CN101082626A - 检测Asial型口蹄疫病毒的ELISA试剂盒及制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种用于检测Asial型口蹄疫病毒的ELISA试剂盒，它包括可与待测样品结合的固体支持物、包被于可与待测样品结合的固体支持物上的Asial型口蹄疫病毒的单克隆抗体、作为二抗的用Asial型口蹄疫病毒免疫豚鼠得到的多克隆抗体，及用酶标记的兔抗豚鼠IgG、标准血清、无色底物、和终止液；本发明还公开了这种试剂盒的制备方法。

Description

检测Asial型口蹄疫病毒的ELISA试剂盒及制备方法

技术领域

本发明涉及一种用于检测口蹄疫病毒的试剂盒及其制备方法，特别是用于检测Asia1型口蹄疫病毒的ELISA试剂盒和制备方法。

背景技术

口蹄疫是一种重大动物疫病，世界各国对该病的检验检疫、预防控制都十分重视。目前检测、诊断口蹄疫的主要方法是检测发病或带毒动物体内的口蹄疫病毒及其抗体水平，如分离病毒方法。分离病毒是对口蹄疫的最可靠的诊断，但较长的周期会延误对该烈性传染病的最佳控制时间；此类实验方法需要昂贵的仪器设备和专业技术人员。因此，研制直接检测口蹄疫病毒抗原的快速、便捷、适合现场使用的检测试剂盒不仅有很强的实用价值和广阔的应用前景，而且对我国口蹄疫的防控具有重要意义。

我国于2005年突发大面积的Asia1型口蹄疫，疫情波及十几个省市，给我国的畜牧业生产造成重大经济损失。此次暴发不仅持续时间长，而且疫情复杂。此次暴发警示我们要及早开发研究便捷、快速、敏感、特异的快速诊断试剂以及研制快速诊断试剂盒。

发明内容

本发明提供一种用于检测Asia1型口蹄疫病毒的ELISA试剂盒，以及这种检测盒的制备方法。

本发明的试剂盒中包括：

a.可与待测样品结合的固体支持物，

b.包被于可与待测样品结合的固体支持物上的Asia1型口蹄疫病毒的单克隆抗体，

c.作为二抗的用Asia1型口蹄疫病毒免疫豚鼠得到的多克隆抗体，

d.用酶标记的兔抗豚鼠IgG，

e.标准阳性血清，

f.标准阴性血清，

g.血清稀释液，

h.底物稀释液，

i.30％H₂O₂，

j.无色底物，

k.终止液。

或者本发明的检测Asia1型口蹄疫病毒的ELISA试剂盒包括：

a.可与待测样品结合的固体支持物，

b.包被于可与待测样品结合的固体支持物上的Asia1型口蹄疫病毒的单克隆抗体，

c.作为二抗的用Asia1型口蹄疫病毒免疫豚鼠得到的并用酶标记的多克隆抗体，

d.标准阳性血清，

e.标准阴性血清，

f.血清稀释液，

g.底物稀释液，

h.3％H₂O₂，

i.无色底物，

j.终止液。

另外，也可在检测盒中再配备25×浓缩PBST洗液和移液槽，以方便使用。

本发明的检测盒中的固体支持物为最少四孔的酶标板，所用的无色底物为邻苯二胺，所用的终止液是2摩尔的硫酸，所用的酶为辣根过氧化物酶。本发明的检测盒使用中所用的洗涤液为磷酸缓冲液，可由用户自行配制。

本发明的检测Asia1型口蹄疫病毒的ELISA试剂盒的制备方法是：

首先制备Asia1型口蹄疫病毒的单抗和多抗：

单抗制备过程：以Asia1型口蹄疫病毒的总mRNA为模板，设计引物进行反转录和聚合酶链式反应，获得Asia1型口蹄疫病毒衣壳蛋白的基因VP1。将VP1插入原核表达载体中得到重组表达质粒，再用重组表达质粒转化大肠杆菌得到重组表达载体的大肠杆菌菌株。将前述菌体超声破碎后除杂蛋白，用层析法得到纯化表达的融合蛋白，将融合蛋白与等体积佐剂充分混匀，给健康小鼠皮下注射进行免疫，其中第一次免疫用的佐剂为完全弗氏佐剂，第二次免疫所用佐剂为不完全弗氏佐剂，第三次免疫不用佐剂，免疫后的3～4天取小鼠的脾脏获得脾细胞进行分散处理，然后按体积比1∶30加入1640培养液，轻轻吹打数次，再将脾细胞离心去上清液得到脾细胞沉淀，取从小鼠中已得到的X-63、NS-1或SP2/0细胞系，在常规培养液中培养3～4天后，离心去上清液得到骨髓瘤细胞沉淀，用1640培养液悬浮上述脾细胞沉淀和骨髓瘤细胞沉淀，并将脾细胞和骨髓瘤细胞按数量比5～10∶1混合两种细胞，然后离心去上清液，充分分散沉淀物，向沉淀物中按体积比1∶2加入浓度为50％的聚乙二醇PEG4000，再静置1～2分钟后离心去上清液，在沉淀物中缓慢加入沉淀物体积的25～35倍的HAT培养液，再将融合细胞按100μl/孔加入至96孔培养板中，每孔中再加100μl用HAT培养液洗取的小鼠腹腔巨噬细胞作为饲养细胞，得到抗Asia1型口蹄疫病毒抗体阳性、滴度高的杂交瘤细胞，再将杂交瘤细胞转移到另一块96孔板中进行克隆，得到杂交瘤细胞株，再用常规培养液培养上述所得到的杂交瘤细胞株，大量生产单克隆抗体。

或者采用另一种方法制备，这种制备方法的前步骤与前述方法基本相同，但在后期大量生产单克隆抗体时是采用小鼠体内诱生法，即：先用Asia1型口蹄疫病毒的总mRNA为模板，设计引物进行反转录和聚合酶链式反应，获得Asia1型口蹄疫病毒衣壳蛋白的基因VP1，再将VP1插入原核表达载体中得到重组表达质粒，再用重组表达质粒转化大肠杆菌得到重组表达载体的大肠杆菌菌株，将菌体超声破碎后除杂蛋白，用层析法得到纯化表达的重组蛋白，将重组蛋白与等体积佐剂充分混匀，给健康小鼠皮下注射进行免疫，其中第一次免疫用的佐剂为完全弗氏佐剂，第二次免疫所用佐剂为不完全弗氏佐剂，第三次免疫不用佐剂，免疫后的3～4天取小鼠的脾脏获得脾细胞进行分散处理，然后按体积比1∶30加入1640培养液，轻轻吹打数次，再将脾细胞离心去上清液得到脾细胞沉淀，取从小鼠中已得到的X-63、NS-1或SP2/0细胞系，在常规培养液中培养3～4天后，离心去上清液得到骨髓瘤细胞沉淀，将所得到的杂交瘤细胞注入经降植烷处理的雌性小鼠腹腔内，2至3周后收集腹水，离心除去固体成分，取其上清液用硫酸铵沉淀和凝胶层析法纯化，得到抗Asia1型口蹄疫病毒的单克隆抗体。

由前述方法所得抗Asia1型口蹄疫病毒的单克隆抗体可采用硫酸铵沉淀和凝胶层析法进行纯化。

多抗制备过程：选取体重为500g以上健康、营养良好的豚鼠为免疫对象进行免疫，主要免疫程序分为两部分来实现，(1)基础免疫，即首先进行用10-6病毒悬液在豚鼠蹠部皮内穿刺3-4针，皮下注射0.1ml；第二次用10^-4病毒液穿刺3-4针，皮下注射0.1ml，第三次用10^-2病毒液穿刺3针，皮下注射0.2ml，每次间隔1周，直至豚鼠发病痊愈后再进行高免。(2)高免，用10^-1病毒液免疫豚鼠，发病后取其蹠部上皮组织，称重研磨后用pH7.4 0.04mol/L的磷酸缓冲液制成1∶10(重量体积比)悬液，4℃过夜浸毒，3500rpm离心15min，取上清为免疫原。将此抗原与不完全弗氏佐剂1∶1体积进行乳化，用该抗原对经基础免疫的豚鼠进行高免2-3次，每次间隔10天，于后肢股内侧肌内接种，剂量分别为0.6、0.8和1.2ml/次。在最后一次免疫15天时，心脏采血分离血清，56℃水浴灭活30min，冷却后加硫柳汞防腐待用。

然后按下述程序制备ELISA检测盒：

a.在可与待测样品结合的固体支持物的每孔加100μl(滴度为1∶100)包被抗体；

b.将5mg辣根过氧化物酶溶解于0.5ml的1.25％的戊二醛中，加入100mol/L磷酸钠缓冲液，使体系的pH为6.8，置室温18小时；

c.选用直径为100μm，排阻极限为20 000-50 000的分离介质，按介质说明制备5ml的分离柱，用0.15mol/L NaCl溶液过10个柱床体积后，经处理的辣根过氧化物酶中加入20μl甘油和1％二甲苯蓝20μl，上柱分离，用0.15mol/LNaCl洗脱，收集棕色部分；

d.用超滤或透析浓缩样品至10mg/mL；

e.在每升0.15毫摩尔的氯化钠水溶液中加入5毫克的Asia1型口蹄疫病毒免疫豚鼠，再将得到的并用酶标记的多克隆抗体0.1ml加于酶溶液中，将体系的pH值调整到9.0～9.6，再在4℃放置24小时，再在其中加入浓度为0.2mol/L，pH7.0的乙醇胺0.1ml；

f.用分子筛杆分离纯化的酶标记抗体，并封装于塑料瓶或玻璃瓶内；

g.用塑料瓶或玻璃瓶分别封装30％的过氧化氢水溶液和2摩尔的硫酸，用黑色纸或塑料袋包装邻苯二胺。

本发明的检测Asia1型口蹄疫病毒的ELISA试剂盒可以迅速及时的检测出动物是否患有Asia1型口蹄疫疾病，其检测过程及制备过程简单，采用本发明的检测盒可以快速确定疫情，本发明为我国口蹄疫的防控提供重要的技术支撑。

具体实施方式

一、单抗的制备

(1)用RNeasy Mini Kit(Qiagen)试剂盒从Asia1型口蹄疫病毒(注：该毒株保藏于中国农业科学院兰州兽医研究所国家口蹄疫参考实验室)中提取的总mRNA为模板，用针对Asia1型VP1的特异性引物进行反转录和PCR扩增，获得Asia1型口蹄疫病毒VP1基因。在本发明中所用的引物为：

上游引物    5′-CCG GAATTCGCTTACCAGTGGATGCTCG-3′

下游引物    5-′CCC AAGCTTCGCTAGCTTGAGCAGGTC-3′

采用通常方法将连接产物转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，构建含有重组克隆载体的大肠杆菌菌株，用琼脂糖平板(amp⁺)及蓝白斑筛选阳性克隆，挑取白斑克隆进行扩增。用PCR、酶切以及序列分析鉴定阳性克隆，采用双酶切从鉴定为阳性的克隆上切下目的基因，以分子生物学通常采用的方法回收酶切目的基因片段，将获得的目的基因定向插入表达载体pP_ROEX HTb，构建重组表达质粒，转化大肠杆菌感受态细胞(DH5α)构建重组表达载体的大肠杆菌菌株，采用细菌涂板(Kan⁺抗性)筛选阳性克隆。经PCR、酶切和序列分析等方法鉴定为阳性的重组表达质粒进行原核表达。当重组表达菌生长至对数中期A₅₅₀＝0.5-1.0时，通常A₅₅₀＝0.6时，用终浓度为1mmol/L IPTG诱导表达。诱导6小时后收获表达菌，8000rpm离心10min收集沉淀，弃上清。按每克重加5ml20mM/L Tris缓冲液(pH8.0)悬浮菌体后，超声破碎菌体，12000rpm离心15分钟后留沉淀弃上清，用包涵体洗涤缓冲液(1M Tris pH8.0，0.5M EDTApH8.0，3M NaCl，0.5％Triton X-100)充分洗涤后，12000rpm离心30min以去除杂蛋白，重复4-5次。用8M尿素缓冲液(0.5M NaCl，0.02M Tris，8M尿素，pH8.0)悬浮沉淀，用亲和层析法(Ni-NTA His)纯化表达的重组蛋白，获得的重组蛋白用紫外分光光度计测定含量后-20℃冻存。

(2)制备免疫脾细胞：取前述的纯化Asia1型口蹄疫病毒VP1基因原核表达的重组抗原与等体积佐剂充分混匀，分别注入健康小鼠颈背部两侧、腹股沟部皮下；每只每次注射的病毒剂量为20～80μg抗原，间隔2～4周后，用同样的方法再次重复注入至少1次；第一次免疫用的佐剂为完全弗氏佐剂、第二次免疫所用佐剂改为不完全弗氏佐剂、第三次免疫不用佐剂，佐剂与抗原的比例为1∶1(体积比)最后一次免疫后2周，测小鼠血清中的抗口蹄疫病毒VP1基因原核表达抗原的抗体滴度，将显示有足够抗体滴度的小鼠作为免疫脾细胞的来源。

测定抗体滴度的方法，可用放射免疫测定(RIA)或酶联免疫吸附(ELISA)测定法等，本发明中采用通常的ELISA法。

(3)制备骨髓瘤细胞：骨髓瘤细胞通常使用从小鼠中已得到的X-63、NS-1和SP2/0细胞系。在进行细胞融合前，将其在加有10％胎牛血清的DMEM(100u/mL青霉素、100ug/mL链霉素)的常规培养液中培养3～4天，以便在融合时可以得到2×10⁷或更多的融合细胞。本发明通常选用SP2/0骨髓瘤细胞。

(4)细胞融合：将20～80μg前述所得的纯化Asia1型口蹄疫病毒VP1基因原核表达抗原向已按步骤(2)的方式免疫接种的小鼠腹腔接种免疫，并且在免疫后的3～4天取小鼠的脾脏获得脾细胞。分散脾细胞，然后按体积比1∶30加入1640培养液，轻轻吹打数次，再将脾细胞离心去上清液得到脾细胞沉淀。将上述(3)培养的小鼠骨髓细胞瘤SP2/0离心去上清液得到骨髓瘤细胞沉淀。用1640培养液悬浮上述脾细胞沉淀和骨髓瘤细胞沉淀，并将脾细胞和骨髓瘤细胞按数量比(5～10)∶1混合两种细胞，然后离心去上清液，充分分散沉淀物，向沉淀物中按体积比1∶2加入浓度为50％的聚乙二醇PEG4000，再静置1～2分钟后离心去上清液，在沉淀物中缓慢加入沉淀物体积的25～35倍的HAT培养液，所用的HAT溶液为：次黄嘌呤10^-6～10^-3M，氨基喋呤10^-8～10^-7M，胸苷10^-6～10^-4M，悬浮融合细胞，最后补加HAT培养液至沉淀物体积的140～160倍。再将融合细胞按100μl/孔加入至96孔培养板中，每孔中再加100μl用HAT培养液洗取的小鼠腹腔巨噬细胞作为饲养细胞(约1～2×10⁵个/孔)。将上述培养孔置于浓度为3～7％的CO₂培养箱中，在温度为35～38℃条件下培养10～14小时，从第3天开始，每隔2～3大用每孔半量HAT培养液换液体一次。

当观察培养孔中出现杂交细胞集落时，先取培养上清液，然后再在每孔加半量HAT培养液。再用ELISA检测抗Asia1型口蹄疫病毒VP1基因原核表达抗原的抗体及滴度。当检测表明其与对照相比有明显的升高时即视为合格。

将上述抗Asia1型口蹄疫病毒抗体阳性、滴度高的杂交瘤细胞转移到另一块96孔板中进行克隆，得到杂交瘤细胞株。可以通过一种经有限稀释该杂交瘤细胞使每一孔中只含有一个单一杂交瘤细胞的方法，或一种从软琼脂培养基中分离集落的软琼脂方法，或一种采用显微操作器，挑取单一杂交瘤细胞的方法，或一种采用细胞分选仪分离单一的杂交瘤细胞的“分选仪克隆”方法。

(5)制备单克隆抗体：用常规培养液培养上述(4)中得到的杂交瘤细胞株。大量生产单克隆抗体，可采用大转瓶旋转培养法，或同系小鼠体内诱生法。其中大转瓶旋转培养法可通过培养上述(3)杂交瘤细胞纯化得到抗口蹄疫病毒单克隆抗体。同系鼠(本发明用Balb/c小鼠)体内诱生法可通过将上述(3)得到的产生抗口蹄疫病毒抗体的杂交瘤细胞(5×10⁵～10⁶)注入经降植烷处理的雌性小鼠(4～8周龄)腹腔内，2至3周后收集腹水，离心除去固体成分，其上清液即含有抗Asia1型口蹄疫病毒单克隆抗体。如果需要进一步纯化，可采用硫酸铵沉淀和凝胶层析法纯化。

将抗Asia1型口蹄疫病毒VP1基因原核表达抗原的单克隆抗体分别与包被Asia1、O、A和C型口蹄疫病毒抗原进行间接ELISA试验，结果显示具有高度的血清型特异性，不与其它血清型发生交叉反应，可用以制备检测Asia1型口蹄疫病毒的ELISA检测试剂盒。

二、多抗的制备：

选取体重为500g以上健康、营养良好的豚鼠为免疫对象进行免疫，主要免疫程序分为两部分来实现，(1)基础免疫，即首先进行用10^-6病毒悬液在豚鼠蹠部皮内穿刺3-4针，皮下注射0.1ml；第二次用10^-4病毒液穿刺3-4针，皮下注射0.1ml，第三次用10^-2病毒液穿刺3针，皮下注射02.ml，每次间隔1周，直至豚鼠发病痊愈后在进行高免。(2)高免，用10^-1病毒液免疫豚鼠，发病后取其蹠部上皮组织，称重研磨后用pH7.4 0.04mol/L的磷酸缓冲液制成1∶10(重量体积比)悬液，4℃过夜浸毒，3500rpm离心15min，取上清为免疫原。将此抗原与不完全弗式佐剂1∶1体积进行乳化，用该抗原对经基础免疫的豚鼠进行高免2-3次，每次间隔10天，于后肢股内侧肌内接种，剂量分别为0.6、0.8和1.2ml/次。在最后一次免疫达15天时，心脏采血分离血清，56℃水浴灭活30min，冷却后加硫柳汞防腐待用。

三、检测Asia1型口蹄疫病毒的ELISA试剂盒的制备

(1)用PBST(pH7.4；NaCl，8.0g；KCl，0.2g；MgCl₂·6H₂O，0.1g；KH₂PO₄，0.2g；Na₂HPO₄，1.14g；CaCl₂·2H₂O，0.1g；Tween-20 0.5ml，用蒸馏水定容1000ml)将保存的单抗稀释成效价为1∶320，按每孔50μl剂量加入96孔ELISA检测板，轻轻振荡混匀后置于4℃过夜或37℃2小时。

(2)用pH7.4的PBST洗涤(1)所述96孔ELISA检测板4次，每次5min。

(3)向(2)述96孔ELISA检测板加入含终浓度为1g/L牛血清白蛋白的PBST，37℃1小时。

(4)重复(2)，拍干液体，装入96孔ELISA检测板专用包装袋，用封口机封口后4℃保存。

(5)用PBST(pH7.4)将酶标豚鼠抗Aisa1型口蹄疫病毒多抗稀释成事先已经确定的浓度(1∶100)，或没有标记的豚鼠抗Aisa1型口蹄疫病毒多抗稀释成事先已经确定的浓度(1∶100)。

(6)25×PBST配制(pH7.4；NaCl，100.0g；KCl，5.0g；MgCl₂·6H₂O，2.5g；KH₂PO₄，5.0g；Na₂HPO₄，28.5g；CaCl₂·2H₂O，2.5g；Tween-20 12.5ml，用蒸馏水定容1000ml)

(7)血清稀释液制备用(1)所述0.01M PBS中加入5％脱脂奶粉(W/V)。

(8)底物稀释液配制柠檬酸(含一分子水)5.11g，Na₂HPO₄，7.3g，溶解于900ml无离子水中，调整pH为5.0后定容至1000ml。

(9)试剂盒的组装，试剂盒含96孔ELISA检测板1块，酶标豚鼠抗Aisa1型口蹄疫病毒多抗(0.5ml/支)1支，没有标记的豚鼠抗Aisa1型口蹄疫病毒多抗(0.5ml/支)1支，酶标兔抗豚鼠血清(0.5ml/支)1支，30％H₂O₂(5ml/支)1支，2M H₂SO₄(10ml/支)1支，酶底物1片，底物稀释液一瓶50ml。内包装用泡沫盒(内加干冰保证低温运输)，外包装用外带标签的纸盒。附操作手册一份。

或是此种组装，即试剂盒含96孔ELISA检测板1块，酶标豚鼠抗Aisa1型口蹄疫病毒多抗(0.5ml/支)1支，30％H₂O₂(5ml/支)1支，2M H₂SO₄(10ml/支)1支，酶底物1片，底物稀释液一瓶50ml。内包装用泡沫盒(内加干冰保证低温运输)，外包装用外带标签的纸盒。附操作手册一份。

本发明建议经用分子筛柱分离纯化标记抗体采用1.5mlEppendorf管保存，每支装0.5ml；用高密度聚乙烯塑料管封装30％的过氧化氢水溶液1支(5ml/支)；用纸包装1片邻苯二胺；同样用高密度聚乙烯塑料管封装2摩尔的硫酸1支(10ml/支)。考虑到本检测盒使用中所需用的清洗液(即磷酸缓冲液)较多，在盒内不再带有清洗液，而由使用者自行配制。或者再在本发明的检测试剂盒中增加25×浓缩洗液25ml/瓶，移液槽3个，以方便使用。

四、敏感性实验与特异性实验

通过对已知样品的检测以确定该试剂盒的敏感性，通过对与其他血清型口蹄疫病毒以及相似病病原如水泡病病毒等的检测以确定该试剂盒的特异性。

检测时第1～3组加50μl Asia1型口蹄疫病毒抗原；第4组加50μl O型口蹄疫病毒抗原；第5组加50μl A型口蹄疫病毒抗原；第6组加C型口蹄疫病毒抗原；第7组加猪水泡病病毒抗原；第8组稀释液对照；第9组为空白对照；第10组为Asia1型口蹄疫细胞毒灭活抗原阳性对照。其相应的检测结果见表1与表2。

表1不同包被浓度时的实验结果

注释：表1中，第1组包被单抗的浓度分别为1∶5(A)、1∶10(B)、1∶20(C)和1∶40(D)；第2组包被浓度依次为1∶80(A)、1∶160(B)、1∶320(C)和1∶640(D)；第3组包被浓度为1∶128(A)、1∶256(B)、1∶512(C)和1∶1024(D)，4～10组的包被浓度与第一列的相同。

表2相同包被浓度时的实验结果

注释：表2中A～D行包被单抗的浓度分别为1∶5、1∶10、1∶20和1∶40。检测时第1列加50μl Asia1型口蹄疫病毒抗原；第2列加50μl O型口蹄疫病毒抗原；第3列加50μl A型口蹄疫病毒抗原；第4列加C型口蹄疫病毒抗原；第5列加猪水泡病病毒抗原；第6列稀释液对照；第7列为空白对照；第8-9列的A和B孔为Asia1型口蹄疫细胞毒灭活抗原阳性对照，第8-9列的C和D孔为O型细胞毒灭活抗原。

结果提示：阴阳性对照成立，针对Asia1单克隆抗体定型ELISA试剂盒具有高特异性不与口蹄疫病毒其他血清型抗原发生交叉反应。

实验结果表明本发明的单抗针对Asia1型口蹄疫病毒，在1∶160滴度时具有高的特异性，与口蹄疫病毒其他血清型不发生交叉反应；当滴度增高后即高于1∶512时与O型有交叉反应，但不是很强；而与口蹄疫病毒A型和C型以及猪水泡病病毒没有交叉反应，阴阳性对照都成立，这说明本发明的ELISA试剂盒具有很高的特异性。

五、本发明的试剂盒使用方法如下：

(1)在检测盒包被有抗体的检测孔中加入50μl待检样品，如病畜的水泡液，轻微振荡混匀后37℃作用1小时。

(2)洗涤用PBST洗涤四次，每次5分钟。

(3)加入50μl二抗，37℃作用1小时。

(4)洗涤用PBST洗涤四次，每次5分钟。

(5)加辣根过氧化物酶标记的兔抗豚鼠IgG，37℃作用1小时。

(6)洗涤用PBST洗涤四次，每次5分钟。

(7)显色加50μl酶底物OPD，37℃显色15分钟，用2M H₂SO₄终止反应。

(8)于490nm读取吸收值(A值)。

(9)最少需要4孔作为对照，即强阳性、弱阳性、阴性以及空白对照。

(10)结果解释：检测结果与阴性及空白对照相比较有明显的差异即可判定为阳性。

Claims (4)

1、一种检测Asial型口蹄疫病毒的ELISA试剂盒，其特征在于试剂盒中包括：

a.可与待测样品结合的固体支持物，

b.包被于可与待测样品结合的固体支持物上的Asial型口蹄疫病毒的单克隆抗体，

c.作为二抗的用Asial型口蹄疫病毒免疫豚鼠得到的多克隆抗体，

d.用酶标记的兔抗豚鼠IgG，

e.30％H₂O₂，

f.无色底物，

g.终止液。

2、一种检测Asial型口蹄疫病毒的ELISA试剂盒，其特征在于试剂盒中包括：

a.可与待测样品结合的固体支持物，

b.包被于可与待测样品结合的固体支持物上的Asial型口蹄疫病毒的单克隆抗体，

c.作为二抗的用Asial型口蹄疫病毒免疫豚鼠得到的并用酶标记的多克隆抗体，

d.30％H₂O₂，

e.无色底物，

g.终止液。

3、根据权利要求1或2所述的一种检测Asial型口蹄疫病毒的ELISA试剂盒，其特征在于其中的固体支持物为最少四孔的酶标板，所用的无色底物为邻苯二胺，所用的终止液是2摩尔的硫酸，所用的酶为辣根过氧化物酶，所用的洗涤液为磷酸缓冲液。

4、权利要求3所述的任一检测Asial型口蹄疫病毒的ELISA试剂盒的制备方法，首先制备Asial型口蹄疫病毒的单抗和多抗，其特征是：

a.在酶标板的每孔加入50μl滴度为1∶320包被抗体；

b.将5mg辣根过氧化物酶溶解于0.5ml的1.25％的戊二醛中，加入100mol/L磷酸钠缓冲液，使体系的pH为6.8，置室温18小时；

c.选用直径为100μm，排阻极限为20,000-50,000的分离介质，按介质说明制备5ml的分离柱，用0.15mol/LNaCl溶液过10个柱床体积后，经处理的辣根过氧化物酶中加入20μl甘油和1％二甲苯蓝20μl，上柱分离，用0.15mol/LNaCl洗脱，收集棕色部分；

d.用超滤或透析浓缩样品至10mg/ml；

e.在每升0.15毫摩尔的氯化钠水溶液中加入5毫克的Asial型口蹄疫病毒免疫豚鼠，再将得到的并用酶标记的多克隆抗体0.1ml加于酶溶液中，将体系的pH值调整到9.0～9.6，再在4℃放置24小时，再在其中加入pH 7.0浓度为0.2mol/L的乙醇胺0.1ml；

f.用分子筛柱分离纯化的酶标记抗体，并封装于塑料瓶或玻璃瓶内；

g.用塑料瓶或玻璃瓶分别封装3％的过氧化氢水溶液和2摩尔的硫酸，用纸或塑料包装邻苯二胺。