CN1271210C - 白斑症病毒的中和单克隆抗体及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明是由杂交瘤细胞(保藏号为：CCTCC-C200423)分泌的白斑症病毒(WSSV)的中和单克隆抗体F。该中和单抗具有与白斑症病毒上的粘附蛋白结合，封闭该病毒粘附蛋白，阻断该病毒粘附蛋白与对该病毒敏感细胞的细胞膜上的该病毒受体的结合，阻止该病毒入侵细胞的功能。该单抗制备的技术路线是：从以提纯白斑症病毒为抗原开始，经免疫学方法，建立抗白斑症病毒的单克隆抗体库，再从该病毒单抗库中，以白斑症病毒分别与该病毒单抗库中的单抗孵育后，再与对虾血细胞的细胞膜反应的创新点检测筛选出该中和单抗F。该中和单抗可作为被动免疫疫苗的原料，为制备亚单位疫苗及基因工程疫苗提供理论依据和技术基础。

Description

白斑症病毒的中和单克隆抗体及其制备方法

技术领域

本发明涉及抗体应用技术的改进，具体讲是一种由杂交瘤细胞分泌的白斑症病毒(White spot syndrome virus，WSSV)的中和单克隆抗体及其制备方法，其属于免疫学和病毒学交叉技术领域。

背景技术

目前，白斑症病毒病是对虾养殖中危害严重的疾病之一，引起对虾大规模死亡，给对虾养殖业造成了巨大的损失。近年来，关于白斑症病毒的研究报道很多，但尚无有关该病毒的中和单克隆抗体及其制备方法的研究。到目前为止国内外尚未建立有效传代的对虾细胞系，不能用细胞连续培养的方法筛选对虾病毒的中和单克隆抗体，由此加大了虾类病毒中和单克隆抗体制备的难度，也使得虾类病毒中和单克隆抗体研究一直处于空白。本发明中，单克隆抗体技术的应用为抗对虾病毒的单克隆抗体的制备及中和单克隆抗体的筛选鉴别提供了更直接的方法，使制备，检测，筛选白斑症病毒的中和单抗成为可能。

发明内容

本发明的目的是要提供一种由杂交瘤细胞分泌的白斑症病毒的中和单克隆抗体及其制备方法。本发明拟设计确定白斑症病毒中和单克隆抗体的检测方法，筛选出白斑症病毒的中和单抗，应用到白斑症病毒病的研究中，并进一步鉴定白斑症病毒的粘附蛋白，研究白斑症病毒的感染机理，从而切断病毒的感染途径，达到预防控制虾类病毒病的目的。

本发明的目的是由以下技术方案实现的，研制了一种由杂交瘤细胞分泌的白斑症病毒的中和单克隆抗体；该杂交瘤细胞的培养物名称：小鼠杂交瘤细胞株WSSV-N，其保藏号为：CCTCC-C200423，保藏日期：2004-12-14，保藏单位CCTCC，地址：中国武汉大学内；其分泌的特异性白斑症病毒的中和单克隆抗体F(简称：中和单抗F)具有与白斑症病毒上的粘附蛋白结合，从而封闭该病毒粘附蛋白，阻断该病毒粘附蛋白与对该病毒敏感细胞的细胞膜上的该病毒受体结合，阻止该病毒入侵细胞的功能；长势良好的该杂交瘤细胞大小均一，浑圆，透亮，分裂旺盛，有无限分裂增生能力；在螯虾体内中和实验中，该中和单抗F中和效果明显，具有使螯虾死亡率低、存活时间长的能力。

所述由杂交瘤细胞分泌的白斑症病毒的中和单克隆抗体的制备方法，其制备技术路线是：从以白斑症病毒为抗原开始，采用免疫学方法建立抗白斑症病毒的单抗库；选择该病毒中和单克隆抗体的检测筛选方法，从该单抗库中检测筛选出白斑症病毒的中和单抗F。

所述的该病毒中和单克隆抗体的检测筛选方法之一是：首先，白斑症病毒分别与抗该病毒的单抗库中的单抗孵育，再与中国对虾血细胞的细胞膜反应，采用斑点免疫印迹检测方法，筛选出白斑症病毒的中和单抗F。所述的斑点免疫印迹检测方法的步骤是：

①将(2)提取的白斑症病毒，分别与抗该病毒单抗库中的单抗混合，室温孵育；

②取(1)步制备的中国对虾血细胞的细胞膜，包被于96孔酶标板中，每孔100μl，4℃过夜；然后倒扣于滤纸上，去多余液体；

③将②步的酶标板用2％-3％的牛血清白蛋白封闭，每孔150μl，4℃过夜或37℃孵育1小时；然后用含0.05％吐温-20的磷酸盐缓冲液洗三次，每次5分钟；

④将③步的酶标板各孔分别加入与单抗孵育后的白斑症病毒液，阳性对照——未与单抗孵育的白斑症病毒液，以及阴性对照——磷酸盐缓冲液，每孔200μl，4℃孵育4小时；然后用0.01M，pH 7.4的磷酸盐缓冲液洗三次，每次5分钟；

⑤将④步的酶标板各孔分别加入抗该病毒单抗库的多种单抗的混合液，每孔200μl，25℃孵育4小时；然后用磷酸盐缓冲液洗三次，每次5分钟；

⑥将⑤步的酶标板各孔分别加入按1∶200稀释的生物素标记的羊抗小鼠IgG抗体液，每孔200μl，37℃孵育1小时；然后用磷酸盐缓冲液洗三次，每次5分钟；

⑦将⑥步的酶标板各孔分别加入按1∶200稀释的碱性磷酸酶标记的亲和素，每孔200μl，37℃孵育1小时；然后用磷酸盐缓冲液洗三次，每次5分钟；

⑧将⑦步的酶标板各孔分别加入4-硝基酚磷酸盐底物液，每孔150μl，2-5分钟后，加入2M NaOH，每孔50μl，用酶标仪400nm波长测OD值；

⑨依据检测结果筛选抗白斑症病毒的中和单抗。

所述的该病毒中和单克隆抗体的检测筛选方法之二是：首先，白斑症病毒分别与抗该病毒单抗库中的单抗孵育，再与中国对虾血细胞的细胞膜反应，采用酶联免疫吸附检测方法，筛选出白斑症病毒的中和单抗F。

所述的酶联免疫吸附检测方法的步骤是：

(1)中国对虾血细胞的细胞膜的提取；

(2)白斑症病毒的制备；

(3)酶联免疫吸附实验检测：

①将(2)提取的白斑症病毒，分别与抗该病毒单抗库中的单抗混合，室温孵育；

②取(1)步制备的中国对虾血细胞的细胞膜，包被子96孔酶标板中，每孔100μl，4℃过夜；然后倒扣于滤纸上，去多余液体；

③将②步的酶标板用2％-3％的牛血清白蛋白封闭，每孔150μl，4℃过夜或37℃孵育1小时；然后用含0.05％吐温-20的磷酸盐缓冲液洗三次，每次5分钟；

④将③步的酶标板各孔分别加入与单抗孵育后的白斑症病毒液，阳性对照——未与单抗孵育的白斑症病毒液，以及阴性对照——磷酸盐缓冲液，每孔200μl，4℃孵育4小时；然后用0.01M，pH 7.4的磷酸盐缓冲液洗三次，每次5分钟；

⑤将④步的酶标板各孔分别加入抗该病毒单抗库的多种单抗的混合液，每孔200μl，25℃孵育4小时；然后用磷酸盐缓冲液洗三次，每次5分钟；

⑥将⑤步的酶标板各孔分别加入按1∶200稀释的生物素标记的羊抗小鼠IgG抗体液，每孔200μl，37℃孵育1小时；然后用磷酸盐缓冲液洗三次，每次5分钟；

⑦将⑥步的酶标板各孔分别加入按1∶200稀释的碱性磷酸酶标记的亲和素，每孔200μl。37℃孵育1小时；然后用磷酸盐缓冲液洗三次，每次5分钟；

⑧将⑦步的酶标板各孔分别加入4-硝基酚磷酸盐底物液，每孔150μl，2-5分钟后，加入2M NaOH，每孔50μl，用酶标仪400nm波长测OD值；

⑨依据检测结果筛选抗白斑症病毒的中和单抗。

所述的该病毒中和单克隆抗体的检测筛选方法之三是：首先，白斑症病毒分别与抗该病毒单抗库中的单抗孵育，再感染原代培养的对虾血细胞，依据血细胞免受感染的程度，筛选出白斑症病毒的中和单抗F。

所述的该病毒中和单克隆抗体的检测筛选方法之四是：其是将与抗该病毒单抗库中的单抗孵育后的白斑症病毒液，阳性对照——未与单抗孵育的白斑症病毒液，以及阴性对照——磷酸盐缓冲液分别注射入螯虾体内，依据被感染整虾的死亡率高低及存活时间长短，筛选出白斑症病毒的中和单抗F。

本发明的优点在于：由于研制了一种由杂交瘤细胞分泌的白斑症病毒的中和单克隆抗体；该杂交瘤细胞的保藏号为：CCTCC-C200423，其分泌的特异性白斑症病毒的中和单克隆抗体F具有与白斑症病毒上的粘附蛋白结合，从而封闭该病毒粘附蛋白，阻断该病毒粘附蛋白与对该病毒敏感细胞的细胞膜上的该病毒受体结合，阻止该病毒入侵细胞的功能；所以使得该中和单抗F应用到白斑症病毒病的研究中，可进一步鉴定白斑症病毒的粘附蛋白，研究白斑症病毒的感染机理，从而切断病毒的感染途径，达到预防控制虾类病毒病的目的。长势良好的该杂交瘤细胞具有大小均一，浑圆，透亮，分裂旺盛，能分泌单一、纯净的抗体，无限生产抗体的性能；该杂交瘤细胞分泌的白斑症病毒的中和单抗F在间接免疫荧光方法检测实验中，能与该病毒特异性结合；在荧光显微镜下观察，被该病毒感染细胞的细胞核，即该病毒繁殖区域显示黄绿色荧光，实验表征了该中和单抗F所具有的免疫特异性。

由于本发明的杂交瘤细胞所分泌的白斑症病毒的中和单克隆抗体及其制备方法，其中重要的制备技术路线是：从以提纯白斑症病毒抗原开始，采用免疫学方法建立抗白斑症病毒的单克隆抗体库，再选择该病毒中和单克隆抗体的检测筛选方法，从该单克隆抗体库中筛选出白斑症病毒的中和单抗F；使得本发明的该技术路线设计新颖，严密而合理。本发明的该技术路线的创新点在于：在采用斑点免疫印迹检测方法和酶联免疫吸附检测方法筛选白斑症病毒的中和单克隆抗体的过程中，首先，白斑症病毒分别与抗该病毒单抗库中的单抗孵育，再与中国对虾血细胞的细胞膜反应，然后用抗该病毒单抗库的多种单抗的混合液、生物素标记的羊抗小鼠IgG抗体和碱性磷酸酶标记的亲和素检测结合在中国对虾血细胞的细胞膜上的白斑症病毒，从而判断白斑症病毒的单克隆抗体的中和效果。在该中和实验中，用中国对虾血细胞的细胞膜与经抗该病毒单抗库中单抗孵育的白斑症病毒反应，筛选该病毒的中和单抗的技术方法是本发明的创新点之一，实验证明该中和技术方法可行。由于目前没有成功建立的对虾细胞系，本发明用经抗该病毒单抗库中单抗孵育的白斑症病毒感染原代培养的对虾血细胞，进行白斑症病毒中和单抗的筛选，实验证明此方法同样有效可行。宿主体内中和实验选取螯虾为实验动物，螯虾易得，对养殖条件要求不高，实验证明螯虾可作为筛选白斑症病毒中和单抗的理想实验动物。本发明的具有中和能力的抗白斑症病毒的单抗为研究白斑症病毒粘附蛋白的筛选、鉴定、分离，以及为研究该病毒的受体、配体奠定了基础；也可作为开发被动免疫口服疫苗的重要原料。中和单克隆抗体与病毒的保护性抗原特异性结合，为制备抗独特型抗体、亚单位疫苗及基因工程疫苗等提供了理论依据。

附图及其具体实施方式

本发明的实施例结合实验及其附图进一步说明如下：

图1为制备白斑症病毒中和单抗的技术路线方框图。

图2为本发明的白斑症病毒中和单抗的功能示意图。

图3为斑点免疫印迹检测方法筛选白斑症病毒的中和单抗的结果图。

图4为酶联免疫吸附检测方法筛选白斑症病毒的中和单抗的结果图。

图5为螯虾体内中和实验筛选白斑症病毒的中和单抗的结果图。

参见图1-5，图1中的制备白斑症病毒中和单抗的技术路线是从以白斑症病毒为抗原开始，采用免疫学方法建立抗白斑症病毒的单抗库；选择该病毒中和单克隆抗体的检测筛选方法，从该单抗库中检测筛选出白斑症病毒的中和单抗F。

图2中的：中和单抗1是从抗白斑症病毒的单抗库中筛选出的白斑症病毒的中和单抗，它可以阻断白斑症病毒2上的粘附蛋白3与中国对虾血细胞的细胞膜5上的白斑症病毒受体4的结合。

图3中的：第一组中的A是中国对虾血细胞的细胞膜和白斑症病毒反应后，用斑点免疫印迹检测方法检测病毒，结果斑点显蓝色；B是阴性对照，将中国对虾血细胞的细胞膜和磷酸盐缓冲液孵育，用斑点免疫印迹检测方法检测病毒，结果斑点无色；第二组中A是白斑症病毒与无中和性的抗白斑症病毒单抗库中单抗孵育后，再与中国对虾血细胞的细胞膜反应，用斑点免疫印迹检测方法检测病毒，结果斑点显蓝色；B是白斑症病毒与白斑症病毒的中和单抗F孵育后，再与中国对虾血细胞的细胞膜反应，用斑点免疫印迹检测方法检测病毒，结果斑点无色。

图4中的：阳性对照是中国对虾血细胞的细胞膜和白斑症病毒反应后，用酶联免疫检测方法检测，酶标仪测得的OD值结果；阴性对照是中国对虾血细胞的细胞膜和磷酸盐缓冲液孵育，用酶联免疫检测方法检测，酶标仪测得的OD值结果；单抗F是白斑症病毒与该病毒的中和单抗F孵育后，再与中国对虾血细胞的细胞膜反应，用酶联免疫检测方法检测，酶标仪测得的OD值结果。阳性对照和阴性对照的OD值的比值不小于2。

图5中的：阳性对照是将白斑症病毒注射入螯虾体内，15天中螯虾的死亡率变化；阴性对照是将磷酸盐缓冲液注射入螯虾体内，15天中螯虾的死亡率变化；单抗F是将有中和性的抗白斑症病毒的单抗F与白斑症病毒孵育后，注射入螯虾体内，15天中螯虾的死亡率变化；无中和作用单抗是白斑症病毒与抗该病毒单抗库中无中和性单抗孵育后，注射入螯虾体内，15天中螯虾的死亡率变化。

具体实施方式

制成的由杂交瘤细胞分泌的白斑症病毒的中和单克隆抗体；该杂交瘤细胞的保藏号为：CCTCC-C200423，其分泌的特异性的白斑症病毒的中和单克隆抗体F(简称：中和单抗F)具有与白斑症病毒上的粘附蛋白结合，从而封闭该病毒的粘附蛋白，阻断该病毒的粘附蛋白与该病毒敏感细胞的细胞膜上的该病毒受体结合，阻止该病毒入侵细胞的功能；长势良好的该杂交瘤细胞大小均一，浑圆，透亮，分裂旺盛，有无限分裂增生能力；在螯虾体内中和实验中，该中和单抗F中和效果明显，具有使螯虾死亡率低、存活时间长的能力。

本发明的白斑症病毒的中和单抗F的制备方法如下：

一、白斑症病毒单克隆抗体的研制：

(1)抗原的制备：白斑症病毒的提取

选取白斑明显的对虾，从心脏取血，200×g离心10分钟，取上清，铺于不连续蔗糖梯度上(蔗糖梯度分别为：35％、50％、60％)，4℃条件下80,000×g离心2小时，取病毒带，用磷酸盐缓冲液(PBS，0.01M，1∶10)稀释，80,000×g离心1小时，取沉淀，磷酸盐缓冲液(0.01M，pH 7.4)重悬，-80℃保存。

(2)免疫：

免疫用小白鼠为4周龄雌性Balb/c小白鼠，用(1)中提纯的病毒作为抗原，每次的免疫剂量为0.1ml。免疫共分4次进行，前2次是腹腔免疫，后2次为尾静脉免疫，前2次免疫间隔为2周，后3次免疫间隔为1周。免疫共分4次进行：第1次，基础免疫，腹腔注射；第2次，加强免疫，腹腔注射；第3次，二次加强免疫，尾静脉注射；第4次，融合前的扩增免疫，尾静脉注射。

(3)骨髓瘤细胞的复苏及培养：

融合前10天，将冷冻的P3U1骨髓瘤细胞从-80℃冰箱中取出，立即放入37℃水浴融化，200×g离心3分钟，加入1640(含10％胎牛血清)培养液，置4.5％CO₂培养箱内培养。处于对数生长期的瘤细胞浑圆，透亮，大小均一，排列整齐，呈半致密分布，取处于对数生长期的骨髓瘤细胞供融合用。

(4)融合：

小白鼠经过4次免疫后，最后一次扩增免疫后的第3天，杀死小鼠，无菌取脾用于细胞融合。

①乙醚麻醉免疫白斑症病毒的Balb/c小鼠，无菌取出脾脏和胸腺后，分别过100目网筛，用RPMI1640(-)吹下形成单细胞悬液。

②将脾细胞悬液和胸腺细胞悬液离心3分钟，1000转/分钟，，弃去上清液，脾细胞沉淀用预热到37℃的RPMIl640(-)重悬，胸腺细胞沉淀用少量预热到37℃的含1％HAT的1640(含10％胎牛血清)选择性细胞培养液重悬。

③取3×10⁷个处于对数生长期的骨髓瘤细胞，1000转/分钟离心3分钟，去上清液后，沉淀用RPMI1640(-)重悬。

④将脾细胞悬液与瘤细胞悬液混合均匀后，1000转/分钟离心3分钟，完全吸去上清液，轻弹离心管底，使两种细胞沉淀充分混匀。

⑤将离心管置于37℃水浴中预热的盛水烧杯中，用吸管吸已经预热到37℃的聚乙二醇溶液1ml，将管尖插入管底，轻轻搅动细胞沉淀，并缓缓滴加聚乙二醇，在1分钟内加完。然后在37℃水浴中静置5分钟。

⑧滴加已经预热到37℃的RPMI1640(-)液40ml，前缓后快，然后1000转/分钟离心5分钟，弃去上清液。

⑦将细胞沉淀用3ml预热到37℃的1640(含10％胎牛血清)细胞培养液重悬，取2ml冻存于-80℃(9份1640(含10％胎牛血清)+1份二甲亚砜)，余细胞悬液里补加含有1％HAT的1640(含10％胎牛血清)选择性细胞培养液和小鼠胸腺细胞40ml，混合均匀后每孔100μl滴加到4个96孔板内。培养于CO₂浓度为4.5％和37℃恒温恒湿条件下的CO₂培养箱中。

(5)检测：

融合以后的2周左右，杂交瘤细胞群落长到占96孔培养板的孔底1/3时开始检测，用间接免疫荧光抗体法检测融合细胞的阳性孔。

①用包埋液包埋患白斑病的对虾鳃丝，冷冻。

②冰冻切片机切包埋块并贴片，载玻片放入丙酮中固定20分钟，然后取出风干。

③取②步处理后载玻片加杂交瘤细胞培养上清，置37℃湿盒中孵育45分钟；用含0.05％吐温-20的磷酸盐缓冲液(PBST)洗3次，每次5分钟。

④取③步处理后载玻片加第二抗体异硫氰酸荧光素标记的羊抗小鼠IgG抗体(1∶200稀释)，37℃湿盒中孵育45分钟；用含0.05％吐温-20的磷酸盐缓冲液(PBST)洗3次，每次5分钟。

⑤甘油封片，荧光显微镜下观察，白斑症病毒和阳性细胞上清结合，再结合荧光素标记的羊抗小鼠IgG抗体，发黄绿色荧光；白斑症病毒和阴性细胞上清孵育，再加荧光素标记的羊抗小鼠IgG抗体，无荧光。

(6)克隆：采用有限稀释法对检测出的阳性杂交瘤细胞进行克隆：

①乙醚麻醉小鼠，无菌取出胸腺细胞(作为饲养细胞)后，在100目网筛上研磨，用RPMI1640(-)吹下形成单细胞悬液。

②1000转/分钟离心3分钟，弃去上清液，胸腺细胞沉淀用30ml1640(含10％胎牛血清)细胞完全培养液重悬。

③阳性细胞孔中的细胞用血球计数板计数，然后用1640(含10％胎牛血清)培养液以10的整次倍稀释，取450个杂交瘤细胞，放入22.5ml的胸腺细胞1640(含10％胎牛血清)悬液中，用滴管吹打均匀后，滴一个96孔板，150μl/孔，即每孔含有三个杂交瘤细胞。

④剩余的细胞悬液7.5ml与预留出的7.5ml胸腺细胞混合均匀，滴一个96孔板，平均每个孔滴加150μl，即含有一个杂交廇细胞。

⑤间接免疫荧光抗体法检测含有一个细胞克隆的细胞孔内上清(如4)所示)，白斑症病毒和阳性细胞上清结合，再结合荧光素标记的羊抗小鼠IgG抗体，发黄绿色荧光；白斑症病毒和阴性细胞上清孵育，再加荧光素标记的羊抗小鼠IgG抗体，无荧光。取阳性杂交瘤细胞转孔并扩增，收集细胞培养上清。

结果：长势良好的阳性杂交瘤细胞，大小均一，浑圆，透亮，分裂旺盛；间接免疫荧光法检测其分泌的抗白斑症病毒单抗与该病毒之间的特异性结合，在荧光显微镜下观察被该病毒感染细胞的细胞核，即病毒繁殖区域，显示黄绿色荧光，而正常组织中没有发现荧光。

二、筛选白斑症病毒的中和单克隆抗体：

(1)中国对虾血细胞的细胞膜的提取：

①取健康海捕中国对虾，用注射器吸取抗凝剂(0.45M NaCl，0.01M KCl，0.01MEDTA·Na₂，0.01M Hepes，pH 7.4)后从心脏抽血，4℃条件下200×g离心10分钟，沉淀用磷酸盐缓冲液(0.01M，pH 7.4)重悬，4℃条件下200×g再离心10分钟。

②将①步所得沉淀用提膜缓冲液(10％蔗糖，10mM Hepes，10mM EDTA，1mM PMSF)重悬，4℃条件下匀浆，显微镜观察细胞破碎情况，至90％细胞破碎。

③将②步所得破碎细胞悬液4℃，200×g离心10分钟，弃沉淀。

④取上清，4℃，8000×g离心10分钟，弃沉淀。

⑤取上清，4℃，100,000×g离心20分钟，弃上清，取沉淀。

⑥将⑤步所得细胞膜沉淀用磷酸盐缓冲液重悬，分装，冻存于-80℃。

(2)白斑症病毒的制备：

①取明显患白斑病的中国对虾头胸部(去除肝胰腺)，加25％蔗糖溶液(蒸馏水配，W/V)，冰浴匀浆。

②匀浆液4℃条件下以600×g离心20分钟，沉淀组织碎块。

③取②步所得上清在4℃条件下800×g离心20分钟，取上清。

④取③步所得上清液4℃条件下25000转/分钟离心2小时，弃去上清液；

⑤取④步所得沉淀用25％蔗糖溶液重悬，4℃条件下搅拌1小时；

⑥搅拌后液体轻铺于蔗糖梯度(蔗糖梯度分别为：33％、40％、46％、52％、57％、62％)上，4℃条件下25000转/分钟离心2小时；

⑦离心后取病毒区带，25％蔗糖稀释，4条件下25000转/分钟离心1小时。

⑧取⑦步所得沉淀的病毒用磷酸盐缓冲液重悬，负染电镜观察病毒完整性，病毒80％完整，具囊膜，分装，冻存于-80℃。

(3)采用斑点免疫印迹检测方法筛选本发明的白斑症病毒的中和单抗：

①取(2)中制备的白斑症病毒液与抗白斑症病毒单抗库中各单抗等体积混合，室温孵育2小时。

②取(1)中提取的中国对虾血细胞的细胞膜点于硝酸纤维素膜(NC)上，每点1μl，室温晾干。

③将上述②步所得硝酸纤维素膜用2％-3％的牛血清白蛋白(BSA)封闭，4℃过夜或37℃孵育1小时；然后硝酸纤维素膜用含0.05％吐温-20磷酸盐缓冲液(PBST)洗三次，每次5分钟。

④将③步硝酸纤维素膜分别放入与单抗孵育后的白斑症病毒液里，未与单抗孵育的白斑症病毒液(病毒与膜结合阳性对照)，以及磷酸盐缓冲液(病毒与膜结合阴性对照)，4℃孵育4小时；然后硝酸纤维素膜用磷酸盐缓冲液(0.01M，pH 7.4)洗三次，每次5分钟。

⑤将④步硝酸纤维素膜放入抗白斑症病毒单抗库的多种单抗的混合液里，25℃孵育4小时；然后硝酸纤维素膜用磷酸盐缓冲液洗三次，每次5分钟。

⑥将⑤步洗过的硝酸纤维素膜放入生物素标记的羊抗小鼠IgG抗体(1∶200稀释)中，37℃孵育1小时；然后硝酸纤维素膜用磷酸盐缓冲液洗三次，每次5分钟。

⑦将⑥步洗过的硝酸纤维素膜放入碱性磷酸酶标记的亲和素(1∶200稀释)里，37℃孵育1小时；然后硝酸纤维素膜用磷酸盐缓冲液洗三次，每次5分钟。

⑧最后将⑦步处理过的硝酸纤维素膜放入NBT-BCIP发色液中发色，约30分钟。

本发明的(3)的斑点免疫印迹法实验结果表明：检测中国对虾血细胞的细胞膜与白斑症病毒的结合反应，其中生物素标记的羊抗小鼠IgG抗体和碱性磷酸酶标记的亲和素的应用，放大了细胞膜与白斑症病毒的结合反应，使结果更容易得出；同时设阴性对照消除了白斑症病毒的混合单抗和生物素标记的羊抗小鼠IgG抗体，以及碱性磷酸酶标记的亲和素的非特异性吸附对实验结果造成的影响。结果表明，抗白斑症病毒的单抗F可以封闭病毒，阻断病毒与中国对虾血细胞的细胞膜的结合。

(4)采用酶联免疫吸附测定法筛选本发明的中和单抗：

①取(2)中制备的白斑症病毒稀释液(1∶10，磷酸盐缓冲液稀释)与抗白斑症病毒单抗库中单抗等体积混合，室温孵育2小时。取2)中制备的白斑症病毒(即，提纯的白斑症病毒)稀释液(1∶10，磷酸盐缓冲液稀释)与等体积的磷酸盐缓冲液混合，室温2小时，做病毒与膜结合阳性对照。

②取(1)中提取的中国对虾血细胞的细胞膜包被于96孔酶标板中，每孔100μl，4℃过夜；将酶标板倒扣于滤纸上，去多余液体。

③将②中包被了中国对虾血细胞的细胞膜的96孔酶标板中加入2％-3％的牛血清白蛋白(BSA)封闭，每孔150μl，4℃过夜或37℃孵育1小时；将上述酶标板用含0.05％吐温-20磷酸盐缓冲液(PBST)洗三次，每次5分钟。

④将③步处理过的酶标板中分别加入与单抗孵育后的白斑症病毒液、未与单抗孵育的白斑症病毒液(病毒与膜结合阳性对照)，以及磷酸盐缓冲液(病毒与膜结合阴性对照)，每孔200μl，4℃孵育4小时；然后酶标板用磷酸盐缓冲液(0.01M，pH7.4)洗三次，每次5分钟。

⑤将④步处理过的酶标板中加入抗白斑症病毒单抗库的多种单抗的混合液，每孔150μl，25℃孵育4小时。然后酶标板用磷酸盐缓冲液(0.01M，pH7.4)洗三次，每次5分钟。

⑥将⑤步处理过的酶标板中加入生物素标记的羊抗小鼠IgG抗体(1∶200稀释)，每孔150μl，37℃孵育1小时；然后酶标板用磷酸盐缓冲液(0.01M，pH7.4)洗三次，每次5分钟。

⑦将⑥步洗过的酶标板中加入碱性磷酸酶标记的亲和素(1∶200稀释)里，每孔150μl，37℃孵育1小时。然后酶标板用磷酸盐缓冲液(0.01M，pH7.4)洗三次，每次5分钟。

⑧将⑦步处理过的酶标板中加入4-硝基酚磷酸盐(pNPP)底物液，每孔150μl，2-5分钟后，加入2M NaOH终止反应，每孔50μl，用酶标仪400nm波长测OD值。

本发明所采用酶联免疫吸附测定法检测的结果：用酶联免疫吸附检测技术检测中国对虾血细胞的细胞膜与白斑症病毒的结合，反应阳性，其中生物素-亲和素的应用放大了病毒和细胞膜的结合反应，使结果更容易得出；同时设阴性对照消除了抗白斑症病毒的混合单抗和生物素标记的羊抗小鼠IgG抗体，以及碱性磷酸酶标记的亲和素的非特异性吸附对实验结果造成的影响。阳性对照与阴性对照的比值不小于2，说明实验结果可信。检测结果表明，白斑症病毒的中和单抗F可以最大程度地封闭病毒，阻断病毒与中国对虾血细胞的细胞膜的结合。

三、原代中国对虾培养及螯虾体内中和实验筛选白斑症病毒的中和单抗：

(1)病毒悬液的制备：

取白斑明显的中国对虾的鳃丝进行称重，与磷酸盐缓冲液(0.01M，pH7.4)1∶10(W/V)稀释，4℃匀浆，匀浆液4℃、600×g离心20分钟，上清液用0.45μm的滤膜过滤除菌，并以此病毒悬液为母液，浓度定为1。

(2)中国对虾血细胞培养：

①无菌配制实验用培养基，实验用基本培养基为Leibovitz’s 2×L-15，培养基中加入青霉素100UI/ml和链霉素100μg/ml，2.4％NaCl，2％葡萄糖，20％小牛血清，pH 7.2-7.4，0.22μm滤膜过滤，实验中所用玻璃器皿都经121℃，15分钟高压灭菌。实验操作在无菌操作台上进行。

②75％酒精消毒健康海捕中国对虾体表，心脏处酒精棉球消毒。

③用5ml注射器吸取抗凝剂(8.2g/L氯化钠，5.5g/L柠檬酸，19.8g/L葡萄糖，8.8g/L柠檬酸钠，pH 5.6)，与血细胞等比从对虾心脏抽血。400×g，离心10分钟，弃上清。

④将③步所得沉淀用培养基重悬，血球计数板计数，加入96孔细胞培养板，50ul/孔，每孔内约有3×10⁵个细胞，25℃恒温培养，2小时后，相差显微镜观察细胞贴壁，补加细胞培养液，100μl/孔。

⑤倒置相差显微镜观察细胞生长状况，3-4天换液一次。

(3)白斑症病毒单抗的体外中和：

①取步骤(1)中制备的白斑症病毒粗提母液以不含小牛血清的2×L-15基本细胞培养液稀释至0.05，与抗白斑症病毒的单抗库中各单抗等比例(1∶1)混合，室温放置2小时。取(1)中制备的白斑症病毒粗提母液以不含小牛血清的2×L-15基本细胞培养液梯度稀释至0.05，与等体积的磷酸盐缓冲液混合，室温2小时，做病毒感染细胞阳性对照。

②将步骤(2)中培养于96孔细胞培养板中的中国对虾血细胞培养3天后，吸除培养液，无菌换入单抗与病毒的混合液、病毒液(病毒感染阳性对照)，以及磷酸盐缓冲液(病毒感染阴性对照)，200μl/孔，25℃恒温孵育2小时。

③孵育后的96孔细胞培养板吸除病毒液等，换入新鲜的细胞培养液，每孔150μl。

④连续4天用相差显微镜观察以上三步处理后的96孔细胞培养板内的细胞，记录细胞病变与死亡情况。结果见表1。

表1用原代培养的中国对虾血细胞检测抗白斑症病毒单抗的中和效果。

注：+：细胞开始聚集成堆，没有明显的细胞死亡现象；++：细胞孔内有细胞碎片，有细胞死亡现象；+++：细胞孔内有成堆的细胞碎片，细胞死亡现象明显；-：细胞无变化，没有细胞病变。

本发明所采用原代培养的中国对虾血细胞中和实验结果：各处理不同，被感染的血细胞的死亡程度也不同。阳性对照中，细胞感染白斑症病毒1天后，感染的细胞聚集成小堆，细胞明显缩小，但没有发现细胞碎片；与无中和作用的抗白斑症病毒单抗孵育后的病毒感染的中国对虾血细胞的病变情况同阳性对照；与抗白斑症病毒单抗F孵育后的病毒感染的中国对虾血细胞没有明显的细胞病变，同未感染病毒的中国对虾血细胞阴性对照。感染3天后，病毒液感染的细胞死亡更多，细胞碎片堆增大；与白斑症病毒的中和单抗F孵育后的白斑症病毒感染的血细胞出现细胞病变的时间晚于阳性对照、与无中和作用的抗白斑症病毒单抗孵育后的白斑症病毒感染的血细胞，细胞病变的程度也小于阳性对照。最终，从抗白斑症病毒单抗库中筛选出白斑症病毒的中和单抗F。

(4)螯虾体内中和筛选白斑症病毒的中和单抗：

①将上述(1)中制备的病毒母液用无菌磷酸盐缓冲液(0.01M，pH 7.4)稀释至0.05，与抗白斑症病毒单抗库中单抗等比例(1∶1)混合，室温孵育2小时。取1)中制备的白斑症病毒粗提母液用无菌磷酸盐缓冲液(0.01M，pH 7.4)稀释至0.05，与等体积的磷酸盐缓冲液混合，室温2小时，做病毒感染细胞阳性对照。

②将上述①中制备的病毒母液和抗白斑症病毒单抗的孵育液、未结合单抗的病毒液，以及磷酸盐缓冲液(0.01M，pH 7.4)从腹面第三腹节皮下注射入螯虾，50μl/只，螯虾分组情况如下表2。

表2：整虾分组注射情况

③各实验组和对照组养殖条件相同，每天换水一次。注射之后每天观察记录的死亡数。

本发明所采用的螯虾体内中和实验结果：阳性对照组中螯虾在注射白斑症病毒后第4天开始死亡，第7天死亡率达100％；与白斑症病毒的中和单抗F孵育后的白斑症病毒注射的螯虾组，在注射后第6天死亡率达56％，此后，螯虾不再死；无中和性的抗白斑症病毒单抗库中的单抗结合病毒后，注射螯虾，螯虾的死亡情况与直接注射病毒螯虾组的死亡情况相同。因此，据各组螯虾死亡率高低及存活时间长短，筛选出白斑症病毒的中和单抗F。

总结结果：

本发明的实验制备了抗白斑症病毒的单克隆抗体库，从该单抗库中采用斑点免疫印迹检测方法、酶联免疫吸附检测方法、原代培养的中国对虾血细胞以及螯虾体内中和实验检测筛选出白斑症病毒的中和单抗F。

本领域的普通技术人员都会理解，在本发明的保护范围内，对于上述实施例进行修改，添加和替换都是可能的，其都没有超出本发明的保护范围。

本发明所用仪器及试剂：

冰冻切片机(购自LEICA公司)；荧光显微镜(购自Olympus公司)；倒置相差显微镜(购自Olympus公司)；1640(购自GIBCO公司)；胎牛血清(购自HYCLONE公司)；HAT(购自GIBCO公司)；异硫氰酸荧光素标记的羊抗小鼠抗体(购自SIGMA公司)；牛血清白蛋白(购自SIGMA公司)；硝酸纤维素膜(购自PALL公司)；碱性磷酸酶标记羊抗小鼠血清(购自SIGMA公司)；生物素标记羊抗小鼠血清(购自SIGMA公司)；碱性磷酸酶标记亲和素(购自SIGMA公司)；NBT-BCIP(购自SIGMA公司)；4-硝基酚磷酸盐(pNPP)(购自SIGMA公司)；Leibovitz’s L-15(购自GIBCO公司)；小牛血清(购自HYCLONE公司)；二甲亚砜(购自SIGMA公司)。

Claims (4)

1、一种白斑症病毒中和单克隆抗体的制备方法，其特征在于：所述的方法是从以白斑症病毒为抗原开始，采用免疫学方法建立抗白斑症病毒的单抗库；选择中和单克隆抗体的检测筛选方法，即首先将白斑症病毒分别与该单抗库中的单抗孵育，再与中国对虾血细胞的细胞膜反应，采用斑点免疫印迹检测方法或酶联免疫吸附检测方法，筛选出白斑症病毒的中和克隆抗体。

2、根据权利要求1所述白斑症病毒中和单克隆抗体的制备方法，其特征在于：所述的斑点免疫印迹检测方法的步骤是：

(1)中国对虾血细胞的细胞膜的制备；

(2)白斑症病毒的提取；

(3)斑点免疫印迹检测：

①取(2)步提取的白斑症病毒，分别与抗该病毒单抗库中的单抗混合，室温孵育；

②取(1)步制备的中国对虾血细胞的细胞膜，点于硝酸纤维素膜上，每点1μl，室温晾干；

③将②步的硝酸纤维素膜用2％——3％的牛血清白蛋白封闭，4℃过夜或37℃孵育1小时；然后用含0.05％吐温-20的磷酸盐缓冲液洗三次，每次5分钟；

④将③步的硝酸纤维素膜分别放入与单抗孵育后的白斑症病毒液中，阳性对照——未与单抗孵育的白斑症病毒液，以及阴性对照——磷酸盐缓冲液，4℃孵育4小时；然后用0.01M，pH7.4的磷酸盐缓冲液洗三次，每次5分钟；

⑤将④步的硝酸纤维素膜分别放入抗该病毒单抗库的多种单抗的混合液中，25℃孵育4小时；然后用磷酸盐缓冲液洗三次，每次5分钟；

⑥将⑤步的硝酸纤维素膜分别放入按1∶200稀释的生物素标记的羊抗小鼠IgG抗体液中，37℃孵育1小时；然后用磷酸盐缓冲液洗三次，每次5分钟；

⑦将⑥步的硝酸纤维素膜分别放入按1∶200稀释的碱性磷酸酶标记的亲和素中，37℃孵育1小时；然后用磷酸盐缓冲液洗三次，每次5分钟；

⑧将⑦步的硝酸纤维素膜放入NBT-BCIP发色液中发色，约30分钟；

⑨依据各斑点的显色结果，筛选白斑症病毒的中和单克隆抗体。

3、根据权利要求1所述白斑症病毒中和单克隆抗体的制备方法，其特征在于：所述的酶联免疫吸附检测方法的步骤是：

(1)中国对虾血细胞的细胞膜的制备；

(2)白斑症病毒的提取；

(3)酶联免疫吸附实验检测：

①将(2)提取的白斑症病毒，分别与抗该病毒单抗库中的单抗混合，室温孵育；

②取(1)步制备的中国对虾血细胞的细胞膜，包被于96孔酶标板中，每孔100μl，4℃过夜；然后倒扣于滤纸上，去多余液体；

③将②步的酶标板用2％——3％的牛血清白蛋白封闭，每孔150μl，4℃过夜或37℃孵育1小时；然后用含0.05％吐温-20的磷酸盐缓冲液洗三次，每次5分钟；

④将③步的酶标板各孔分别加入与单抗孵育后的白斑症病毒液，阳性对照——未与单抗孵育的白斑症病毒液，以及阴性对照——磷酸盐缓冲液，每孔200μl，4℃孵育4小时；然后用0.01M，pH 7.4的磷酸盐缓冲液洗三次，每次5分钟；

⑤将④步的酶标板各孔分别加入抗该病毒单抗库的多种单抗的混合液，每孔150μl，25℃孵育4小时；然后用磷酸盐缓冲液洗三次，每次5分钟；

⑥将⑤步的酶标板各孔分别加入按1∶200稀释的生物素标记的羊抗小鼠IgG抗体液，每孔150μl，37℃孵育1小时；然后用磷酸盐缓冲液洗三次，每次5分钟；

⑦将⑥步的酶标板各孔分别加入按1∶200稀释的碱性磷酸酶标记的亲和素，每孔150μl，37℃孵育1小时；然后用磷酸盐缓冲液洗三次，每次5分钟；

⑧将⑦步的酶标板各孔分别加入4-硝基酚磷酸盐底物液，每孔150μl，2——5分钟后，加入2M NaOH，每孔50μl，用酶标仪400nm波长测OD值；

⑨依据检测结果筛选抗白斑症病毒的中和单克隆抗体。

4一种如权利要求1所述方法制备的白斑症病毒中和单克隆抗体，其特征在于：所述的白斑症病毒中和单克隆抗体是由保藏号为：CCTCC-C200423的杂交瘤细胞分泌的。

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