１９８４）
］。
この３種のｒａｓ３１伝子によって特定されるアミノ酸
配列はきわめて類似している。野生型蛋白質の最初の°
８６個のアミノ酸残基は同一であり、ｒａｓ蛋白質の次
の７５個の残基はたがいに約８５％の相同性を有する。
しかしながら、これらの蛋白質は、カルボキシ末端付近
に存在する１５個のアミノ酸部分（残基１７１〜１８５
）で著しく異なっている［Ｖａｎ　Ｂｅｖｅｒｅｎ、　
Ｃ，＆　Ｖｅｒｍａ、　１．　Ｈ，：Ｃｕｒｒｅｎｔ　
Ｔｏｐｉｃｓ　ｉｎ　Ｈｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　ａｎ
ｄｒｍｍｕｎｏｌＯｇｙ、　Ｖｏｌ、　　１２３、Ｉ）
ｆ）７３〜７８（１９８６）の総説参照］。一群のｒａ
ｓの各メンバーのＣ末端可変部は鳴歯類とヒトの間で高
度に維持されている。この可変ドメインがｐ２１　ｒａ
ｓ蛋白質の一部の生理的機能における特異性を付与して
いるものと考えられてきた。この可変ドメインに考えら
れる機能的役割は、Ｉ）２１　ｒａｓのカルボキシ末端
が翻訳後プロセッシングの間に蛋白分解的に切断される
ことを示唆する証拠により疑問視されている［　５ｈｉ
ｉｉｚｕ、に、ほか：　Ｎａｔｔ＋ｒｅ、　３０４．４
９７〜５００　（１９８３）］。しかしながら、さらに
最近になって、ｒ　ａ　ｓ　”蛋白質のＣ末端はプロセ
ッシングの間、共有結合的に無傷のままであることが明
らかにされた。さらにほかのデータから、ｒａｓに蛋白
質についても同じことが示唆されている。
他の研究グループは、各ｒａｓ蛋白質の可変ドメインの
すぐ上流にエンドヌクレアーピ標的部位と推定される場
所の存在に注目した。彼らは、蛋白質はこの部位で切断
されるものの、１８６位の維持されたシスティン残基が
関与するジスルフイド橋でＣ末端フラグメントは分子の
残部とつながッテいルト考エタ（７）Ｔ”ｄＦ＋ル［Ｗ
ｉｌｌｕｍｓｅｎ、　Ｂ、　Ｈ，ほか：ＥＭＢＯＪ’＋
　３．２５８１〜２５８５　（１９８４）］、このモデ
ルでは、成熟ｐ２１　ｒａｓの還元により約２．０００
ダルトンのペプチドが遊離することを予想させる。さら
に最近のデータは、ｒ　ａ　ｓ　”蛋白質からこのよう
なペプチドの放出は検知できないことを示している。し
たがって、ｐ２１ｒａｓ蛋白質のＣ末端ドメインが共有
結合によって統合性を保持していることを強く支持する
証拠があるといえる。すなわち、一群のｒａｓ蛋白質で
は可変領域は無傷に残っていることが明らかであるので
、ｐ２１　ｒａｓ群の蛋白質の各メンバー、ｒａｓ　　
、ｒａｓ　　、ｒａｓ４にＡおよびＩＩ　　　　　　　
　　Ｎ ｒａｓ４に８の間の配列の差を利用して、これらの蛋白
質の間の識別、したがって、対象が腫瘍遺伝子をもって
いるか否かの調査を可能にする選択性試薬を提供するこ
とができるようになる。この方法で、各個体が新生物疾
患の危険性の高いグループに属するかどうかを判定する
こと、またすでにこの疾患を有する患者の新生物疾患が
どの段階にあるかを調べることができるものと考えてよ
い。
さらに、癌の発生段階の評価、治療中の患者のモニター
が可能になろう［Ｎｉｎ＋ａｎ、　Ｈ，１，、：Ｈｙｂ
ｒｉｄｏｍａ、　　４　（１）、　７５　（１９８５）
　］。
本発明は、ｐ２１ｒａｓＨ、ｐ２１ｒａｓＮ、ｐ２１ｒ
ａｓＫ４Ａ蛋白質群の各メンバーの可変領域から誘導さ
れるアミノ酸配列を有する新規ポリペプチドのプレバレ
ージョン、このようなポリペプチドが免疫原性担体物質
に共有結合した免疫原性組成物を製造するためのこのよ
うなポリペプチドの使用、このようなポリペプチドによ
って誘発される抗体であってそのポリペプチド配列が誘
導されたｒａｓ腫瘍遺伝子に特異的な抗 体の製造、およびこのような抗体を用いるｐ２１ｒａｓ
腫瘍遺伝子に属する各メンバーの存在を測定するための
免疫定量法に関する。
本発明の第一の態様は、ヒトＤ２１ｒａｓ蛋白質のＣ末
端部分における可変領域から誘導される一連のポリベプ
チドプレパレーションに関する。
本発明のポリペプチドは、式 で示される特異的配列からなるポリペプチドおよびその
誘導体である。
配列■および■は、それぞれＤ２１ｒａｓＨ（１７１〜
１８つ）およびｐ２ｉ　ｒａｓＨ　　（１７０〜１８９
）ポリペプチドを示す。配列■はｐ２１ｒａｓＨ　　（
１７０〜１８６）のポリペブチに４Ａ ドである。配列■はｐ２１ｒａｓ　　　（１７１〜１８
６）のポリペプチドである。最後に、配列Ｖに４Ｂ はｐ２１ｒａｓ　　　（１７０〜１８５）ポリペプチド
である。
上に特定した配列は、本技術分野においてよく知られた
慣用のペプチド合成方法によって合成することができる
。このような方法には、溶液相合成および固相合成が包
含される。Ｒ３８゜Ｈｅｒｒｉｆｉｅｌｄによって開発
された方法論を応用したものである［Ｊ、静、　Ｃｈｅ
ｍ、　５ｏｃ１．１支、２１４９〜２１５４　（１９６
３）］。本発明のペプチドを合成するのに好ましい方法
は、合成すべきペプチドのカルボキシ末端アミノ酸を慣
用の固相合成樹脂に共有結合させ、これへのアミノ酸の
環状付加を用いる固相法である。この目的に適当な樹脂
は市販されていて、たとえば架橋ポリスチレン樹脂があ
る。現在では、所望のカルボキシ末端アミノ酸がすでに
樹脂に共有結合された市販品を入手できる。付加された
アミノ酸は慣用されている側鎖保護基で保ｉすることが
できる。この目的に適当な側鎖保：ｆ！基には、ベンジ
ル、ベンジルオキシカルボニル、クロロベンジル、ｐ−
クロロベンジルオキシカルボニルおＪ：びｐ　−＋−ル
エンスルホニルまたはジメヂルベンジルが包含される。
固相合成法の最終工程では、本技術分野においてよく知
られた方法、たとえば例１に記載の方法によって、保護
基を除去し、ペプチドを樹脂から遊離さける。
同様に、液相合成法を用いる場合も、保護基を慣用方法
により、たとえば１ｌｏｕｂｅｎ−Ｗｅｙｌ　　：“Ｈ
ｅｔｈｏｄｅｎ　ｄｅｒ　ｏｒｇａｎｉｓｃｈｃｎ　Ｃ
ｈｅｍｉｅ”、Ｘｖ巻、”５ｙｎｔｈｅｓｅ　ｖｏｎ　
Ｐｅｐｔｉｄｅｎ”に記載された方法で除去して、ペプ
チドが得られる。
このような方法で、先に定義したポリペプチド■〜Ｖが
製造でき、これは本発明の好ましいｉｍを構成する。
上述のポリペプチドは、抗体を製造するための免疫原と
して使用できる。
すなわち、本発明は他の態様として、抗体を誘発するた
めの免疫原性組成物およびその製造方法、ならびに上述
のヒトｐ２１ｒａｓポリペプチドの免疫定量法を提供す
る。
免疫原性組成物は、上述のポリペプチドそれぞれを慣用
の免疫原担体物質に共有結合させることにより容易に得
られる。「免疫原担体物質」の語は、宿主動物に独立し
て免疫原性応答を誘発する性質を有し、上述のポリペプ
チドの遊離カルボキシル、アミンもしくはヒドロキシル
基と免疫原担体物質の相当する基との間にペプチドもし
くはエステル結合を形成することにより直接または慣用
の二官能性連結基を介して結合することにより、上述の
ポリペプチドと共有結合できる物質を包含する。　本発
明のポリペプチドの免疫原担体物質への共有結合による
カップリングは、本技術分野においてよく知られた方法
で実施できる。たとえば、直接共有結合によりカップリ
ングさせる場合は、カルボジイミド、とくに好ましくは
ジシクロへキシルカルボジイミドまたは１−エチル−３
＝（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドをカ
ップリング剤として使用することかできる。
このような直接カップリングにおいては、この工程にわ
ずかに酸性の反応メジウム、たとえば約３から６．５の
範囲のｐＨ１とくに好ましくは約４から６．５の範囲の
Ｅ）Ｈを有するメジウムを使用するのが望ましい。
カップリングを行うのに適当な二官能性連結基としては
、Ｃジアルカナールたとえばグル２〜１ タールアルデヒドを挙げることができる。この別法の態
様におけるカップリングは、Ｓ、＾ｖｒａｍｅａｓ（Ｉ
ｉＩＩｌｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　　６．４３〜５
２　（１９６９）〕に記載の条件を用いて行うのが便利
である。
本発明のポリペプチドと免疫原担体物質とのカップリン
グに使用されるさらに他の好ましい試薬には、室温下、
水溶性溶媒たとえばＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミド（Ｄ
ＭＦ）中で使用できるｍ−マレイミドベンゾイルＮ−ヒ
ドロキシコハク酸イミド（ＭＢＳ）がある。免疫原担体
物質は適当なリン酸緩衝液中ｐＨ７，２で使用するのが
好ましい。
得られた免疫原性組成物は、さらに精製することなく、
または所望により本技術分野においてよく知られた方法
たとえば未反応ペプチドやカップリング試薬を除去する
ための透析、あるいは適当なカラム〔たとえばセファデ
ックス（５ｅｐｈａｄｅｘｏ）Ｇ−２５グルクロマトグ
ラフィー〕上刃ラムクロマトグラフィーを用いて精製し
たのち、使用される。
本発明の免疫原性組成物の製造に使用できる適当な担体
物質には、蛋白質、天然もしくは合成ポリマー化合物、
たとえばポリリジンもしくはアミノ酸共重合体のような
ポリペプチド；ポリサッカライド等が包含される。とく
に好ましい担体物質は蛋白質およびポリペプチドであり
、とくに蛋白質が好ましい。
本発明の免疫原性組成物の製造に使用される蛋白質は広
範囲の蛋白質から選択できる。適当な蛋白質の例として
は、咄乳類動物血清蛋白質たとえばヒトγ−グロブリン
、ヒト血清アルブミン°、ウシ血清アルブミン、メチル
化ウシ血清アルブミン、ウサギ血清アルブミン、ウシγ
−グロブリン、ウシサイログロブリンおよびウマγ−グ
ロブリン、または非浦乳類動物蛋白質たとえばヘモシア
ニンとくに好ましくは笠形具（ｋｅｙｈｏｌｅ　ｌｉｍ
ｐｅｐのヘモシアニンを挙げることができる。その他の
適当な蛋白質は本技術分野の熟練者には自明であろう。
本発明の免疫原性組成物は、これを宿主動物に、好まし
くはアジュバントを用いて注射することにより、宿主に
それぞれＨ−ｒａｓｌＮ−ｒａｓおよびに−ｒａｓＨ、
ｐ２１ｒａｓＮ、ｐ２１ｒａｓＫ４Ａ　　ｐ２１蛋白質
に特異的な抗体の生成の誘導に使用できる。長期にわた
って反復注射することにより、力価を改良することがで
きる。
この目的に適当な宿主動物には、ウサギ、モルモット、
ウマ、ヤギ、ラット、マウス、ウシ、ヒツジ等のような
哺乳類動物が包含される。生成した抗血清は、それぞれ
の腫瘍遺伝子蛋白質と選択的に複合体を形成する抗体を
含有する。このような血清はそれ自体、腫瘍遺伝子蛋白
質の測定に使用できるし、また所望により、抗体は本技
術分野でよく知られた方法たとえば硫酸アンモニウム沈
殿ついでゲルクロマトグラフィーを用いて濃縮すること
ができる。本発明の別の態様においては、指示されたｐ
２１　ｒａｓ腫瘍遺伝子蛋白質の検出に有用なモノクロ
ナール抗体を、本技術分野において利用される公知の方
法によって、たとえばＣ１Ｈｉｌｓｔｅｉｎ　＆　Ｇ、
にｏｈｌｅｒ　　（Ｎａｔｕｒｅ、　　２５６．４９５
〜４９７　（１９７５））の記載に従って得ることがで
きる。この場合、本発明の免疫原性組成物をマウスまた
はラットに注射する。ついで宿主動物を層殺し、その牌
臓から採取した細胞を骨髄腫細胞と融合する。得られた
ハイブリッド細胞（以下ハイブリドーマという）をｉｎ
　ＶｉｔｒＯで増殖させる。ハイブリドーマの集団をス
クリーニングに付し、それぞれ免疫原性組成物に使用し
た抗原ポリペプチドに対する単−抗体種を分泌する各ク
ローンを単離する。この方法で得られる各抗体種は、免
疫原物質上に認識される特異的抗原部位に応答して生じ
る、免疫処置動物からの単−Ｂ細胞の各生成物である。
この場合、ｐ２１蛋白質のサブ配列が用いられたので、
抗体はこのサブ配列を含む全Ｄ２１蛋白質にも特異性を
示すことが考えられる。
別のハイブリドーマ細胞系を次にスクリーニングし、所
望の抗原に対する抗体を生産するものを同定する。別の
ハイブリドーマ細胞系によって産生された抗体を好まし
くはスクリーニングに付し、ハイブリドーマ細胞の産生
に用いた免疫原性物質に対して最高の親和性および結合
活性を有するものを同定する。
本発明に従って製造されたポリクロナールまたはモノク
ロナール抗体は、任意の慣用の免疫定量法により、試験
サンプル中の各ｐ２１ｒａｓＨ、ｐ２１ｒａｓＮ、ｐ２
１ｒａｓＫ４Ａ蛋白質の存在の検出に使用できる。この
ような方法では、たとえば、測定すべきサンプルの既知
量、本発明の特異的抗体および標識Ｄ２１ｒａｓポリペ
プチドまたは蛋白質をたがいに混合し、放置する。
抗体−抗原複合体を結合しない試薬から本技術分野にお
いて公知の方法により、すなわち硫酸アンモニウム、ポ
リエチレングリコール、過剰のまたは不可性支持体に結
合した第二の抗体で処理して分離する。適当な不要性支
持体には、キナール（にｙｎａｒ■）、デキストラン被
覆炭素粒等のようなポリマーが包含される。標識ｒａｓ
ポリペプチドまたは蛋白質の濃度を結合相または非結合
相のいずれかで測定し、サンプルの特異性 ｐ２１ｒａｓ蛋白質含量は認められた標識成分のレベル
を標準曲線とそれ自体公知の方法によって比較し、定量
することができる。適当な標準曲線は、既知量のｐ２１
　ｒａｓ蛋白質を固定足の標識ｐ２１　ｒａｓ蛋白質お
よび本発明のｐ２１ｒａｓ特異性抗体と混合し、それぞ
れの既知量に対する結合の割合を定量することにより作
成することができる。本発明の抗体はｐ２１　ｒａｓ蛋
白質の各Ｈ，Ｎ、に４△およびＫＪＢ型を識別できるの
で、これらのｒａｓ腫１！遺伝子蛋白質の各型が混合し
て存在していても、それぞれを別個に定量できる。
特異的なｐ２１ｒａｓＨ、ｐ２１ｒａｓＮ、ｐ２１ｒａ
ｓＫ４Ａ腫瘍遺伝子蛋白質に対する２種の別個のモノク
ロナール抗体で、たがいにその抗原への結合を妨害しな
い抗体は、２部位免疫定■法操作に使用できる。適当な
均一および不拘−２部位免疫定吊法操作については、米
国特許第４．３７６．１１０号に記載されている。
本発明の実施に際して使用できるさらに他の免疫定量法
には、免疫プロット法（いわゆるウェスタン法）を用い
るものがある。この方法では、ｐ２１　ｒａｓＨ、ｐ２
１ｒａｓＮ、ｐ２１ｒａｓＫ４Ａ蛋白質を含むサンプル
を、ＳＤＳザンブル緩衝液（Ｌａｅｍｍｌｉ、　Ｕ、　
Ｋ、　：　Ｎａｔｕｒｅ、　　２２７　。
６８０〜６８５　（１９７０））と混合し、スルフヒド
リル還元剤として２−メルカプトエタノールの存在下ま
たは非存在下に煮沸し、ポリアクリルアミドゲル上電気
泳動に付す。蛋白質をトランスプロット（Ｔｒａｎｓｂ
ｌｏｔ　）装置を用い、Ｔｏｗｂ　ｉ　ｎら（Ｐｒｏｃ
、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　　
７６．４３５０〜４３５４　（１９７９））によって報
告された操作に従って電気泳動により、ニトロセルロー
スろ紙上に移す。緩衝化ウシ血清アルブミンとブレイン
キュベーションしたのち、ろ液を所望のヒトｐ２１　ｒ
ａｓポリペプチドに対する抗血清と一夜インキユベート
する。ついでろ液を洗浄し、続いてｒａｓ特異性抗体を
誘発させた動物種のＩＱＧに対する適当な標識抗血清と
インキュベートする。
この第二の抗体は任意の慣用の標識、たとえば放射性同
位元素または好ましくは酵素たとえばパーオキシダーゼ
でラベルできる。ろ液を再び洗浄し、オートラジオグラ
フィーに付すか、あるいは酵素に対する適当な基質たと
えばジアミノベンジジンと蛋白質バンドが認められるま
でインキュベートする。ヒトＩ）２１ｒａｓ蛋白質に対
する特異的抗体との着色バンドの不存在は試験サンプル
中におけるこのような蛋白質の不存在を示すものである
。
試験サンプル中にｒａｓ腫瘍遺伝子生成蛋白質が存在す
るか否かのみを知りたい場合は、特異的抗体の組合せを
使用することができる。一方、特定のｐ２１　ｒａｓ蛋
白質が存在するかを決定する場合には、各ｒａｓ蛋白質
に特異的な各抗体のパネルを各試験サンプルについて使
用することになる。
本発明の抗体はまた、不均一な゛サンドウィッチ″型定
量に使用することもできる。このような不均一定量法に
おいては、非標識抗体好ましくはモノクロナール抗体を
サンプルからの試験蛋白質物質の抽出に使用する。この
場合の抗体は免疫定量法に用いられる任意の慣用支持体
上に固定化される。このような支持体には、ろ紙、プラ
スチックビーズ、またはポリエチレン、ポリスチレン、
ポリプロピレンまたは他の適当な材料から製造された試
験チューブが包含される。この目的に有用なものとして
は、また、アガロース、架橋デキストランおよび他のポ
リサッカライドのような粒子状物質を挙げることができ
る。この場合の結合方法は本技術分野の熟練者にはよく
知られている。
たとえば抗体は米国特許第３，６４５．８５２号に記載
の方法を用いてポリサッカライドポリマーに結合させる
ことができる。
本発明に用いられる標識された特異的抗体は、本技術分
野において公知の免疫定量法に用いられるのと同じ標識
を付与することができる。たとえば、米国特許第３．９
４０．４７５号に記載されたような蛍光法で検出できる
蛍光原標識、米国特許第３，６５４．０９０号に記載さ
れたような酵素マーカーを挙げることができる。また、
たとえば　　Ｉのような放射標識で、たとえばＬＨｏＩ
ｔ　ｕ　ｎ　ｔ　ｅ　ｒおよびＦ、　Ｃ，Ｇｒｅｅｎｗ
ｏｏｄ　　［Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）　　、　　
　１９４．　　４９５　〜４９６　　　（１９６２）］
またはＧ、　Ｓ、　ＤａｖｉｄおよびＲ０八、　Ｒｅｉ
ｓｆｅｌｄ（ＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒＶ、　　１３．　
１０１４〜１０２１　（１９７４））の方法によってラ
ベルした抗体を用いることもできる。
典型的な不均一サンドウィッチ法においては、不溶性サ
ンドウィッチ複合体は会合した標識抗体の量を、適当な
方法による不溶性担体物質の検査によって決定する。し
かしながら、定量すべき液体サンプル中の試験蛋白質の
存否を、定量中に反応せず溶解型のままの標識抗体遺と
関係づけることも可能である。
本発明のさらに他の態様においては、本発明の抗体をそ
の特異的結合パートナ−である各Ｄ２１　ｒａｓ蛋白質
の抗体アフィニティークロマトグラフィー精製に使用す
ることができる。この目的では、抗体をマトリツスク上
にそれ自体公知の方法で、好ましくは適当な抗体アフイ
、ニテイークロマトグラフイーマトリックスたとえば架
橋アガロース（たとえばセファロース（５ｅｐｈａｒｏ
ｓｅ　０）４Ｂ、ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃ　ｉａ
　）から市販されている〕に共有結合させて固定化する
。抗体アフィニティークロマトグラフィーによるヒトｐ
２１　ｒａｓ蛋白質含有溶液の精製は、公知の任意の方
法に従い、バッチ法によりあるいは好ましくはカラム上
に配置したマトリックス固定化抗体を用いて実施できる
。
例１ Ｈ−ｒａｓＴ−２４腫Ｓ遺伝　でコードされるノナデカ
ペプチドｐ２１ｒａｓＨ　　（１７１〜１８９）の合成
） ＲＤ−２０シエイカーヘツドを付したＳ−５００型シエ
イカ−（にｒａｆｔ　Ａｐｐａｒａｔｕｓ、　Ｉｎｃ、
。
Ｈｉｎｎｅｏｌａ、　Ｎ、　Ｙ、）　ニ装着Ｌ／　タ直
立容ｉ　内ｒ、マニュアル法を用いて、固相ペプチド合
成を実施した。５ｅｒ（Ｂｚｌ）−１％架橋ポリスチレ
ン（２００〜４００メツシユ）樹脂（３，０９，０，２
１ミリモル／ｇ樹脂、０．６３ミリモル（８ＡＣＨＥＨ
，ｒｏｒｒａｎｃｅ、　ＣＡより購入〕を、予め形成し
た対称無水物法（Ｈｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、　Ｒ，Ｂ、、
前出）を用い、ｐ２１　ｒａｓＨ　（７）１８６から１
７１の配列に従って１８サイクルの固相ペプチド合成に
付した。α−アミノ基はｔ−ブチルオキシガルボニル基
で保護し、一方側鎖の基は、次のように保護した：Ａｓ
ｐ、Ｇｌｕ、Ｓｅｒ　（ベンジル）；Ｃｙｓ　（３，４
−ジメチルベンジル）二ＬｙＳ（２−クロロベンジルオ
キシカルボニルされたノナデカペプチド（ｐ２１ｒａｓ
”　　（１７１〜１８９）−樹脂４．４ｇ（０．６３ミ
リモル）が得られた。この保護されたペプチド−樹脂１
、０９を無水液体フッ化水素（ＨＦ）（１０％１、２−
エタンジチオール含有１　０ｄ）によりＯｏで１時間処
理し、蒸発させた（高真空、ＣａＯトラップ）。粗ペプ
チドと樹脂混合物を酢酸エチル（ＥｔＯＡｃ）と磨砕し
、トリフルオロ酸Ｍ　（ＴＦＡ）で抽出し、蒸発させ、
残留物をエーテルと磨砕し、乾燥した。粗生成物 （０．５１５ｇ）を蒸留水１０ｄに溶解し、ろ過し、ｌ
ａｔｍａｎ　Ｐａｒｔｉｓｉｌ■Ｍ．−２０　　０ＤＳ
−３カラム（２Ｘ５０ａ１１）上に負荷した゛。
カラムを（ハ）水（０．１％ＴＦＡ含有）および０アセ
トニトリル（０．１％ＴＦＡ含有）からなる溶媒系の但
）１０〜３５％直線勾配で１８０分溶出した。分画を集
め（２ｎｄ！／分画）、それぞれ一部をとって分析ｈｐ
ｌｃ系を用い分析した。分画６１〜６５に出現した生成
物を合し、蒸発させ、凍結乾燥すると純粋なノナデカペ
プチド ｐ２１ｒａｓＨ　（１７１〜１８９）が得られた。
収率：４２ａｙ（１５．２％）。この生成物は分析ｈｐ
ｌｃにより均一であることが明らさかにされ、期待され
たアミノ酸組成を与えた（６Ｎｊ！ｉ酸水溶液中、１１
０”、２４時間加水分解）：ＡＳｐ。
１、９８　：Ｓｅｒ．２．７１　；Ｇｌｕ．１．０３　
：Ｐｒｏ、３．１５；Ｇｌｙ．２．０８：Ｖａｌ。
１、０２：Ｌｅｕ，１．９３：Ｌｙｓ，１．１０。
Ｍｅｔ，０．９５；Ｃｙｓ，２．７４ λユ Ｈ−ｒａｓＴ−２４腫瘍遺伝　でコー゛されるエイコサ
ベブチ＾ｌｒａｓ”　　（１７０　〜１８９）の合成 例１で得られた保護ノナデカペプチド （ｐ２１　ｒａｓ”　　（１　７　１　〜１　８９））
樹脂２、１　７ｇ（０．３１０ミリモル）をＮ　−８ｏ
ｃ−Ｎ−２−クロロ−ベンジルオキシカルボニル− に付した。生成物１ｇ（０．１４３ミリモル）をとり、
液体ＨＦ（例１と同様にしＣ）により保護基を除去した
。収ｆｆｉ：５２５．６Ｒｇ。粗生成物をｈｐｌｃ精製
に付しく例１と同様にして）、エイコサペプチドｐ２１
ｒａｓＨ、ｐ２１ｒａｓＮ、ｐ２１ｒａｓＫ４ＡＨ　（
１７０〜１８９）２４、４＃１９（収率：８、３％）を
得た。
生成物は分析ｈｐｌｃによ・り均一であって、期待され
たアミノ酸組成を与えた（１％チオグリコール酸（ＴＧ
Ａ）含有６Ｎ塩酸水溶液中、１５０°で１時間加水分解
）：ＡＳｐ，１．９０：Ｓｅｒ，２．３０：ＧＩｕ，１
．０９、Ｐｒｏ。
２、８１　；Ｇｌｙ．２．ＯＯ：Ｖａｌ，０．９４：Ｌ
ｅｕ，１．８０　：Ｍ’ｅｔ，１．０２　：　Ｌｙｓ。
１、９７：（、ＶＳ．２．７１ 県 ８６）の合成 ＣＶＳ　（ＤＭＢ）−１％架橋ポリスチレン樹脂（２，
０ｇ：０．４８ミリモル／ｇ樹脂；０．９６ミリモル）
をｐ２１　ｒａｓＮの配列１８５から１７０の順に１６
サイクルの固相ペプチド合成に付した。得られた保護ペ
プチド樹脂の一部（１ｇ；０．２６ミリモル）をとり、
無水液体ＨＦで処理した（例１と同様にして）。収量＝
３８５ＩＩ！ｇ。粗ペプチドを例１と同様にｈｒｐｃｙ
ｉｔａに付した。勾配時間：１５０分、所望の生成物は
分画５０〜５１に出現した。これらの分画を合し、蒸発
させ、凍結乾燥した。収ａ：　２０Ｒｇ（４，４％）。
得られたヘブタデ力ペブチード ｐ２１ｒａｓＨ　　（１７０〜１８６）は分析ｈ　ｌ　
ｐｃで均一であることが明からにされた。アミノ酸組成
（６Ｎ塩酸水溶液／１％ＴＧＡ中、１５０’で１時間加
水分解）：ＡＳｐ、２．００：Ｔｈｒ、１．０８：Ｓｅ
ｒ、１．６５：Ｇｌｕ。
２．０６、Ｐｒｏ、１．０９：Ｇｌｙ、３．００：Ｍｅ
ｔ、１．０２：Ｌｅｕ、１．９９：ＬＶｓ。
ｉ、ｏｏ；ｃｙｓ　＜エルマン試験）、２．０５例４ に−ｒａｓＴ−２４８８１１伝子（ｅｘｏｎ　　ＵＶａ
　）Ｃｙｓ　（ＤＭＢ）−１％架橋ポリスチレン樹脂（
２，０！７　：０．４８ミリモル／ｇ−樹脂；ＫＡ ０．９６ミリモル）をｐ２ｉ　ｒａ５　　　の１８５位
から１７１位の順に１５サイクルの固相ペプチド合成に
付し、ＴＦＡで処理し、乾燥して、側鎖保護ペプチド樹
脂６．５２ｇ（湿重聞）を得た。
その一部（１ｇ：０．１４７ミリモル）を１−ＩＦで分
解しく例１と同様に）、後処理すると粗へキサに４八 デカペプチドｐ２１ｒａｓ　　　（１７１〜１８６）３
７４．６ｆｒｔｇが得られた。粗物質をｈｐｌｃＭ製に
付した（例１と同様：勾配：５〜３０％（［３）／１８
０分）。分画４３〜４９に溶出した生成物を集め、蒸発
させ、凍結乾燥した。収量：へキサデカベブに４Ａ ヂドｐ２１ｒａｓ　　　（１７１〜１８６）１０１＃Ｉ
ｙ（３８，４％）。この生成物は分析ｈｐｌｃで均一と
判定された。アミノ酸組成（６Ｎ塩酸水溶液／４％ＴＧ
Ａ、１５０’、１時間加水分解）：丁ｈｒ、０．９９＋
Ｓｅｒ、０．８７：Ｇｌｕ。
２．０７　　：Ｐｒｏ、　　１．０３　　：Ｇ　　ｌ　
　ｙ、　　１．０７　　：Ｖａｌ、０．９７：Ｉｌｅ、
　　１．８９：Ｌｙｓ。
５．１０．ＣＶＳ　（システィン酸として）。
１．７２；Ｃｙｓ（エルマン試験、１．９６）λ二 ＣＶＳ　（ＤＭＢ）−１％架橋ポリスチレン樹脂（２，
（１：ｏ、４８ミリモル／ｇ〜樹脂；４にＢ ０．９６ミリモル）をｐ２１ｒａｓ　　　の１８４位か
ら１７０位の順に１５サイクルの固相ペプチド合成に付
し、ＴＦＡで処理し、乾燥して、側鎖保護ペプチド樹脂
４．７１７を得た。その１ｇ（０，２０ミリモル）をと
り、無水ＨＦで分解しく例２とＴＥ１様にして）、後処
理すると、粗へキサに４Ｂ デカペプチドｐ２１ｒａｓ　　　（１７０〜１８５）３
００．５１１１９が得られた。粗物質をｈｐｌｃ精製〔
例１と同様にして、勾配＝５〜２０％（へ）／１５０分
〕に付し、生成物を含む分画く２０〜３０）を合し、蒸
発させ、凍結乾燥した。収は：へキサデカベプに４Ｂ チドｐ２１ｒａｓ　　　（１７０〜１８５）６４Ｉｔｇ
（１７，３％）。生成物は分析ｈｐｌｃで均一であるこ
とが明らかにされた。アミノ酸組成（６Ｎ塩酸水［ｉ／
１％ＴＧＡ中、１５０°、１時１１加水分解）：Ａｓｐ
、０．９９　：　ｌ”ｈｒ、１．０２　：Ｓｅｒ、１．
８３　；Ｃｙｓ　（システィン酸として）、０．８８；
Ｇｌｙ、０．９９　；Ｍｅｔ。
１．０５：Ｌｙｓ、９．３３．Ｃｙｓ　（エルマン）、
１．０４ 例６ キーホール・リンペット（ｋｅｙｈｏｌｅ　ｆｉｎａｌ
）のヘモシアニン（ＫＬＨ）（１６１１１９，５０％グ
リセロール溶液中）を、Ｎａ２８ＰＯ４（８ＩＩＩＨ）
。
ＫＣｊ！　（１，６ｍＭ）　、ＮａＣｊ！　（１４０ｍ
Ｈ）およびＫＨ２ＰＯ４（１，１ｎ＋８）各０．３−で
調製した緩衝溶液（ｐｔ１７．２　；　１．２ｄ）に加
え、室温で電磁攪拌器によって攪拌した。ｍ〜マレイミ
ドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＭＢＳ
）のＤＭＦ　（０，６ｍ）溶液を徐々に加え（滴加）、
わずかに白濁した反応混合物を室温で３０分間攪拌した
。反応生成物、ＫＬＨ−ＭＢを、予め０．０５Ｍリン酸
±トリウム緩衝液（ｐ１１６、Ｏ）で平衡化したセファ
デックスＧ−２５カラム（１，２Ｘ５０ＣＩｌンに通し
た。カラムを同じ緩衝液で溶出しく流速＝１ｄ／分）、
各分画を集めた。ＫＬＨ−ＭＢ複合体を含有する分画（
２０〜４４）を合した（２０雇：波長λ−２８０ｎｍに
おいて１０．３００単位）。ＫＬＨ−Ｍｅ生成物の一部
（５−１２，０６０Ｄ）をとり、０．０５Ｍリン酸す［
−リウム緩衝液２ｄに溶解したノナデカペプチドｐ２１
ｒａｓＨ　　（１７’１〜１８９）５〜と反応させた。
ｐＨをｌＮＮａＯＨで７〜７．５に調整し、反応混合物
を室温ｔ−３時間攪拌した。この溶液をリン酸緩衝食塩
溶液（ｐＨ７゜２）に対して、頻回に交換しながら４０
時間透析し、ついで凍結乾燥した。免疫原付組成物（リ
ン酸緩衝食塩含有）３７〜が得られた。
〔 ノナデカペプチドＩ）２１　ｒａｓ”　　（１７１〜１
ウシ勺イログロプゾロ（６，６９ｑ、１０ナノモル）を
０．ＩＭ　　ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ７，２，１０−に溶
解し、ノナデカペプチド ｐ２１ｒａｓ”　　（１７１〜１８９）９．８ｍ１（５
マイクロモル）を加えた。全ペプチドが溶消したのら、
グルタルアルデヒドの溶液（シグマ（Ｓｉｇｍａ　）　
、　Ｉ級、２５％水溶液）０．２ｄを加え、反応混合物
を２５°で２時間継続的に攪拌した。混合物をＯ，ＯＯ
ＩＭ　　ＮａＨＰＯ４緩衝液（ｐＨ７，２）に対して十
分透析し、凍結乾燥した。免疫原付組成物（リン酸塩含
有）の収量は１７■であった。
絆１ 上述のように固相法で合成したｐ２１ｒａｓ”、に ｐ２１　ｒａｓ　　およびｐ２１ｒａｓＨ、ｐ２１ｒａ
ｓＮ、ｐ２１ｒａｓＫ４ＡＮのカーレボキシル末端に相
当するペプチドを、例７に記載のグルタルアルデヒド法
によってウシサイログロブリンに、または例６に記載し
たＭＢＳ法（Ｌｉｕ、　Ｆ、　−■、ほか：　Ｂｉｏｃ
ｈｅｍｉｓｔｒｙ、±８，６９０〜６９７（１９７９）
）によってキーホルトリンペットのヘモシアニンにカッ
プリングさせた。抱合体を凍結乾燥し、使用前にリン酸
緩！！食塩溶液（２０ｍＮリン酸ナトリウム、ｐＨ７，
４，０，１５ＭＮａＧりゴばあたり抱合体３Ｉ！ｔｇの
濃度に再懸濁した。
抱合体は１ｑあたり、５５０〜６０６μりのペプチドを
含有した。
Ｂａ１ｂ／ＣマウスおよびＬｅｗ　ｉ　ｓラットを以下
のスケジュールに従って免疫処置した。
免疫処置プロトコール ８００．２ｑ抱合体 （１：１〕ロインド完全アジュバント混合） 腹腔内注射（ｉ、ｐ、） 週８２回目の免疫処置（ブースター） ０．２ｍｇ抱合体 （１：１７０インド完全アジュバント混合） ｉ、ｐ注射 週１１　採血 Ｄ２７　３回目の免疫処置（ブースター）０．１巧抱合
体 （１：１７０インド完全アジュバント混合） １、ｐ、注射 週３０　採血 動物は指示した時点で採血し、血中の抗−ｐ２１ｒａｓ
抗体の力価を測定した。力価および抗血清の特異性は直
接結合ＥＬＩＳＡおよび免疫ブロワ［−法（いわゆるウ
ェスタンプロット解析法）によって定量した。結果を第
１表および第２表に示す。
例９ 抗ペプチド血清およびＹ１３−２５９　（陽性コントロ
ールとして用いた広い特異性をもつｒａｓモノクロナー
ル抗体）とｒａｓ蛋白質との免疫プロッティングを、そ
れぞれ高レベルのｒａｓ遺伝子を発現する一連の細胞系
から調製した溶解物に対して実施した。標識していない
、対数生育期の細Ｉｌｌ、１　％　（ｖ／ｖ　）　Ｔｒ
ｉｔｏｎＯＸ　−１００，０，５％（Ｗ／ｌデオキシコ
ール酸ナトリウムおよび２ｍＨフェニルメチルスルホニ
ルフルオライライ有ＴＮＥ−ＭＷＪ液（２０＋１１）Ｉ
　Ｔｒｉｓ　−ＨＣｌ　。
１００ｍＨＮａＣ１，１ｎ＋ＨＥＤＴＡ、ｐｈ７．４）
中４℃で１０分間インキュベートして溶解した。
サンプルを１００．ｏｏｏｘｇで３０分間遠心分離し、
上清を集め、−８０℃に操作した。蛋白質の相対濃度を
、ＢｉｏＲａｄ定吊キットにより、標準としてウシ血清
アルブミン（ＢＳＡ）を用いて比色法で測定した。１ｍ
蛋白質０．０５４Ｉ９を含む溶解物の一部を、スルフヒ
ドリル還元試薬として２−メルカプトエタノールを用い
または用いないで等量の２ＸＳＤＳサンプル緩衝液と混
合し、３分間煮沸し、１２％ポリアクリルアミドゲル上
電気泳動に付した。蛋白質は、Ｈ，Ｔｏｗｂｉｎら（前
出）の記載にほぼ従いＴｒａｎｓｂｌｏｔ装置を用いて
ニトロセルロースろ紙（０，２２ミクロン孔）に電気泳
動で移した。ＴＮＥ緩１液中３％ＢＳＡと４℃で３時間
ブレインキュベーションしたのち、ろ紙を、モノクロナ
ール抗体Ｙ１３−２５９　（１０μｇ／Ｉｔ！ｌりとま
たは３％ＢＳへ含有ＴＮＥ緩衝液で１：１０に希釈した
抗ペプチド血清と一部インキユベートした。ろ紙を洗浄
し、続いて１　：２，０００に希釈したラットＩｇＧに
対する抗血清、およびヒツジで調製しくベーリンガーー
マンハイム）、１：８００に希釈した、ウサギＩｇＧに
対するバーオキダーゼ抱合、アフィニティー精製抗体と
、２時間インキュベートした。ろ紙を洗浄し、褐色の蛋
白質バンドが観察されるまでジアミノベンジジン基質と
インキュベートした。
広い特異性を有するモノクロナール抗体、Ｙ−１３−２
５９は、試験したすべてのｒａｓ蛋白質と反応する。ヒ
トＤ２１ｒａｓＨ、ｐ２１ｒａｓＮ、ｐ２１ｒａｓＫ４
Ａ”に対するラット抗血清はＨｓＭＳＶのｖ−ｒａｓ遺
伝子およびヒトｐ２１ｒａｓＨによってコードされるｐ
２１と反応するが、ＫｉＭＳＶのｖ−ｒａｓに遺伝子、
に ヒトｌ）２１　ｒａｓ　　またはヒトｐ２ｉｒａｓＮに
よってコードされるＤ２１とは反応しない。
に４Ｂ ｒａｓ　　　Ｃ末端ペプチドに対する＠歯頚抗血清との
免疫プロッティングの結果は、きわめて高レベルのｒａ
ｓＫ蛋白質を発現する＠菌類造血細胞系４１６Ｂからの
変性および還元１）２１　ｒａｓがこの血清と反応する
ことを示している。４１６Ｂ細胞中に発現されるｒａｓ
Ｈ、ｐ２１ｒａｓＮ、ｐ２１ｒａｓＫ４ＡＫ蛋白質は、
４Ａおよび４Ｂ型の混合物であると思われる。
に４Ｂ ｒａｓ　　　Ｃ末端ペプチドに対するＩ＠ｉ歯類抗血消
はヒトｒａｓＫ蛋白質と反応するが、ＫｉＭＳＶによっ
てコードされるＤ２１　ｒａｓとの反応は検知できない
。この抗血清はｒａｓＨおよびｒａｓＮによってコード
されるｐ２１蛋白質とは反応しない。

Claims (33)

    【特許請求の範囲】
  1. （１）式 【アミノ酸配列があります】（ I ） 【アミノ酸配列があります】（II） 【アミノ酸配列があります】（III） 【アミノ酸配列があります】（IV） 【アミノ酸配列があります】（Ｖ） からなる群から選ばれるポリペプチドおよびその誘導体
  2. （２）側鎖およびＮ末端は保護された型で、カルボキシ
    末端はポリスチレン固相合成樹脂に共有結合している特
    許請求の範囲第１項記載のポリペプチド誘導体
  3. （３）免疫原性担体物質に共有結合した特許請求の範囲
    第１項記載のポリペプチドからなり、宿主のｐ２１ｒａ
    ｓポリペプチドまたは蛋白質に特異的な抗体の生成を誘
    発するのに適当な免疫原性組成物
  4. （４）ヒトｐ２１ｒａｓ＾Ｈポリペプチドに選択性を示
    し、ヒトｐ２１ｒａｓ＾Ｎ、ｐ２１ｒａｓ＾Ｋ＾４＾Ａ
    およびｐ２１ｒａｓ＾Ｋ＾４＾Ｂポリペプチドとは交差
    反応性を示さない抗体
  5. （５）式 【アミノ酸配列があります】 で示される配列を有するポリペプチドからなる特許請求
    の範囲第３項記載の免疫原性組成物によつて誘発される
    特許請求の範囲第４項記載の抗体
  6. （６）式 【アミノ酸配列があります】 で示される配列を有するポリペプチドからなる特許請求
    の範囲第３項記載の免疫原性組成物によつて誘発される
    特許請求の範囲第４項記載の抗体
  7. （７）ヒトｐ２１ｒａｓ＾Ｎポリペプチドに選択性を示
    し、ヒトｐ２１ｒａｓ＾Ｈ、ｐ２１ｒａｓおよびｐ２１
    ｒａｓ＾Ｋ＾４＾Ｂポリペプチドとは交差反応性を示さ
    ない抗体
  8. （８）式 【アミノ酸配列があります】 で示される配列を有するポリペプチドからなる特許請求
    の範囲第３項記載の免疫原性組成物によつて誘発される
    特許請求の範囲第４項記載の抗体
  9. （９）ヒトｐ２１ｒａｓ＾Ｋ＾４＾Ａポリペプチドに選
    択性を示し、ヒトｐ２１ｒａｓ＾Ｈ、ｐ２１ｒａｓ＾Ｎ
    およびｐ２１ｒａｓ＾Ｋ＾４＾Ｂポリペプチドとは交差
    反応性を示さない抗体
  10. （１０）式 【アミノ酸配列があります】 で示される配列を有するポリペプチドからなる特許請求
    の範囲第３項記載の免疫原性組成物によつて誘発される
    特許請求の範囲第４項記載の抗体
  11. （１１）ヒトｐ２１ｒａｓ＾Ｋ＾４＾Ｂポリペプチドに
    選択性を示し、ヒトｐ２１ｒａｓ＾Ｈ、ｐ２１ｒａｓ＾
    Ｎおよびｐ２１ｒａｓ＾Ｋ＾４＾Ａポリペプチドとは交
    差反応性を示さない抗体
  12. （１２）式 【アミノ酸配列があります】 で示される配列を有するポリペプチドからなる特許請求
    の範囲第３項記載の免疫原性組成物によつて誘発される
    特許請求の範囲第４項記載の抗体
  13. （１３）モノクロナール抗体である特許請求の範囲第４
    項から第１２項までのいずれか一つに記載の抗体
  14. （１４）慣用のポリペプチド合成法を使用する特許請求
    の範囲第１項記載のポリペプチドの製造方法
  15. （１５）固相合成法を用いる特許請求の範囲第１４項記
    載の製造方法
  16. （１６）特許請求の範囲第１項記載のポリペプチドを免
    疫原性担体物質と直接共有結合させる特許請求の範囲第
    ３項記載の免疫原性組成物の製造方法
  17. （１７）特許請求の範囲第１項記載のポリペプチドを免
    疫原性担体物質と、慣用の二官能性連結基を介してカッ
    プリングさせる特許請求の範囲第３項記載の免疫原性組
    成物の製造方法
  18. （１８）特許請求の範囲第３項記載の免疫原性組成物を
    、免疫原性組成物のｒａｓポリペプチドに対する免疫応
    答を誘発できる宿主に注射する特許請求の範囲第４項か
    ら第１２項までのいずれか一つに記載の抗体の製造方法
  19. （１９）定量すべきヒトｐ２１ｒａｓ蛋白質に選択性を
    示し、他のヒトｐ２１ｒａｓ蛋白質とは交差反応性を示
    さない抗体を用いることを特徴とする、ｐ２１ｒａｓ＾
    Ｈ、ｐ２１ｒａｓ＾Ｎ、ｐ２１ｒａｓ＾Ｋ＾４＾Ａおよ
    びｐ２１ｒａｓ＾Ｋ＾４＾Ｂからなる群より選ばれる試
    験サンプル中のヒトｐ２１ｒａｓ蛋白質の２種またはそ
    れ以上の組合せの免疫定量方法
  20. （２０）定量すべきヒトｐ２１ｒａｓ蛋白質に選択性を
    示し、他のヒトｐ２１ｒａｓ蛋白質とは交差反応性を示
    さない抗体を用いることを特徴とする、ｐ２１ｒａｓ＾
    Ｈ、ｐ２１ｒａｓ＾Ｎ、Ｐ２１ｒａｓ＾Ｋ＾４＾Ａおよ
    びｐ２１ｒａｓ＾Ｋ＾４＾Ｂからなる群より選ばれる試
    験サンプル中のヒトｐ２１ｒａｓ蛋白質の免疫定量方法
  21. （２１）不均一定量法による特許請求の範囲第２０項記
    載の免疫定量方法
  22. （２２）定量すべき試験サンプル中のヒトｐ２１ｒａｓ
    蛋白質と選択性抗体の間に形成される免疫複合体の存在
    を、標識された第二の抗体とこの免疫複合体の接触によ
    つて測定することを特徴とする免疫プロット法を用いる
    特許請求の範囲第２１項記載の免疫定量方法
  23. （２３）第二の抗体は酵素で標識され、この酵素によつ
    て非着色状態から着色状態に変換されるこの酵素の基質
    を添加する特許請求の範囲第２２項記載の免疫定量方法
  24. （２４）均一定量法による特許請求の範囲第２０項記載
    の免疫定量方法
  25. （２５）定量すべきヒトｐ２１ｒａｓ蛋白質に相当する
    標識ヒトｐ２１ｒａｓ蛋白質またはそのカルボキシ末端
    フラグメントの既知量を用いる競争阻害法による特許請
    求の範囲第２４項記載の免疫定量方法
  26. （２６）精製すべきヒトｐ２１ｒａｓ蛋白質に選択性を
    示し、他のヒトｐ２１ｒａｓ蛋白質とは交差反応性を示
    さない抗体をアフイニテイークロマトグラフイーマトリ
    ツクスに結合させて使用することを特徴とするＰ２１ｒ
    ａｓ＾Ｈ、ｐ２１ｒａｓ＾Ｎ、ｐ２１ｒａｓ＾Ｋ＾４＾
    Ａおよびｐ２１ｒａｓ＾Ｋ＾４＾Ｂからなる群より選ば
    れる特異的ヒトｐ２１ｒａｓ蛋白質の精製方法
  27. （２７）特許請求の範囲第３項記載の免疫原性組成物の
    、宿主に免疫応答を誘発するための使用
  28. （２８）特許請求の範囲第４項から第１３項までのいず
    れか一つに記載の抗体の、免疫定量法への使用
  29. （２９）特許請求の範囲第４項から第１３項までのいず
    れか一つに記載の抗体の、ヒトｐ２１ｒａｓ蛋白質およ
    び特許請求の範囲第１項記載のアミノ酸配列からなるポ
    リペプチドの精製のための使用
  30. （３０）特異的ヒトｐ２１ｒａｓ蛋白質および特許請求
    の範囲第１項記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド
    の、特許請求の範囲第１９項から第２５項までのいずれ
    か一つに記載の免疫定量法への使用
  31. （３１）宿主に免疫応答を誘発するのに適当な特許請求
    の範囲第３項記載の免疫原性組成物
  32. （３２）ヒトｐ２１ｒａｓ蛋白質の免疫定量法に使用す
    るのに適当な特許請求の範囲第４項から第１３項までの
    いずれか一つに記載の抗体
  33. （３３）以上の特許請求の範囲各項に記載された発明
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