JPS6374492A - モノクロ−ナル抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、Ｋｉ−ｒａｓ発癌遺伝子産物に対するモノク
ローナル抗体、該抗体を生産するノ１イブリドーマおよ
び該抗体を用いる癌の検出方法に関する。従って、本発
明は癌の臨床診断分野において利用される。

従来技術 細胞の癌化における遺伝子の役割が注目されている。癌
遺伝子としては、ｒａｓ遺伝子やｍｙｃ遺伝子などが知
られており、これらの遺伝子に支配される産物をマーカ
ーとして癌を検出しようとする試みがなされている。

ｒａｓ遺伝子産物に関しては、これに対するモノクロー
ナル抗体を用いて癌の検出を行う方法が知られている。

ｒａｓ遺伝子にはＨａ−ｒａｓ。

Ｋｉ−ｒａｓ、Ｎ−ｒａｓなどの種類があり、これらｒ
ａｓ遺伝子に支配される産物は分子量２１．０００の蛋
白質で、それぞれＨａ−ｐ２１゜Ｋｉ−ｐ２１．Ｎ−ｐ
２１　（総称してｐ２１という）として示される。

ｐ２１に対するモノクローナル抗体としては、１ａｒｖ
ｅｙのマウス肉腫ウィルスによってトランスフオームし
たラット腎由来のＮＲＫ　（正常ラット腎臓）細胞を抗
原として作製されたｐ２１に対するラットモノクローナ
ル抗体［Ｊ、　Ｖｉｒｏ１４３、２９４−３０４　（１
９８２））　、　　Ｈａ　−ｒ　ａ　ｓのＮ末端から１
０番目〜１７番目の合成ペプチドを抗原として作製され
たマウスモノクローナル抗体（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、
　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、、　ＩＪｓ＾、　　８１．５２
２７−５２３１　（１９８４）　〕などが知られている
。

Ｎ−ｒａＳおよびに−ｒａｓを抗原とするモノクローナ
ル抗体の例は知られていない。

発明が解決しようとする問題点 従来知られている）（ａ−ｒａｓの遺伝子産物に反応す
るモノクローナル抗体を癌の診断に使用する試みがなさ
れているが、適用できる癌の範囲は限られており、適用
範囲拡大の意味からもさらに優れたモノクローナル抗体
の開発が望まれている。たとえば）（ａ−ｒａｓの抗体
を用いる免疫組織学的検出で、ヒト結腸癌、乳癌。

前立腺癌、胃癌に陽性のものは知られている。

問題点を解決するための手段 本発明者は、Ｋｉ−ｒａｓ遺伝子産物で免疫されたマウ
スの肺臓細胞とマウスミエローマ細胞との融合細胞（ハ
イブリドーマ）が生産するモノクローナル抗体が、種々
の癌細胞と反応し癌の診断に利用できることを見出した
。該モノクローナル抗体はとくにヒト甲状腺癌に対して
反応性を有しているが、ヒト甲状腺癌に対して有効なモ
ノクローナル抗体は現在まで知られておらず、癌診断上
非常に有用である。

以下、本発明のモノクローナル抗体、その製造法ならび
にそれらを用いる癌の検出方法について詳細に説明する
。

本発明は、Ｋｉ−ｒａｓ遺伝子産物に反応するモノクロ
ーナル抗体を提供する。本発明のモノクローナル抗体は
、Ｋｉ−ｒａｓ遺伝子産物を用いてマウスを免疫し、得
られる肺臓細胞とマウスミエローマ細胞とを融合させ、
得られる融合細胞（ハイブリドーマ）からＫｉ−ｒａｓ
遺伝子産物に反応する細胞を選択し、該細胞を培養する
ことにより製造することができる。

このハイブリドーマ製造に際しては、Ｋｏ°旧ｅｒとＭ
ｉｌｓｔｅｉｎの方法［Ｎａｔｕｒｅ　　２５６．４９
５−４９７（１９７５））を改良した加藤らの方法［Ｇ
ＡＮＮ　　７６゜５２４−５３１　（１９８５））に従
って行う。

Ｋｉ−ｒａｓ遺伝子産物としては、１（ｉｒｓｔｅｉｎ
肉腫ウィルス由来のＫ　ｉ　−ｒ　’ａ　ｓ癌遺伝子を
使って工注らの組換えＤＮＡ技法〔バイオケミカル・ア
ンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーショ
ン（Ｂｉｏｃｈ、Ｂｉｏｐｈｙ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍ
、）。

皿１２６−１３３　（１９８５）　）に従って製造した
に１−ｐ２１が好適に用いられるが、他の方法で得られ
るＫｉ−ｒａｓ遺伝子産物も用いることができる。

免疫用マウスとしては、ＢＡＬＢ／Ｃ系マウス、ＢＡＬ
Ｂ／ｃ系マウスと他系マウスとのＦ１マウスなどが用い
られる。

免疫はマウス１匹（６〜８週令、２０〜３０ｇ）に対し
て蛋白５０〜２００尾を用いて２〜３週間ごとに３〜６
回行う、マウスの飼育および肺細胞の採取は常法に従う
。

ミエローマ細胞としては、ＭＯＰＣ−２１ＮＳ／　Ｉ　
ＣＮａｔｕｒｅ、　２５６．４９５−４９７　（１９７
５）　：］、ＳＰ　２／　Ｏ−Ａｇ　１４　’［Ｎａｔ
ｕｒｅ、　２７７、１３１−１３３（１９７９））　、
Ｓ　１９４１５．　ＸＸＯ，ＢＵ、１（Ｊ、ＥＸＩＩ、
　Ｍｅｄ、、　１４８．３１３−３２８　（ｉ９７Ｂ）
　：ｌなどが用いられる。肺細胞とミエローマ細胞は１
対１〜１０対１の割合で混合し、融合は、ＮａＣｊ２（
約０．８５％）、ジメチルスルホキシド〔１０〜２０％
（Ｖ／Ｖ）　）および分子量１．０００〜６．　Ｏ００
のポリエチレングリコールを含むリン酸緩衝液（ｐ　Ｈ
７，２〜７．４）中で行う。

融合は両細胞の混合物を３５〜３７℃で１〜３分間イン
キュベートすることによって行う。

融合細胞（ハイブリドーマ）の選択は、ヒポキサンチン
（１，３〜１．４ｍｇ／Ｊ）　、アミノブチリ７　（１
８〜２０Ｉｔｇ／ａ＞　、　ｆミジ７（３７５〜４．０
００■／＃）　、ストレプトマイシン（５０〜１００ｘ
／ｍｌ）　、ペニシリン（５０〜１００単位／？ｌ１１
）、グルタミン（３，５〜４．０ｇ／Ａ）。

牛胎児血清（１０〜２０％）を含む基礎培地を用い、生
育してくる細胞として選択する。

基礎培地としては、動物細胞の培養に一般に使用されて
いるＲＰＭ　Ｉ　１６４０培地、ＥａｇｌｅのＭＥＭ培
地などが用いられる。

融合細胞（ハイブリドーマ）のクローン化は限界希釈法
にて少なくとも３回繰り返して行う。

ハイブリドーマを通常の動物細胞の培養と同様にして培
養すれば、培地中に本発明の抗体が生育される。例えば
２〜５×１０６のハイブリドーマ細胞をストレプトマイ
シン（５０〜１００Ｒ／ｍｌ）、ペニシリン（５０〜１
００単位／＋＋＋１）。

グルタミン（３，５〜４．０　ｇ　／〜Ｉｌ）、牛胎児
血清（１０〜２０％）を含むＲＰＭ１１６４０培地１０
〜２０ｍ１を用い、フラスコ内で５％Ｇ　Ｏ２存在下、
３５〜３７℃、３〜７日間培養することによって培養液
中に抗体が分泌、蓄積される。

またバイプリドーマ細胞をプリスタン（Ｐｒｉｓｔａｎ
ｅ）処理のヌードマウスまたはＢＡＬＢ／Ｃマウスの腹
腔内に移植して増殖することにより腹水中に本発明の抗
体を蓄積させることができる。すなわち、これらのマウ
ス腹腔内にプリスタン（Ｐｒｉｓｔａｎｅ、　２．５．
　ＩＱ、　１４　ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ　ｐｅｎｔａ
ｄｅｃａｎｅ。

米国アルドリッチ社製）０．５〜１ｍｌを注射し、その
後２〜３週目に腹腔に５Ｘ１０６〜ｌ０Ｘ１０６個のハ
イブリドーマ細胞を移植する。通常７〜１０日後に腹水
が蓄積し、これを採取する。

培養物および腹水中のモノクローナル抗体はアフィゲル
プロティンＡ　　ＭＡＰＳ−ＩＩキット（日本バイオラ
ッドラボラトリ−社）を用いるアフィニティクロマトグ
ラフィーにて採取する。

かくして得られるモノクローナル抗体としては、ＲＡＳ
Ｋ−１，ＲＡＳＫ−２，ＲＡＳＫ−３右よびＲＡＳＫ−
４と命名したものが具体例としてあげられる。これらは
、下記のごとき理化学的および生物学的性質で特徴づけ
られる。

本発明のこれらモノクローナル抗体を生産するハイブリ
ドーマは１９８６年９月１１日イ寸で、英国のＢｕｒａ
ｐｅａｎ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ａｎｉｍａｌ
　Ｃｅ１ｌＣｕｌｔｕｒｅｓに、ＥＣＡＣＣ８６０９１
１０１゜８６０９１１０２．８６０９１１０３゜８６０
９１１’０４としてそれぞれ寄託されている。

本発明モノクローナル抗体の生物学的活性は実施例２〜
７に示された如くである。実施例中に示された間接蛍光
抗体法（Ｉｎｄｉｒｅｃｔｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓ
ｃｅｎｃｅ　ａｓｓａｙ　；　Ｉ　Ｆ法）、酵素抗体固
相法（Ｅｎｚｙｍｅ　１ｉｎｋｅｃｌ　ｉｍｍｕｎｏｓ
ｏｒｂｅｎｔ　ａｓｓａｙ；　ＥＬ　Ｉ　ＳＡ法）、イ
ムノブロッティング法（Ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔｔｉｎｇ
）　、アビジン−ビオチン複合体酵素抗体法（Ａｖｉｄ
ｉｎ−Ｂｉｏｔｉｎ　ｃｏｍｐｌｅｘ　ｅｎｚｙｍｅｉ
ｍｍｕｎｏａｓｓａｙ　；　ＡＢＣ法）は以下の如く行
った。

間接蛍光抗体法（ＩＰ法）； １０％牛脂児血清添加ＭＥＭ培地に浮遊したヒト癌培養
細胞を６０穴マイクロプレートに１０５個／ｍｌあて分
注し、５％Ｃｏ２中にて３７℃、−昼夜培養してプレー
トに付着せしめる。ＰＢＳにて洗浄後細胞を１０％フォ
ルマリン溶液にて常温で６０分間固定し、再度洗浄する
。モノクローナル抗体を１０ρづつ各穴に加え常温にて
４５分間インキニベートし、洗浄後蛍光標識山羊抗マウ
ス免疫グロブリン抗体（コールタ−社）を１０ｇづつ加
え常温にて３０分間反応させる。再度ＰＢＳにて洗浄後
蛍光顕微鏡にて細胞の蛍光発色を検鏡する。

酵素抗体同相法（ＥＬＩＳＡ法）； ＥＬＩＳＡ用９６穴用人６穴イムノプレート、標的とな
るｒａｓ−ｐ２１蛋白溶液（５０ｇ／ｍｌ）を５０ｍづ
つ分注し、４℃にて一昼夜放置、０．５％Ｔｗｅｅｎ　
２Ｑ添加ＰＢＳ　（以下同じ）にて洗浄後５％牛血清ア
ルブミン溶液１００１ｊＩｌにて１時間常温でブロッキ
ングを行う。洗浄後適宜希釈したモノクローナル抗体５
０ｇを加え常温にて４，５分間反応させる。再度洗浄後
ペルオキシダーゼ標識山羊抗マウス免疫グロブリン抗体
（医学生物学研究所）（１／２，０００に希釈）を５０
ｄづつ分注し、常温にて４５分間反応させた後洗浄する
。基質としてＯ−フェニレンジアミンを用い発色せしめ
、自動ＥＬＩＳＡ！Ｊ−グー（ＳＬＴ２１０．ラボサイ
エンス社）により４９０ｎｍの波長での吸光度を測定す
る。

アビジン−ビオチン複合体酵素抗体法（ＡＢＣ法〉；パ
ラフィン包埋の１０％ホルマリン固定組織標本を４廓の
厚さに薄切しスライドに付着させ脱パラフイン化を行う
。蒸留水にて洗浄後０．３％過酸化水素を含んだ１００
％エタノールにて３０分間処置し、蒸留水にて３回洗浄
後正常馬血清（ベクタスティンＡＢＣキット、ベクター
ラボ社）を滴下し、２０分間インキュベートする。その
後適宜希釈したモノクローナル抗体を加えて常温にて３
０分間インキュベートし、ＰＢＳにて３回洗浄後ビオチ
ン化山羊抗マウス免疫グロブリン抗体（ベククスティン
ＡＢＣキット、ベクターラボ社）を加え３００分間反応
せる。３回洗浄後ペルオキシダーゼ化アビジン−ビオチ
ン複合体（ベクタスティンＡＢＣキット。

ベクターラボ社）を加え１時間反応させ、再度３回洗浄
後０．０５％ジアミノベンチジンと０．０１％過酸化水
素を含んだ０．０５　Ｍ　）　Ｕス塩酸緩衝液（ｐＨ７
，２）にて常温で５分間反応させる。

水洗後へマドキシリン染色を常法で行い組織内の基質発
色を検鏡する。

イムツブｏ−７テイング法（Ｔｏｗｉｎ　Ｌら、　Ｐｒ
ｏｃ。

Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、　ＵＳＡ、　　７６、
４３５０　（１９７９））　　：試料を５ＤＳ−ポリア
クリルアミドゲル電気泳動法により泳動し、ニトロセル
ロース膜に各ペプチド（ｒａｓ癌遺伝子支配ｐ２１蛋白
など）を電気的に転移し、その後モノクローナル抗体と
反応させる。洗浄後ビオチン化抗マウス免疫グロブリン
抗体（ベクタスティンＡＢＣキット。

ベクターラボ社）と反応せしめ、再度洗浄後ペルオキシ
ダーゼ化アビジン−ビオチン複合体（ベクタスティンＡ
ＢＣキット、ベクターラボ社）と反応させ、４−塩化１
−ナフトールを基質として発色させる。モノクローナル
抗体の特定蛋白（この場合はｐ２１蛋白）に対する反応
の指標または泳動距離より反応蛋白の分子量が測定でき
る。

本発明のモノクローナル抗体は、種々の癌細胞、癌組織
に反応性を有している。たとえば、ヒト甲状腺癌、ヒト
胃癌、ヒト乳癌、ヒト子宮癌、ヒト大腸癌などに反応を
示す。従来ヒト甲状腺癌に反応性を示すモノクローナル
抗体は知られておらず、本発明のモノクローナル抗体は
甲状腺癌の検出にとくに有用である。癌の診断法として
は、上記のごとき組織染色法、血清診断法への応用が考
えられ、実施例にその例を示す。

実施例１゜ ＲＡＳＫ−１，ＲＡＳＫ−２，ＲＡＳＫ−３およびＲＡ
ＳＫ−４モノクロ一ナル抗体の製造：Ｋｉｒｓｔｅｉｎ
肉腫ウィルス由来のＫｉ−ｒａｓ癌遺伝子を使い工注ら
の方法〔バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・
リサーチ・コミニニケーシ−ａ　７　（Ｂｉｏｃｈ、Ｂ
ｉｏｐｈｙ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍ、）。

１３２、１２６−１３３　（１９８５）　）に従ってＫ
ｉ−ｒａｓ癌遺伝子支配蛋白（Ｋｉ−ｐ２１）を製造し
た。

Ｋｉ−ｐ２１　＜蛋白量５０■）と完全フロインドアジ
ユバント（ディフコ社製）０．０２ｍ１とを混合し、（
ＢＡＬＢ／ｃｘＣ５７ＢＬ／６）Ｆ１マウス（８週令、
２５ｇ）（静岡実験動物より購入）１匹の背面に皮下接
種することにより免疫した。２週間後に同量のＫｉ−ｐ
２１蛋白と不完全フロインドアジユバント（ディフコ社
製）０．０２ｍ１とを混合し、同マウスの背面に皮下接
種を行い、さらに２週間後に１００■、４週間後に２０
０■の同蛋白質のみを腹腔的接種した。最終免疫４日目
にマウスを殺し、肺臓を摘出し、常法により浮遊細胞を
得た。

この膵臓浮遊細胞１０８個とマウスミニロー？ＭＯＰＣ
−２１ＮＳ／１細胞〔Ｎａｔｕｒｅ、　２５６゜４９５
−４９７　（１９７５））　２　Ｘ　１０’個とを、４
２％（Ｗ／Ｖ）ポリエチレングリコール（Ｍ、　１１．
４，０００゜Ｋｏｃｈ−Ｌ’ｉｇｈｔ、　Ｂｕｃｋｓ、
英国）および１５％（Ｖ／Ｖ）ジメチルスルホキシド（
Ｍｅｒｃｋ、　Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、西独）を含むリン
酸緩衝液生理食塩水（ＰＢＳ）０．２ｍｌ中で、加藤ら
の方法［ＧＡＮＮ、　７６、５２４−５３１　（１９８
５）　：）に従って融合させた。

融合細胞は、ＨＡＴ培地〔ヒポキサンチン１、３６　ｍ
ｇ／ｄｌ、アミノプテリン１９．１ｘｒ／Ｊ。

チミジン３８７■／ａ、ストレプトマイシン１００ｘｒ
／ｍｌ、　ヘ＝シリン１００単位／ｍｌ　、グルタミン
２ｍＭおよび牛脂児血清１０％を含むＲＰＭ１１６４０
培地（ｐＨ７，２）を用いて前記加藤らの方法に従い選
択した。

得られた融合細胞４個を限界希釈法を２回繰り返すこと
によりクローン化した。得られた４個のクローンを下記
の方法で培養してＫｉ−ｐ２１蛋白抗原に対して特異的
に反応するモノクローナル抗体を著量生産する株を得た
。すなわち、各クローンの５Ｘ１０６細胞を、ストレプ
トマイシン１００ｇ／ｍｌ、ペニシリン１００単位／ｍ
１．グルタミン３．８　ｇ　／　１および牛脂児血清１
０％を含むＲＰＭ１１６４０培地１５ｍｌを用い、１５
　Ｑｍｌのフラスコ内で９５％ＣＯ□−５％ｏ２の存在
下、３７℃で７日間培養した。

これら４個のクローンの生産するモノクローナル抗体を
ＲＡＳＫ−１，ＲＡＳＫ−２゜ＲＡＳＫ−３およびＲＡ
ＳＫ−４とした。各クローンの細胞５Ｘ１０６個を、前
もってプリスタン０．５ｍｌを注射したＢＡＬＢ／ｃＸ
Ｃ５７ＢＬ／６）Ｆｌ（静岡実験動物より購入〉マウス
腹腔内に接種移植した。２週間〜１ケ月後に腹水的１〜
５１を採取し、アフィゲルプロティンＡＭＡＰＳ−Ｉ［
キット（日本バイオ・ラッド・ラボラトリーズ社）を用
いるアフィニティクロマトグラフィに従って各腹水から
モノクローナル抗体ＲＡＳＫ−１，ＲＡＳＫ−２，ＲＡ
ＳＫ−３およびＲＡＳＫ−４をそれぞれ腹水１ｍｌあた
り約２〜１０ｍｇ得た。

実施例２゜ モノクローナル抗体の各種培養株細胞に対する反応性： 実施・例１で得たモノクローナル抗体と、各種培養株細
胞の細胞質内抗原との反応を前記間接蛍光抗体法で検索
した。細胞としては、Ｃａ１ｕ−１（肺癌細胞）、Ｐａ
ｃａ２　（膵癌細胞）。

５Ｋ−ＮＳＨ（神経芽腫）、５Ｗ１３（副腎皮質癌細胞
）、ＨＬ６０（前骨髄球性白血病細胞）を用いた。

本発明のモノクローナル抗体ＲＡＳＫ−１゜ＲＡＳＫ−
２，ＲＡＳＫ−３およびＲＡＳＫ−４は、これら全ての
細胞と反応性を示した。

反応の程度は下記第１表に示すとおりである。

第　　　　１　　　　表 実施例３゜ モノクローナル抗体のｒａｓ癌遺伝子支配蛋白ｐ２１に
対する反応性： 実施例１で得たモノクローナル抗体とｒａｓ癌遺伝子支
配蛋白ｐ２１との反応性を前記ＥＬ　Ｉ　ＳＡ法および
イムノブロッティング法により検討した。

免疫に用いたＫｉ−ｐ２１蛋白を固相として行ったＥＬ
ＩＳＡ法にてＲＡＳＫ−１，ＲＡＳＫ−２，ＲＡＳＫ−
３，ＲＡＳＫ−４の全ての抗体が強い陽性反応を示した
。これらの抗体のＫｉ−ｐ２１に対する抗体価は、ＥＬ
ＩＳＡ法にてＲＡＳＫ−１；１／１０００．　ＲＡＳＫ
−２；１／４０００．　ＲＡＳＫ−３；１／４０００．
　ＲＡＳＫ−４；　１／４０００　、であった。Ｎ−ｒ
ａｓ癌遺伝子の支配蛋白Ｎ−ｐ２１を固相として用いた
ＥＬＩＳＡ法ではＲＡＳＫ−１は陰性、ＲＡＳＫ−２は
極弱い陽性反応を示したがＲＡＳＫ−３，ＲＡＳＫ−４
は極めて強い陽性反応を示した。

これらの抗体のｒａｓ癌遺伝子支配ｐ２１蛋白に対する
反応をイムノブロッティング法により検討した。Ｋ１−
１）２１蛋白、Ｎ−ｐ２１蛋白、および１ａｒｖｅｙ肉
腫ウイルス変異細胞。

Ｋｉｒｓｔｅｎ肉腫ウィルス変異細胞の細胞抽出液を用
いてイムノブロッティングを行った。結果を第２表に示
す。この結果、ＲＡＳＫ−１はＫｉ−ｒａｓ癌遺伝子由
来ｐ２１蛋白（Ｋｉ−ｐ２１）に対しては反応を示すが
、Ｎ−ｒａｓ癌遺伝子由来ｐ２１　（Ｎ−ｐ２１）およ
びＨａｒｖｅｙ肉腫ウィルス変異細胞に対しては反応を
示さなかった。ＲＡＳＫ−２はＫｉ−ｒａｓ癌遺伝子由
来ｐ２１蛋白（Ｋｉ−ｐ２１）に反応したが、Ｎ−ｒａ
ｓ癌遺伝子由来］）２１蛋白　（Ｎ−ｐ２１）には極弱
く反応し、１ａｒｖｅｙ肉腫ウイルス変異細胞には全く
反応しなかった。ＲＡＳＫ−３およびＲＡＳＫ−４は、
Ｋｉ−ｒａｓ癌遺伝子。

Ｎ−ｒａｓ癌遺伝子、および）（ａ−ｒａｓ癌遺伝子由
来の全ての１）２１蛋白と反応した。

第　　　　２　　　　表 ＲＡＳＫ−４＋　　　　　　　　　　十　　　　　　　
　十　　　　　　　　＋実施例４゜ 本発明のモノクローナル抗体のＫｉ−ｒａｓ蛋白に対す
る結合部位の異同を、ビオチン化したＲＡＳＫ−３およ
びＲＡＳＫ−４を用いて検討した。

前述の如くアフィゲルプロティンＡ　　ＭＡＰＳ−■に
より採取したＲＡＳＫ−３およびＲＡＳＫ−４をＮ−ハ
イドロオキシサクシニミドービ第チンと４時間室温にて
インキユベートすることによりモノクローナル抗体のビ
オチン化をおこなった。

ＥＬＩＳＡ用プレートにＫｉ−ｒａｓ蛋白ｐ２１を結合
させ、あらかじめＲＡＳＫ−１゜ＲＡＳＫ−２，ＲＡＳ
Ｋ−３，ＲＡＳＫ−４を加え１時間室温にてインキユベ
ートした。その後１／２０００．１／４０００．１／８
０００に稀釈したビオチン化ＲＡＳＫ−３またはＲＡＳ
Ｋ−４を加え、ＡＢＣ法によりＥＬＩＳＡ法を奢こなっ
た。結果は第３表に示された如くである。ビオチン化Ｒ
ＡＳＫ−３のＫｉ−ｒａｓｐ２１に対する結合はＲＡＳ
Ｋ−３＞ＲＡＳＫ−４＞ＲＡＳＫ−２＞ＲＡＳＫ−１の
順に阻害される。一方ビオチン化ＲＡＳＫ−４のＫｉ−
ｒａｓｐ２１に対する結合は、ＲＡＳＫ−４＞ＲＡＳＫ
−３＞ＲＡＳＫ−２＞ＲＡＳＫ−１の順に阻害され、Ｒ
ＡＳＫ−３とＲＡＳＫ−４は同一のｐ２１の異なった部
位に反応していることが示唆される。

第　　　　３　　　　表 ビオチン化抗体 ＲＡＳＫ−３ＲＡＳＫ−４ 実施例５゜ 本発明モノクローナル抗体（ＲＡＳＫ−３）の甲状腺癌
組織に対する反応性（ＡＢＣ法による）： １０％フォルマリン固定甲状腺癌５０症例に対するモノ
クローナル抗体（ＲＡＳＫ−３）の反応性を前記ＡＢＣ
法により検討した。結果を第４表に示す。第４表に示す
ごとく、病理形態学的に癌と診断し得た部分では全体に
強く陽性反応を示した症例は４０例であり、部分的に強
い陽性反応を示した症例が１０症例であった。

一方非癌化部分では、一部陽性を示したものが３症例、
一部局陽性が２５症例、全く陰性なものが２２症例であ
った。他のモノクローナル抗体による結果もこれと同様
であった。

第　　　　４　　　　表 抗体との反応性 全体陽性　部分陽性　部分周陽性　陰性実施例６゜ 本発明モノクローナル抗体の胃癌に対する反応（ＡＢＣ
法による）： １０％フォルマリン固定胃癌４２症例に対する本発明モ
ノクローナル抗体の反応性をＡＢＣ法により検討した。

ＲＡＳＫ−３による結果を第５，６表に示す。第５表に
示すごとく病理形態学的に癌と診断し得た部分では全体
に強く陽性反応を示したちの６症例、全く陰性なもの５
症例であった。一方正常粘膜上皮細胞では部分的弱陽性
のもの３症例であり、残る３９症例は陰性であった。胃
癌部分の陽性度を、胃癌組織型別に検討した結果が第６
表に示されている。乳頭腺癌は３症例全てが、また高分
化型管状腺癌は１２症例全てが全体に強く陽性を示した
。中分化型管状腺癌は１１症例中９症例が全体に陽性を
示し、低分化腺癌は１２症例中５例が全体的に、６例が
部分的に強陽性を示した。膠様腺癌は２症例全てが陽性
であったが、印環細胞癌は２症例全てが陰性であった。

第　　　　５　　　　表 抗体との反応性 胃癌部分　　　　３１／４２　　　６／４２　　　０／
４２　　５／４２第　　　　６　　　　表 乳頭腺癌　　　３／３ 管状腺癌 高分化型　　　１２／１２ 申分化型　　　９／１１ 低分化腺癌　　　　　１１／１２（内６例部分陽性）膠
様腺癌　　　２／２ 印環細胞癌　　　　０／２ 実施例７゜ 本発明モノクローナル抗体の大腸癌、子宮癌。

乳癌に対する反応（ＡＢＣ法による）：１０％フォルマ
リン固定大腸癌、子宮癌、乳癌に対するこれらのモノク
ローナル抗体の反応性をＡＢＣ法により検討した。全て
の抗体が、大腸癌、子宮癌、乳癌組織と強く反応したが
、正常組織では局限性か、または陰性があった。

発明の効果 本発明によれば、Ｋｉ−ｒａｓ遺伝子産物に対して反応
性を有するモノクローナル抗体が提供され、これらは癌
の検出や血清診断などに応用できる。

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. （１）ＩｇＧクラスに属し、Ｋｉ−ｒａｓ遺伝子産物に
   反応するモノクローナル抗体。
2. （２）該Ｋｉ−ｒａｓ遺伝子産物がＫｉ−ｐ２１である
   特許請求の範囲第１項記載のモノクローナル抗体。
3. （３）ＲＡＳＫ−１、ＲＡＳＫ−２、ＲＡＳＫ−３また
   はＲＡＳＫ−４で特定される特許請求の範囲第１項記載
   のモノクローナル抗体。
4. （４）Ｋｉ−ｒａｓ遺伝子産物に反応するモノクローナ
   ル抗体を用い、間接蛍光抗体法、酵素抗体固相法、ＡＢ
   Ｃ法またはイムノブロッティング法により癌の検出を行
   う方法。
5. （５）癌がヒト甲状腺癌、ヒト胃癌、ヒト乳癌、ヒト子
   宮癌およびヒト大腸癌から選ばれるものである特許請求
   の範囲第４項記載の方法。
6. （６）Ｋｉ−ｒａｓ遺伝子産物に反応するモノクローナ
   ル抗体を生産する能力を有するハイブリドーマ。
7. （７）ＥＣＡＣＣ８６０９１１０１、ＥＣＡＣＣ８６０
   ９１１０２、ＥＣＡＣＣ８６０９１１０３またはＥＣＡ
   ＣＣ８６０９１１０４の番号で特定される特許請求の範
   囲第６項記載のハイブリドーマ。