CN1171903C

CN1171903C - 小麦高分子量谷蛋白亚基单克隆抗体及其杂交瘤细胞系

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Publication number: CN1171903C
Application number: CNB011447818A
Authority: CN
Inventors: 张学勇; 王汉潜
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2001-12-25
Filing date: 2001-12-25
Publication date: 2004-10-20
Anticipated expiration: 2021-12-25
Also published as: CN1428354A

Abstract

本发明公开了一种小麦高分子量谷蛋白亚基单克隆抗体及其杂交瘤细胞系，目的是提供能与小麦高分子量谷蛋白亚基专一结合的单克隆抗体。本发明拥有能够分泌与小麦高分子量谷蛋白亚基专一结合的单克隆抗体的杂交瘤细胞系，保藏号为：CGMCC №0651。用本发明的单克隆抗体作探针，对小麦胚乳发育时期表达文库实施筛选，可排除其它基因的干扰，高效、准确地分离和克隆高分子量谷蛋白亚基编码基因。用本发明的单抗作探针，可以从小麦和其近亲特别是山羊草属植物中大量分离和克隆高分子量麦谷蛋白编码基因，并对其它禾本科作物小麦高分子量麦谷蛋白基因转化体进行鉴定和筛选。

Description

小麦高分子量谷蛋白亚基单克隆抗体及其杂交瘤细胞系

技术领域

本发明涉及杂交瘤细胞系及其所产生的单克隆抗体。

背景技术

小麦加工品质在遗传上主要受谷蛋白(Glutenin)和醇溶蛋白(Gliadin)组成、直链淀粉和支链淀粉比例的影响，其中高分子量谷蛋白亚基(HMW-GS)组成对品质的影响最为突出(Payne et al，1983；Shewry et al 1992)。例如1D染色体上“5+10”组合通常与优良烘烤品质密切相关。优质亚基含有比较丰富的半胱氨酸，亚基之间能形成比较多的二硫键，使面团具有较强的弹性和延展性。谷蛋白基因的表达受遗传背景的影响较小，同一基因在不同品种中表达强度差异很小，谷蛋白每个亚基的合成又受单个基因位点或数个相同基因串联控制。这些基因都在小麦胚乳中表达，且表达的时间明确，主要是在受精至蜡熟期表达，为通过cDNA文库分离、克隆和研究这些基因提供了极大的方便；因此，小麦品质基因的克隆和利用是目前小麦功能基因组学研究进展最快的领域之一(Anderson et al.1997，1998；Blechl & Anderson1996)。在小麦胚乳发育时期，有上千个不同的基因同时表达，如何从胚乳发育时期cDNA表达文库众多基因中将重要的高分子量谷蛋白亚基编码筛选出来，是利用基因工程改良小麦品质的关键技术。

发明内容

本发明的目的是提供能与小麦高分子量谷蛋白亚基专一结合的单克隆抗体。

能够分泌与小麦高分子量谷蛋白亚基专一结合单克隆抗体的杂交瘤细胞系已于2001年11月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏号为CGMCC №0651。

本发明巧妙地以小麦高分子量谷蛋白亚基(14，15)为抗原对小鼠实施免疫，通过杂交瘤细胞来生产与小麦高分子量谷蛋白亚基专一结合的单克隆抗体。用该单克隆抗体作探针，对表达文库实施筛选，就可排除其它基因的干扰，高效、准确地分离和克隆高分子量谷蛋白亚基编码基因。

用本发明所得的单抗作探针，可以从小麦和其近亲、特别是山羊草属植物中大量分离和克隆高分子量麦谷蛋白编码基因，为小麦品质的基因工程改良提供众多的候选基因，图5即为用所发明的单克隆抗体筛选后得到的阳性噬菌斑。

用本发明的单抗作探针，可以进行水稻、大麦、玉米、谷子、高粱等作物小麦HMW-GS基因转化体的鉴定和筛选。研究目的基因在这些作物的细胞和组织中的表达及表达产物的转运过程。

下面结合附图对本发明的实施例做进一步说明。

附图说明

图1为高分子量谷蛋白亚基的SDS-PAGE分离电泳谱带。

图2为用间接ELISA方阵法，确定包被抗原、抗体的最适工作浓度。

图3-A为13个不同小麦品种的麦谷蛋白经SDS-PAGE分离后的电泳结果。

图3-B为13个不同小麦品种West Blotting杂交结果。

图4-A为一些禾本科作物贮藏全蛋白经SDS-PAGE分离后的电泳结果。

图4-B为一些禾本科作物West Blotting杂交结果。

图5为用本发明抗体筛选得到的阳性噬菌斑。

具体实施方式

实施例1、抗原的制备

1、高分子量谷蛋白亚基(HMW-GS)的提取

取0.1克小麦种子研碎成粉状，置于1.5毫升Eppendorf管中，加入1毫升50％异丙醇，60℃水浴20--30分钟后，室温放置2小时，4000rpm离心20分钟，弃上清。重复以上操作一次。

向管中加入0.7毫升蛋白提取缓冲液[0.125M Tris-HCl，pH6.8；2％(W/V)SDS；20％(V/V)甘油；1％(W/V)DTT；0.2％(W/V)溴酚兰]，60℃水浴至少2小时后，4000rpm离心20分钟，取上清液用于电泳。

2、高分子量谷蛋白亚基(HMW-GS)的SDS-PAGE分离

采用Bio-rad公司的PROTEAN II XI型垂直板电泳槽进行分离，每块板10mA稳流电泳18小时，其中浓缩胶缓冲液为0.5Mtris-HCl，pH6.8；分离胶缓冲液为3Mtris-HCl，pH8.8；浓缩胶的浓度为3.75％；分离胶的浓度为10％；凝胶的交联度为2.66％。

3、高分子量谷蛋白亚基(HMW-GS)1Bx14和1By15亚基的制备

SDS-PAGE分离后用水冲洗胶板，然后纵向切下一部分凝胶，染色后快速脱色，找出HMW-GS的1Bx14和1By15亚基(两者不能完全分开)所在的位置，对比未染色部分凝胶、横向切下所需的部分。采用Bio-rad公司的422型电洗脱仪，将切下的胶条置于玻璃管之中，以每管8-10mA恒流洗脱3-5小时，收集洗出液。用聚乙二醇6000(PEG 6000)浓缩，之后用蒸馏水透析24小时，其间换透析液3次，再用PBS透析24小时，换透析液3次。收集透析后的HWM-GS。

用紫外分光光度计测定HMW-GS在260nm和280nm的吸收值分别为1.106和1.019，利用下列公式计算蛋白质的浓度：蛋白质含量(mg/ml)＝1.45×OD₂₈₀-0.74×OD₂₆₀，蛋白质含量为0.659mg/ml。

同时，按照上述方法，对HMW-GS总蛋白提取液和HMW-GS的1Bx14和1By15亚基制备液进行电泳，验证HMW-GS的1Bx14和1By15亚基制备效果，如图1所示，第一泳道是纯化的样品，第二泳道是小麦品种小偃6号对照，从图中可以看出，经上述方法得到了HMW-GS的1Bx14和1By15亚基。将HMW-GS的1Bx14和1By15亚基制备液分装于Eppendorf管中，-20℃保存备用。

实施例2、杂交瘤细胞系的建立

1、动物免疫

按表1方案进行对6-8周龄雌性BALB/c小鼠，：

表1、抗原HMW-GS 1Bx14/1Bx15亚基的免疫方案

免疫时间抗原类型免疫剂量(μg/只) 免疫途径

首免 HMW-GS1Bx14/1By15+FCA 90 背部、颈部皮下多点注射

间隔时间 14天

二免 HMW-GS1Bx14/1By15+FICA 90 背部、颈部皮下多点注射

间隔时间 23天

三免HMW HMW-GS1Bx14/1By15+FICA 90 背部、颈部皮下多点注射

间隔时间 30天

四免 HMW-GS1Bx14/1By15+FICA 90 背部、颈部皮下多点注射

间隔时间 65天

五免 HMW-GS1Bx14/1By15 45 腹腔注射

2、检测方法的建立

采用间接ELISA方法，按方阵法确定包被抗原、抗体的最适工作浓度，如图2所示，纵列为抗原，横向是抗血清的浓度，第1列为阴性血清；第2-3列为13.18μg/ml；第4-5列为6.59μg/ml；第6-7列为3.28μg/ml；第8-9列为1.64μg/ml；第10-11列为0.82μg/ml；第12列为鼠骨髓瘤细胞SP2/0培养上清液，抗血清的浓度自上而下分别为1∶800、1∶1600、1∶3200、1∶6400、1∶12800、1∶25600、1∶51200、1∶102400。具体步骤如下：

(1)抗原的稀释

用0.05M(pH9.6)的碳酸盐缓冲液将包被抗原倍比稀释成13.18μg/ml、6.59μg/ml、3.28μg/ml、1.64μg/ml和0.82μg/ml。

(2)抗血清的稀释

用0.01M(pH7.2)PBST-BSA[0.1％(W/V)]将四免后小鼠血清按1∶800、1∶1600、1∶3200、1∶6400、1∶12800、1∶25600、1∶51200、1∶102400稀释。

(3)ELISA反应程序

A、包被：将稀释好的包被抗原加至酶标板，100μl/孔，4℃过夜，PBST洗3遍，每次浸泡3分钟。

B、封闭：每孔加入200μl PBST-BSA[2％(W/V)]封闭液，37℃湿盒中放置30-60分钟，洗涤同上。

C、加样：加入已经稀释好的抗血清，1001/孔，37℃湿盒中放置60分钟，洗涤同上。

D、加二抗：除空白对照孔以外，加入HRP-羊抗鼠IgG(按推荐浓度稀释)100μl/孔，空白对照孔内加入PBST(100μl/孔)，37℃湿盒中保温60分钟，洗涤同上。

E、显色：加入TMB反应液，100μl/孔，室温放置10分钟。

F、终止：加入2MH₂SO₄(50μl/孔)，终止反应。

G、读数：测定各孔450nm的OD值。

判定标准：阳性血清OD_450nm在1.0左右，与阴性血清差距最大的抗原包被浓度，抗体稀释度为最佳工作浓度，最佳抗原包被浓度为6.59μg/mL，最佳二抗工作浓度为1∶10000。

3、三免后小鼠血清效价的测定

采用已经建立好的间接ELISA方法测定效价

判定标准：以P/N≥2，即OD_450nm大于2倍阴性对照孔的抗血清最高稀释度为该血清的ELISA终点效价，这里是1∶102400。

4、杂交瘤细胞的建立

(1)细胞的冻存与复苏

a、细胞的冻存

i、将预备冻存的细胞从瓶壁吹下，移入离心管中，1000rpm离心10分钟。

ii、弃上清，视沉淀细胞多少用3-4ml细胞冻存液悬浮，分装于冻存管中。

iii、将做好标记的冻存管放入4℃冰箱中过夜后，移入-70℃冰箱中3-18小时后，转入液氮罐中保存。

B、细胞的复苏

i、自液氮罐中取出待复苏的细胞，迅速投入37-40℃水浴中，等冻存管内容物全部融化后，1000rpm离心8-10分钟。

ii、1000rpm将冻存管离心10min。置于超净台中，用75％酒精擦试冻存管盖，旋开管盖，弃上清，用含10％胎牛血清培养液将沉淀细胞转移至100ml细胞瓶中。

iii、将细胞置于37℃，5％ CO2培养箱中培养，等细胞轻附瓶壁后(约24-36小时)换液。

(2)饲养细胞的制备

A、将未免疫的BALB/C小鼠(10周龄以上)，处死，用注射器吸取DMEM培养液8-10ml注入小鼠腹腔。1-2min，再轻轻吸出腹内DMEM液，置于灭菌后的50ml离心管中。

B、将离心管中含腹腔饲养细胞的DMEM液离心(1000rpm，200g)10min，弃上清液，用20ml 1％HAT选择培养基悬浮并混匀，铺加于两块96孔细胞培养液中，100μl/孔。

(3)细胞融合

A、免疫脾细胞的制备

i、在强化免疫后第三天取免疫小鼠，分离血清作为抗体阳性对照。

ii、取出眼球放血致死后的小鼠脾脏，放入盛有5-10ml DMEM液中，轻轻漂洗，剥除脾脏周围的结缔组织。

iii、将脾脏移入另一个盛有约30ml DMEM液的平皿中，用灭菌注射器(10ml)吸10ml DMEM液，针头插入脾脏的一端，并用力推注DMEM液，将脾脏内的细胞冲洗出来，反复冲洗数次，直至脾脏颜色呈淡白为止。

iv、将冲洗下来的脾细胞转移入50ml离心管中，1000rpm(200g)离心10min，弃上清，然后将细胞重悬至20ml DMEM液中。

v、显微镜下计数。

B、骨髓瘤细胞的制备

i、融合前的第10天左右在培养基中加入8-氮杂鸟嘌呤(20ug/ml)，将SP2/0细胞连传三代，以保持HGPRT缺陷型。

ii、融合前24-48小时将SP2/0细胞扩大培养(分瓶培养)于100ml细胞瓶中。

iii、融合当天，选择处于对数生长期的SP2/0细胞，用吸管将细胞从瓶壁上轻轻吹下，收集于50ml离心管中，1000rpm离心10min，然后以30mlDMEM液重新悬浮。

iv、用血球计数板计数，并加少许台粉兰，计算细胞成活率，细胞成活率大于90％后，方可用于融合。

C、融合方法

i、分别取1×108个脾细胞和2×107个SP2/0细胞的细胞悬液(两种细胞之比为5∶1)，合并置于50ml塑料离心管中，轻轻混匀。

ii、1000rpm(200×g)离心8min，将上清尽量弃净，然后用手指轻弹管底，使沉淀细胞松散成糊状。

iii、吸1ml DMEM液加入1g灭菌的PEG2000中，并用灭菌7％NaHCO₃调其pH值至7.5左右，混匀。

iv、吸50％PEG2000 1ml，沿转动的离心管缓缓加入，控制时间在60秒钟内加完，然后置于37℃水中静置作用60秒。

v、加入25ml DMEM液终止PEG2000的作用。

vi、将融合细胞置于800rpm(150×g)离心8min，弃上清液，加入20ml 1％ HAT培养，轻轻吸吹，使沉淀细胞悬浮。

vii、将悬浮细胞液再加于有饲养细胞的96孔板中，每孔100μl，置于37℃，5％ CO₂培养箱中培养。

viii、观察记录细胞生长情况，融合后第4天，用1％HAT选择培养液半量换液，第8天改用1％HT选择培养液半量换液。

(4)阳性杂交瘤细胞的筛选

待融合后的细胞克隆生长到覆盖细胞孔底部1/4-1/3时，即用建立好的间接ELISA方法对所有有克隆生长的培养上清进行抗体检测，检测为阳性的细胞迅速扩大培养或选择强阳性孔进行克隆，阴性孔两天后再测一次，如仍为阴性则弃去。

(5)阳性杂交瘤细胞的克隆化

采用有限稀释法。

A、克隆化的前一天制备饲养细胞，方法如前所述。

B、将检测为强阳性的细胞孔用巴氏吸管轻轻吹吸细胞使之分散均匀，吸至1ml20％胎牛血清的DMEM培养液中，并取少许细胞悬液于血球细胞计数板上计数。

C、用1％HT选择培养液将阳性杂交瘤稀释至100个/ml，然后，再稀释至20个/ml、10个/ml、5个/ml。

D、将20个/ml细胞的细胞悬液按100μl/孔加于96孔细胞板中，共32个孔，同样将10个/ml细胞的细胞悬液和5个/ml的细胞悬液分别加至另外两组32个细胞孔中。

E、观察细胞生长情况。第4天开始用1％HT选择培养液进行半量换液，每3天一次，待细胞克隆长至覆盖培养孔面积的1/4-1/3时，取上清液作抗体检测。

F、选择仅有一个克隆生长的阳性孔再进行克隆化，获得稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株CGMCC №0651。

实施例3、体外培养法制备单抗

将已建立的细胞株CGMCC №0651扩大培养，待细胞浓度达105个/ml时停止换液，持续培养直至细胞全部死亡。收集培养液，1000rpm，离心10min，获得高分子量麦谷蛋白亚基的单克隆抗体，上清液4℃保存备用。

实施例4、体内诱生腹水法制备单抗

1、挑选经产BALB/C小鼠，并腹腔注射灭菌石蜡油0.5ml/只。

2、10天后，将稳定分泌阳性抗体的杂交瘤细胞CGMCC №0651吹打下来，1000rpm离心10min，弃上清，用5ml DMEM液重新悬浮，并做细胞计数。

3、每只小鼠腹腔接种杂交瘤细胞约1×106个。

4、接种细胞7-10天后，可见小鼠腹部明显增大，用注射器采集腹水。

5、将腹水5000rpm离心10min，收集上清，获得抗高分子量谷蛋白亚基的单克隆抗体，分装-30℃冰箱冻存待用。

实施例5、单克隆抗体的特异性鉴定(杂交瘤细胞培养上清液、腹水中单抗效价的测定)

1、将收集的杂交瘤细胞培养上清按2×倍比稀释，按照已建立的ELISA方法测定其效价，结果为1∶100。

2、将腹水5000rpm离心30min，取上清按10×倍比稀释，按建立的ELISA方法测其效价，结果为1∶10000。

实施例6、单克隆抗体的IgG亚类鉴定

1、采用饱和硫酸铵沉淀法将杂交瘤细胞上清浓缩及纯化

(1)将一瓶生长状态良好的杂交瘤细胞于100ml细胞瓶中，培养至细胞全部死亡(中间不换液)，然后收集细胞上清，约20ml，经1000rpm离心10min，弃沉淀，取上清。

(2)上清置于烧杯中，逐渐加入等体积饱和硫酸铵，边加边搅拌。室温搅拌30min后，3000rpm离心20min，弃上清液，加入0.2ml 0.01M pH7.4 PBS悬浮沉淀。

(3)将沉淀悬浮移至透析袋中进行透析除去NH₄ ⁺和SO₄ ^2-，-20℃保存待用。

2、采用琼脂免疫双向双扩散方法(IDD)进行反应

将铺好的1％琼脂板取出，打梅花孔，过酒精灯封闭孔底，将浓缩细胞上清按2×倍比稀释(1∶2、1∶4、1∶8)加于周围孔，IgG亚类加于中间孔(羊抗鼠)，置37℃水浴中保湿过夜，24小时后观察。结果显示所得到的单克隆抗体属IgG1亚类。

3、琼脂板反应结果的保存

A、反应48小时后的琼脂板，用生理盐水浸泡24小时(中间换几次液)，将生理盐水弃去，并吸干孔中的生理盐水，用5％甘油或0.5％的琼脂填孔以防变形干裂。然后覆盖以湿滤纸，37℃恒温过夜，至琼脂干燥，用生理盐水浸湿滤纸，将滤纸连同干燥琼脂轻轻取下，生理盐水轻轻漂洗琼脂板2-3次，然后浸入0.05％氨基黑染液中反应10-15min。

B、染色后，用蒸馏水将琼脂漂洗3-4次，放于盛有5％醋酸的平皿脱色，至背景无色，沉淀线清晰，平铺展开保存。

实施例7、杂交瘤细胞染色体计数

1、细胞染色体计数前24小时，将细胞分瓶，选择生长状态良好的细胞，并加入秋水仙素，使其最终浓度为0.4μg/ml，继续培养4-6小时，然后用吸管轻轻将细胞吹下，移入50ml离心管中。

2、将细胞培养液1000rpm离心10min，弃上清。

3、用已预热的37℃ 0.075M KCl 5ml，将沉淀细胞悬浮并混匀，置37℃水浴15-20min低渗处理。

4、向悬液中加入新配制的甲醇固定液1ml，混匀后，经1000rpm离心10min，弃上清，再用固定液5ml将细胞悬浮并混匀，室温静置20-30min。然后1000rpm离心10min，弃上清，如此反复固定三次。最后加入固定液5ml，悬浮细胞并混匀。封试管口，静置4℃过夜。

5、细胞悬浮静置过夜后，轻轻吸去上清，留约1ml固定液，将细胞沉积悬浮混匀，用滴管吸取细胞悬液1-2滴，滴于刚从冰水中取出的载坡片上，立即用口吹散。并在火焰上固定，干燥。

6、用新配的Giemsa工作液染色10-20min，然后用自来水洗去清液，自然干燥。

7、显微下观察并计数染色体数量，结果为103±3条。

实施例8、SDS-PAGE电泳测单抗重链、轻链分子量

1、采用辛酸-饱和硫酸铵法进行腹水的纯化

(1)取腹水10ml，加入0.06M醋酸钠-醋酸缓冲液(pH4.0)20ml。

(2)用1N NaOH将腹水pH调至4.8后，边搅边加入正辛酸0.33ml，室温搅拌30min。

(3)腹水经6000rpm离心30min后，弃沉淀，上清用1N NaOH调pH7.2，边加边搅，缓慢加入等积体饱和硫酸铵，搅拌30分钟。经6000rpm离心30min，弃上清，留沉淀，沉淀溶于6.0ml 0.01M pH7.2的PBS中。

(4)逐渐缓慢加入4.0ml饱和硫酸铵，边加边搅30min后，6000rpm离心min，弃上清，沉淀溶于适量0.01M pH7.2的BPS中，移至透析袋中进行透析，过夜(期间换3次液)。

(5)将提纯浓缩的单抗移至小瓶中，-20℃保存待用。

2、SDS-PAGE凝胶电泳

将纯化的腹水进行SDS-PAGE电泳，按常规方法进行(分离胶为12.5％，浓缩胶为4.5％)。

3、单抗稳定性的测定

复苏杂交瘤细胞，收集不同传代次数的细胞上清，并用ELISA测其OD值和效价。结果表明单抗保持稳定。

实施例9、单克隆抗体的结合特性分析

1、所得单克隆抗体与小麦种子蛋白结合反应特点：

提取13个不同小麦品种的麦谷蛋白，经SDS-PAGE分离电泳，结果如图3-A，West Blotting杂交结果如图3-B。结果清楚表明所得单克隆抗体与小麦所有的高分子量谷蛋白亚基发生强烈的结合反应，而与种子醇溶蛋白和低分子量谷蛋白亚基不反应。因此，该单克隆抗体可用于筛选小麦胚乳发育时期cDNA文库，分离和克隆高分子量谷蛋白亚基编码基因。同时也可用该单抗作探针，研究小麦胚乳发育过程中，高分子量谷蛋白亚基在细胞和组织中的合成和转移。

2、所得单克隆抗体与其它禾本科作物种子贮藏蛋白结合反应特点：

提取小麦、大麦、黑麦、燕麦、玉米、高粱、谷子和水稻的种子贮藏全蛋白，经SDS-PAGE分离电泳，结果如图4-A所示，其中1-3条是小麦；4、5为大麦；6为黑麦；7为燕麦；8、9为玉米；10、11为高粱；12、13为谷子；14、15为水稻；各作物的West Blotting杂交结果如图4-B所示。结果清楚表明，所得单克隆抗体仅与黑麦的贮藏蛋白有交叉反应，在其它作物中无反应。表明所得的单克隆抗体与抗原的结合有高度的专一性，可用于水稻、大麦、玉米等作物小麦HWM-GS基因转化体的鉴定和筛选。

Claims

1、具有保藏号为CGMCC №0651的杂交瘤细胞系。

2、与小麦高分子量谷蛋白亚基抗原专一结合的单克隆抗体，由保藏号为CGMCC №0651的杂交瘤细胞系产生。