JP2022502017A - 官能基化ウェルプレート、その作製及び使用方法 - Google Patents
官能基化ウェルプレート、その作製及び使用方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2022502017A JP2022502017A JP2021515077A JP2021515077A JP2022502017A JP 2022502017 A JP2022502017 A JP 2022502017A JP 2021515077 A JP2021515077 A JP 2021515077A JP 2021515077 A JP2021515077 A JP 2021515077A JP 2022502017 A JP2022502017 A JP 2022502017A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- well plate
- region
- antigen
- cells
- activating
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title abstract description 15
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 claims abstract description 332
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 314
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims abstract description 244
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 claims abstract description 232
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 claims abstract description 143
- 239000003446 ligand Substances 0.000 claims description 482
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical group N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 claims description 345
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 claims description 258
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 claims description 258
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 claims description 243
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 215
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 claims description 186
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 185
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 185
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 185
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 claims description 185
- 239000011616 biotin Substances 0.000 claims description 185
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 claims description 180
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 158
- 238000009739 binding Methods 0.000 claims description 157
- 230000004913 activation Effects 0.000 claims description 148
- 108700018351 Major Histocompatibility Complex Proteins 0.000 claims description 129
- 230000020382 suppression by virus of host antigen processing and presentation of peptide antigen via MHC class I Effects 0.000 claims description 128
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 68
- 101000934346 Homo sapiens T-cell surface antigen CD2 Proteins 0.000 claims description 67
- 102100025237 T-cell surface antigen CD2 Human genes 0.000 claims description 67
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 63
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 claims description 62
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 61
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 58
- IVRMZWNICZWHMI-UHFFFAOYSA-N azide group Chemical group [N-]=[N+]=[N-] IVRMZWNICZWHMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 46
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 claims description 44
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 claims description 44
- -1 polypropylene Polymers 0.000 claims description 42
- 230000012010 growth Effects 0.000 claims description 41
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 claims description 39
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 36
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 claims description 34
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 26
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 26
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 claims description 26
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 claims description 26
- 102000009465 Growth Factor Receptors Human genes 0.000 claims description 24
- 108010009202 Growth Factor Receptors Proteins 0.000 claims description 24
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 23
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims description 22
- 239000011521 glass Substances 0.000 claims description 22
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 claims description 21
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 claims description 21
- XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N Silicon Chemical compound [Si] XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 20
- 239000010703 silicon Substances 0.000 claims description 20
- 229910052710 silicon Inorganic materials 0.000 claims description 20
- 101000578784 Homo sapiens Melanoma antigen recognized by T-cells 1 Proteins 0.000 claims description 19
- 101001094545 Homo sapiens Retrotransposon-like protein 1 Proteins 0.000 claims description 19
- 102100028389 Melanoma antigen recognized by T-cells 1 Human genes 0.000 claims description 19
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims description 18
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 claims description 17
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 claims description 17
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 claims description 17
- 239000007825 activation reagent Substances 0.000 claims description 16
- 229920000515 polycarbonate Polymers 0.000 claims description 16
- 239000004417 polycarbonate Substances 0.000 claims description 16
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 claims description 16
- 102000043129 MHC class I family Human genes 0.000 claims description 15
- 108091054437 MHC class I family Proteins 0.000 claims description 15
- 229920000877 Melamine resin Polymers 0.000 claims description 15
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 claims description 15
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 claims description 15
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 claims description 15
- 101001063392 Homo sapiens Lymphocyte function-associated antigen 3 Proteins 0.000 claims description 14
- 102100030984 Lymphocyte function-associated antigen 3 Human genes 0.000 claims description 14
- JDSHMPZPIAZGSV-UHFFFAOYSA-N melamine Chemical compound NC1=NC(N)=NC(N)=N1 JDSHMPZPIAZGSV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 102000017420 CD3 protein, epsilon/gamma/delta subunit Human genes 0.000 claims description 13
- 108050005493 CD3 protein, epsilon/gamma/delta subunit Proteins 0.000 claims description 13
- 101000837401 Homo sapiens T-cell leukemia/lymphoma protein 1A Proteins 0.000 claims description 13
- 101000807990 Homo sapiens Variable charge X-linked protein 3 Proteins 0.000 claims description 13
- 102100037258 Membrane-associated transporter protein Human genes 0.000 claims description 13
- 108091007563 SLC45A2 Proteins 0.000 claims description 13
- 102100028676 T-cell leukemia/lymphoma protein 1A Human genes 0.000 claims description 13
- 101710180188 T-lymphocyte activation antigen CD80 Proteins 0.000 claims description 13
- 102100027222 T-lymphocyte activation antigen CD80 Human genes 0.000 claims description 13
- 102100038978 Variable charge X-linked protein 3 Human genes 0.000 claims description 13
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 13
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 claims description 13
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 12
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims description 12
- 230000006690 co-activation Effects 0.000 claims description 9
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 claims description 7
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 claims description 6
- 101000914514 Homo sapiens T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Proteins 0.000 claims 11
- 102100027213 T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Human genes 0.000 claims 11
- 230000004048 modification Effects 0.000 abstract description 32
- 238000012986 modification Methods 0.000 abstract description 32
- 239000000463 material Substances 0.000 abstract description 5
- 238000010586 diagram Methods 0.000 abstract description 2
- 239000012620 biological material Substances 0.000 abstract 1
- 238000006557 surface reaction Methods 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 170
- 238000001994 activation Methods 0.000 description 140
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 description 96
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 60
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 58
- 125000004429 atom Chemical group 0.000 description 54
- 150000001540 azides Chemical class 0.000 description 48
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 40
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 38
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 38
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 36
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 35
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 34
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 32
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 27
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 27
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 26
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 25
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 24
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 22
- 102000023732 binding proteins Human genes 0.000 description 22
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 22
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 22
- 238000007306 functionalization reaction Methods 0.000 description 22
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 21
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 20
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 19
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 19
- 108010002586 Interleukin-7 Proteins 0.000 description 18
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 18
- 108060008683 Tumor Necrosis Factor Receptor Proteins 0.000 description 15
- 125000000304 alkynyl group Chemical group 0.000 description 15
- 102000003298 tumor necrosis factor receptor Human genes 0.000 description 15
- 125000001425 triazolyl group Chemical group 0.000 description 13
- 150000001345 alkine derivatives Chemical class 0.000 description 12
- VMQMZMRVKUZKQL-UHFFFAOYSA-N Cu+ Chemical class [Cu+] VMQMZMRVKUZKQL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 230000006044 T cell activation Effects 0.000 description 11
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 11
- 241000894007 species Species 0.000 description 11
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 10
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 10
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 10
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 10
- 102000009410 Chemokine receptor Human genes 0.000 description 9
- 108050000299 Chemokine receptor Proteins 0.000 description 9
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 9
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 9
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 9
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 9
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 9
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 9
- 125000002947 alkylene group Chemical class 0.000 description 8
- 230000030741 antigen processing and presentation Effects 0.000 description 8
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 8
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 8
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 8
- 125000000852 azido group Chemical group *N=[N+]=[N-] 0.000 description 7
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 7
- 238000002161 passivation Methods 0.000 description 7
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 7
- 102000019260 B-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 6
- 108010012919 B-Cell Antigen Receptors Proteins 0.000 description 6
- 102100036856 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 9 Human genes 0.000 description 6
- 238000005229 chemical vapour deposition Methods 0.000 description 6
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 6
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 6
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 6
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 6
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 6
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L copper(II) sulfate Chemical compound [Cu+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 5
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 5
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 5
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 5
- 235000010378 sodium ascorbate Nutrition 0.000 description 5
- 229960005055 sodium ascorbate Drugs 0.000 description 5
- PPASLZSBLFJQEF-RKJRWTFHSA-M sodium ascorbate Substances [Na+].OC[C@@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1[O-] PPASLZSBLFJQEF-RKJRWTFHSA-M 0.000 description 5
- PPASLZSBLFJQEF-RXSVEWSESA-M sodium-L-ascorbate Chemical compound [Na+].OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1[O-] PPASLZSBLFJQEF-RXSVEWSESA-M 0.000 description 5
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 5
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 5
- 239000011593 sulfur Substances 0.000 description 5
- 150000003573 thiols Chemical class 0.000 description 5
- HJCMDXDYPOUFDY-WHFBIAKZSA-N Ala-Gln Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(N)=O HJCMDXDYPOUFDY-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 4
- 108010019670 Chimeric Antigen Receptors Proteins 0.000 description 4
- 101000851370 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 9 Proteins 0.000 description 4
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 4
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102100028785 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 14 Human genes 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 4
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 4
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 4
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 4
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 210000003071 memory t lymphocyte Anatomy 0.000 description 4
- 210000000581 natural killer T-cell Anatomy 0.000 description 4
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 4
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 4
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 4
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 4
- 238000009281 ultraviolet germicidal irradiation Methods 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- NEHKZPHIKKEMAZ-ZFVKSOIMSA-N (2s)-2-[[(2s,3r)-2-[[(2s)-2-[[(2s,3s)-2-[[2-[[(2s,3s)-2-[[2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-azaniumylpropanoyl]amino]propanoyl]amino]acetyl]amino]-3-methylpentanoyl]amino]acetyl]amino]-3-methylpentanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]amino]-3-methylb Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O NEHKZPHIKKEMAZ-ZFVKSOIMSA-N 0.000 description 3
- RTGNKKMTFHKHPS-UHFFFAOYSA-N 7-azidoheptyl(trimethoxy)silane Chemical compound CO[Si](OC)(OC)CCCCCCCN=[N+]=[N-] RTGNKKMTFHKHPS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102100024222 B-lymphocyte antigen CD19 Human genes 0.000 description 3
- 102100022005 B-lymphocyte antigen CD20 Human genes 0.000 description 3
- 102100027207 CD27 antigen Human genes 0.000 description 3
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 3
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 3
- 101000980825 Homo sapiens B-lymphocyte antigen CD19 Proteins 0.000 description 3
- 101000897405 Homo sapiens B-lymphocyte antigen CD20 Proteins 0.000 description 3
- 101000914511 Homo sapiens CD27 antigen Proteins 0.000 description 3
- 101000679903 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 25 Proteins 0.000 description 3
- 108010010995 MART-1 Antigen Proteins 0.000 description 3
- 102000016200 MART-1 Antigen Human genes 0.000 description 3
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 3
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 3
- 102100026890 Tumor necrosis factor ligand superfamily member 4 Human genes 0.000 description 3
- 102100022203 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 25 Human genes 0.000 description 3
- 102100022153 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 4 Human genes 0.000 description 3
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 3
- LNHSQAOQVNHUGL-QRBHCBQLSA-N dbco-peg4-biotin Chemical compound C1C2=CC=CC=C2C#CC2=CC=CC=C2N1C(=O)CCNC(=O)CCOCCOCCOCCOCCNC(=O)CCCC[C@H]1[C@H]2NC(=O)N[C@H]2CS1 LNHSQAOQVNHUGL-QRBHCBQLSA-N 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 3
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 3
- 150000002430 hydrocarbons Chemical class 0.000 description 3
- 230000001788 irregular Effects 0.000 description 3
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 3
- 230000004044 response Effects 0.000 description 3
- 238000007363 ring formation reaction Methods 0.000 description 3
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 3
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 3
- 102000003390 tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 3
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- QEMLFXRMMQQYMF-UHFFFAOYSA-N 7-azidoheptyl(trimethyl)silane Chemical compound C[Si](C)(C)CCCCCCCN=[N+]=[N-] QEMLFXRMMQQYMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IYMAXBFPHPZYIK-BQBZGAKWSA-N Arg-Gly-Asp Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O IYMAXBFPHPZYIK-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 2
- 101150013553 CD40 gene Proteins 0.000 description 2
- 239000004215 Carbon black (E152) Substances 0.000 description 2
- 229910021589 Copper(I) bromide Inorganic materials 0.000 description 2
- 229910021595 Copper(I) iodide Inorganic materials 0.000 description 2
- JPVYNHNXODAKFH-UHFFFAOYSA-N Cu2+ Chemical class [Cu+2] JPVYNHNXODAKFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 101000633786 Homo sapiens SLAM family member 6 Proteins 0.000 description 2
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 2
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 2
- 102000003812 Interleukin-15 Human genes 0.000 description 2
- 108090000172 Interleukin-15 Proteins 0.000 description 2
- 108010061593 Member 14 Tumor Necrosis Factor Receptors Proteins 0.000 description 2
- 108010042215 OX40 Ligand Proteins 0.000 description 2
- 108091007960 PI3Ks Proteins 0.000 description 2
- 108090000430 Phosphatidylinositol 3-kinases Proteins 0.000 description 2
- 102000003993 Phosphatidylinositol 3-kinases Human genes 0.000 description 2
- 229920002560 Polyethylene Glycol 3000 Polymers 0.000 description 2
- 208000008425 Protein deficiency Diseases 0.000 description 2
- 102100029197 SLAM family member 6 Human genes 0.000 description 2
- 241000186983 Streptomyces avidinii Species 0.000 description 2
- 108010008038 Synthetic Vaccines Proteins 0.000 description 2
- 101710187780 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 14 Proteins 0.000 description 2
- 101710165473 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 4 Proteins 0.000 description 2
- 102100040245 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 5 Human genes 0.000 description 2
- 101710165434 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 9 Proteins 0.000 description 2
- 238000011467 adoptive cell therapy Methods 0.000 description 2
- 125000003342 alkenyl group Chemical group 0.000 description 2
- 125000003289 ascorbyl group Chemical class [H]O[C@@]([H])(C([H])([H])O*)[C@@]1([H])OC(=O)C(O*)=C1O* 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 229920001222 biopolymer Polymers 0.000 description 2
- 229910002091 carbon monoxide Inorganic materials 0.000 description 2
- 125000002915 carbonyl group Chemical group [*:2]C([*:1])=O 0.000 description 2
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 2
- 150000001732 carboxylic acid derivatives Chemical group 0.000 description 2
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 description 2
- 238000012650 click reaction Methods 0.000 description 2
- 229910000365 copper sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000000139 costimulatory effect Effects 0.000 description 2
- IBWIRDQMNBYUPH-UHFFFAOYSA-N dbco-peg5-acid Chemical compound OC(=O)CCOCCOCCOCCOCCOCCC(=O)NCCC(=O)N1CC2=CC=CC=C2C#CC2=CC=CC=C12 IBWIRDQMNBYUPH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KPUWHANPEXNPJT-UHFFFAOYSA-N disiloxane Chemical class [SiH3]O[SiH3] KPUWHANPEXNPJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 2
- 125000002228 disulfide group Chemical group 0.000 description 2
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 2
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N ether Substances CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 2
- 229930195733 hydrocarbon Natural products 0.000 description 2
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 2
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000000873 masking effect Effects 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 2
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 239000002094 self assembled monolayer Substances 0.000 description 2
- 239000013545 self-assembled monolayer Substances 0.000 description 2
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- POVNCJSPYFCWJR-USZUGGBUSA-N (4s)-4-[[(2s)-2-[[(2s)-2-amino-3-(4-hydroxyphenyl)propanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-5-[(2s)-2-[[2-[(2s)-2-[[(2s)-1-[[(2s,3r)-1-[[(1s)-1-carboxy-2-methylpropyl]amino]-3-hydroxy-1-oxobutan-2-yl]amino]-3-methyl-1-oxobutan-2-yl]carbamoyl]pyrrolidin-1- Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)NCC(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 POVNCJSPYFCWJR-USZUGGBUSA-N 0.000 description 1
- LKKMLIBUAXYLOY-UHFFFAOYSA-N 3-Amino-1-methyl-5H-pyrido[4,3-b]indole Chemical compound N1C2=CC=CC=C2C2=C1C=C(N)N=C2C LKKMLIBUAXYLOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VAKXPQHQQNOUEZ-UHFFFAOYSA-N 3-[4-[[bis[[1-(3-hydroxypropyl)triazol-4-yl]methyl]amino]methyl]triazol-1-yl]propan-1-ol Chemical compound N1=NN(CCCO)C=C1CN(CC=1N=NN(CCCO)C=1)CC1=CN(CCCO)N=N1 VAKXPQHQQNOUEZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QOXOZONBQWIKDA-UHFFFAOYSA-N 3-hydroxypropyl Chemical group [CH2]CCO QOXOZONBQWIKDA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 1
- 239000012103 Alexa Fluor 488 Substances 0.000 description 1
- 241000796533 Arna Species 0.000 description 1
- 238000012935 Averaging Methods 0.000 description 1
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102100036842 C-C motif chemokine 19 Human genes 0.000 description 1
- 102100036846 C-C motif chemokine 21 Human genes 0.000 description 1
- 102100026094 C-type lectin domain family 12 member A Human genes 0.000 description 1
- 101710188619 C-type lectin domain family 12 member A Proteins 0.000 description 1
- 102100038077 CD226 antigen Human genes 0.000 description 1
- 102100036008 CD48 antigen Human genes 0.000 description 1
- 102100025221 CD70 antigen Human genes 0.000 description 1
- 102100035793 CD83 antigen Human genes 0.000 description 1
- 102100039510 Cancer/testis antigen 2 Human genes 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 102000000844 Cell Surface Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010001857 Cell Surface Receptors Proteins 0.000 description 1
- 241000252506 Characiformes Species 0.000 description 1
- 229910021591 Copper(I) chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 108010049207 Death Domain Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000009058 Death Domain Receptors Human genes 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 108010055196 EphA2 Receptor Proteins 0.000 description 1
- 102100030340 Ephrin type-A receptor 2 Human genes 0.000 description 1
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 1
- 102100035139 Folate receptor alpha Human genes 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 101150071461 HAVCR1 gene Proteins 0.000 description 1
- 208000031220 Hemophilia Diseases 0.000 description 1
- 208000009292 Hemophilia A Diseases 0.000 description 1
- 241000709721 Hepatovirus A Species 0.000 description 1
- 102000008949 Histocompatibility Antigens Class I Human genes 0.000 description 1
- 108010088652 Histocompatibility Antigens Class I Proteins 0.000 description 1
- 101000713106 Homo sapiens C-C motif chemokine 19 Proteins 0.000 description 1
- 101000713085 Homo sapiens C-C motif chemokine 21 Proteins 0.000 description 1
- 101000884298 Homo sapiens CD226 antigen Proteins 0.000 description 1
- 101000716130 Homo sapiens CD48 antigen Proteins 0.000 description 1
- 101000934356 Homo sapiens CD70 antigen Proteins 0.000 description 1
- 101000946856 Homo sapiens CD83 antigen Proteins 0.000 description 1
- 101000889345 Homo sapiens Cancer/testis antigen 2 Proteins 0.000 description 1
- 101001023230 Homo sapiens Folate receptor alpha Proteins 0.000 description 1
- 101001055145 Homo sapiens Interleukin-2 receptor subunit beta Proteins 0.000 description 1
- 101001018097 Homo sapiens L-selectin Proteins 0.000 description 1
- 101001109501 Homo sapiens NKG2-D type II integral membrane protein Proteins 0.000 description 1
- 101000884270 Homo sapiens Natural killer cell receptor 2B4 Proteins 0.000 description 1
- 101001012157 Homo sapiens Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Proteins 0.000 description 1
- 101000633778 Homo sapiens SLAM family member 5 Proteins 0.000 description 1
- 101000633784 Homo sapiens SLAM family member 7 Proteins 0.000 description 1
- 101000633792 Homo sapiens SLAM family member 9 Proteins 0.000 description 1
- 101000669511 Homo sapiens T-cell immunoglobulin and mucin domain-containing protein 4 Proteins 0.000 description 1
- 101001018021 Homo sapiens T-lymphocyte surface antigen Ly-9 Proteins 0.000 description 1
- 101000687905 Homo sapiens Transcription factor SOX-2 Proteins 0.000 description 1
- 101000851376 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 8 Proteins 0.000 description 1
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 102000037982 Immune checkpoint proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091008036 Immune checkpoint proteins Proteins 0.000 description 1
- 102100026879 Interleukin-2 receptor subunit beta Human genes 0.000 description 1
- 102100031413 L-dopachrome tautomerase Human genes 0.000 description 1
- 101710093778 L-dopachrome tautomerase Proteins 0.000 description 1
- 102100033467 L-selectin Human genes 0.000 description 1
- 241000270322 Lepidosauria Species 0.000 description 1
- 102000043131 MHC class II family Human genes 0.000 description 1
- 108091054438 MHC class II family Proteins 0.000 description 1
- 102000012750 Membrane Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010090054 Membrane Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000006957 Michael reaction Methods 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 102000003945 NF-kappa B Human genes 0.000 description 1
- 108010057466 NF-kappa B Proteins 0.000 description 1
- 102100022680 NKG2-D type II integral membrane protein Human genes 0.000 description 1
- 102100038082 Natural killer cell receptor 2B4 Human genes 0.000 description 1
- 235000003889 Paeonia suffruticosa Nutrition 0.000 description 1
- 240000005001 Paeonia suffruticosa Species 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 102100029740 Poliovirus receptor Human genes 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 102100030086 Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Human genes 0.000 description 1
- 239000006146 Roswell Park Memorial Institute medium Substances 0.000 description 1
- 102100029216 SLAM family member 5 Human genes 0.000 description 1
- 102100029198 SLAM family member 7 Human genes 0.000 description 1
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 101710173694 Short transient receptor potential channel 2 Proteins 0.000 description 1
- BLRPTPMANUNPDV-UHFFFAOYSA-N Silane Chemical compound [SiH4] BLRPTPMANUNPDV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700015968 Slam family Proteins 0.000 description 1
- 101000873983 Streptomyces avidinii Streptavidin Proteins 0.000 description 1
- 102100039367 T-cell immunoglobulin and mucin domain-containing protein 4 Human genes 0.000 description 1
- 102100033447 T-lymphocyte surface antigen Ly-9 Human genes 0.000 description 1
- 102100024270 Transcription factor SOX-2 Human genes 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 102100036857 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 8 Human genes 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 230000003044 adaptive effect Effects 0.000 description 1
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 1
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 230000031018 biological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 1
- 125000004057 biotinyl group Chemical group [H]N1C(=O)N([H])[C@]2([H])[C@@]([H])(SC([H])([H])[C@]12[H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 230000006287 biotinylation Effects 0.000 description 1
- 238000007413 biotinylation Methods 0.000 description 1
- 239000012267 brine Substances 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- BPKIGYQJPYCAOW-FFJTTWKXSA-I calcium;potassium;disodium;(2s)-2-hydroxypropanoate;dichloride;dihydroxide;hydrate Chemical compound O.[OH-].[OH-].[Na+].[Na+].[Cl-].[Cl-].[K+].[Ca+2].C[C@H](O)C([O-])=O BPKIGYQJPYCAOW-FFJTTWKXSA-I 0.000 description 1
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 1
- 150000007942 carboxylates Chemical group 0.000 description 1
- 210000000845 cartilage Anatomy 0.000 description 1
- 230000020411 cell activation Effects 0.000 description 1
- 230000021164 cell adhesion Effects 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 239000002771 cell marker Substances 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000012412 chemical coupling Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 230000004186 co-expression Effects 0.000 description 1
- 229910000431 copper oxide Inorganic materials 0.000 description 1
- OXBLHERUFWYNTN-UHFFFAOYSA-M copper(I) chloride Chemical compound [Cu]Cl OXBLHERUFWYNTN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- BERDEBHAJNAUOM-UHFFFAOYSA-N copper(I) oxide Inorganic materials [Cu]O[Cu] BERDEBHAJNAUOM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NKNDPYCGAZPOFS-UHFFFAOYSA-M copper(i) bromide Chemical compound Br[Cu] NKNDPYCGAZPOFS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- LSXDOTMGLUJQCM-UHFFFAOYSA-M copper(i) iodide Chemical compound I[Cu] LSXDOTMGLUJQCM-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- OPQARKPSCNTWTJ-UHFFFAOYSA-L copper(ii) acetate Chemical compound [Cu+2].CC([O-])=O.CC([O-])=O OPQARKPSCNTWTJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000007822 coupling agent Substances 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- KRFJLUBVMFXRPN-UHFFFAOYSA-N cuprous oxide Chemical compound [O-2].[Cu+].[Cu+] KRFJLUBVMFXRPN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940112669 cuprous oxide Drugs 0.000 description 1
- ZPWOOKQUDFIEIX-UHFFFAOYSA-N cyclooctyne Chemical group C1CCCC#CCC1 ZPWOOKQUDFIEIX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000016396 cytokine production Effects 0.000 description 1
- 102000003675 cytokine receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010057085 cytokine receptors Proteins 0.000 description 1
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- RCJVRSBWZCNNQT-UHFFFAOYSA-N dichloridooxygen Chemical compound ClOCl RCJVRSBWZCNNQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 150000002019 disulfides Chemical class 0.000 description 1
- WRZXKWFJEFFURH-UHFFFAOYSA-N dodecaethylene glycol Chemical compound OCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCO WRZXKWFJEFFURH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003828 downregulation Effects 0.000 description 1
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000003862 glucocorticoid Substances 0.000 description 1
- 230000005484 gravity Effects 0.000 description 1
- 208000024200 hematopoietic and lymphoid system neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 1
- 230000005660 hydrophilic surface Effects 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 208000026278 immune system disease Diseases 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000008606 intracellular interaction Effects 0.000 description 1
- 230000004068 intracellular signaling Effects 0.000 description 1
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 230000001926 lymphatic effect Effects 0.000 description 1
- FVVLHONNBARESJ-NTOWJWGLSA-H magnesium;potassium;trisodium;(2r,3s,4r,5r)-2,3,4,5,6-pentahydroxyhexanoate;acetate;tetrachloride;nonahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.O.O.O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[Mg+2].[Cl-].[Cl-].[Cl-].[Cl-].[K+].CC([O-])=O.OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C([O-])=O FVVLHONNBARESJ-NTOWJWGLSA-H 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 150000007974 melamines Chemical class 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 1
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 description 1
- 210000003463 organelle Anatomy 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 108010048507 poliovirus receptor Proteins 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 1
- 210000004986 primary T-cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000376 reactant Substances 0.000 description 1
- 238000006479 redox reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000004043 responsiveness Effects 0.000 description 1
- 230000000284 resting effect Effects 0.000 description 1
- 229910000077 silane Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 1
- HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M sodium;chloride;hydrate Chemical compound O.[Na+].[Cl-] HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 239000012192 staining solution Substances 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Natural products CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 1
- 125000005017 substituted alkenyl group Chemical group 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 230000002463 transducing effect Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- ZWIPLIVXLWPTRN-UHFFFAOYSA-N tris(1-benzyltriazol-4-yl)methanamine Chemical compound C=1N(CC=2C=CC=CC=2)N=NC=1C(C=1N=NN(CC=2C=CC=CC=2)C=1)(N)C(N=N1)=CN1CC1=CC=CC=C1 ZWIPLIVXLWPTRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003171 tumor-infiltrating lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
- C12M23/02—Form or structure of the vessel
- C12M23/12—Well or multiwell plates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
- C07K14/70539—MHC-molecules, e.g. HLA-molecules
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
- C07K16/2806—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against CD2
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
- C07K16/2818—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against CD28 or CD152
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K17/00—Carrier-bound or immobilised peptides; Preparation thereof
- C07K17/02—Peptides being immobilised on, or in, an organic carrier
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
- C12M23/20—Material Coatings
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M25/00—Means for supporting, enclosing or fixing the microorganisms, e.g. immunocoatings
- C12M25/06—Plates; Walls; Drawers; Multilayer plates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
- C12N5/0636—T lymphocytes
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
- G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
- G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
- G01N33/5047—Cells of the immune system
- G01N33/505—Cells of the immune system involving T-cells
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Sustainable Development (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Clinical Laboratory Science (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Physical Or Chemical Processes And Apparatus (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
Abstract
【課題】生物科学及び関連する分野において、生体分子及び生体微小物体などの生体材料と接触する装置、デバイス及び材料の表面を修飾することは、有用であり得る。【解決手段】本明細書には、表面修飾及び表面官能基化試薬、それらの作製並びに制御可能且つ再現可能な方法において、限定しないが、Ｔリンパ球を含むリンパ球を活性化するためにウェルプレート内のウェルの表面を修飾する方法が記載される。【選択図】図６Ａ
Description
関連出願の相互参照
[0001] 本出願は、２０１８年９月２１日に出願された「FUNCTIONALIZED WELL PLATE, METHODS OF PREPARATION AND USE THEREOF」という名称の米国仮特許出願第６２／７３４，９２４号；及び２０１９年８月２９日に出願された「FUNCTIONALIZED WELL PLATE, METHODS OF PREPARATION AND USE THEREOF」という名称の米国仮特許出願第６２／８９３，７１２号の利益を主張し、これらの開示の各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
[0001] 本出願は、２０１８年９月２１日に出願された「FUNCTIONALIZED WELL PLATE, METHODS OF PREPARATION AND USE THEREOF」という名称の米国仮特許出願第６２／７３４，９２４号；及び２０１９年８月２９日に出願された「FUNCTIONALIZED WELL PLATE, METHODS OF PREPARATION AND USE THEREOF」という名称の米国仮特許出願第６２／８９３，７１２号の利益を主張し、これらの開示の各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
発明の背景
[0002] 免疫療法は、癌の治療の成功のために潜在的に有効なアプローチを提供する。抗原提示樹状細胞によるＴリンパ球の活性化は、免疫療法に使用される腫瘍ターゲティング細胞傷害性Ｔリンパ球を作製する１つの態様である。樹状細胞による活性化は、再現性及び特性評価性に優れた技術を使用することによって改善され得る。本発明のいくつかの実施形態は、Ｔリンパ球を活性化するように構成されたウェルプレートの修飾表面、こうした修飾表面を使用してＴリンパ球を活性化する関連する方法及びこうした活性化Ｔリンパ球を含有する組成物を含む。
[0002] 免疫療法は、癌の治療の成功のために潜在的に有効なアプローチを提供する。抗原提示樹状細胞によるＴリンパ球の活性化は、免疫療法に使用される腫瘍ターゲティング細胞傷害性Ｔリンパ球を作製する１つの態様である。樹状細胞による活性化は、再現性及び特性評価性に優れた技術を使用することによって改善され得る。本発明のいくつかの実施形態は、Ｔリンパ球を活性化するように構成されたウェルプレートの修飾表面、こうした修飾表面を使用してＴリンパ球を活性化する関連する方法及びこうした活性化Ｔリンパ球を含有する組成物を含む。
発明の概要
[0003] 第１態様では、反応性部分提示共有結合官能基化領域又は活性化部分提示共有結合官能基化領域である第１領域を有する表面を含むウェルプレートであって、反応性部分は、アジド部分、ビオチン部分又はストレプトアビジン部分であり、及び活性化部分は、リンパ球活性化部分である、ウェルプレートが提供される。第１領域は、少なくとも０．５ｍｍ２（例えば、約０．５ｍｍ２から約５０ｍｍ２、約１．０ｍｍ２から約４０ｍｍ２、約２ｍｍ２から約３５ｍｍ２、約３ｍｍ２から約３０ｍｍ２又は約４ｍｍ２から約２５ｍｍ２）の面積を有し得る。第１領域は、実質的に円形であり得、且つ約０．５ｍｍから約４．０ｍｍ（例えば、約１．０ｍｍから約３．５ｍｍ又は約１．５ｍｍから約３．０ｍｍ）の直径を有し得る。第１領域は、少なくとも５０／ｕｍ２のそれぞれの反応性部分又は活性化部分の密度を有し得る。反応性部分又は活性化部分は、有機リンカーなどのリンカーを介して表面に共有結合され得る。リンカーは、炭素、ケイ素、窒素及び酸素から選択される５から約２０個の骨格原子、約１０から約４０個の骨格原子又は約１５から約５０個の骨格原子を有し得る。ウェルプレートの表面は、表面遮断リガンドを含む共有結合修飾領域である第２領域をさらに含み得る。任意選択で、第２領域は、第１領域を取り囲み得る。一部の実施形態では、表面遮断リガンドの各々は、親水性又は負荷電部分を含み得る。一部の実施形態では、表面遮断リガンドの各々は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分を含み得る。ウェルプレートの表面は、ガラス又はポリスチレンを含み得る。一部の変形形態では、ウェルプレートの表面は、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ポリエチレン、シクロオレフィンコポリマー又はメラミンを含み得る。
[0003] 第１態様では、反応性部分提示共有結合官能基化領域又は活性化部分提示共有結合官能基化領域である第１領域を有する表面を含むウェルプレートであって、反応性部分は、アジド部分、ビオチン部分又はストレプトアビジン部分であり、及び活性化部分は、リンパ球活性化部分である、ウェルプレートが提供される。第１領域は、少なくとも０．５ｍｍ２（例えば、約０．５ｍｍ２から約５０ｍｍ２、約１．０ｍｍ２から約４０ｍｍ２、約２ｍｍ２から約３５ｍｍ２、約３ｍｍ２から約３０ｍｍ２又は約４ｍｍ２から約２５ｍｍ２）の面積を有し得る。第１領域は、実質的に円形であり得、且つ約０．５ｍｍから約４．０ｍｍ（例えば、約１．０ｍｍから約３．５ｍｍ又は約１．５ｍｍから約３．０ｍｍ）の直径を有し得る。第１領域は、少なくとも５０／ｕｍ２のそれぞれの反応性部分又は活性化部分の密度を有し得る。反応性部分又は活性化部分は、有機リンカーなどのリンカーを介して表面に共有結合され得る。リンカーは、炭素、ケイ素、窒素及び酸素から選択される５から約２０個の骨格原子、約１０から約４０個の骨格原子又は約１５から約５０個の骨格原子を有し得る。ウェルプレートの表面は、表面遮断リガンドを含む共有結合修飾領域である第２領域をさらに含み得る。任意選択で、第２領域は、第１領域を取り囲み得る。一部の実施形態では、表面遮断リガンドの各々は、親水性又は負荷電部分を含み得る。一部の実施形態では、表面遮断リガンドの各々は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分を含み得る。ウェルプレートの表面は、ガラス又はポリスチレンを含み得る。一部の変形形態では、ウェルプレートの表面は、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ポリエチレン、シクロオレフィンコポリマー又はメラミンを含み得る。
[0004] 一部の変形形態では、反応性部分は、ストレプトアビジンであり得、及びストレプトアビジン官能基は、ウェルプレートの表面の第１領域に共有結合される。他の変形形態では、反応性部分は、ストレプトアビジンであり得、及びストレプトアビジン官能基は、ビオチン部分に非共有結合され、ビオチン部分は、それ自体、ウェルプレートの表面の第１領域に共有結合される。
[0005] 一部の変形形態では、第１領域は、複数の特異的に結合された一次活性化分子リガンドと、複数の特異的に結合された共活性化分子リガンドとを含む活性化部分提示共有結合官能基化領域であり得る。表面の第１領域上における一次活性化分子リガンドと共活性化分子リガンドとの比は、約１：１０から約２：１（例えば、約１：５から約２：１、約１：２から約２：１、約１：１０から約１：１、約１：５から約１：１、約１：１から約２：１又は約１：２から約１：１）であり得る。一部の実施形態では、複数の特異的に結合された一次活性化分子リガンドの各リガンドは、Ｔ細胞のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）に結合するように構成された主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子を含み得る。ＭＨＣ分子は、クラスＩ又はクラスＩＩ分子であり得、且つ抗原ペプチドをさらに含み得る。抗原ペプチドは、腫瘍関連抗原ペプチド、ウイルス抗原、細菌抗原、真菌抗原又は原生動物抗原であり得る。一部の変形形態では、複数の特異的に結合された共活性化分子リガンドの各リガンドは、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）共活性化分子又は補助ＴＣＲ活性化分子を含み得る。複数の共活性化分子リガンドのＴＣＲ共活性化分子と補助ＴＣＲ活性化分子との比は、約１００：１から約１：１００（例えば、約２０：１から約１：２０又は約３：１から約１：３）である。一部の変形形態では、ＴＣＲ共活性化分子は、ＣＤ２８結合タンパク質（例えば、ＣＤ８０分子若しくは抗ＣＤ２８抗体）又はＣＤ２８に対する結合能力を保持するその断片を含み得る。一部の変形形態では、補助ＴＣＲ活性化分子は、ＣＤ２結合タンパク質（例えば、ＣＤ５８分子若しくは抗ＣＤ２抗体）又はＣＤ２に対する結合能力を保持するその断片を含み得る。
[0006] 複数の特異的に結合された一次活性化分子リガンドは、第１領域において、１平方ミクロン当たり少なくとも約１×１０２分子の密度、及び任意選択で、第１領域において、１平方ミクロン当たり約１×１０２から約１×１０５分子の密度を有し得る。複数の特異的に結合された共活性化分子リガンドは、第１領域において、１平方ミクロン当たり少なくとも約１×１０２分子の密度、及び任意選択で、第１領域において、１平方ミクロン当たり約１×１０３から約１×１０５分子の密度を有し得る。
[0007] 別の態様では、ウェルプレートであって、ウェルプレートの１つ又は複数のウェル（例えば、全てのウェル）の各々は、表面及びその第１領域を含み、第１領域は、上記の又は本明細書の他の箇所に記載される表面及び第１領域を有する任意のウェルプレートと同様に、反応性部分提示共有結合官能基化領域又は活性化部分提示共有結合官能基化領域である、ウェルプレートが提供される。１つ又は複数のウェルの各々の第１領域は、対応するウェルの底部表面上に位置し得る。それぞれの第１領域の面積は、対応するウェルの底部面積の約５０％未満（例えば、約４０％未満、約３０％未満、約２５％未満、約２０％未満、約１５％未満、約１０％未満、約５％未満又は約２％未満）であり得る。一部の実施形態では、１つ又は複数のウェルの各々は、表面遮断リガンドを含む共有結合修飾領域である第２領域をさらに含む。それぞれの第２領域は、任意選択で、対応するウェルの第１領域を取り囲み得る。存在する場合、第２領域の表面遮断リガンドの各々は、親水性又は負荷電部分を含み得る。一部の実施形態では、表面遮断リガンドは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分を含み得る。
[0008] 別の態様では、アジド提示共有結合官能基化領域を有する表面を含むウェルプレートが提供される。アジド提示共有結合官能基化領域は、ウェルプレート表面の一部若しくは全部を包含し得るか、又はウェルプレートの全表面より少なく分布され得る。一部の変形形態では、ウェルプレートの１つ又は複数のウェルは、アジド提示共有結合官能基化領域を有する表面を含み得る。１つ又は複数のウェルの各々のアジド提示共有結合官能基化領域は、対応するウェルの表面全体（即ち内部表面）を包含し得るか、又は対応するウェルの底部表面上に位置し得る。ウェルプレートの表面又はウェルプレートの１つ若しくは複数のウェルの表面は、ガラス又はポリマーを含み得、これは、任意の好適な種類のポリマーであり得る。
[0009] 一部の実施形態では、アジド提示共有結合官能基化領域は、少なくとも０．５ｍｍ２（例えば、少なくとも１ｍｍ２、少なくとも１０ｍｍ２、少なくとも１００ｍｍ２、少なくとも１０００ｍｍ２、少なくとも１０，０００ｍｍ２、少なくとも１００，０００ｍｍ２又は上記の端点の２つによって画定される任意の範囲）の面積を有し得る。アジド提示共有結合官能基化領域は、少なくとも５０／ｕｍ２のアジド基の密度を有し得る。一部の実施形態では、表面に共有結合されたアジド官能基は、炭素、ケイ素、窒素及び酸素から選択される少なくとも５個の骨格原子を有するリンカーを介して結合され得る。例えば、アジド官能基は、一続きの５から約２０個の骨格原子若しくは約１０から約４０個の骨格原子又は約５、７、９、１０、１１、１３、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、９０、１００、２００結合長のリンカー或いはそれらの間の任意の数の骨格原子を介して表面に共有結合され得る。
[0010] 別の態様では、ビオチン提示共有結合官能基化領域を含む表面を含むウェルプレートが提供され、且つウェルプレート表面の一部を含み得、及び／又はウェルプレートの全表面より少なく分布され得る。一部の実施形態では、１つ又は複数のウェルプレートは、ビオチン提示共有結合官能基化領域を有する表面を含み得る。一部の実施形態では、１つ又は複数のウェルのビオチン提示共有結合官能基化領域は、対応するウェルの底部表面上に位置し得る。ウェルプレートの表面又はウェルプレートの１つ若しくは複数のウェルの表面は、ガラス又はポリマーを含み得、これは、任意の好適な種類のポリマーであり得る。
[0011] 一部の変形形態では、ビオチン提示共有結合官能基化領域は、少なくとも０．５ｍｍ２（例えば、少なくとも１．０ｍｍ２、少なくとも２．０ｍｍ２、少なくとも３．０ｍｍ２、少なくとも４．０ｍｍ２、少なくとも５．０ｍｍ２、少なくとも６．０ｍｍ２、少なくとも７．０ｍｍ２、少なくとも８．０ｍｍ２、少なくとも９．０ｍｍ２、少なくとも１０．０ｍｍ２、少なくとも１５ｍｍ２、少なくとも２０ｍｍ２、少なくとも２５ｍｍ２若しくは少なくとも５０ｍｍ２又は上記の端点の２つによって画定される任意の範囲）の面積を有し得る。一部の実施形態では、ビオチン提示共有結合官能基化領域は、１００ｍｍ２未満の面積を有し得る。一部の実施形態では、ビオチン提示共有結合官能基化領域は、少なくとも５０／ｕｍ２のビオチン官能基の密度を有し得る。一部の変形形態では、ビオチン提示共有結合官能基化領域は、炭素、ケイ素、窒素及び酸素から選択される少なくとも１０個の骨格原子を有するリンカーを介して表面に共有結合されたビオチン官能基を含み得る。例えば、リンカーは、炭素、ケイ素、窒素及び酸素から選択される約５から約２００個の骨格原子若しくは約１０から約４０個の骨格原子又はそれらの間の任意の数の骨格原子を有し得る。
[0012] 一部の実施形態では、ビオチン提示共有結合官能基化領域の面積は、１つ又は複数のウェルの各々の底部の面積の約２％未満から約５０％未満の範囲であり得る。一部の実施形態では、ビオチン提示共有結合官能基化領域は、０．５から４．０ｍｍ（例えば、約１．０から約３．５ｍｍ）の寸法を有し得る。様々な実施形態では、ビオチン提示共有結合官能基化領域は、実質的に円形であり得、且つ０．５から４．０ｍｍ（例えば、約１．０から約３．５ｍｍ）の直径を有する。
[0013] 一部の実施形態では、ウェルプレートの表面又は１つ若しくは複数のウェルの各々の表面は、表面遮断リガンドを含む第２共有結合修飾領域をさらに含み得る。一部の実施形態では、表面遮断リガンドの各々は、親水性又は負荷電部分を含み得る。一部の実施形態では、表面遮断リガンドは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分を含み得る。一部の実施形態では、第２共有結合修飾領域は、接着刺激部分を提供する少なくとも１つのリガンドをさらに含み得る。
[0014] 別の態様では、ストレプトアビジン提示共有結合官能基化領域を有する表面を含むウェルプレートが提供される。ストレプトアビジン提示共有結合官能基化領域は、ウェルプレートの一部を包含し得、及び／又はウェルプレートの全表面より少なく分布され得る。一部の変形形態では、ウェルプレートの１つ又は複数のウェルは、ストレプトアビジン提示共有結合官能基化領域を有する表面を含み得る。一部の変形形態では、１つ又は複数のウェルのストレプトアビジン提示共有結合官能基化領域は、対応するウェルの底部表面上に位置し得る。ウェルの表面又はウェルプレートの１つ若しくは複数のウェルの表面は、ガラス又はポリマーを含み得、これは、任意の好適な種類のポリマーであり得る。
[0015] 一部の実施形態では、ストレプトアビジン官能基は、ウェルの表面又はウェルプレートの１つ若しくは複数のウェルの表面の共有結合官能基化領域に共有結合され得る。ストレプトアビジン官能基は、炭素、ケイ素、窒素及び酸素から選択される約５から約２００個の骨格原子若しくは約１０から約５０個の骨格原子又はそれらの間の任意の数の骨格原子を有するリンカーを介して表面に共有結合され得る。ストレプトアビジンがそれ自体表面に共有結合される場合、結合は、本明細書に記載される表面の任意のアジド提示共有結合官能基化領域のアジド官能基とのカップリングを介するものであり得る。一部の他の実施形態では、ストレプトアビジン官能基は、ビオチン部分に非共有結合され得、ビオチン部分は、それ自体、前述したように、ウェルプレートの表面又はウェルプレートの１つ若しくは複数のウェルの表面の共有結合官能基化領域に共有結合される。
[0016] ストレプトアビジン提示共有結合官能基化領域は、少なくとも０．５ｍｍ２（例えば、少なくとも１．０ｍｍ２、少なくとも２．０ｍｍ２、少なくとも３．０ｍｍ２、少なくとも４．０ｍｍ２、少なくとも５．０ｍｍ２、少なくとも６．０ｍｍ２、少なくとも７．０ｍｍ２、少なくとも８．０ｍｍ２、少なくとも９．０ｍｍ２、少なくとも１０．０ｍｍ２、少なくとも１５ｍｍ２、少なくとも２０ｍｍ２、少なくとも２５ｍｍ２若しくは少なくとも５０ｍｍ２又は上記の端点の２つによって画定される任意の範囲）の面積を有し得る。一部の実施形態では、ビオチン提示共有結合官能基化領域は、１００ｍｍ２未満の面積を有し得る。一部の実施形態では、ストレプトアビジン提示共有結合官能基化領域は、少なくとも５０／ｕｍ２のストレプトマイシン官能基の密度を有し得る。一部の実施形態では、ストレプトアビジン提示共有結合官能基化領域は、１つ又は複数のウェルの各々の底部の面積の約２％未満から約５０％未満の面積又はそれらの間の任意の面積を有し得る。一部の実施形態では、ストレプトアビジン提示共有結合官能基化領域は、０．５から４．０ｍｍ（例えば、約１．０から約３．５ｍｍ）の寸法を有し得る。一部の実施形態では、ストレプトアビジン提示共有結合官能基化領域は、実質的に円形であり得、且つ０．５から４．０ｍｍ（例えば、約１．０から約３．５ｍｍ）の直径を有する。
[0017] 一部の実施形態では、ウェルプレートの表面又は１つ若しくは複数のウェルの各々の表面は、表面遮断リガンドを含む第２共有結合修飾領域をさらに含み得る。一部の実施形態では、表面遮断リガンドの各々は、親水性又は負荷電部分を含み得る。一部の実施形態では、表面遮断リガンドは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分を含み得る。一部の実施形態では、第２共有結合修飾領域は、接着刺激部分を提供する少なくとも１つのリガンドをさらに含み得る。
[0018] 別の態様では、Ｔ細胞を活性化するためのウェルプレートの抗原提示共有結合官能基化領域を有する表面を含むウェルプレートが提供される。抗原提示共有結合官能基化領域は、ウェルプレートの一部を包含し得、及び／又はウェルプレートの全表面より少なく分布され得る。一部の実施形態では、ウェルプレートの１つ又は複数のウェルは、抗原提示共有結合官能基化領域を有する表面を含み得る。一部の実施形態では、１つ又は複数のウェルの抗原提示共有結合官能基化領域は、対応するウェルの底部表面上に位置し得る。
[0019] 抗原提示共有結合官能基化領域は、複数の特異的に結合された一次活性化分子リガンドと、複数の特異的に結合された共活性化分子リガンドとを含み得る。共有結合官能基化領域上における一次活性化分子リガンドと共活性化分子リガンドとの比は、約１：１０から約２：１、約１：５から約２：１、約１：２から約２：１、約１：１０から約１：１、約１：５から約１：１、約１：１から約２：１又は約１：２から約１：１であり得る。一部の変形形態では、複数の特異的に結合された一次活性化分子リガンドは、Ｔ細胞のＴ細胞受容体に結合するように構成された主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子（例えば、クラスＩ又はクラスＩＩ）をそれぞれ含み得る。一部の実施形態では、ＭＨＣ分子は、ＭＨＣクラスＩタンパク質配列及びβミクログロブリンタンパク質配列を含み得る。ＭＨＣ分子のタンパク質配列は、タンパク質配列のＣ末端結合を介して抗原提示合成表面に連結され得る。一部の実施形態では、ＭＨＣ分子を含む複数の一次活性化分子の各々は、腫瘍関連抗原ペプチド、ウイルス抗原、細菌抗原、真菌抗原又は原生動物抗原などの抗原ペプチドをさらに含み得る。一部の実施形態では、抗原ペプチドは、腫瘍関連抗原ペプチドであり、これらは、ＳＬＣ４５Ａ２、ＴＣＬ１、ＶＣＸ３Ａ、ＭＡＲＴ１又はＮＹＥＳＯ１であり得る。
[0020] 一部の変形形態では、複数の特異的に結合された共活性化分子リガンドは、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）共活性化分子又は補助ＴＣＲ活性化分子をそれぞれ含み得る。複数の共活性化分子リガンドのＴＣＲ共活性化分子と補助ＴＣＲ活性化分子との比は、約１００：１から約１：１００、約２０：１から約１：２０又は約３：１から約１：３であり得る。一部の実施形態では、ＴＣＲ共活性化分子は、ＣＤ２８結合タンパク質又はＣＤ２８に対する結合能力を保持するその断片を含み得る。ＣＤ２８結合タンパク質は、ＣＤ８０分子又はＣＤ２８に対する結合活性を保持するその断片；ＣＤ２８に対する結合活性を保持する抗ＣＤ２８抗体又はその断片であり得る。一部の実施形態では、補助ＴＣＲ活性化分子は、ＣＤ２結合タンパク質又はＣＤ２に対する結合活性を保持するその断片を含み得る。ＣＤ２結合タンパク質は、ＣＤ５８分子若しくはＣＤ２との結合活性を保持するその断片；又は抗ＣＤ２抗体若しくはＣＤ２との結合活性を保持するその断片であり得る。一部の実施形態では、複数の特異的に結合された一次活性化分子リガンド及び複数の特異的に結合された共活性化分子リガンドは、本明細書に記載されるストレプトアビジン提示共有結合官能基化領域を含む表面を有する任意のウェルプレートと同様に、ウェルプレートのストレプトアビジン提示共有結合官能基化領域のストレプトアビジン官能基に特異的に結合され得る。
[0021] 一部の実施形態では、複数の特異的に結合された一次活性化分子リガンドは、抗原提示共有結合官能基化領域において、１平方ミクロン当たり少なくとも約１×１０２分子又は１平方ミクロン当たり約１×１０２から１×１０５分子の密度を有し得る。一部の実施形態では、複数の特異的に結合された共活性化分子リガンドは、抗原提示共有結合官能基化領域の抗原提示合成表面上において、１平方ミクロン当たり約１×１０２から１×１０５分子又は１平方ミクロン当たり約１×１０３から１×１０５分子の密度を有し得る。
[0022] 別の態様では、Ｔリンパ球（Ｔ細胞）を活性化する方法であって、複数のＴ細胞をウェルプレートの表面の抗原提示共有結合官能基化領域と接触させ、それにより複数のＴ細胞の少なくとも一部を活性化Ｔ細胞に変換することを含む方法が提供される。抗原提示共有結合官能基化領域は、複数の一次活性化分子リガンドであって、Ｔ細胞のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）に結合するように構成された主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子（例えば、クラスＩ又はクラスＩＩ）をそれぞれ含み、及びさらに、複数の一次活性化分子リガンドの各々は、表面に結合され得る、複数の一次活性化分子リガンドを含み得る。抗原提示共有結合官能基化領域は、複数の共活性化分子リガンドであって、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）共活性化分子又は補助ＴＣＲ活性化分子をそれぞれ含み、共活性化分子リガンドの各々は、表面に結合され得る、複数の共活性化分子リガンドをさらに含み得る。複数のＴ細胞は、表面の抗原提示共有結合官能基化領域と接触させて培養され、それにより複数のＴ細胞の少なくとも一部を活性化Ｔ細胞に変換することができる。Ｔ細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞を含み得る。
[0023] 抗原提示共有結合官能基化領域は、上記の又は本明細書の他の箇所に記載される活性化部分提示共有結合官能基化領域を有する任意のウェルプレートと同様に、ウェルプレートの表面の第１領域であり得る。
[0024] 一部の変形形態では、複数の共活性化分子リガンドは、ＴＣＲ共活性化分子及び補助ＴＣＲ活性化分子を含み得る。複数の共活性化分子リガンドのＴＣＲ共活性化分子と補助ＴＣＲ活性化分子との比は、約１００：１から約１：１００、約２０：１から約１：２０又は約３：１から約１：３であり得る。
[0025] 複数のＭＨＣ分子の各分子は、ＭＨＣクラスＩタンパク質配列、βミクログロブリンタンパク質配列及び抗原ペプチドを含み得る。一部の変形形態では、ＭＨＣ分子のタンパク質配列は、Ｃ末端結合を介して表面の抗原提示共有結合官能基化領域に連結され得る。ＭＨＣ分子は、ビオチン部分を含み得るか、又はストレプトアビジンとの非共有結合を介して表面の抗原提示共有結合官能基化領域に結合され得る。一部の実施形態では、ストレプトアビジンは、それ自体、表面の抗原提示共有結合官能基化領域に共有結合される。別の実施形態では、ストレプトアビジンは、表面の抗原提示共有結合官能基化領域に非共有結合され得る。ストレプトアビジンがビオチン部分と非共有結合される場合、ビオチン部分は、表面の抗原提示共有結合官能基化領域に共有結合され得る。
[0026] 一部の変形形態では、抗原ペプチドは、腫瘍関連抗原、ウイルス抗原、細菌抗原、真菌抗原又は原生動物抗原であり得る。一部の実施形態では、抗原ペプチドは、腫瘍関連抗原であり得る。一部の変形形態では、腫瘍関連抗原は、ＳＬＣ４５Ａ２、ＴＣＬ１、ＶＣＸ３Ａ、ＭＡＲＴ１又はＮＹＥＳＯ１であり得る。
[0027] 一部の変形形態では、複数の共活性化分子リガンドの各々は、表面の抗原提示共有結合官能基化領域に結合され得る。
[0028] 一部の変形形態では、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）共活性化分子は、ＣＤ２８結合タンパク質若しくはＣＤ２８に対する結合能力を保持するその断片；ＣＤ８０分子若しくはＣＤ２８に対する結合活性を保持するその断片；又は抗ＣＤ２８抗体若しくはＣＤ２８に対する結合活性を保持するその断片を含み得る。
[0029] 一部の変形形態では、補助ＴＣＲ活性化分子は、ＣＤ２結合タンパク質又はＣＤ２に対する結合能力を保持するその断片を含み得る。補助ＴＣＲ活性化分子は、ＣＤ５８分子若しくはＣＤ２との結合活性を保持するその断片；又は抗ＣＤ２抗体若しくはＣＤ２との結合活性を保持するその断片を含み得る。
[0030] 複数の特異的に結合された一次活性化分子リガンドは、表面の抗原提示共有結合官能基化領域において、１平方ミクロン当たり少なくとも約１×１０２分子の密度を有し得る。一部の実施形態では、複数の特異的に結合された一次活性化分子リガンドは、表面の抗原提示共有結合官能基化領域において、１平方ミクロン当たり約１×１０２から１×１０５分子の密度を有し得る。複数の特異的に結合された共活性化分子リガンドは、表面の抗原提示共有結合官能基化領域において、１平方ミクロン当たり少なくとも１×１０２から１×１０５分子の密度を有し得る。一部の実施形態では、複数の特異的に結合された共活性化分子リガンドは、表面の抗原提示共有結合官能基化領域において、１平方ミクロン当たり約１×１０３から１×１０５分子の密度を有し得る。表面の抗原提示共有結合官能基化領域における一次活性化分子リガンドと共活性化分子リガンドとの比は、約１：１０から約２：１、約１：５から約２：１、約１：２から約２：１、約１：１０から約１：１、約１：５から約１：１、約１：１から約２：１又は任意選択で約１：２から約１：１であり得る。一部の変形形態では、複数の共活性化分子リガンドのＴＣＲ共活性化分子と補助ＴＣＲ活性化分子との比は、約３：１から約１：３であり得る。一部の実施形態では、複数の共活性化分子リガンドのＴＣＲ共活性化分子と補助ＴＣＲ活性化分子との比は、約２：１から約１：２であり得る。一部の実施形態では、複数の共活性化分子リガンドのＴＣＲ共活性化分子と補助ＴＣＲ活性化分子との比は、約１：１であり得る。
[0031] 一部の変形形態では、本方法は、複数のＴ細胞を複数の接着刺激分子リガンドと接触させることをさらに含み得る。複数の接着刺激分子リガンドは、ＩＣＡＭ分子を含み得る。
[0032] 一部の変形形態では、本方法は、複数のＴ細胞を複数の成長刺激分子リガンドと接触させることをさらに含み得る。一部の実施形態では、成長刺激分子リガンドの各々は、成長因子受容体リガンドを含み得る。成長因子受容体リガンドは、ＩＬ−２１又はその断片を含み得る。
[0033] 一部の変形形態では、複数のＴ細胞を複数の成長刺激分子リガンドと接触させることは、少なくとも１日の第１培養期間後に実施され得る。抗原提示合成表面と接触させて培養することは、約４日から約７日の期間にわたって実施され得る。
[0034] 一部の変形形態では、活性化Ｔ細胞は、ＣＤ４５ＲＯ＋であり得る。一部の変形形態では、活性化Ｔ細胞は、ＣＤ２８陽性である。
[0035] 一部の変形形態では、抗原提示官能基化領域の面積は、ウェルプレートのウェルの底部表面の面積の約２５％未満、約１５％未満、約１０％未満、約５％未満又は約２％未満であり得る。
[0036] 別の態様では、リンパ球を活性化する方法であって、複数のリンパ球をウェルプレートの表面の活性化部分提示共有結合官能基化領域と接触させることであって、活性化部分提示共有結合官能基化領域は、表面に結合された複数の一次活性化分子リガンドと；表面に結合された複数の共活性化分子リガンドとを含む、接触させることと；複数のリンパ球を培養し、それにより複数のリンパ球の少なくとも一部を活性化リンパ球に変換することとを含む方法が提供される。リンパ球は、Ｂ細胞、Ｔ細胞又はＮＫ細胞を含み得る。
[0037] 活性化部分提示共有結合官能基化領域は、本明細書に記載される活性化部分提示共有結合官能基化領域を含む任意のウェルプレートと同様に、ウェルプレートの表面の第１領域であり得る。表面の活性化部分提示共有結合官能基化領域を含むウェルプレートは、本明細書に記載されるリンパ球活性化共有結合官能基化領域を含む表面を有するウェルプレートを作製する任意の方法によって作製され得る。
[0038] 一部の変形形態では、一次活性化分子リガンドは、ＣＤ３結合分子又はＭＨＣ分子を含み得る。一部の実施形態では、複数のＭＨＣ分子は、ＭＨＣクラスＩタンパク質配列及びβミクログロブリンタンパク質配列をそれぞれ含み得る。ＭＨＣ分子は、抗原ペプチドをさらに含み得る。一部の変形形態では、ＣＤ３結合タンパク質は、抗体又は結合親和性を保持するその断片であり得る。
[0039] 一部の変形形態では、複数の共活性化分子リガンドは、ＴＣＲ共活性化分子及び補助ＴＣＲ活性化分子を含み得る。一部の変形形態では、複数の共活性化分子リガンドは、ＣＤ２結合分子及び／又はＣＤ２８結合分子を含み得る。２種以上の共活性化分子リガンドが存在する一部の変形形態では、異なる共活性化分子リガンドの比は、約２０：１から約１：２０又は約３：１から約１：３であり得る。
[0040] 一部の変形形態では、複数の特異的に結合された一次活性化分子リガンドは、表面の活性化部分提示共有結合官能基化領域において、１平方ミクロン当たり少なくとも約１×１０２分子又は１平方ミクロン当たり約１×１０２から約１×１０５分子の密度を有し得る。一部の変形形態では、複数の特異的に結合された共活性化分子リガンドは、表面の活性化部分提示共有結合官能基化領域において、１平方ミクロン当たり約１×１０２から約１×１０５分子又は１平方ミクロン当たり約１×１０３から約１×１０５分子の密度を有し得る。活性化部分提示共有結合官能基化領域における一次活性化分子リガンドと共活性化分子リガンドとの比は、約１：１０から約２：１、約１：５から約２：１、約１：２から約２：１、約１：１０から約１：１、約１：５から約１：１、約１：１から約２：１又は約１：２から約１：１であり得る。
[0041] 一部の変形形態では、活性化部分提示共有結合官能基化領域の面積は、ウェルプレートのウェルの底部表面の面積の約２５％未満、約１５％未満、約１０％未満、約５％未満又は約２％未満であり得る。
[0042] 別の態様では、活性化部分提示共有結合官能基化領域を有する表面を含むウェルプレートを作製するキットであって、反応性部分提示共有結合官能基化領域を含む表面を有するウェルプレートを含み、反応性部分は、アジド部分、ビオチン部分又はストレプトアビジン部分である、キットが提供される。キットは、活性化試薬を含み得る。一部の変形形態では、キットは、表面官能基化試薬をさらに含み得る。一部の変形形態では、活性化部分提示共有結合官能基化領域を有する表面を含むウェルプレートは、本明細書に記載のように、アジド提示、ビオチン提示又はストレプトアビジン提示共有結合官能基化領域を有する任意のウェルプレートであり得る。
[0043] 一部の変形形態では、キットは、表面官能基化試薬を含み得、表面官能基化試薬は、反応性部分と反応するように構成されたビオチン含有試薬又はストレプトアビジン含有試薬であり得る。一部の実施形態では、キットは、ビオチン含有試薬及びストレプトアビジン含有試薬の両方をさらに含み得る。
[0044] 一部の変形形態では、活性化試薬は、Ｔ細胞のＴ細胞受容体と結合するように構成され、且つストレプトアビジンの結合部位又は複数のＣＤ３結合分子に結合するように構成された複数の主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子（例えば、クラスＩ又はクラスＩＩ）を含む一次活性化試薬を含み得る。
[0046] 一部の変形形態では、キットは、ストレプトアビジンの結合部位に結合するようにそれぞれ構成された複数の共活性化分子を含む共活性化試薬をさらに含み、共活性化分子の各々は、ＣＤ２結合分子又はＣＤ２８結合分子を含む。
図面の簡単な説明
[0046]本開示のいくつかの実施形態に従うアジド官能基化ウェルプレートのウェルの表面へのストレプトアビジン結合部分の導入のための代替方法の概略図である。
[0046]本開示のいくつかの実施形態に従うアジド官能基化ウェルプレートのウェルの表面へのストレプトアビジン結合部分の導入のための代替方法の概略図である。
[0046]本開示のいくつかの実施形態に従うアジド官能基化ウェルプレートのウェルの表面へのストレプトアビジン結合部分の導入のための代替方法の概略図である。
[0047]本開示のいくつかの実施形態に従う、ストレプトアビジン提示共有結合リガンドを有する表面の制限領域の導入と、それに続くリンパ球を活性化するための活性化リガンドの導入とを示す概略図である。
[0048]本開示のいくつかの実施形態に従うＴ細胞活性化のための活性化経路の概略図である。
[0049]本開示のいくつかの実施形態に従って活性化されたＴ細胞の細胞集団特徴を示すグラフである。
[0049]本開示のいくつかの実施形態に従って活性化されたＴ細胞の細胞集団特徴を示すグラフである。
[0049]本開示のいくつかの実施形態に従って活性化されたＴ細胞の細胞集団特徴を示すグラフである。
[0049]本開示のいくつかの実施形態に従って活性化されたＴ細胞の細胞集団特徴を示すグラフである。
[0050]多変量Ｔ細胞活性化実験に使用される実験条件を示す表である。
[0051]図４Ａで設計された多変量Ｔ細胞活性化実験から得られ、観察された細胞表面マーカの概略図である。
[0051]図４Ａで設計された多変量Ｔ細胞活性化実験から得られ、観察された細胞表面マーカの概略図である。
[0052]本開示のいくつかの実施形態に従って活性化されたＴ細胞の細胞集団特徴を示すグラフである。
[0052]本開示のいくつかの実施形態に従って活性化されたＴ細胞の細胞集団特徴を示すグラフである。
[0052]本開示のいくつかの実施形態に従って活性化されたＴ細胞の細胞集団特徴を示すグラフである。
[0052]本開示のいくつかの実施形態に従って活性化されたＴ細胞の細胞集団特徴を示すグラフである。
[0053]本開示のいくつかの実施形態に従う、ウェルプレートの表面の様々なサイズのストレプトアビジン提示領域を示す写真である。蛍光標識された領域１９３、１９５，１９７は、サイズ及び境界についての精度標準を例示する。
[0054]本開示のいくつかの実施形態に従って導入されたストレプトアビジン提示共有結合官能基化領域の測定及び計算面積を示すグラフである。
[0055]本開示のいくつかの実施形態に従って活性化されたＴ細胞の細胞集団特徴を示すグラフである。
[0055]本開示のいくつかの実施形態に従って活性化されたＴ細胞の細胞集団特徴を示すグラフである。
[0055]本開示のいくつかの実施形態に従って活性化されたＴ細胞の細胞集団特徴を示すグラフである。
[0055]本開示のいくつかの実施形態に従って活性化されたＴ細胞の細胞集団特徴を示すグラフである。
[0056]本開示のいくつかの実施形態に従って活性化されたＴ細胞の細胞集団特徴を示すグラフである。
[0056]本開示のいくつかの実施形態に従って活性化されたＴ細胞の細胞集団特徴を示すグラフである。
[0056]本開示のいくつかの実施形態に従って活性化されたＴ細胞の細胞集団特徴を示すグラフである。
[0056]本開示のいくつかの実施形態に従って活性化されたＴ細胞の細胞集団特徴を示すグラフである。
発明の詳細な説明
[0057] 本明細書は、本開示の例示的な実施形態及び適用を説明する。しかしながら、本開示は、これらの例示的な実施形態及び適用又は例示的な実施形態及び適用が機能するか若しくは本明細書に記載される様式に限定されない。さらに、図面は、概略図又は部分図を示す場合があり、図面中の要素の寸法は、拡大されるか又はそうでなければ正確な比率でないことがあり得る。加えて、用語「上」、「結合した」、「連結した」、「カップリングした」又は類似の用語が本明細書で使用される場合、１つの要素（例えば、材料、層、基質など）は、１つの要素が直接他の要素の上にあるか、それに結合するか、連結するか若しくはカップリングするか、又は１つの要素と他の要素との間に１つ若しくは複数の介在要素があるか否かにかかわらず、別の要素の「上」にあるか、それに「結合」するか、「連結」するか若しくは「カップリング」し得る。また、文脈から他の解釈が要求されない限り、方向（例えば、上方、下方、上部、底部、側部、上に、下に、下、上、上位、下位、水平、鉛直、「ｘ」、「ｙ」、「ｚ」など）は、記載がある場合、相対的であり、例として且つ説明及び記述を容易にするために付与されるに過ぎず、限定のためではない。さらに、要素のリスト（例えば、要素ａ、ｂ、ｃ）について言及がなされる場合、こうした言及は、それ自体、列挙された要素のいずれか１つのみ、列挙された要素の全部ではない任意の組合せ及び／又は列挙された要素全部の組合せを包含することが意図される。用語「又は」は、文脈から他の解釈が要求されない限り、包括的意味において、即ち「及び／又は」と均等に使用される。本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「１つの（a）」、「１つの（an）」及び「その」並びに任意の用語のあらゆる単数使用は、１つの指示語に明示的且つ明確に限定されない限り、複数の指示語を含むことに留意されたい。本明細書で使用される場合、用語「含む」、「包含する」及びその文法的変形は、非限定的であることが意図され、従って、あるリスト中の項目の記載内容は、列記項目に代わる又は追加され得る他の類似項目を除外しない。本明細書のセクション区分は、あくまで読みやすさのためであり、記述される要素のいずれかの組合せを限定するものではない。参照により組み込まれる資料と、本明細書に明示的に記載される内容との間に何らかの矛盾又は不一致があった場合、明示的に記載される内容が優先されるものとする。
[0057] 本明細書は、本開示の例示的な実施形態及び適用を説明する。しかしながら、本開示は、これらの例示的な実施形態及び適用又は例示的な実施形態及び適用が機能するか若しくは本明細書に記載される様式に限定されない。さらに、図面は、概略図又は部分図を示す場合があり、図面中の要素の寸法は、拡大されるか又はそうでなければ正確な比率でないことがあり得る。加えて、用語「上」、「結合した」、「連結した」、「カップリングした」又は類似の用語が本明細書で使用される場合、１つの要素（例えば、材料、層、基質など）は、１つの要素が直接他の要素の上にあるか、それに結合するか、連結するか若しくはカップリングするか、又は１つの要素と他の要素との間に１つ若しくは複数の介在要素があるか否かにかかわらず、別の要素の「上」にあるか、それに「結合」するか、「連結」するか若しくは「カップリング」し得る。また、文脈から他の解釈が要求されない限り、方向（例えば、上方、下方、上部、底部、側部、上に、下に、下、上、上位、下位、水平、鉛直、「ｘ」、「ｙ」、「ｚ」など）は、記載がある場合、相対的であり、例として且つ説明及び記述を容易にするために付与されるに過ぎず、限定のためではない。さらに、要素のリスト（例えば、要素ａ、ｂ、ｃ）について言及がなされる場合、こうした言及は、それ自体、列挙された要素のいずれか１つのみ、列挙された要素の全部ではない任意の組合せ及び／又は列挙された要素全部の組合せを包含することが意図される。用語「又は」は、文脈から他の解釈が要求されない限り、包括的意味において、即ち「及び／又は」と均等に使用される。本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「１つの（a）」、「１つの（an）」及び「その」並びに任意の用語のあらゆる単数使用は、１つの指示語に明示的且つ明確に限定されない限り、複数の指示語を含むことに留意されたい。本明細書で使用される場合、用語「含む」、「包含する」及びその文法的変形は、非限定的であることが意図され、従って、あるリスト中の項目の記載内容は、列記項目に代わる又は追加され得る他の類似項目を除外しない。本明細書のセクション区分は、あくまで読みやすさのためであり、記述される要素のいずれかの組合せを限定するものではない。参照により組み込まれる資料と、本明細書に明示的に記載される内容との間に何らかの矛盾又は不一致があった場合、明示的に記載される内容が優先されるものとする。
[0058] ミクロ流体特徴の寸法が幅又は面積を備えるものとして記載される場合、この寸法は、典型的に、ｘ軸及び／又はｙ軸方向の寸法に関して記載され、それらのいずれもミクロ流体デバイスの支持体及び／又はカバーに対して平行な平面内に位置する。ミクロ流体特徴の高さは、ｚ軸方向に関して記載され得、これは、ミクロ流体デバイスの支持体及び／又はカバーに対して平行な面に垂直である。いくつかの事例では、チャンネル又は通路などのミクロ流体特徴の横断面は、ｘ軸／ｚ軸、ｙ軸／ｚ軸又はｘ軸／ｙ軸面に関して述べられ得る。
[0059] 本明細書及び添付の特許請求の範囲の目的で、別に指示のない限り、本明細書及び特許請求の範囲で使用される、量、パーセンテージ又は割合を表す全ての数及び他の数値は、それらが依然としてそのように修正されていない程度まで、用語「約」によってあらゆる事例で修正されるものとして理解すべきである。「約」は、記載される主題の特性に実質的に影響を及ぼさない程度の変動、例えば１０％、５％、２％又は１％以内の変動を意味する。従って、反対の指示がない限り、以下の本明細書及び添付の特許請求の範囲に記載される数値パラメータは、近似値であり、得ようとする所望の特性に応じて変動し得る。少なくとも且つ特許請求の範囲に対する均等物の原則の適用を限定する試みとしてではなく、各数値パラメータは、少なくとも報告される有効数字の数を考慮し、且つ常用の丸め技術を適用することにより解釈されるべきである。
[0060] 本明細書で使用される場合、「実質的に」は、意図される目的のために機能する上で十分であることを意味する。従って、用語「実質的に」は、当業者により予想されるような絶対又は完全状態、寸法、測定、結果などから若干の些末な変動を許容するが、それは、性能全体に明らかな影響を与えるものではない。数値又は数値として表すことができるパラメータ又は特徴に関して使用されるとき、「実質的に」は、１０パーセント以内を意味する。
[0061] 用語「１つ」は、１つを超えるものを意味する。本明細書で使用される場合、用語「複数」は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれを超え得る。
[0062] 本明細書で使用される場合、用語「複数」は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれを超え得る。
[0063] 平方ミクロン、ｍｍ２又はｍｍ２のいずれで表されていても、これらの表記は、全てミクロン×ミクロンの寸法を有する面積の同じ尺度を指す。
[0064] 本明細書で使用される場合、用語「配置される」は、その意味に「位置する」を包含する。
[0065] 本明細書で使用される場合、用語「細胞」は、用語「生体細胞」と置き換え可能に使用される。生体細胞の非限定的な例として、真核細胞、植物細胞、動物細胞、例えば哺乳動物細胞、爬虫類細胞、鳥類細胞、魚類細胞など、原核細胞、細菌細胞、真菌細胞、原生動物細胞など、例えば筋肉、軟骨、脂肪、皮膚、肝臓、肺、神経組織などのような組織から解離された細胞、免疫学的細胞、例えばＴ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、マクロファージなど、胚（例えば、接合子）、卵母細胞、卵子、精細胞、ハイブリドーマ、培養細胞、細胞株からの細胞、癌細胞、感染細胞、トランスフェクト及び／又は形質転換細胞、リポーター細胞などが挙げられる。哺乳動物細胞は、例えば、ヒト、マウス、ラット、ウマ、ヤギ（ｇoat）、ヤギ（sheep）、ウシ、霊長類などに由来するものであり得る。
[0066] 生体細胞のコロニーは、生殖が可能なコロニー中の生存細胞の全てが単一の親細胞に由来する娘細胞であれば、「クローン」である。特定の実施形態において、クローンコロニー中の全娘細胞は、単一の親細胞から１０回以下の分裂により生じる。他の実施形態では、クローンコロニー中の全娘細胞は、単一の親細胞から１４回以下の分裂により生じる。他の実施形態では、クローンコロニー中の全娘細胞は、単一の親細胞から１７回以下の分裂により生じる。他の実施形態では、クローンコロニー中の全娘細胞は、単一の親細胞から２０回以下の分裂により生じる。用語「クローン細胞」は、同じクローンコロニーの細胞を指す。
[0067] 本明細書で使用される場合、生体細胞の「コロニー」は、２個以上の細胞（例えば、約２から約２０個、約４から約４０個、約６から約６０個、約８から約８０個、約１０から約１００個、約２０から約２００個、約４０から約４００個、約６０から約６００個、約８０から約８００個、約１００から約１０００個又は１０００個を超える細胞）を指す。
[0068] 本明細書で使用される場合、用語「細胞を維持する」とは、細胞を生存可能に維持及び／又は拡大するのに必要な条件を付与する、流体及び気体成分の両方を含む環境並びに任意選択で表面を提供することを指す。
[0069] 本明細書で使用される場合、細胞に関して述べるとき、用語「拡大（する」とは、細胞数を増加させることを指す。
[0070] 本明細書で使用される場合、「合成表面」は、支持構造と気体／液体媒体との間の界面を指し、合成表面は、非生物学的プロセスにより作製される。合成表面は、抗原提示合成表面を提供するために、それに連結した生体由来の物質、例えば本明細書に記載の一次及び共活性化分子を有し得るが、その場合、合成表面は、生物によって発現されないものとする。典型的に、支持構造は、ビーズの非表面曝露部分、ウエハー又はミクロ流体デバイスの支持体、カバー若しくは回路物質のような固体であり、生体核又はオルガネラを封入しない。
[0071] 本明細書で使用される場合、「ウェルプレート」は、生体細胞を培養するために用いられるデバイスである。ウェルプレートは、複数のウェル（例えば、２つ、６つ、１２、２４、９６、３８４又はそれらの間の任意の数のウェル）を含み得る。代わりに、ウェルプレートは、単一のウェルを含むこともでき、従って、用語「ウェルプレート」は、従来の培養プレート（例えば、丸い培養プレート）及び培養フラスコを包含し得る。ウェルプレートは、ウェルプレートの１つ又は複数のウェルを覆うか又はキャップするのに好適なカバー又はキャップを含み得る。
[0072] 本明細書で使用される場合、「ストレプトアビジン」は、一般に、高い親和性でビオチンと結合し、且つストレプトマイセス・アビジニ（Streptomyces avidinii）の細菌から元々単離されたストレプトアビジンタンパク質と構造及び／又はタンパク質配列相同性を共有する任意のタンパク質を指す。従って、用語「ストレプトアビジン」は、ビオチンに対する結合を保持するストレプトマイセス・アビジニ（Streptomyces avidinii）ストレプトアビジンの変異バージョン及び／又は断片並びにビオチンに対する結合を保持するストレプトマイセス・アビジニ（Streptomyces avidinii）ストレプトアビジン（例えば、アビジン）と相同性のタンパク質のビオチン結合変異バージョン及び／又は断片を包含する。ストレプトアビジンは、典型的に、４量体の構造であるが、用語「ストレプトアビジン」は、非４量体も同様に包含する。
[0073] 本明細書で使用される場合、「共活性化」は、生体高分子、その断片又はその合成若しくは修飾バージョンとＴ細胞との結合相互作用（一次Ｔ細胞受容体／抗原：ＭＨＣ結合相互作用以外）を指し、これは、生産的免疫応答を増大してＴ細胞の活性化をもたらす。共活性化相互作用は、例えば、ＣＤ２８、ＣＤ２、ＩＣＯＳなどの細胞内シグナル伝達に関与することができるＴ細胞表面タンパク質とそのアゴニストとの間など、抗原非特異的相互作用である。本明細書で使用される「共活性化」及び「共活性化する」は、それぞれ用語「共刺激」及び「共刺激する」と均等である。
[0074] 本明細書で使用される場合、「ＴＣＲ共活性化分子」は、Ｔ細胞上の１つ又は複数の共受容体に結合する生体高分子、その断片又はその合成若しくは修飾バージョンであり、これらは、ＴＣＲの抗原特異的結合により開始される応答を増幅及び／又は完了する遠位シグナル伝達分子を活性化する。一例では、転写因子である核内因子κＢ（ＮＦｋＢ）及び活性化Ｔ細胞の核内因子（ＮＦＡＴ）などのシグナル伝達分子は、ＴＣＲ共活性化分子により活性化される。ＴＣＲ共活性化分子は、例えば、ＣＤ２８受容体のアゴニストであり得、これは、ホスホイノシタイド３キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）／Ａｋｔ経路を介してシグナル伝達する。図２を参照されたい。
[0075] 本明細書で使用される場合、「ＣＤ２８高」又は「ＣＤ２８（高）」は、Ｔ細胞における高度ＣＤ２８表面発現の表現型を指す。当業者は、ＣＤ２８高表現型及びＣＤ２８高Ｔ細胞を識別する好適な方法を知っている。別に指示のない限り、ＣＤ２８高Ｔ細胞は、以下の基準のいずれかを満たすＴ細胞を含む。いくつかの請求項において、ＣＤ２８高Ｔ細胞は、休止ＣＤ８＋Ｔ細胞より高いレベルのＣＤ２８を発現するＴ細胞である。ＣＤ２８高Ｔ細胞は、無関連の非抗原特異的Ｔ細胞より高いレベルのＣＤ２８も発現し得る。いくつかの請求項において、ＣＤ２８高Ｔ細胞は、ＦＡＣＳにより測定可能な表面ＣＤ２８のレベルが、ＦＡＣＳにより測定可能な循環メモリーＴ細胞上に存在する表面ＣＤ２８のレベルと同等以上である集団である。いくつかの請求項において、ＣＤ２８高Ｔ細胞は、同じサンプル又は個体由来の循環メモリーＴ細胞上に存在する表面ＣＤ２８のレベルと同等以上の表面ＣＤ２８のレベルを有する。表面ＣＤ２８の発現は、ＦＡＣＳにより決定することができ、循環メモリーＴ細胞上に存在する表面ＣＤ２８のレベルの平均値（例えば、幾何平均）又は中央値は、所与のＴ細胞がＣＤ２８高であるか否かを決定するために使用することができる。いくつかの請求項において、ＣＤ２８高Ｔ細胞は、同じサンプル又は個体由来のナイーブＣＤ８Ｔ細胞に典型的な発現より有意に高いレベル、例えばナイーブＴ細胞の７５％、８０％、８５％、８７．５％、９０％、９２．５％又は９５％より高いレベルでＣＤ２８を発現するＴ細胞である。ナイーブＣＤ８Ｔ細胞は、検出可能なＣＤ２８を発現するため、わずかにのみＣＤ４５ＲＯを発現するか又はそれを発現しないＣＤ８＋細胞のように、公知の方法、例えばフローサイトメトリーにより識別及び特性決定することができる。
[0076] 本明細書で使用される場合、「ＴＣＲ補助活性化分子」は、抗原特異的ＴＣＲ相互作用を増幅するシグナル伝達分子のクラスを刺激し、ＴＣＲ共活性化分子と異なる。例えば、ＴＣＲ近位シグナル伝達複合体のリン酸化によるＴＣＲ近位シグナル伝達は、ＴＣＲ補助活性化分子が作用することができる１つの経路である。ＴＣＲ補助活性化分子は、例えば、ＣＤ２受容体のアゴニストであり得る。図２を参照されたい。
[0077] 本明細書で使用される場合、「活性化Ｔ細胞」は、抗原（又はその子孫）を経験して、その抗原に対して抗原特異的応答をマウントすることができるＴ細胞である。活性化Ｔ細胞は、一般に、ＣＤ２８、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ１２７及びＣＤ１９７の少なくとも１つに対して陽性である。
[0078] 本明細書で使用される場合、「抗体」は、免疫グロブリン（Ｉｇ）を指し、ポリクローナル及びモノクローナル抗体の両方；プリマタイズした（例えば、ヒト化）；マウス；マウス−ヒト；マウス−霊長類；及びキメラを含み；インタクトな分子、その断片（例えば、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、Ｆｄ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’及びＦ（ａｂ）’２フラグメント）又はインタクトな分子の多量体若しくは凝集体及び／又は断片であり得；天然に存在するものであり得るか、又は例えば免疫化、合成若しくは遺伝子操作により生産され得る。本明細書で使用される「抗体断片」は、抗体に由来するか又は関連する断片を指し、これは、抗原に結合し、一部の実施形態では、例えばガラクトース残基の組込みにより、クリアランス及び取込みを促進する構造的特徴を発揮するように誘導体化され得る。抗体断片は、例えば、Ｆ（ａｂ）、Ｆ（ａｂ）’２、ｓｃＦｖ、軽鎖可変領域（ＶＬ）、重鎖可変領域（ＶＨ）及びそれらの組合せを含む。
[0079] 癌のための免疫療法は、前向きな流れであるが、一部の実施形態では、治療の対象と適合性の特異的活性化Ｔリンパ球を必要とする。しかし、Ｔリンパ球を活性化するための抗原提示樹状細胞の現在の使用には、いくつかの不利な側面がある。樹状細胞は、ドナーソースから取得しなければならず、処理能力を制限する。樹状細胞は、毎回一連のＴリンパ球活性化のために成熟させなければならず、これには約７日のリードタイムを要する。また、樹状細胞の照射も必要であり、これは、こうした処理を実施することが可能な場所を制限する。
[0080] Ｔリンパ球活性化のために、自己抗原提示樹状細胞の代わりに、ウェルプレートの１つ又は複数のウェル内の抗原提示合成表面を使用すれば、治療に関連する集団のＴリンパ球を刺激し、拡大するためにより高い再現性が達成され得る。ウェルプレートの抗原提示合成表面をＴリンパ球の抗原特異的活性化のために操作して、癌の治療のために所望の表現型を有する活性化Ｔリンパ球の集団のより制御可能、及び／又は特性決定可能、及び／又は高再現性、及び／又は高速の発生を達成することができる。ウェルプレートの１つ又は複数のウェルの抗原提示合成表面は、活性化後の所望のＴ細胞表現型のより正確なターゲティング、例えば特定の形態のメモリーＴ細胞の濃縮を含め、Ｔ細胞活性化に対してより高い制御性及び選択性も可能にし得る。さらに、ウェルプレートの１つ又は複数のウェルの抗原提示合成表面は、スケールメリットも利用することができ、及び／又は自己抗原提示樹状細胞を使用する場合よりも高い程度まで再現性を付与することができる。このように、この技術は、より多くの必要とする患者に対して及び／又はより短い時間で細胞療法を利用可能にすることができる。細胞療法に有用なＴ細胞をより迅速に提供することは、特に進行した疾患を有する患者にとって重要となり得る。こうしたウェルプレートの１つ又は複数のウェルの抗原提示合成表面の構造並びにそれらの作製及び使用方法が本明細書に記載される。一部の実施形態では、ウェルプレートの１つ又は複数のウェルの抗原提示合成表面は、一緒になってＴ細胞を活性化する上で役立つＴＣＲ共活性化分子及び／又は補助ＴＣＲ活性化分子と組み合わせて、一次活性化リガンドを含む。有効性をさらに改善することができるこれらの構成要素の表面密度範囲及び互いに対する比も本明細書に開示される。一部の実施形態では、ウェルプレートの１つ又は複数のウェルの抗原提示合成表面並びにそれらの作製方法及び使用は、前述した利点の１つ又は複数を提供する。
[0081] さらに、本明細書に記載のウェルプレート内に適切に作製されたリンパ球活性化共有結合官能基化表面と接触させることにより、Ｔリンパ球以外のリンパ球を活性化することもできる。概して、免疫療法及び細胞生産を含む任意の目的のために、本明細書に記載のウェルプレートの活性化表面を用いてＢリンパ球及びＮＫ細胞を活性化及び／又は拡大することができる。
[0082] ウェルプレートのウェル内にリンパ球活性化合成表面を設けるために、そうした活性化のための限定領域を有する制御可能に共有結合官能基化されたウェルプレートが本出願人により発見され、記載される。
[0083] 従って、反応性部分提示共有結合官能基化領域又は活性化部分提示共有結合官能基化領域である第１領域を有する表面を含むウェルプレートであって、反応性部分は、アゾ部分、ビオチン部分又はストレプトアビジン部分であり、及び活性化部分は、リンパ球活性化部分である、ウェルプレートが提供される。第１領域は、少なくとも０．５ｍｍ２（例えば、少なくとも０．６ｍｍ２、少なくとも０．７ｍｍ２、少なくとも０．８ｍｍ２、少なくとも０．９ｍｍ２、少なくとも１．０ｍｍ２、少なくとも１．１ｍｍ２、少なくとも１．２ｍｍ２、少なくとも１．３ｍｍ２、少なくとも１．４ｍｍ２、少なくとも１．５ｍｍ２、少なくとも１．６ｍｍ２、少なくとも１．７ｍｍ２、少なくとも１．８ｍｍ２、少なくとも１．９ｍｍ２、少なくとも２．０ｍｍ２、少なくとも２．５ｍｍ２、少なくとも３．０ｍｍ２、少なくとも３．５ｍｍ２、少なくとも４．０ｍｍ２、少なくとも４．５ｍｍ２、少なくとも５．０ｍｍ２、少なくとも６．０ｍｍ２、少なくとも７．０ｍｍ２、少なくとも８．０ｍｍ２、少なくとも９．０ｍｍ２、少なくとも１０ｍｍ２、少なくとも１５ｍｍ２、少なくとも２０ｍｍ２、少なくとも２５ｍｍ２、少なくとも３０ｍｍ２、少なくとも３５ｍｍ２、少なくとも４０ｍｍ２、少なくとも４５ｍｍ２、少なくとも５０ｍｍ２、少なくとも７５ｍｍ２、少なくとも１００ｍｍ２、少なくとも１５０ｍｍ２、少なくとも２００ｍｍ２、少なくとも２５０ｍｍ２、少なくとも３００ｍｍ２、少なくとも４００ｍｍ２、少なくとも５００ｍｍ２、少なくとも６００ｍｍ２、少なくとも７００ｍｍ２、少なくとも８００ｍｍ２、少なくとも９００ｍｍ２、少なくとも１０００ｍｍ２又はそれを超える）の面積を有し得る。提示される反応性部分がビオチン部分若しくはストレプトアビジン部分であるか、又は第１領域が活性化部分提示共有結合官能基化領域であるようないくつかの実施形態では、第１領域は、典型的に、１００ｍｍ２未満、７５ｍｍ２未満又は５０ｍｍ２未満の面積を有するであろう。反応性部分がアゾ部分であるような他の実施形態では、第１領域は、１０００ｍｍ２を超える面積を有し得、例えば、第１領域は、少なくとも２，０００ｍｍ２、少なくとも３，０００ｍｍ２、少なくとも４，０００ｍｍ２、少なくとも５，０００ｍｍ２、少なくとも６，０００ｍｍ２、少なくとも７，０００ｍｍ２、少なくとも８，０００ｍｍ２、少なくとも９，０００ｍｍ２、少なくとも１０，０００ｍｍ２、少なくとも２０，０００ｍｍ２、少なくとも３０，０００ｍｍ２、少なくとも４０，０００ｍｍ２、少なくとも５０，０００ｍｍ２、少なくとも６０，０００ｍｍ２、少なくとも７０，０００ｍｍ２、少なくとも８０，０００ｍｍ２、少なくとも９０，０００ｍｍ２、少なくとも１００，０００ｍｍ２又はそれを超える（例えば、ウェルプレートのウェル又は２つ以上のウェルの各々の内部表面の実質的に全部）面積を有し得る。一部の変形形態では、第１領域は、約０．５ｍｍから約４．０ｍｍ（例えば、約１．０ｍｍから３．５ｍｍ又は約１．５ｍｍから３．０ｍｍ）の寸法を有し得る。第１領域は、実質的に円形であり得、且つ約０．５ｍｍから約４．０ｍｍ（例えば、約１ｍｍから３．５ｍｍ又は約１．５ｍｍから３．０ｍｍ）の直径を有し得る。
[0084] ウェルプレートの表面は、表面遮断リガンドを含む共有結合修飾領域である第２領域をさらに含み得る。任意選択で、第２領域は、第１領域を取り囲み得る。一部の実施形態では、表面遮断リガンドの各々は、親水性又は負荷電部分（例えば、カルボキシレート基）を含み得る。一部の実施形態では、表面遮断リガンドの各々は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分を含み得る。
[0085] ウェルプレートの表面は、ガラス又はポリスチレンを含み得る。一部の変形形態では、ウェルプレートの表面は、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ポリエチレン、シクロオレフィンコポリマー又はメラミンを含み得る。
[0086] 第１領域は、少なくとも５０／ｕｍ２、例えば約５０反応性部分又は活性化部分／ｕｍ２から約８×１０５／ｕｍ２、約１×１０２／ｕｍ２から約８×１０５／ｕｍ２；約５０／ｕｍ２から約５×１０５／ｕｍ２；約１×１０２／ｕｍ２から約１×１０５／ｕｍ２；約５０／ｕｍ２から約５×１０４／ｕｍ２；約１×１０２／ｕｍ２から約１×１０４／ｕｍ２；約１×１０２／ｕｍ２から約５×１０３／ｕｍ２；約１×１０２／ｕｍ２から約１×１０３／ｕｍ２；約５０／ｕｍ２から約５×１０２／ｕｍ２；約５０／ｕｍ２から約１×１０２／ｕｍ２；又は反応性部分若しくは活性化部分／ｕｍ２の数についてこれらの間の任意の数値の各反応性部分又は活性化部分の密度を有し得る。それぞれの反応性部分又は活性化部分を含む第１領域は、５から約２０個の骨格原子、約１０から約４０個の骨格原子、約１５から約５０個の骨格原子又は５０個を超える骨格原子を有するリンカーを介して表面に共有結合され得、骨格原子は、炭素、ケイ素、窒素及び酸素から選択される。従って、例えば、反応性部分又は活性化部分は、一続きの約５、７、９、１０、１１、１３、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、９０、１００、２００結合長のリンカー又はそれらの間の任意の数の結合長を介して表面に共有結合され得る。
[0087] 一部の変形形態では、反応性部分は、ストレプトアビジンであり得、及びストレプトアビジン官能基は、ウェルプレートの表面の第１領域に共有結合される。他の変形形態では、反応性部分は、ストレプトアビジンであり得、及びストレプトアビジン官能基は、ビオチン部分に非共有結合され、ビオチン部分は、それ自体、ウェルプレートの表面の第１領域に共有結合される。
[0088] 一部の変形形態では、第１領域は、複数の特異的に結合された一次活性化分子リガンドと、複数の特異的に結合された共活性化分子リガンドとを含む活性化部分提示共有結合官能基化領域であり得る。表面の第１領域上における一次活性化分子リガンドと共活性化分子リガンドとの比は、約１：１０から約２：１、約１：５から約２：１、約１：２から約２：１、約１：１０から約１：１、約１：５から約１：１、約１：１から約２：１又は約１：２から約１：１である。
[0089] 一部の実施形態では、複数の特異的に結合された一次活性化分子リガンドの各リガンドは、Ｔ細胞のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）に結合するように構成された主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子（例えば、クラスＩ又はクラスＩＩ）を含み得る。ＭＨＣ分子は、ＭＨＣクラスＩタンパク質配列及びβミクログロブリンタンパク質配列を含み得る。一部の変形形態では、ＭＨＣ分子は、Ｃ末端結合を介して活性化部分提示共有結合官能基化領域に連結され得る。
[0090] ＭＨＣ分子は、抗原ペプチドをさらに含み得る。抗原ペプチドは、腫瘍関連抗原ペプチド、ウイルス抗原、細菌抗原、真菌抗原又は原生動物抗原であり得る。一部の変形形態では、抗原ペプチドは、腫瘍関連抗原であり得る。一部の実施形態では、腫瘍関連抗原は、ＳＬＣ４５Ａ２、ＴＣＬ１、ＶＣＸ３Ａ、ＭＡＲＴ１又はＮＹＥＳＯ１であり得る。
[0091] 一部の変形形態では、複数の特異的に結合された共活性化分子リガンドの各リガンドは、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）共活性化分子又は補助ＴＣＲ活性化分子を含み得る。複数の共活性化分子リガンドのＴＣＲ共活性化分子と補助ＴＣＲ活性化分子との比は、約１００：１から約１：１００である。一部の実施形態では、複数の共活性化分子リガンドのＴＣＲ共活性化分子と補助ＴＣＲ活性化分子との比は、１００：１から９０：１、９０：１から８０：１、８０：１から７０：１、７０：１から６０：１、６０：１から５０：１、５０：１から４０：１、４０：１から３０：１、３０：１から２０：１、２０：１から１０：１、１０：１から１：１、３：１から１：３、１：１から１：１０、１：１０から１：２０、１：２０から１：３０、１：３０から１：４０、１：４０から１：５０、１：５０から１：６０、１：６０から１：７０、１：７０から１：８０、１：８０から１：９０、１：９０から１：１００であり得、上記数値の各々は、「約」により修正される。他の実施形態では、複数の特異的に結合された共活性化分子リガンドのＴＣＲ共活性化分子と補助ＴＣＲ活性化分子との比は、約２０：１から約１：２０又は約３：１から約１：３であり得る。
[0092] 一部の変形形態では、ＴＣＲ共活性化分子は、ＣＤ２８結合タンパク質又はＣＤ２８に対する結合能力を保持するその断片を含み得る。一部の実施形態では、ＣＤ２８結合タンパク質又はその断片は、部位特異的Ｃ末端ビオチン部分をさらに含み得る。一部の実施形態では、ＴＣＲ共活性化分子は、ＣＤ８０分子又はＣＤ２８に対する結合活性を保持するその断片を含み得る。一部の他の実施形態では、ＴＣＲ共活性化分子は、抗ＣＤ２８抗体又はＣＤ２８に対する結合活性を保持するその断片を含み得る。
[0093] 一部の変形形態では、補助ＴＣＲ活性化分子は、ＣＤ２結合タンパク質又はＣＤ２に対する結合活性を保持するその断片を含み得る。一部の実施形態では、ＣＤ２結合タンパク質又はその断片は、部位特異的Ｃ末端ビオチン部分をさらに含み得る。一部の他の実施形態では、補助ＴＣＲ活性化分子は、ＣＤ５８分子又はＣＤ２との結合活性を保持するその断片を含み得る。一部の実施形態では、補助ＴＣＲ活性化分子は、抗ＣＤ２抗体又はＣＤ２との結合活性を保持するその断片を含み得る。
[0094] 一部の変形形態では、複数の特異的に結合された一次活性化分子リガンド及び複数の特異的に結合された共活性化分子リガンドは、ウェルプレートのストレプトアビジン提示第１領域のストレプトアビジン官能基に特異的に結合され得る。
[0095] 複数の特異的に結合された一次活性化分子リガンドは、第１領域において、１平方ミクロン当たり少なくとも約１×１０２分子の密度、及び任意選択で、第１領域において、１平方ミクロン当たり約１×１０２から１×１０５分子の密度を有し得る。複数の特異的に結合された共活性化分子リガンドは、第１領域において、１平方ミクロン当たり少なくとも約１×１０２分子又は１平方ミクロン当たり約１×１０３から約１×１０５分子の密度を有する。
[0096] 一部の変形形態では、ウェルプレートであって、ウェルプレートの１つ又は複数のウェルの各々は、表面及びその第１領域を含み、第１領域は、本明細書に記載される表面及び第１領域を有する任意のウェルプレートと同様に、反応性部分提示共有結合官能基化領域又は活性化部分提示共有結合官能基化領域である、ウェルプレートが提供される。１つ又は複数のウェルの各々の第１領域は、対応するウェルの底部表面上に位置し得る。それぞれの第１領域の面積は、対応するウェルの底部表面の面積の約５０％未満、約２５％未満、約１５％未満、約１０％未満、約５％未満又は約２％未満であり得る。一部の実施形態では、第１領域の面積がウェルの底部表面の全面積よりも小さい場合、反応性部分は、アジド部分ではない。一部の実施形態では、表面遮断リガンドの各々は、親水性又は負荷電部分を含み得る。一部の実施形態では、表面遮断リガンドは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分を含み得る。
[0097] 前述したように、反応性部分提示共有結合官能基化領域、例えばアジド提示又はアルキニル提示部分を含む表面を有するウェルプレートは、中心にアクセス可能な官能基化形態として使用することができ、これは、限定されないが、生体細胞及びその断片を含め、様々なクラスの微小物体の無数の生物学的及び化学的形質転換のための多様な共有結合パートナー分子を用いて、多くの異なる方法で修飾することができ、限定されないが、制御可能な選択表現型を有する所望の集団を取得する目的で、リンパ球を活性化するための本明細書に記載の方法を含む方法に使用される。本明細書で使用される場合、アジド提示とは、それに共有結合されたリガンドを有する表面の共有結合機能化領域を指し、リガンドは、リガンドの表面結合第２末端とは反対側のリガンドの第１末端又はその付近にアジド官能基を有する。表面結合末端から反対側の末端又はその付近のアジド基は、アジド基が反応し得る反応対部分との反応に実質的に利用可能であり、そうした部分として、限定されないが、アルキン、環状歪アルキン、αケトクロライドなどがある。本明細書で述べる共有結合官能基化表面は、以下に詳述する通り、共有結合された分子（例えば、リガンド）がカップリングしたあらゆる種類のガラス又はポリマー表面を含む。共有結合官能基化された表面の領域は、以下により詳細に説明するように、表面全体、表面の一部又は表面の選択された部分であり得る。
[0098] 他の有用な制御可能な共有結合官能基化ウェルプレートも本出願人によって見出され、本明細書に記載される。ビオチン又はストレプトアビジンを特にウェルプレートの１つ又は複数のウェル内でウェルプレートのアジド提示共有結合官能基化表面に導入して、ウェルプレートの表面のビオチン提示共有結合官能基化領域又はウェルプレートの表面のストレプトアビジン提示共有結合官能基化領域を形成することができる。一構成では、ストレプトアビジンは、それ自体、反応性基を含むリンカーを介してウェルプレートの表面と共有結合され、この反応性基は、ウェルプレートのアジド提示共有結合官能基化表面と反応するように構成される。別の構成では、ストレプトアビジン部分は、ビオチン部分と非共有結合され、ビオチン部分は、それ自体、ウェルプレートのアジド提示共有結合官能基化表面と反応するように構成された反応性基を含むリンカーを介して表面と共有結合される。いずれの場合にも、ストレプトアビジン提示共有結合官能基化領域が表面に導入され、ストレプトアビジン部分は、アジド部分と同様に、表面と共有結合され、それにより、ストレプトアビジンの結合部位の少なくとも１つは、本明細書に記載されるリンパ球を活性化する方法で使用される生体分子リガンドとの結合のために利用可能となる。
[0099] ウェルプレートの表面のストレプトアビジン提示共有結合官能基化領域は、様々な用途に使用され得るが、非限定的であるが、１つの重要な用途は、リンパ球の活性化であり、そうしたものとして、限定されないが、Ｔ細胞の抗原特異的活性化が挙げられる。本出願人は、ウェルプレートのウェル内に存在するストレプトアビジンリガンドの密度を制限する能力、及び／又はストレプトアビジンリガンドを提示する領域のサイズを制限する能力、及び／又はストレプトアビジンリガンドを提示する領域の位置を選択する能力がＴ細胞の有効且つ効率的な活性化に重要であり得ることを見出した。理論に拘束されることを意図しないが、ウェルプレートのウェルの官能基化表面上に存在するストレプトアビジン部分の高い密度は、抗原を提示するＭＨＣ複合体及び共刺激リガンドが、高濃度において、各ストレプトアビジンに対して利用可能な複数の結合部位に結合して、高度に刺激性の抗原提示合成表面を提供することを可能にする。この高度に刺激性の抗原提示合成表面は、実際にＴ細胞を過剰刺激し、過剰活性化した細胞を疲弊又は病的表現型に向けて押し進めて、有効な細胞産物に生理学的に拡大することができる抗原特異的細胞の数を減少させ得る。代わりに又は加えて、大きい領域の一次及び二次（又は共活性化）活性化リガンドを有するウェルは、リンパ球も同様に過剰刺激して、望ましくない表現型の活性化リンパ球、例えば疲弊Ｔ細胞などをもたらし得る。リンパ球活性化リガンドの面積をウェルプレートのウェルのより小さい領域に制限して、リンパ球が遊走し得る面積を有利に提供し、それにより病的表現産生を防ぐことができる。加えて、本明細書に記載のウェルプレートに使用される制限活性化領域を用いれば、一部の実施形態において、丸底ウェルを使用し、且つウェル内の活性化領域に細胞を移すのに重力を使用する上で有用となり得る。
[00100] 同様に、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２８などの細胞表面マーカ、ペプチドロードＭＨＣ分子、サイトカイン、細胞接着リガンド及び成長刺激分子などの１つ又は複数の抗原提示種を提示するように修飾されたウェルの底部全体又は細胞含有領域のような大きい領域若しくは非制御表面エリアを有するウェルは、活性化及び一部の実施形態では拡大される細胞との過剰に活性化させる接触を誘導し、所望の細胞表面マーカ及び他の内部シグナル伝達経路の下方制御を招き、さらに、限定されないが、疲弊若しくは非拡大性活性化Ｔ細胞などの望ましくない細胞集団をもたらし得る。
[00101] 従って、本出願人らは、官能基化ウェルプレート内のウェルの指定領域内のストレプトアビジン部分の制御可能であり、明確且つ制限された接触領域及び接触密度を有する官能基化ウェルプレートを記載する。次に、ストレプトアビジン部分のこれらの制限領域／濃度を使用して、リンパ球の有効且つ効率的な活性化のための活性化種を導入することができ、こうしたものとして、限定されないが、個体の免疫療法に使用される細胞産物のための抗原特異性及び所望の表現型を有するＴ細胞が挙げられる。存在する活性化リガンドを有する領域の面積を制限することにより、刺激シグナルを受けた後、細胞が活性化領域から移動して、過剰活性化を起こさずに刺激を維持できることが提案される。加えて、それ自体、活性化分子種と結合することを許容しない表面遮断リガンドを使用して、ストレプトアビジン官能基（及び従ってそれに導入される活性化リガンド）の密度又は物理的位置の制限並びに刺激シグナル伝達への追加なしに、細胞維持、拡大及び可搬性に寄与する支持表面修飾の達成のいずれかを可能にすることができる。ウェルプレート表面の活性化のための限定領域の具体的且つ制御可能な導入について、以下により詳細に説明する。
[00102] ウェルプレート内の表面の共有結合機能化領域の制御可能且つ融通性に富む導入は、図１Ａから１Ｃ及び添付の説明を検討することにより理解することができる。図１Ａに示すように、ウェルプレート１１０が提供される。ウェルプレートは、ガラス又はポリマー、例えばプラスチックポリマーであり得るか、又はガラス若しくはポリマー表面を含み得る。ウェルプレート１１０ウェルプレートは、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ポリエチレン、シクロオレフィンコポリマー又はメラミンポリエチレン、ポリプロピレン、ポリカーボネート、シクロオレフィンコポリマー及びメラミンなどを含むか、それから構成されるか又は実質的にそれから構成され得る。ウェルプレート１１０は、ウェルプレート内に１６、４８、９６、３８４以上のウェルを有し得る。ウェルプレート１１０は、不純物を除去すると共に、表面に複数の反応性官能基を導入するために官能基化前に処理又はクリーニングされ得る。処理／クリーニングは、プラズマクリーニングを含み得、これは、本明細書に記載されるように又は当技術分野で周知のようなプラズマクリーニングの任意の好適な変形形態で実施され得る。代わりに又は加えて、ウェルプレート１１０の表面への反応性官能基、例えば酸化物の同様の導入を達成するために、ウェルプレートの表面をピラニア溶液で処理し得る。
[00103] 処理又はクリーニングされ得るウェルプレート１１０は、試薬１０３と反応され得、それにより、さらなる加工のためにウェルプレートの表面に反応性部分を含む、合成によりアクセス可能なハンドルが得られる。容易に導入することができる一般に有用な反応性部分として、限定されないが、アジド又はアルキンが挙げられ、これらの各々は、ウェルプレート表面に対する多様な表面修飾を達成するために、クリックケミストリー試薬の群に分類される試薬とさらに反応させることができる。しかし、当技術分野で公知の他の化学カップリング剤、例えば鈴木ボランカップリング反応試薬、マイケル反応などを使用して、表面官能基化試薬又は表面遮断試薬を好適に反応性の表面に結合させることもでき、また他の反応性部分、例えばカルボニル、共役カルボニル並びに他の活性化部分を使用し得る。本開示は、修飾表面及びその上に支持される活性化種を導入するためのクリックケミストリー及びそれぞれの試薬組合せの使用に限定されず、アジド部分の導入も、簡単にするために本明細書に詳細に説明する。
[00104] ミクロ流体デバイスの内部表面又はウェルプレートのウェルの修飾に適用することができるビーズ、例えばガラス若しくはポリマービーズなどの表面のいずれかで実施されるケミストリーのさらなる例は、２０１７年５月２６日に出願されたＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１７／０３４８３２号（Lowe et al.）及び２０１８年７月２０日に出願されたＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１８／０４３１４６号（Beemiller, et al.）に記載されており、これらの開示の各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
[00105] 表面の初期官能基化のための１つの非常に有用なクラスの試薬１０３としては、アゾ置換トリアルコキシシロキサンが挙げられ、トリアルコキシシロキサンは、ウェルプレート１１０の洗浄済表面の表面露出部分（例えば、酸化物）と反応する。シロキサンは、シロキサンに対するアジド反応性部分と連結するリンカーを有し、これは、炭化水素、置換炭化水素又はアルキレンオキシド鎖を含む。反応は、溶液中又は気体条件下で実施され、一部の変形形態では、アジド置換トリアルコキシシロキサンの反応は、揮発したアジド置換トリアルコキシシロキサンを用いて真空下で実施される。特定のアジド−トリアルコキシシロキサンの選択は、ウェルプレートの材料に応じて変わり、これは、種々のポリマーウェルプレートが様々な高温に対して耐性であるためである。リンカーの長さにより、アジド−トリアルコキシシロキサンを揮発させるのに使用しなければならない温度が決定され、これは、導入される修飾反応性表面の性質に影響を与える。ウェルプレート表面上の表面露出部分、例えば酸化物部分と、分子のトリアルコキシシロキサン部分との反応による表面へのアジド置換リガンドの導入である。反応は、溶液中で実施され得るか、又はアジド置換トリアルコキシシロキサンを揮発させて、表面露出部分と反応する条件下で実施され得る。アジド置換トリアルコキシシロキサンと反応するウェルプレートの面積は、ウェルプレート全体であり得るか、又はウェルプレートの一部との反応を制限するようにマスクする（例えば、ウェルプレートの１つ若しくは複数のウェルのみが反応し得るようにマスクする）か、又はそれらの任意の変形形態であり得る。一部の他の実施形態では、ウェルプレートの１つのウェル（又は複数のウェル）の底部の領域のみがウェルプレートのアジド提示共有結合官能基化領域であり得る。本明細書に述べるように、底部表面は、ウェルを形成する容器の壁上に位置し、底部表面は、ウェルプレート内のウェル上部の開口部とは反対側に配置される。一部の実施形態では、アジド提示共有結合官能基化領域は、ウェルを形成する容器の側壁上に位置せず、側壁は、ウェルプレートのウェルの開口部と隣接する。一部の他の実施形態では、アジド提示共有結合官能基化領域は、ウェルを形成する容器の側壁上に位置せず、側壁は、ウェル上部の開口部に対して実質的に垂直である。
[00106] 一部の変形形態では、アジド提示共有結合官能基化領域は、少なくとも０．５ｍｍ２（例えば、少なくとも１．０ｍｍ２、少なくとも１．５ｍｍ２、少なくとも２．０ｍｍ２、少なくとも３．０ｍｍ２、少なくとも４．０ｍｍ２、少なくとも５．０ｍｍ２、少なくとも６．０ｍｍ２、少なくとも７．０ｍｍ２、少なくとも８．０ｍｍ２、少なくとも９．０ｍｍ２、少なくとも１０ｍｍ２、少なくとも１５ｍｍ２、少なくとも２０ｍｍ２、少なくとも２５ｍｍ２、少なくとも３０ｍｍ２、少なくとも３５ｍｍ２、少なくとも４０ｍｍ２、少なくとも４５ｍｍ２、少なくとも５０ｍｍ２、少なくとも７５ｍｍ２、少なくとも１００ｍｍ２、少なくとも１５０ｍｍ２、少なくとも２００ｍｍ２、少なくとも２５０ｍｍ２、少なくとも３００ｍｍ２、少なくとも４００ｍｍ２、少なくとも５００ｍｍ２、少なくとも６００ｍｍ２、少なくとも７００ｍｍ２、少なくとも８００ｍｍ２、少なくとも９００ｍｍ２、少なくとも１，０００ｍｍ２、少なくとも２，０００ｍｍ２、少なくとも３，０００ｍｍ２、少なくとも４，０００ｍｍ２、少なくとも５，０００ｍｍ２、少なくとも６，０００ｍｍ２、少なくとも７，０００ｍｍ２、少なくとも８，０００ｍｍ２、少なくとも９，０００ｍｍ２、少なくとも１０，０００ｍｍ２、少なくとも２０，０００ｍｍ２、少なくとも３０，０００ｍｍ２、少なくとも４０，０００ｍｍ２、少なくとも５０，０００ｍｍ２、少なくとも６０，０００ｍｍ２、少なくとも７０，０００ｍｍ２、少なくとも８０，０００ｍｍ２、少なくとも９０，０００ｍｍ２、少なくとも１００，０００ｍｍ２又はそれを超える）の面積を有し得る。
[00107] アジド提示共有結合官能基化領域は、少なくとも５０／ｕｍ２（例えば、約５０アジド基／ｕｍ２から約２×１０７／ｕｍ２、約１×１０２／ｕｍ２から約１×１０７／ｕｍ２；約５０／ｕｍ２から約５×１０６／ｕｍ２；約１×１０２／ｕｍ２から約１×１０６／ｕｍ２；約１×１０２／ｕｍ２から約５×１０５／ｕｍ２；約１×１０２／ｕｍ２から約１×１０５／ｕｍ２；約１×１０２／ｕｍ２から約５×１０４／ｕｍ２；約５０／ｕｍ２から約５×１０４／ｕｍ２；約１×１０２／ｕｍ２から約５×１０３／ｕｍ２；約５０／ｕｍ２から約５×１０２／ｕｍ２；又はアジド基／ｕｍ２の数についてこれらの間の任意の数値）のアジド基の密度を有し得る。
[00108] リンカーは、５、７、９、１０、１１、１３、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、９０、１００、２００結合長又はそれらの間の任意の数の結合長であり得る結合長の長さを有し得る。一部の実施形態では、アジド提示共有結合官能基化領域は、一続きの約５結合長から約２０結合長又は約１０結合長から約４０結合長を介して表面に共有結合されたアジド官能基を含む。一部の実施形態では、アジド官能基を表面に連結するリンカーの原子は、炭素、ケイ素、窒素、硫黄及び酸素から選択され得る。一部の実施形態では、リンカーの原子は、炭素、ケイ素及び酸素から選択され得る。一部の変形形態では、リンカーは、約７から約１７個の骨格原子を有し、これらは、炭素、ケイ素及び酸素から選択され得る。一部の実施形態では、リンカーは、線状リンカーであり、リンカーは、アジド部分に結合した１つのみの第１末端と、表面に結合した１つの第２末端とを有する。他の実施形態では、リンカーは、分岐リンカーであり、分岐リンカーは、表面に結合した１つのみの第２末端と、アジド部分、例えばアジド官能基化ブラシポリマーにそれぞれ結合した複数の第１末端とを有し得る。様々な実施形態では、表面のアジド提示表面結合リガンドは、ウェルプレートの表面上に単分子膜を形成する。一部の実施形態では、アジド提示表面結合リガンドは、自己組織化単分子膜を形成し、これは、約１０オングストローム、約２０オングストローム、約３０オングストローム、約４０オングストローム、約５０オングストローム、約７０オングストローム、約１００オングストロームまで又はそれらの間の任意の値のウェルプレートの表面からの厚さを有し得る。
[00109] 一部の変形形態では、アジド部分をトリアルコキシシロキサンと連結するリンカーは、約２０、約１８、約１６、約１４、約１２、約１０、約９、約８、約７、約６、約５又は約４原子長さの骨格長を有する。一部の実施形態では、骨格は、約７原子の長さであり、炭化水素鎖である。ガラスウェルプレートは、一般に高い反応条件にかなり耐えることができるが、他のポリマーウェルプレートは、変形するか、又はそうでなければ非常に高い温度に対する曝露後に使用できなくなり得る。ポリスチレン又はポリカーボネートなどのポリマーウェルプレートを修飾するのに有効であることが判明したものは、７炭素原子の長さを有するアゾ置換トリアルコキシシロキサンの使用である。従って、図１Ａに示されるように、表面官能基化試薬１０３は、特にポリマーウェルプレートでの使用の場合、７−アジドヘプチル−トリメトキシシランであり、それにより表面に官能基化リガンド１０５を提示する官能基化ウェルプレート１１５を形成する。７−アジドヘプチル−トリメトキシシランを用いる具体的な場合、リガンド１０５は、シロキサン部分を介して表面に共有結合されたアジドヘプチルリガンドである。
[00110] ウェルプレートの表面のストレプトアビジン提示共有結合官能基化領域を提供する経路。共有結合官能基化ウェルプレート表面１１５（具体的な例では、アジド提示共有結合官能基化ウェルプレート表面）は、ストレプトアビジン部分を提示するように修飾され得る。これは、いくつかの方法の１つで達成することができる。
[00111] ウェルプレートの表面のビオチン提示共有結合官能基化領域。ウェルプレートの表面のストレプトアビジン提示共有結合官能基化領域を作製する一手法は、ウェルプレートの表面に対する共有結合ビオチン基を介して行うものである。アジド官能基化ウェルプレート１１５は、ジシクロオクチニル含有クリック試薬のようなビオチン結合アルキン含有試薬と反応させることができる。図１Ａでは、一例として、ビオチンを含むジベンゾシクロオクチニル（ＤＢＣＯ）クリック試薬であるＤＢＣＯ試薬１０７を使用し得、その場合、ビオチン部分は、中でも、アルキル、アルキレンオキシド又は切断可能なアルキル若しくはアルキレンオキシド骨格を含むリンカーによってＤＢＣＯ部分に連結される。リンカーは、少なくとも４原子、少なくとも８原子、少なくとも１２原子、少なくとも１６原子、少なくとも２０原子、少なくとも５０原子、少なくとも１００原子又はそれを超える骨格長を有し得、これらは、炭素、酸素、窒素若しくは硫黄であり得る。試薬１０７のＤＢＣＯ部分とアジドリガンド１０５との反応により、共有結合ビオチン含有リガンド１０９が得られ、ウェルプレートの表面１２０のビオチン提示共有結合官能基化領域が提供される。
[00112] ウェルプレートの表面のビオチン提示共有結合官能基化領域の一部の変形形態では、ウェルプレート１１５のアジド官能基化表面をまず表面遮断試薬１１７と反応させて、ウェルプレートの表面のアジド提示共有結合官能基化領域１３０を形成することができる。表面遮断試薬１１７は、クリーニング／作製された表面の残る表面露出部分と反応するように構成された反応性部分を有し得るが、これは、アジド官能基化ステップにおいて試薬１０３と結合しなかった。表面遮断試薬１１７は、クリーニングにより導入される表面露出部分と反応するように構成された１つの反応性官能基、例えばトリアルコキシシロキサンなどを含む。しかし、表面遮断試薬１１７は、ビオチン含有試薬、ストレプトアビジン、ストレプトアビジン含有試薬又はリンパ球活性化試薬のいずれかと反応するように構成された官能基を含まない。表面遮断試薬１１７は、以下に十分詳細に説明するいずれか好適な遮断試薬と同様であり得る。
[00113] 表面１３０への共有結合ビオチンの導入は、前述した表面１１５の反応と同様に、ＤＢＣＯ連結ビオチン部分１０７を用いて実施することができ、これは、アジドリガンド１０５のアジド官能基とのみ反応して、共有結合ビオチンリガンド１０９及び表面遮断リガンド１１９を有するウェルプレートの表面のビオチン提示共有結合官能基化領域１３５を提供する。
[00114] 表１Ｂに示すまた別の代替形態では、ウェルプレート１１５のアジド提示共有結合官能基化表面をビオチン含有ＤＢＣＯ試薬１０７及び表面遮断ＤＢＣＯ試薬１２１の混合物と反応させることができ、これらは、表面１１５のアジド部分と反応するように構成された表面遮断部分及びＤＢＣＯ部分を有する。表面遮断部分は、以下にさらに詳細に説明するいずれかの好適な表面遮断ＤＢＣＯ試薬であり得る。この反応の産物は、ウェルプレートの表面のビオチン提示共有結合官能基化領域１４５であり、これは、ビオチン含有リガンド１０９と表面遮断リガンド１２３との両方を有する。混合表面上のリガンドの割合を任意の好適な割合に修正して、所望の量に対する単位面積当たりのビオチン部分の密度を「調整」し得る。ビオチンリガンドと表面遮断リガンドとの割合は、約３：１、約２：１、約１：１、約１：２、約１：３、約１：４、約１：５、約１：６、約１：８、約１：１０又はそれを超え得る。また、表面遮断リガンド１２３の表面遮断部分の化学的性質も、選択したリンパ球活性化のための最適化表面を提供するように変化させることができる。
[00115] ビオチン提示共有結合官能基化領域１３５、１４５の場合、表面遮断試薬１１７及び表面遮断ＤＢＣＯ試薬１２１は、２種以上の表面遮断部分を含み得る。例えば、異なる鎖長、荷電部分及び／又は親水性を有する試薬の混合物を用いることができる。
[00116] ビオチン提示共有結合官能基化領域１２０、１３５、１４５は、少なくとも０．５ｍｍ２、例えば少なくとも０．６ｍｍ２、少なくとも０．７ｍｍ２、少なくとも０．８ｍｍ２、少なくとも０．９ｍｍ２、少なくとも１．０ｍｍ２、少なくとも１．１ｍｍ２、少なくとも１．２ｍｍ２、少なくとも１．３ｍｍ２、少なくとも１．４ｍｍ２、少なくとも１．５ｍｍ２、少なくとも１．６ｍｍ２、少なくとも１．７ｍｍ２、少なくとも１．８ｍｍ２、少なくとも１．９ｍｍ２、少なくとも２．０ｍｍ２、少なくとも３．０ｍｍ２、少なくとも４．０ｍｍ２、少なくとも５．０ｍｍ２、少なくとも６．０ｍｍ２、少なくとも７．０ｍｍ２、少なくとも８．０ｍｍ２、少なくとも９．０ｍｍ２、少なくとも１０ｍｍ２、少なくとも１５ｍｍ２、少なくとも２０ｍｍ２、少なくとも２５ｍｍ２、少なくとも３０ｍｍ２、少なくとも３５ｍｍ２、少なくとも４０ｍｍ２、少なくとも４５ｍｍ２、少なくとも５０ｍｍ２又は上記の端点の２つによって画定される任意の範囲の面積を有し得る。従って、例えば、ビオチン提示共有結合官能基化領域１２０、１３５、１４５の面積は、約０．５ｍｍ２から約５０ｍｍ２、約１ｍｍ２から約４０ｍｍ２、２ｍｍ２から約３５ｍｍ２、約３ｍｍ２から約３０ｍｍ２又は約４ｍｍ２から約２５ｍｍ２の範囲であり得る。典型的に、ビオチン提示共有結合官能基化領域１２０、１３５、１４５は、１００ｍｍ２以下（例えば、７５ｍｍ２以下又は５０ｍｍ２以下）の面積を有する。
[00117] ビオチン提示共有結合官能基化領域１２０、１３５、１４５は、少なくとも５０／ｕｍ２（例えば、約５０ビオチン基／ｕｍ２から約５×１０６／ｕｍ２、約１×１０２／ｕｍ２から約１×１０６／ｕｍ２；約１×１０２／ｕｍ２から約５×１０５／ｕｍ２；約１×１０２／ｕｍ２から約１×１０５／ｕｍ２；約１×１０２／ｕｍ２から約５×１０４／ｕｍ２；約１×１０２／ｕｍ２から約１×１０４／ｕｍ２；約１×１０２／ｕｍ２から約５×１０３／ｕｍ２；約１×１０２／ｕｍ２から約１×１０３／ｕｍ２；約５０／ｕｍ２から約５×１０２／ｕｍ２；約５０／ｕｍ２から約１×１０２／ｕｍ２；又はビオチン基／ｕｍ２の数についてこれらの間の任意の数値）のビオチン官能基の密度を有し得る。
[00118] ビオチン提示共有結合官能基化領域は、一続きの約５、７、９、１０、１１、１３、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、９０、１００、２００結合長のリンカー又はそれらの間の任意の数の結合長の長さを介して表面に共有結合されたリンカーにより表面に共有結合されたビオチン官能基を含む。一部の実施形態では、ビオチン官能基を表面に連結させるリンカーの原子は、炭素、ケイ素、窒素、硫黄及び酸素から選択され得る。一部の実施形態では、リンカーの原子は、炭素、ケイ素及び酸素から選択される。一部の実施形態では、ビオチンをＤＢＣＯ部分に連結するリンカーは、炭素、ケイ素、窒素及び酸素から選択される約１０から４０個の骨格原子を有し得る。一部の実施形態では、リンカーは、線状リンカーであり、リンカーは、ビオチン基に結合した１つのみの第１末端と、表面に結合した１つの第２末端とを有する。一部の実施形態では、リンカーは、実質的に線状のリンカーであり、実質的に線状のリンカーは、トリアゾリル又は置換トリアゾリル部分などの環状部分を含むか又はそれによって分断され得る。トリアゾリル又は置換トリアゾリル部分などの環状部分は、実質的に線状のリンカーの一部であり得、これは、クリックカップリングにより導入されて、共有結合ビオチンを導入する。他の実施形態では、リンカーは、分岐リンカーであり、分岐リンカーは、表面に結合した１つの第２末端と、結合したビオチン部分、例えばビオチン提示官能基化ブラシポリマーをそれぞれ有する複数の第１末端とを有し得、これは、トリアゾリル及び／又は置換トリアゾリル部分などの環状部分を含み得る。一部の他の実施形態では、ビオチン部分を表面に連結させるリンカーは、ジスルフィド結合又は光解離性部分をさらに含み得る。様々な実施形態では、ビオチン提示共有結合官能基化表面のリガンドは、領域１２０、１３５、１４５の表面上に単分子膜を形成する。一部の実施形態では、ビオチン提示表面結合リガンドは、自己組織化単分子膜を形成し、これは、約１０オングストロームから約１００オングストローム又はそれらの間の任意の値のウェルプレートの表面からの厚さを有し得る。
[00119] ウェルプレートの表面のビオチン提示共有結合官能基化領域１２０、１３５、１４５は、直ちにさらに修飾され得るか、又は後の使用のために貯蔵され得る。図１Ａ、１Ｂは、ウェルプレートの表面のストレプトアビジン提示共有結合官能基化領域にさらに形質転換された表面のビオチン提示共有結合官能基化領域１２０、１３５、１４５を示すが、本発明は、そのように限定されない。ビオチンとのいずれか好適な結合ペアをウェルプレートの表面のビオチン提示共有結合官能基化領域１２０に結合され得る。
[00120] ウェルプレートの表面のストレプトアビジン提示共有結合官能基化領域。図１Ａ及び１Ｂに示すように、ビオチン提示共有結合官能基化領域１２０、１３５、１４０のいずれかは、ストレプトアビジンをその上のビオチン部分に結合させ得る。ストレプトアビジンは、天然ストレプトアビジン又はビオチンとの結合親和性を備える修飾ストレプトアビジンのいずれでもあり得、４つの結合部位を有し、且つ構造１１１として概略的に示され、これを領域１２０、１３５、１４５のビオチン含有リガンド１０９と反応させて、ストレプトアビジンの４つの利用可能な部位の１つに結合させることにより、ストレプトアビジンリガンド１１３を有するそれぞれストレプトアビジン提示共有結合官能基化領域１２５、１４０、１５０を得ることができる。ストレプトアビジンは、それ自体、非共有結合であると考えられ得るが、それ自体、表面と共有結合されたビオチンを介して表面に結合され、それによりウェルプレートの表面のストレプトアビジン提示共有結合官能基化領域を形成する。ビオチン／ストレプトアビジン結合ペアの強度（解離定数Ｋｄは、約１０−１４ｍｏｌ／Ｌである）は、共有結合と同等の強度と考えられ得るため、表面との強力な結合を可能にする。
[00121] 前述したように、ストレプトアビジン提示共有結合官能基化領域１４０、１５０は、それぞれ表面遮断リガンド１１９及び１２３を含み、活性化表面の選択性設計を可能にする。
[00122] 表面のアジド提示共有結合官能基化領域に直接結合したストレプトアビジン。図１Ｃに示すなおもさらなる代替形態では、ウェルプレートの表面のストレプトアビジン提示共有結合官能基化領域は、アジド官能基リガンド１０５を有するアジド提示共有結合官能基化表面１１５から直接形成することができる。ストレプトアビジンは、試薬１２７などのアルキニル部分と共有結合されたストレプトアビジン分子を有するクリックケミストリー試薬との反応によりワンステップで表面１１５と共有結合され得、ＤＢＣＯ部分は、ストレプトアビジン４量体分子（４つの結合部位を有する）にリンカーを介して共有結合される。ＤＢＣＯをストレプトアビジンと連結させるリンカーは、アルケニルオキシド、アルキル又は切断可能なアルケニルオキシド若しくはアルキル線状部分であり得る。リンカーは、炭素、ケイ素、窒素及び酸素から選択される１０から５０個の骨格原子を有し得る。（例えば、ストレプトアビジン官能基は、一続きの約５、７、９、１０、１１、１３、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、９０、１００、２００結合長のリンカー又はそれらの間の任意の数の結合長を介して表面に共有結合され得る。一部の実施形態では、ストレプトアビジンを表面に連結させるリンカーの原子は、炭素、ケイ素、窒素、硫黄及び酸素から選択され得る。一部の実施形態では、リンカーの原子は、炭素、ケイ素及び酸素から選択され得る。一部の実施形態では、リンカーは、線状リンカーであり、リンカーは、ストレプトアビジンに共有結合された１つのみの第１末端と、表面に直接又は間接的に結合した１つの第２末端とを有する。一部の実施形態では、リンカーは、実質的に線状のリンカーであり、このリンカーは、ストレプトアビジン部分に共有結合された１つのみの第１末端と、表面に直接又は間接的に結合した１つの第２末端とを有し、実質的に線状のリンカーは、トリアゾリル又は置換トリアゾリル部分などの環状部分を含むか又はそれによって分断され得る。トリアゾリル又は置換トリアゾリル基などの環状部分は、実質的に線状のリンカーの一部であり得、これは、クリックカップリングにより導入されて、共有結合ストレプトアビジンを導入する。他の実施形態では、リンカーは、分岐リンカーであり、分岐リンカーは、表面に直接又は間接的に結合した１つの第２末端と、ストレプトアビジン部分、例えばストレプトアビジン官能基化ブラシポリマーに各々が結合した複数の第１末端とを有し得、これは、トリアゾリル及び／又は置換トリアゾリル基などの環状基を含み得る。他の変形形態では、ストレプトアビジンは、ストレプトアビジン分子の２点以上で表面に共有結合され得る。一部の他の実施形態では、ストレプトアビジン部分を表面に連結させるリンカーは、ジスルフィド部分又は光解離性部分をさらに含み得る。一部の実施形態では、ストレプトアビジン提示表面結合リガンドは、膜を形成し、これは、約１０オングストロームから約１００オングストローム又はそれらの間の任意の値のウェルプレートの表面からの厚さを有する。
[00123] 図１Ｃに示すように、このワンステップ法は、ストレプトアビジン連結ＤＢＣＯクリック試薬１２７と表面遮断試薬１２１のような表面遮断試薬の混合物も使用する場合もあり、表面遮断試薬は、前述した任意の組成物を有し得る。ストレプトアビジンＤＢＣＯ試薬１２７と表面遮断試薬１２１との混合物を任意の所望の比で使用して、修飾表面１５５に対するストレプトアビジン部分の選択密度／分布を提供することができる（混合物は示していない）。ストレプトアビジンリガンドと表面遮断リガンドとの比は、約３：１；約２：１；約１：１；約１：２；約１：３；約１：４；約１：５；約１：６；約１：８；約１：１０又はそれを超え得る。
[00124] また別の代替形態では、これまでの例は、ＤＢＣＯクリック試薬を用いて説明してきたが、同じ表面の全てを、図１Ａ〜１Ｃに示すものと同様の対応する方法で非環状アルキン連結ビオチン、表面遮断試薬及びストレプトアビジン結合試薬を用いて導入することができる。一部の変形形態では、銅触媒と共にアゾリガンド１０５と反応させるためのアルキン結合クリック試薬の使用は、以下でより詳細に述べられるように、より正確に画定された修飾領域を取得する上で十分にクリック反応を示すのに有用となり得る。
[00125] 本明細書のいずれかと同様に、ストレプトアビジン提示共有結合官能基化領域は、少なくとも５０／ｕｍ２（例えば、約５０ストレプトアビジン基／ｕｍ２から約８×１０５／ｕｍ２、約１×１０２／ｕｍ２から約８×１０５／ｕｍ２；約５０／ｕｍ２から約５×１０５／ｕｍ２；約１×１０２／ｕｍ２から約１×１０５／ｕｍ２；約５０／ｕｍ２から約５×１０４／ｕｍ２；約１×１０２／ｕｍ２から約１×１０４／ｕｍ２；約１×１０２／ｕｍ２から約５×１０３／ｕｍ２；約１×１０２／ｕｍ２から約１×１０３／ｕｍ２；約５０／ｕｍ２から約５×１０２／ｕｍ２；約５０／ｕｍ２から約１×１０２／ｕｍ２；又はストレプトアビジン基／ｕｍ２の数についてこれらの間の任意の数値）のストレプトアビジン官能基の密度を有し得る。
[00126] 本明細書のいずれかと同様に、ストレプトアビジン提示共有結合官能基化領域は、少なくとも０．５ｍｍ２（例えば、少なくとも０．６ｍｍ２、少なくとも０．７ｍｍ２、少なくとも０．８ｍｍ２、少なくとも０．９ｍｍ２、少なくとも１．０ｍｍ２、少なくとも１．１ｍｍ２、少なくとも１．２ｍｍ２、少なくとも１．３ｍｍ２、少なくとも１．４ｍｍ２、少なくとも１．５ｍｍ２、少なくとも１．６ｍｍ２、少なくとも１．７ｍｍ２、少なくとも１．８ｍｍ２、少なくとも１．９ｍｍ２、少なくとも２．０ｍｍ２、少なくとも３．０ｍｍ２、少なくとも４．０ｍｍ２、少なくとも５．０ｍｍ２、少なくとも６．０ｍｍ２、少なくとも７．０ｍｍ２、少なくとも８．０ｍｍ２、少なくとも９．０ｍｍ２、少なくとも１０ｍｍ２、少なくとも１５ｍｍ２、少なくとも２０ｍｍ２、少なくとも２５ｍｍ２、少なくとも３０ｍｍ２、少なくとも３５ｍｍ２、少なくとも４０ｍｍ２、少なくとも４５ｍｍ２、少なくとも５０ｍｍ２又は上記の端点の２つによって画定される任意の範囲）の面積を有し得る。従って、例えば、ストレプトアビジン提示共有結合官能基化領域の面積は、約０．５ｍｍ２から約５０ｍｍ２、約１ｍｍ２から約４０ｍｍ２、２ｍｍ２から約３５ｍｍ２、約３ｍｍ２から約３０ｍｍ２又は約４ｍｍ２から約２５ｍｍ２の範囲であり得る。典型的に、ストレプトアビジン提示共有結合官能基化領域は、１００ｍｍ２以上（例えば、７５ｍｍ２以上又は５０ｍｍ２以上）の面積を有する。
[00127] 表面の活性化領域内の１つ又は複数の異なる活性化分子を結合するのに十分な数の結合部位（最大４つの利用可能な結合部位を有するストレプトアビジン）を提供する目的で、活性化分子が存在し得る密度に上限を設けながら、ストレプトアビジン部分の密度を選択するために、上記作製方法により提供される制御を使用することが望ましい場合もある。理論に拘束されることを望まないが、本明細書に記載される最大密度を超える密度の刺激リガンドを用いると、リンパ球を過剰に刺激する可能性があり、これは、リンパ球を望ましくない生理状態、例えば疲弊表現型又は非特異的活性化表現型に到らせる恐れがある。
[00128] 選択的に導入された共有結合官能基化領域。前述したように、本出願人らは、リンパ球にアクセス可能な量を超えない限定された活性化領域を形成すれば、非常に改善された活性化表現型が得られることを見出した。従って、リンパ球活性リガンドを結合することができる共有結合官能基化表面の導入は、ウェルプレートの表面の規定領域内で実施することができる。一部の実施形態では、ウェルプレートの１つ又は複数の表面は、導入されたアジド提示共有結合官能基化領域を有し得る。１つ又は複数の表面は、ウェルプレートの１つ又は複数のウェルであり得、さらに、ウェルプレートの１つ又は複数のウェルの底部表面であり得、底部表面である。本明細書で述べるように、底部表面は、ウェルを形成する容器の壁に位置し、底部表面は、ウェルプレートのウェル上部の開口部と反対側に配置される。一部の実施形態では、アジド提示共有結合官能基化領域は、ウェルを形成する容器の側壁に位置せず、側壁は、ウェルプレートのウェルの開口部と隣接する。
[00129] しかし、様々な実施形態では、特に、アジド連結トリアルコキシシロキサンが、ウェルプレートの表面と接触する揮発試薬として反応して、表面露出部分と反応する場合、ウェルプレートの表面の全ては、導入されたアジド提示共有結合官能基化表面を有する場合もある。記載されるように、任意の好適なタイプのマスキングを使用する場合、表面の全部より少ない部分を反応させて、アジド提示共有結合官能基化表面を形成することができる。例えば、ウェルプレートの上部及び下部側をマスクして、１つ又は複数のウェル内部の表面のみが反応して、アジド提示共有結合官能基化領域を形成するようにし得る。代わりに、ウェルプレートの選択したウェルのみを反応させて、底部及び側壁を含め、ウェル内部の表面の全部に延在するアジド提示共有結合官能基化領域を有するようにし得る。また別の変形形態では、ウェルプレートの１つ又は複数のウェルの底部表面のみを反応させて、ウェルプレートの１つ又は複数のウェルの底部内にアジド提示共有結合官能基化領域を有するようにし得る。
[00130] これらの表面のいずれかのアジド提示共有結合官能基化領域は、少なくとも０．５ｍｍ２（例えば、少なくとも１．０ｍｍ２、少なくとも１．５ｍｍ２、少なくとも２．０ｍｍ２、少なくとも３．０ｍｍ２、少なくとも４．０ｍｍ２、少なくとも５．０ｍｍ２、少なくとも６．０ｍｍ２、少なくとも７．０ｍｍ２、少なくとも８．０ｍｍ２、少なくとも９．０ｍｍ２、少なくとも１０ｍｍ２、少なくとも１５ｍｍ２、少なくとも２０ｍｍ２、少なくとも２５ｍｍ２、少なくとも３０ｍｍ２、少なくとも３５ｍｍ２、少なくとも４０ｍｍ２、少なくとも４５ｍｍ２、少なくとも５０ｍｍ２、少なくとも７５ｍｍ２、少なくとも１００ｍｍ２、少なくとも１５０ｍｍ２、少なくとも２００ｍｍ２、少なくとも２５０ｍｍ２、少なくとも３００ｍｍ２、少なくとも４００ｍｍ２、少なくとも５００ｍｍ２、少なくとも６００ｍｍ２、少なくとも７００ｍｍ２、少なくとも８００ｍｍ２、少なくとも９００ｍｍ２、少なくとも１，０００ｍｍ２、少なくとも２，０００ｍｍ２、少なくとも３，０００ｍｍ２、少なくとも４，０００ｍｍ２、少なくとも５，０００ｍｍ２、少なくとも６，０００ｍｍ２、少なくとも７，０００ｍｍ２、少なくとも８，０００ｍｍ２、少なくとも９，０００ｍｍ２、少なくとも１０，０００ｍｍ２、少なくとも２０，０００ｍｍ２、少なくとも３０，０００ｍｍ２、少なくとも４０，０００ｍｍ２、少なくとも５０，０００ｍｍ２、少なくとも６０，０００ｍｍ２、少なくとも７０，０００ｍｍ２、少なくとも８０，０００ｍｍ２、少なくとも９０，０００ｍｍ２、少なくとも１００，０００ｍｍ２又はそれを超える（例えば、ウェルプレートの１つのウェル又は２つ以上のウェルの各々の内部表面のほぼ全部））面積を有し得る。加えて、アジド提示共有結合官能基化領域は、少なくとも５０／ｕｍ２、例えば約５０アジド基／ｕｍ２から約２×１０７／ｕｍ２、約１×１０２／ｕｍ２から約１×１０７／ｕｍ２；約５０／ｕｍ２から約５×１０６／ｕｍ２；約１×１０２／ｕｍ２から約１×１０６／ｕｍ２；約１×１０２／ｕｍ２から約５×１０５／ｕｍ２；約１×１０２／ｕｍ２から約１×１０５／ｕｍ２；約１×１０２／ｕｍ２から約５×１０４／ｕｍ２；約５０／ｕｍ２から約５×１０４／ｕｍ２；約１×１０２／ｕｍ２から約５×１０３／ｕｍ２；約５０／ｕｍ２から約５×１０２／ｕｍ２；又はアジド基／ｕｍ２の数についてこれらの間の任意の数値のアジド基の密度を有する。
[00131] 同様に、ウェルプレートの表面のビオチン提示共有結合官能基化領域は、ウェルプレートの全表面にわたって又はウェルプレートの表面の選択及び／又は限定領域に導入することができる。一部の実施形態では、ウェルプレートの１つ又は複数のウェルの少なくとも表面にアジド提示共有結合官能基化領域を有するウェルプレートは、１つ又は複数のウェルの少なくとも１つの表面内にビオチン提示共有結合官能基化領域を有する。特に、領域１２０に類似するビオチン提示共有結合官能基化領域は、ウェルの底部の所望の部分内の領域のみにビオチン結合クリック試薬１０７を添加することにより、ウェルプレートの１つ又は複数のウェルの底部の一部に形成し得、この場合、底部表面は、ウェルプレートのウェル上部の開口部とは反対側に配置される。一部の実施形態では、ビオチン提示共有結合官能基化領域は、ウェルを形成する容器の側壁上に位置せず、側壁は、ウェルプレートのウェルの開口部と隣接する。一部の実施形態では、これは、ＤＢＣＯクリック試薬ではなく、アルキンクリック試薬であり得、銅触媒クリック反応が実施されて、領域の選択した境界が得られる。
[00132] ウェルプレートの表面のビオチン提示共有結合官能基化領域は、少なくとも０．５ｍｍ２、例えば少なくとも０．６ｍｍ２、少なくとも０．７ｍｍ２、少なくとも０．８ｍｍ２、少なくとも０．９ｍｍ２、少なくとも１．０ｍｍ２、少なくとも１．１ｍｍ２、少なくとも１．２ｍｍ２、少なくとも１．３ｍｍ２、少なくとも１．４ｍｍ２、少なくとも１．５ｍｍ２、少なくとも１．６ｍｍ２、少なくとも１．７ｍｍ２、少なくとも１．８ｍｍ２、少なくとも１．９ｍｍ２、少なくとも２．０ｍｍ２、少なくとも３．０ｍｍ２、少なくとも４．０ｍｍ２、少なくとも５．０ｍｍ２、少なくとも６．０ｍｍ２、少なくとも７．０ｍｍ２、少なくとも８．０ｍｍ２、少なくとも９．０ｍｍ２、少なくとも１０ｍｍ２、少なくとも１５ｍｍ２、少なくとも２０ｍｍ２、少なくとも２５ｍｍ２、少なくとも３０ｍｍ２、少なくとも３５ｍｍ２、少なくとも４０ｍｍ２、少なくとも４５ｍｍ２、少なくとも５０ｍｍ２又はそれを超える面積を有し得る。従って、ビオチン提示共有結合官能基化領域の面積は、約０．５ｍｍ２から約５０ｍｍ２、約１ｍｍ２から約４０ｍｍ２、２ｍｍ２から約３５ｍｍ２、約３ｍｍ２から約３０ｍｍ２又は約４ｍｍ２から約２５ｍｍ２の範囲であり得る。典型的に、ビオチン提示共有結合官能基化領域は、１００ｍｍ２以下（例えば、７５ｍｍ２以下又は５０ｍｍ２以下）の面積を有し得る。ビオチン提示共有結合官能基化領域の面積は、ウェルプレートの１つ又は複数のウェルの各々の底部の面積の約５０％未満、約２５％未満、約１５％未満、約１０％未満、約５％未満又は約２％未満であり得る。代わりに、この関係は、ビオチン提示共有結合官能基化領域の面積が約３５ｍｍ２未満、約２０ｍｍ２未満、約１２ｍｍ２未満、約５ｍｍ２未満、約２ｍｍ２未満、約１ｍｍ２未満又は約０．５ｍｍ２未満の面積を有する場合に述べることができる。ビオチン提示共有結合官能基化領域は、約０．５ｍｍから約４．０ｍｍ（例えば、約１．０ｍｍから約３．５ｍｍ又は約１．５ｍｍから約３．０ｍｍ）の寸法を有し得る。ビオチン提示共有結合官能基化領域は、任意の所望の形状：円形、楕円形、不規則、長方形、正方形又は多角形であり得る。一部の実施形態では、ビオチン提示共有結合官能基化領域は、実質的に円形であり得、且つ約０．５ｍｍから約４．０ｍｍ（例えば、約１．０ｍｍから約３．５ｍｍ又は約１．５ｍｍから約３．０ｍｍ）の直径を有する。
[00133] 加えて、ウェルプレートの表面は、複数のビオチン提示共有結合官能基化領域を含み得る。さらに、ビオチン含有試薬をウェルプレートの１つ又は複数のウェルの表面の反応性部分にカップリングさせ得、この場合、複数のビオチン提示共有結合官能基化領域がウェルプレートのウェルの底部にクラスター形成し得る。複数のビオチン提示共有結合官能基化領域の各々の面積は、１つ又は複数のウェルの底部の面積の約５％未満であり得る。複数のビオチン提示共有結合官能基化領域の総面積は、少なくとも１つのウェルの底部の面積の約５０％又は約２５％未満であり得る。
[00134] ビオチン提示共有結合官能基化領域は、少なくとも５０／ｕｍ２（例えば、約５０ビオチン基／ｕｍ２から約５×１０６／ｕｍ２、約１×１０２／ｕｍ２から約１×１０６／ｕｍ２；約１×１０２／ｕｍ２から約５×１０５／ｕｍ２；約１×１０２／ｕｍ２から約１×１０５／ｕｍ２；約１×１０２／ｕｍ２から約５×１０４／ｕｍ２；約１×１０２／ｕｍ２から約１×１０４／ｕｍ２；約１×１０２／ｕｍ２から約５×１０３／ｕｍ２；約１×１０２／ｕｍ２から約１×１０３／ｕｍ２；約５０／ｕｍ２から約５×１０２／ｕｍ２；約５０／ｕｍ２から約１×１０２／ｕｍ２；又はビオチン基／ｕｍ２の数についてこれらの間の任意の数値）のビオチン官能基の密度を有し得る。
[00135] ウェルプレートの表面のストレプトアビジン提示共有結合官能基化領域は、図１Ｃの領域１５５に示すように、クリック若しくは銅媒介クリック反応を介してアジド部分に直接結合するか、又は図１Ａ及び１Ｂの領域１２５、１４０、１５０について示すようにビオチン提示共有結合官能基化領域のビオチン部分との結合を介して結合されるかにかかわらず、選択した領域に同様に形成され得る。いずれの場合にも、ストレプトアビジン提示共有結合官能基化領域は、ウェルプレートの１つ又は複数のウェル内に表面上に形成し得る。さらに、ストレプトアビジン提示共有結合官能基化領域は、ウェルの底部の所望の部分のみの表面に形成され得、底部表面は、ウェルプレート内のウェル上部の開口部とは反対側に配置される。一部の実施形態では、ストレプトアビジン提示共有結合官能基化領域は、ウェルを形成する容器の側壁上に位置せず、側壁は、ウェルプレート内のウェルの開口部と隣接する。
[00136] ストレプトアビジン提示共有結合官能基化領域は、少なくとも０．５ｍｍ２、例えば少なくとも０．６ｍｍ２、少なくとも０．７ｍｍ２、少なくとも０．８ｍｍ２、少なくとも０．９ｍｍ２、少なくとも１．０ｍｍ２、少なくとも１．１ｍｍ２、少なくとも１．２ｍｍ２、少なくとも１．３ｍｍ２、少なくとも１．４ｍｍ２、少なくとも１．５ｍｍ２、少なくとも１．６ｍｍ２、少なくとも１．７ｍｍ２、少なくとも１．８ｍｍ２、少なくとも１．９ｍｍ２、少なくとも２．０ｍｍ２、少なくとも３．０ｍｍ２、少なくとも４．０ｍｍ２、少なくとも５．０ｍｍ２、少なくとも６．０ｍｍ２、少なくとも７．０ｍｍ２、少なくとも８．０ｍｍ２、少なくとも９．０ｍｍ２、少なくとも１０ｍｍ２、少なくとも１５ｍｍ２、少なくとも２０ｍｍ２、少なくとも２５ｍｍ２、少なくとも３０ｍｍ２、少なくとも３５ｍｍ２、少なくとも４０ｍｍ２、少なくとも４５ｍｍ２、少なくとも５０ｍｍ２又はそれを超える面積を有し得る。従って、ストレプトアビジン提示共有結合官能基化領域の面積は、約０．５ｍｍ２から約５０ｍｍ２、約１ｍｍ２から約４０ｍｍ２、２ｍｍ２から約３５ｍｍ２、約３ｍｍ２から約３０ｍｍ２又は約４ｍｍ２から約２５ｍｍ２の面積を有し得る。典型的に、ストレプトアビジン提示共有結合官能基化領域は、１００ｍｍ２以下（例えば、７５ｍｍ２以下又は５０ｍｍ２以下）の面積を有する。ストレプトアビジン提示共有結合官能基化領域は、少なくとも５０／ｕｍ２）。約５０ストレプトアビジン基／ｕｍ２から約８×１０５／ｕｍ２、約１×１０２／ｕｍ２から約８×１０５／ｕｍ２；約５０／ｕｍ２から約５×１０５／ｕｍ２；約１×１０２／ｕｍ２から約１×１０５／ｕｍ２；約５０／ｕｍ２から約５×１０４／ｕｍ２；約１×１０２／ｕｍ２から約１×１０４／ｕｍ２；約１×１０２／ｕｍ２から約５×１０３／ｕｍ２；約１×１０２／ｕｍ２から約１×１０３／ｕｍ２；約５０／ｕｍ２から約５×１０２／ｕｍ２；約５０／ｕｍ２から約１×１０２／ｕｍ２；又はストレプトアビジン基／ｕｍ２の数についてこれらの間の任意の数値）のストレプトアビジン官能基の密度を有し得る。
[00137] ストレプトアビジン提示共有結合官能基化領域は、１つ又は複数のウェルの各々の底部表面の面積の約５０％未満の面積を有し得る。ストレプトアビジン提示共有結合官能基化領域の面積は、１つ又は複数のウェルの各々の底部表面の面積の約２５％未満、約１５％未満、約１０％未満、約５％未満又は約２％未満であり得る。代わりに、この関係は、ストレプトアビジン提示共有結合官能基化領域の面積が約３５ｍｍ２未満、約２０ｍｍ２未満、約１２ｍｍ２未満、約５ｍｍ２未満、約２ｍｍ２未満又は約１ｍｍ２未満の面積を有し得る場合に述べることができる。一部の実施形態では、ストレプトアビジン提示共有結合官能基化領域は、約０．５ｍｍから約４．０ｍｍ（例えば、約１．０ｍｍから約３．５ｍｍ又は約１．５ｍｍから約３．０ｍｍ）の寸法を有し得る。
[00138] ストレプトアビジン提示共有結合官能基化領域は、任意の所望の形状：円形、楕円形、不規則、長方形、正方形又は多角形であり得る。一部の実施形態では、ストレプトアビジン提示共有結合官能基化領域は、実質的に円形であり得、且つ約０．５ｍｍから約４．０ｍｍ（例えば、約１．０ｍｍから約３．５ｍｍ又は約１．５ｍｍから約３．０ｍｍ）の直径を有し得る。一部の実施形態では、ストレプトアビジン提示共有結合官能基化領域は、実質的に円形であり得、且つ約０．５ｍｍから約４．０ｍｍ（例えば、約１．０ｍｍから約３．５ｍｍ又は約１．５ｍｍから約３．０ｍｍ）の直径を有し得る。
[00139] 加えて、ウェルプレートの表面は、複数のストレプトアビジン提示共有結合官能基化領域を含み得る。さらに、ストレプトアビジン含有試薬をウェルプレートの１つ又は複数のウェルの表面の反応性部分にカップリングさせ得るか、又はストレプトアビジンを表面のビオチン提示共有結合官能基化領域のビオチン部分に結合させ得、複数のストレプトアビジン提示共有結合官能基化領域がウェルプレートのウェルの底部にクラスター形成され得る。複数のストレプトアビジン提示共有結合官能基化領域の各々の面積は、１つ又は複数のウェルの底部の面積の約５％未満であり得る。複数のストレプトアビジン提示共有結合官能基化領域の総面積は、少なくとも１つのウェルの底部の面積の約５０％又は約２５％未満であり得る。
[00140] 表面遮断修飾表面。一部の実施形態では、ウェルプレートの表面又は１つ若しくは複数のウェルの各々の表面は、表面遮断リガンドを含む別の（例えば、第２）共有結合修飾領域をさらに含む。図１Ｄに示すように、表面１６０は、ストレプトアビジンリガンド１１３と共にストレプトアビジン提示共有結合官能基化領域１６５を有し、これは、領域１２５と同様に、ビオチニルリガンド１０９’による初期官能基化を介して、これに続いてストレプトアビジンがビオチン部分に結合する。ストレプトアビジン提示共有結合官能基化領域１６５を取り囲む第２領域１６７は、反応性部分（この場合、アジド提示リガンド１０５のアジド部分）を表面遮断ＤＢＣＯ試薬１２１と反応させることにより、表面遮断リガンドでさらに修飾され得る。表面遮断リガンドは、本明細書に記載される通り、任意の表面遮断部分（例えば、親水性若しくは負荷電部分及び／又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分を含む）を有し得る。得られた表面１７０は、表面遮断リガンド１２３を含む修飾表面１７７を有する第２領域１７７に取り囲まれたストレプトアビジン提示共有結合官能基化領域１６５を有する。表面遮断リガンドは、単一タイプの表面遮断リガンドであり得るか、又は表面遮断リガンドの混合物であり得る。表面遮断リガンド１２３のタイプ／混合物の選択は、リンパ球細胞培養のための最適化支持体を提供し得る。ストレプトアビジン提示共有結合官能基化領域１６５を有する表面１６０について図１Ｄに例示したが、共有結合官能基化領域１２０、１２５、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５を有する同様の表面は、反応性部分提示リガンド、例えばアジド提示リガンド１０５を含む類似の周囲第２領域を有し得、また同様に修飾して、それぞれの周囲第２領域に表面遮断リガンド１２３を導入し得る。一部の実施形態では、領域１７７などの表面修飾領域は、ビオチン提示共有結合官能基化領域１２０、１３５、１４５又はストレプトアビジン提示共有結合官能基化領域１２５、１３５、１４５、１５５と重ならない。
[00141] 一部の変形形態では、第２共有結合修飾領域は、接着刺激部分を提供する少なくとも１つのリガンドをさらに含み得る。例えば、ＤＢＣＯクリックカップリング試薬に結合したペプチド配列を領域１７７に導入し得る。ペプチド配列は、ＲＧＤ（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ）モチーフを含み得、これは、機械的接着を付与することにより、培養中のリンパ球を刺激し得る。いずれか他の接着刺激部分を改変して同様に導入し得る。接着刺激部分は、ストレプトアビジン提示領域１６５の導入後且つ表面遮断領域１７７を形成する表面遮断リガンド１２３の導入前、それと同時又はその後に導入され得る。
[00142] リンパ球活性化共有結合官能基化領域を含む表面を有するウェルプレート。前述したように、本出願人らは、活性化が表面の領域に限定されるウェルプレートの活性化表面を使用すれば、より制御可能且つ効率的なリンパ球の活性化が達成されることを見出した。リンパ球は、任意の好適なリンパ球であり得、限定されないが、Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞又はＢ細胞が挙げられる。図１Ｄに示すように、活性化部分を表面のストレプトアビジン提示共有結合官能基化領域に導入して結合し得る。活性化部分の導入を表面１７０について示すが、本発明は、そのように限定されない。領域１２５、１４０、１５０、１５５のような共有結合官能基化領域を組み込む任意の表面は、表面１８０の領域１８５のようなリンパ球活性化共有結合官能基化領域を形成するために、導入された活性化部分を有し得る。一部の変形形態では、遮断リガンド−修飾領域１７７とリンパ球活性化共有結合官能基化領域１８５とは、ウェルプレートの表面全体を覆う。一部の実施形態では、遮断リガンド−修飾領域１７７とリンパ球活性化共有結合官能基化領域１８５とは、表面の非重複領域である。リンパ球活性化共有結合官能基化領域１８５は、ウェルプレートの１つ又は複数のウェルの各々における表面に導入され得る。一部の変形形態では、リンパ球活性化共有結合官能基化領域１８５は、１つ又は複数のウェルの各々の底部表面上に導入され得る。一部の実施形態では、リンパ球活性化共有結合官能基化領域は、対応するウェルの底部表面上のみに配置される。リンパ球活性化共有結合官能基化領域は、１つ又は複数のウェルの底部の面積の約５０％未満の面積を有し得る。リンパ球活性化共有結合官能基化領域の面積は、１つ又は複数のウェルの底部の面積の約５０％未満、約２５％未満、約１５％未満、約１０％未満、約５％未満、約２％未満又は約１％未満である。リンパ球活性化共有結合官能基化領域の面積は、約３５ｍｍ２、約２０ｍｍ２、約１２ｍｍ２、約５ｍｍ２、約２ｍｍ２未満又は約１ｍｍ２未満の面積を有する。一部の実施形態では、リンパ球提示共有結合官能基化領域は、約０．５ｍｍから約４．０ｍｍ（例えば、約１．０ｍｍから約３．５ｍｍ又は約１．５ｍｍから約３．０ｍｍ）の寸法を有する。リンパ球提示共有結合官能基化領域は、任意の所望の形状：円形、楕円形、不規則、長方形、正方形又は多角形であり得る。一部の実施形態では、リンパ球提示共有結合官能基化領域は、実質的に円形であり得、且つ約０．５ｍｍから約４．０ｍｍ（例えば、約１．０ｍｍから約３．５ｍｍ又は約１．５ｍｍから約３．０ｍｍ）の直径を有する。一部の実施形態では、リンパ球提示共有結合官能基化領域は、実質的に円形であり得、且つ約０．５ｍｍから約４．０ｍｍ（例えば、約１．０ｍｍから約３．５ｍｍ又は約１．５ｍｍから約３．０ｍｍ）の直径を有し得る。
[00143] 一部の変形形態では、活性化分子１３１は、それぞれ活性化部分、例えば分子１３１の「Ｐ」と、ストレプトアビジンの結合部位に結合することができる結合部分、例えばビオチンとを含み、リンパ球活性化共有結合官能基化領域１８５を形成する。結合した第１活性化分子複合体１３７は、特異的に結合した活性化分子リガンドと呼ばれる場合もある。一部の変形形態では、１種のみの活性化分子が存在し得る。他の変形形態では、一次活性化分子であり得る第１活性化分子１３１及び他のタイプの活性化分子１３３が存在し得る。活性化分子１３３は、追加の活性化分子、共活性化分子、補助活性化分子又は二次活性化分子であり得る。第１活性化分子と第２活性化分子との比は、リンパ球を活性化するためのいずれか好適な比、例えば１０：１；８：１；６：１；５：１；３：１；２：１；１：１；１：２；１：３；１：５；１：６；１：８；１：１０又はそれを超え得る。
[00144] 一部の変形形態では、第１活性化分子１３１は、限定されないが、分化結合分子、免疫グロブリン結合分子、Ｔ細胞受容体活性化分子、ＴＮＦ受容体スーパーファミリー結合分子、ケモカイン受容体結合分子、成長因子分子又は接着促進分子の細胞表面クラスターであり得る。一部の変形形態では、第１活性化分子は、ＭＨＣ分子（例えば、クラスＩ若しくはクラスＩＩ）、分化結合活性の細胞表面クラスターを保持するタンパク質若しくはその断片、Ｔ細胞受容体結合活性を保持するタンパク質若しくはその断片、ＴＮＦ受容体スーパーファミリー結合活性を保持するタンパク質若しくはその断片、ケモカイン受容体結合活性を保持するタンパク質若しくはその断片、成長刺激活性を保持するタンパク質若しくはその断片又は接着促進活性を保持するタンパク質若しくはその断片を含み得る。タンパク質は、抗体又は特定の標的に対する結合活性を保持することができるその断片であり得る。
[00145] 特異的に結合した第１活性化分子リガンドは、リンパ球活性化共有結合官能基化領域において、１平方ミクロン当たり少なくとも約１×１０２分子、１平方ミクロン当たり少なくとも約５×１０２分子、１平方ミクロン当たり少なくとも約１×１０３分子、１平方ミクロン当たり少なくとも約５×１０３分子、１平方ミクロン当たり少なくとも約１×１０４分子、１平方ミクロン当たり少なくとも約５×１０４分子、１平方ミクロン当たり少なくとも約１×１０５分子又は１平方ミクロン当たり約１×１０２から約１×１０５分子の密度を有し得る。
[00146] 一部の変形形態では、それぞれ活性化部分、例えば「Ｓ」及び結合部分であって、ストレプトアビジンの結合部位と結合する結合部分を含む第２活性化分子１３３をリンパ球活性化領域１８５に導入して、リンパ球活性化共有結合官能基化領域１８５内に特異的に結合した第２活性化分子リガンド１３９を提供することができる。複数の第２活性化分子として、限定されないが、中でも、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）共活性化分子、細胞表面免疫グロブリン結合分子、成長因子分子、接着促進分子が挙げられる。第２活性化分子１３３は、１種の第２活性化分子であり得るか、又は第２活性化分子１３３は、２つ以上の異なる分子の混合物であり得、これらは、リンパ球の活性化に好適とみなされる任意の比で使用され得る。
[00147] 一部の変形形態では、特異的に結合した第２活性化分子リガンド１３７は、リンパ球活性化共有結合官能基化領域において、１平方ミクロン当たり約１×１０２分子、１平方ミクロン当たり約５×１０２分子、１平方ミクロン当たり約１×１０３分子、１平方ミクロン当たり約５×１０３分子、１平方ミクロン当たり約１×１０４分子、１平方ミクロン当たり約５×１０４分子、１平方ミクロン当たり約１×１０５分子、１平方ミクロン当たり約１×１０２から約１×１０５分子又は１平方ミクロン当たり約１×１０３から約１×１０５分子の密度を有し得る。
[00148] 一部の変形形態では、リンパ球活性化領域を含む表面を有するウェルプレートは、１つ又は複数のウェルの各々に複数のリンパ球活性化共有結合官能基化領域を有し得る。複数のリンパ球活性化共有結合官能基化領域の各々の面積は、１つ又は複数のウェルの底部の面積の約５％未満であり得る。一部の実施形態では、複数のリンパ球活性化共有結合官能基化領域の総面積は、１つ又は複数のウェルの底部の面積の約５０％、約２５％又は１０％未満であり得る。
[00149] 分子リガンド。任意の好適なリンパ球活性化リガンドを、本明細書に記載されるウェルプレートの表面のリンパ球活性化領域に組み込むことができる。活性化リガンドは、分化結合分子、Ｔ細胞受容体分子活性化分子、ＴＮＦ受容体スーパーファミリー分子、ケモカイン受容体結合分子、成長因子分子又は接着促進分子の細胞表面クラスターであり得る。これらの分子の一部の非限定的な例として、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ４８、ＣＤ５８、ＣＤ７０、ＣＤ８３、ＣＤ１３７、ＣＤ１２２、ＣＤ１５５、ＣＤ２２６結合分子などが挙げられる。これらの結合分子は、それらの組換えリガンドを含み得る。特に、ＣＤ２、ＣＤ２８結合分子は、抗原特異的Ｔ細胞を活性化するのに有用となり得る。ＣＤ３、ＣＤ１３７又はＣＤ４０リガンドは、Ｔ細胞の拡大を活性化する上で有用となり得る。ＣＤ１９及びＣＤ２０結合分子は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞を活性化する上で有用となり得る。活性化分子は、これら分子のアゴニスト抗体、例えば抗ＣＤ２、抗ＣＤ３、抗ＣＤ２７、抗ＣＤ２８、抗ＣＤ３０、抗ＣＤ４０、抗ＣＤ５８、抗ＣＤ４８、抗ＣＤ１２２、抗ＣＤ１３７などであり得る。
[00150] ケモカイン受容体リガンドは、ＣＣＬ２１又はＣＣＬ１９などのＣＣＬファミリーに属するものなど、リンパ球を活性化するために使用され得る。誘導性Ｔ細胞共刺激分子は、免疫チェックポイントタンパク質及びＣＤ２７８若しくはＩＣＯＳ（誘導性Ｔ細胞共刺激分子）結合分子であるか、又はアゴニスト抗体を本明細書に記載の活性化提示領域に使用することができる。Ｔ細胞免疫グロブリン及びムチンドメイン（ＴＩＭ−１）としても知られるＡ型肝炎ウイルス細胞受容体１（ＨＡＶｃｒ−１）は、ヒトにおいてＨＡＶＣＲ１遺伝子によりコードされるタンパク質である。抗ＴＩＭ１又はＴＩＭ４リガンドを使用して、Ｔ細胞を活性化することができる。
[00151] ＴＮＦＲＳＦ２５としても知られるＤＲ３、即ちリンパ球関連デスレセプター（ＬＡＲＤ）は、ＴＮＦ受容体スーパーファミリー（ＴＮＦＲＳＦ）に属する。その結合分子又はそのアゴニスト抗体を用いて、Ｔ細胞及びＮＫＴ細胞を活性化することができる。
[00152] シグナル伝達リンパ球活性化分子（ＳＬＡＭ）ファミリーメンバー１（ＣＤ１５０としても知られる）は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ及び樹状細胞に発現される自己リガンド細胞表面糖タンパク質である。ＣＤ１５０は、Ｔ細胞と抗原提示細胞（ＡＰＣ）との間の接着及びシグナル伝達に重要な役割を果たす。ＣＤ１５０は、ＳＬＡＭファミリーとして知られる造血幹細胞上の糖タンパク質受容体の成長するファミリーの原型的メンバーであり、そうしたものとして、ＣＤ２２９、ＣＤ８４、ＣＤ２４４、ＳＦ２０００／Ｌｙ１０８、ＳＦ２００１及び１９Ａ（ＣＲＡＣＣ）が挙げられる。アゴニスト抗体を用いて、リンパ球、特にＴ細胞及びＢ細胞を活性化することができる。
[00153] ＧＩＴＲ（グルココルチコイド誘導ＴＮＦＲファミリー関連遺伝子）は、ＴＮＦＲスーパーファミリー（ＴＮＦＲＳＦ）のメンバーである。抗ＧＩＴＲ又はＧＩＴＲリガンドを用いて、Ｔ細胞を活性化することができる。ＯＸ４０（ＣＤ１３４）及びその結合パートナー、ＯＸ４０Ｌ（ＣＤ２５２）は、ＴＮＦＲ／ＴＮＦスーパーファミリーのメンバーであり、活性化ＣＤ４及びＣＤ８Ｔ細胞並びにいくつかの他のリンパ系及び非リンパ系細胞に発現される。ＯＸ４０及びＯＸ４０Ｌは、Ｔ細胞、抗原提示細胞、ＮＫ細胞及びＮＫＴ細胞からのサイトカイン産生を調節すると共に、サイトカイン受容体シグナル伝達をモジュレートすることから、それらの抗体又はリガンドを用いてＴ細胞又はＮＫ細胞を活性化することもできる。
[00154] ＣＤ１３７は、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体ファミリーのメンバーである。その別名は、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー９（ＴＮＦＲＳＦ９）、４−１ＢＢであり、リンパ球活性化により誘導される（ＩＬＡ）。抗４１ＢＢ又は４１ＢＢ−Ｌを活性化領域に用いて、リンパ球を活性化することができる。腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー１４（ＴＮＦＲＳＦ１４）としても知られるヘルペスウイルス侵入メディエーター（ＨＶＥＭ）は、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーのヒト細胞表面受容体である。
[00155] ＩＬ７及び／又はＩＬ１５などのサイトカインは、リンパ球活性化領域内に誘導され得るか、又はリンパ球活性化領域を取り囲む修飾表面内に導入され得る。
[00156] ＮＫ細胞又はＮＫ ＣＡＲ細胞を拡大するために、ＮＫＧ２Ｄリガンドなどの天然キラー受容体結合分子をリンパ球活性化領域内に導入し得る。
[00157] 前述したように、ＭＨＣ分子などの免疫グロブリン結合分子を用い得る。ＭＨＣは、クラスＩ ＭＨＣであり得る。一部の他の実施形態では、ＭＨＣは、様々なサブタイプのＴ細胞を活性化するためにクラスＩＩ ＭＨＣであり得る。
[00158] やはり前述したように、成長因子リガンド又は接着促進リガンドを用い得る。
[00159] 抗原提示共有結合官能基化領域を有するウェルプレート。一部の変形形態では、リンパ球活性化共有結合官能基化領域を有するウェルプレートは、Ｔ細胞（Ｔ細胞）を活性化するためのウェルプレートの抗原提示共有結合官能基化領域であり得、前述したように、１つ又は複数のリンパ球活性化共有結合官能基化領域を有するウェルの特徴のいずれかを有し得る。即ち、ウェルプレートの１つ又は複数のウェルの各々は、抗原提示共有結合官能基化領域を有する表面を有し得る。１つ又は複数のウェルの各々の抗原提示共有結合官能基化領域は、対応するウェルの底部表面上に位置し得る。さらに、１つ又は複数のウェルの各々の抗原提示共有結合官能基化領域は、１つ又は複数のウェルの底部表面上のみに配置され得る。一部の実施形態では、抗原提示共有結合官能基化領域は、１つ又は複数のウェルの側壁上に配置されなくてもよい。一部の実施形態では、ウェルプレートの１つ又は複数のウェルの各々は、１つ又は複数のウェルの底部表面上のみに配置された複数の抗原提示共有結合官能基化領域を有し得る。
[00160] 抗原提示共有結合官能基化領域は、特異的に結合した一次活性化分子リガンド１３７（「第１活性化分子リガンド）及び特異的に結合した共活性化分子リガンド１３９（「第２活性化分子リガンド）を含み得、一次活性化分子１３１の各々は、一次活性化分子（「Ｐ）と、ストレプトアビジン提示共有結合官能基化領域１２５、１４０、１５０、１５５、１７０などのストレプトアビジンの結合部位に結合することができる結合部分（例えば、ビオチン）とを有する。一次活性化分子リガンド１３７及び共活性化分子リガンド１３９は、本明細書に記載する比のいずれか、例えば約１：１から約２：１；約１：１；又は３：１から約１：３で抗原提示共有結合官能基化領域内に配置され得る。
[00161] いくつかの変形形態では、特異的に結合した一次活性化分子リガンド１３７は、Ｔ細胞のＴ細胞受容体に結合するように構成された主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子（例えば、クラスＩ又はクラスＩＩ）をそれぞれ含む。ＭＨＣ分子は、ＭＨＣクラスＩタンパク質配列、βミクログロブリンタンパク質配列及び抗原ペプチドを含み得る。一部の変形形態では、ＭＨＣ分子のタンパク質配列は、タンパク質配列のＣ末端連結を介して例えば部位特異的ビオチン化のためのＣ末端ＢｉｒＡタグにより抗原提示合成表面に連結され得る。
[00162] 特異的に結合した一次活性化分子リガンド１３７は、１８５のような抗原提示共有結合官能基化領域において、１平方ミクロン当たり少なくとも約１×１０２分子、１平方ミクロン当たり少なくとも約５×１０２分子、１平方ミクロン当たり少なくとも約１×１０３分子、１平方ミクロン当たり少なくとも約５×１０３分子、１平方ミクロン当たり少なくとも約１×１０４分子、１平方ミクロン当たり少なくとも約５×１０４分子、１平方ミクロン当たり少なくとも約１×１０５分子又は１平方ミクロン当たり約１×１０２から約１×１０５分子の密度を有し得る。
[00163] ＭＨＣ分子を含む一次活性化分子リガンドは、腫瘍関連抗原ペプチドもさらに含み得、これは、当業者により決定され得るように任意の好適な腫瘍関連抗原ペプチドであり得る。腫瘍関連抗原ペプチドは、一次活性化分子リガンド（例えば、ＭＨＣ分子）と非共有結合され得る。腫瘍関連抗原ペプチドは、Ｔリンパ球の活性化を開始することができる配向の一次活性化分子リガンド（例えば、ＭＨＣ分子）によって提示され得る。腫瘍関連抗原は、ペプチドであり得る。
[00164] 腫瘍関連抗原ペプチドの一部の非限定的な例として、黒色腫の場合、ＭＡＲＴ１（ペプチド配列ＥＬＡＧＩＧＩＬＴＶ）、黒色腫及びいくつかの癌腫に関与するＮＹＥＳ０１（ペプチド配列ＳＬＬ ＷＩＴＱＶ）、ＳＬＣ４５Ａ２、ＴＣＬ１及びＶＣＸ３Ａが挙げられるが、本開示は、これらに限定されない。腫瘍抗原の別の例として、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＬＬ−１、ＴＲＰ−２、ＬＡＧＥ−１、ＨＥＲ２、ＥｐｈＡ２、ＦＯＬＲ１、ＭＡＧＥ−Ａ１、メソテリン、ＳＯＸ２、ＰＳＭ、ＣＡ１２５、Ｔ抗原などの腫瘍細胞の表面に発現されるタンパク質からのアミノ酸配列のセグメントを含むペプチドがある。ペプチドは、腫瘍関連抗原の細胞外ドメインに由来するものであり得る。抗原は、腫瘍細胞が由来する健康な細胞型よりも高いレベルで腫瘍細胞に発現すれば、腫瘍関連とみなされる。この腫瘍関連抗原を認識するＴ細胞は、抗原特異的Ｔ細胞である。任意の腫瘍関連抗原を本明細書に記載の抗原提示表面に使用することができる。一部の実施形態では、腫瘍関連抗原は、新生抗原ペプチド、例えば腫瘍細胞中の変異型遺伝子によりコードされるものである。新生抗原ペプチドについて詳細な説明は、例えば、米国特許出願公開第２０１１／０２９３６３７号を参照されたい。一部の実施形態では、腫瘍関連抗原は、ＳＬＣ４５Ａ２、ＴＣＬ１、ＶＣＸ３Ａ、ＭＡＲＴ１又はＮＹＥＳＯ１であり得る。
[00165] 他の変形形態では、抗原ペプチドは、ウイルス抗原、細菌抗原、真菌抗原又は原生動物抗原であり得る。
[00166] 特異的に結合した共活性化分子リガンド１３３（例えば、第２活性化分子リガンド）は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）共活性化分子（「Ｓ」）；又は補助ＴＣＲ活性化分子（「Ｓ」）をそれぞれ含み得る。複数の共活性化分子リガンドのＴＣＲ共活性化分子と補助ＴＣＲ活性化分子との比は、約１００：１から約１：１００であり得る。一部の実施形態では、複数の共活性化分子リガンドのＴＣＲ共活性化分子と補助ＴＣＲ活性化分子との比は、１００：１から９０：１、９０：１から８０：１、８０：１から７０：１、７０：１から６０：１、６０：１から５０：１、５０：１から４０：１、４０：１から３０：１、３０：１から２０：１、２０：１から１０：１、１０：１から１：１、３：１から１：３、１：１から１：１０、１：１０から１：２０、１：２０から１：３０、１：３０から１：４０、１：４０から１：５０、１：５０から１：６０、１：６０から１：７０、１：７０から１：８０、１：８０から１：９０、１：９０から１：１００であり得、上記数値の各々は、「約」により修正される。一部の実施形態では、複数の共活性化分子リガンドのＴＣＲ共活性化分子と補助ＴＣＲ活性化分子との比は、約２０：１から約１：２０又は約３：１から約１：３であり得る。
[00167] 一部の実施形態では、ＴＣＲ共活性化分子は、ＣＤ２８結合タンパク質又はＣＤ２８に対する結合能力を保持するその断片を含み得る。一部の実施形態では、ＣＤ２８結合タンパク質又はその断片は、部位特異的Ｃ末端ビオチン部分をさらに含み得る。一部の実施形態では、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）共活性化分子は、ＣＤ８０分子又はＣＤ２８に対する結合活性を保持するその断片を含み得る。一部の他の実施形態では、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）補助活性化分子は、抗ＣＤ２８抗体又はその断片であり得る。
[00168] 一部の変形形態では、補助ＴＣＲ活性化分子は、ＣＤ２結合タンパク質又はＣＤ２に対する結合活性を保持するその断片を含み得る。ＣＤ２結合タンパク質又はその断片は、部位特異的Ｃ末端ビオチン部分をさらに含み得る。他の実施形態では、補助ＴＣＲ活性化分子は、ＣＤ５８分子又はＣＤ２との結合活性を保持するその断片を含み得る。一部の実施形態では、補助ＴＣＲ活性化分子は、抗ＣＤ２抗体又はその断片を含み得る。特異的に結合した共活性化分子リガンドは、抗原提示共有結合官能基化領域における抗原提示合成表面上において、１平方ミクロン当たり少なくとも約１×１０２分子、１平方ミクロン当たり少なくとも約５×１０２分子、１平方ミクロン当たり少なくとも約１×１０３分子、１平方ミクロン当たり少なくとも約５×１０３分子、１平方ミクロン当たり少なくとも約１×１０４分子、１平方ミクロン当たり少なくとも約５×１０４分子、１平方ミクロン当たり少なくとも約１×１０５分子又は１平方ミクロン当たり約１×１０３から約１×１０５分子の密度を有し得る。
[00169] 切断可能なリンカー。一部の実施形態において、活性化分子リガンド、共有結合ストレプトアビジン、ビオチン又はアジド部分を連結するリンカーに切断可能なリンカーが含まれ得る。切断可能なリンカーは、ジスルフィド部分を含み得るか、又は置換ニトロベンジルリンカーなどの光解離性部分を含み得、これは、約３６５ｎｍのＵＶ照射で切断することができる。これらを用いて、所望の使用期間後に表面結合リガンドを除去することができるか、又はこれらを用いて、マスク／フォトマスクされていない領域でのみ所望される分子リガンドの部位選択的導入のためにマスク又はフォトマスクを必要とする方法に使用し得る。分子リガンドの部位選択的導入後、チオール（ジスルフィド）の存在下のアルカリ条件下において又は光切断によりマスキングリガンドを表面から放出し得る。
[00170] 表面遮断リガンド及びそれから形成されるリガンド。本明細書に記載の表面に使用される表面遮断試薬は、２つのタイプであり得る。第１タイプは、図１Ａの表面遮断試薬１１７などの表面遮断試薬を含み、これは、天然に存在する酸化物官能基などのクリーニング済／作製表面１１０の残りの反応性部分と反応するように構成されるか、又はクリーニング若しくは他の酸化ステップにより導入された反応性部分を有し得る。表面遮断試薬１１７は、例えば、酸化物などの表面露出部分と反応するように構成されたトリアルコキシシロキサンなどの１つの反応性官能基を含み、且つビオチン含有試薬、ストレプトアビジン又はストレプトアビジン含有試薬と反応する、例えばそれを妨害し得る他の官能基を一切含まない。
[00171] 第２クラスの表面遮断試薬は、表面遮断ＤＢＣＯ試薬１２１のようなものであり得、これは、初めに官能基化された表面１１５の、反応性官能基、例えばアジド又はアルキンなどと反応するように構成される。従って、第２クラスの表面遮断試薬は、図１Ａ及び１Ｂに示すように、リガンド１０５と反応するように構成されたアルキン（ＤＢＣＯなどの環状歪アルキンを含む）のような１つの反応性部分を有する。
[00172] 表面遮断試薬のクラスとは関係なく、表面遮断試薬の反応性部分は、連結部分を有し、これは、反応性部分に結合したアルキレンオキシド、アルキル又は置換アルケニルオキシド又はアルキル線状部分であり得る。任意選択で、連結部分は、線状構造を有する。
[00173] 表面との反応後に結合されないまま残る表面遮断試薬の末端部分は、親水性部分、両親媒性部分、双イオン性又は負荷電部分であり得る。一部の実施形態では、末端遮断基は、末端ヒドロキシル基を含む。一部の実施形態では、末端遮断基は、末端カルボキシル基を含み、一部の実施形態では、末端遮断基は、末端双イオン性基を含む。複数の表面遮断リガンドは、全て同じ末端表面遮断基を有し得るか、又は末端表面遮断基の混合物を有し得る。理論に拘束されることを望まないが、末端表面遮断基及び表面遮断リガンドの親水性リンカーは、水分子と相互作用し得る。より親水性の表面全体を形成するための修飾表面を取り囲む水性媒体におけるものである。この増強された親水性は、修飾表面と生体微小物体との間の接触をより適合性にし、且つ天然細胞内相互作用及び／又はインビボでの細胞−細胞外流体環境に類似させることができる。
[00174] 表面遮断試薬／リガンドの連結部分は、例えば、ポリマーを含み得る。ポリマーは、アルキレンエーテル部分を含むポリマーを含み得る。多様なアルキレンエーテル含有ポリマーは、本明細書に記載の表面に使用する上で好適となり得る。アルキレンエーテル含有ポリマーの１クラスは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ Ｍｗ＜１００，０００Ｄａ）であり、これは、当技術分野で生体適合性であることがわかっている。一部の実施形態では、ＰＥＧは、約８８Ｄａ、１００Ｄａ、１３２Ｄａ、１７６Ｄａ、２００Ｄａ、２２０Ｄａ、２６４Ｄａ、３０８Ｄａ、３５２０ａ、３９６Ｄａ、４４０Ｄａ、５００Ｄａ、６００Ｄａ、７００Ｄａ、８００Ｄａ、９００Ｄａ、１００００ａ、１５００Ｄａ、２０００Ｄａ、５０００Ｄａ、１０，０００Ｄａ若しくは２０，０００ＤａのＭｗを有するか、又は上記の値のいずれか２つによって画定される範囲内のＭｗを含み得る。一部の実施形態では、ＰＥＧポリマーは、約３、４、５、１０、１５、２５単位のポリエチレン部分反復を有するか、又はそれらの間の任意の値を有し得る。一部の実施形態では、ＰＥＧは、カルボキシル置換ＰＥＧ部分であり得る。一部の実施形態では、ＰＥＧは、ヒドロキシル置換ＰＥＧ部分であり、一部の実施形態では、複数の表面遮断リガンドの各々は、複数の他のリガンドの連結部分と同じ長さを有する連結部分を有し得る。他の実施形態では、複数の表面遮断リガンドの連結部分は、様々な長さを有し得る。一部の実施形態では、表面遮断基及び連結部分の長さは、複数の表面遮断リガンドの各々について同じであり得る。
[00175] 代わりに、表面遮断基及び連結部分の長さは、複数の表面遮断リガンド内で変動し得、２、３若しくは４個の異なる表面遮断基及び／又は２、３、４個以上の異なる長さを含み得、これらは、一般に任意の組合せで選択され、表面遮断リガンドは、活性化リガンドの結合及び／又は機能を立体的に妨害しないように十分に短い長さ及び／又は構造を有する。例えば、一部の実施形態では、表面遮断リガンドの長さは、表面に結合した他のリンカー（例えば、カップリング基又は活性化リガンドを連結するリンカー）の長さと同等以下である。一部の実施形態では、表面遮断リガンドの長さは、表面に結合した他のリンカー（例えば、活性化リガンド／分子を連結するリンカーの長さより約１オングストローム以上（例えば、約２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、７５、１００オングストローム又はそれを超える）短い。一部の実施形態では、表面遮断リガンドの長さは、表面に結合した他のリンカーの長さより約１から約１００オングストローム（例えば、約２から約７５、約３から約５０、約４から約４０又は約５から約３０オングストローム）短い。表面遮断リガンドが、表面に結合する他の連結部分の長さと同じ又はそれより幾分短い連結部分の長さを有する場合、得られる表面は、ウェルプレートのウェル内により生体適合性の表面を提供することができるか、又は表面と結合させる上で活性化分子に十分アクセスを提供しながら、生体微小物体との不要な結合を阻止し、それにより不要な結合若しくは生物付着を阻止することができる。
[00176] 一部の変形形態では、表面遮断試薬１１７又は１２１は、アルキレンオキシド、アルキル又は置換アルキレンオキシド又はトリアルコキシシロキサンに結合したアルキル部分を有し得る。アルキレンオキシド、アルキル又は置換アルキレンオキシド又はアルキル部分は、線状部分であり得、少なくとも４原子、少なくとも８原子、少なくとも１２原子、少なくとも１６原子、少なくとも２０原子、少なくとも５０原子若しくは少なくとも１００原子又はそれを超える線状骨格長を有し得、これらは、炭素、酸素、窒素若しくは硫黄であり得る。
作製方法
[00177] ウェルプレートの表面の反応性部分提示領域。反応性部分（例えば、アジド提示又はアルキニル提示）共有結合官能基化領域を有する表面を含むウェルプレートの作製は、ウェルプレートの表面の一部の表面露出部分（例えば、酸化物部分）をアジド含有カップリング試薬と接触させることと；ウェルプレートの反応性部分提示共有結合官能基化領域を形成することとを含む。ウェルプレートの表面は、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ポリエチレン、シクロオレフィンコポリマー又はメラミンを含むか、それから構成されるか又は実質的にそれから構成され得る。ウェルプレートの表面のプラズマクリーニングは、表面の部分の表面曝露部分をアジド含有カップリング試薬と接触させる前に実施され得る。反応性部分含有カップリング試薬は、カップリング反応中に気相又は液相中で表面露出部分と接触し得る。反応性部分含有カップリング試薬は、５から９炭素の炭素骨格を有するリンカーを含み得る。一部の実施形態では、リンカーは、７炭素の炭素骨格を有し得る。
[00177] ウェルプレートの表面の反応性部分提示領域。反応性部分（例えば、アジド提示又はアルキニル提示）共有結合官能基化領域を有する表面を含むウェルプレートの作製は、ウェルプレートの表面の一部の表面露出部分（例えば、酸化物部分）をアジド含有カップリング試薬と接触させることと；ウェルプレートの反応性部分提示共有結合官能基化領域を形成することとを含む。ウェルプレートの表面は、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ポリエチレン、シクロオレフィンコポリマー又はメラミンを含むか、それから構成されるか又は実質的にそれから構成され得る。ウェルプレートの表面のプラズマクリーニングは、表面の部分の表面曝露部分をアジド含有カップリング試薬と接触させる前に実施され得る。反応性部分含有カップリング試薬は、カップリング反応中に気相又は液相中で表面露出部分と接触し得る。反応性部分含有カップリング試薬は、５から９炭素の炭素骨格を有するリンカーを含み得る。一部の実施形態では、リンカーは、７炭素の炭素骨格を有し得る。
[00178] 反応性部分提示（例えば、アジド提示）共有結合官能基化領域は、少なくとも５０／ｕｍ２（例えば、約５０アジド基／ｕｍ２から約２×１０７／ｕｍ２、約１×１０２／ｕｍ２から約１×１０７／ｕｍ２；約５０／ｕｍ２から約５×１０６／ｕｍ２；約１×１０２／ｕｍ２から約１×１０６／ｕｍ２；約１×１０２／ｕｍ２から約５×１０５／ｕｍ２；約１×１０２／ｕｍ２から約１×１０５／ｕｍ２；約１×１０２／ｕｍ２から約５×１０４／ｕｍ２；約５０／ｕｍ２から約５×１０４／ｕｍ２；約１×１０２／ｕｍ２から約５×１０３／ｕｍ２；約５０／ｕｍ２から約５×１０２／ｕｍ２；又はアジド基／ｕｍ２の数についてこれらの間の任意の数値）のアジド基の密度を有し得る。
[00179] 表面を接触させることは、ウェルプレートの１つ又は複数のウェルの各々の表面を反応性部分含有（例えば、アジド提示）カップリング試薬と接触させて、１つ又は複数のウェルの各々に反応性部分提示共有結合官能基化領域を有する表面を形成することを含み得る。接触させることは、対応するウェルの底部表面を反応性部分含有カップリング試薬と接触させて、それにより１つ又は複数のウェルの各々の底部表面に反応性部分提示共有結合官能基化領域を形成することを含み得る。他の実施形態では、ウェルプレートの表面全部が接触され得るか、反応性部分提示領域がウェルプレートの表面全部に延在するようにし得る。
[00180] 一部の実施形態では、１つ又は複数のウェルの各々の底部表面を接触させることは、底部表面のみを接触させることを含み、それにより１つ又は複数のウェルの各々の底部表面のみに反応性部分（例えば、アジド）提示共有結合官能基化領域を形成することもできる。
[00181] ウェルプレートの表面のビオチン提示共有結合官能基化領域の作製。ビオチン提示共有結合官能基化領域を有する表面を含むウェルプレートの作製は、ウェルプレートの表面の一部を、反応性基に連結したビオチン基を含む試薬と接触させることを含み、反応性基は、表面の反応性（例えば、アゾ又はアルキニル）部分と反応するように構成され、それによりウェルプレートのビオチン提示官能基化領域を形成する。この方法は、ウェルプレートの表面を、反応性部分に連結した表面遮断リガンドを含む試薬と接触させることをさらに含み、反応性基は、表面の反応性（例えば、アゾ又はアルキニル）部分と反応するように構成され、それにより表面の遮断リガンド修飾領域を形成する。遮断リガンド修飾領域及びビオチン提示領域は、表面全体を覆い得る。一部の変形形態では、遮断リガンド修飾領域及びビオチン提示領域は、表面の非重複領域であり得る。
[00182] ウェルプレートの表面の一部と、反応性基に連結したビオチン基を有する試薬とを接触させることは、ウェルプレートの１つ又は複数のウェルの各々における表面を接触させることを含み得る。１つ又は複数のウェルの各々を接触させることは、対応するウェルの底部表面における１つ又は複数のウェルの各々を、反応性基に連結したビオチン部分を含む試薬と接触させ、それにより対応するウェルの底部表面にビオチン提示共有結合官能基化領域を生成することをさらに含む。一部の実施形態では、反応性基（例えば、アジド基）は、ウェルプレートの１つ又は複数のウェル内に配置され、また任意選択で１つ又は複数のウェル内のみに配置され得る。
[00183] 一部の実施形態では、ビオチン提示共有結合官能基化領域は、対応するウェルの底部表面のみに形成され得る。ビオチン提示共有結合官能基化領域は、少なくとも５０／ｕｍ２（例えば、約５０ビオチン基／ｕｍ２から約５×１０６／ｕｍ２、約１×１０２／ｕｍ２から約１×１０６／ｕｍ２；約１×１０２／ｕｍ２から約５×１０５／ｕｍ２；約１×１０２／ｕｍ２から約１×１０５／ｕｍ２；約１×１０２／ｕｍ２から約５×１０４／ｕｍ２；約１×１０２／ｕｍ２から約１×１０４／ｕｍ２；約１×１０２／ｕｍ２から約５×１０３／ｕｍ２；約１×１０２／ｕｍ２から約１×１０３／ｕｍ２；約５０／ｕｍ２から約５×１０２／ｕｍ２；約５０／ｕｍ２から約１×１０２／ｕｍ２；又はビオチン基／ｕｍ２の数についてこれらの間の任意の数値）のビオチン官能基の密度を有し得る。
[00184] ビオチン提示共有結合官能基化領域は、少なくとも１つのウェルの底部の面積の約５０％未満の面積を有し得る。一部の実施形態では、ビオチン提示共有結合官能基化領域の面積は、少なくとも１つのウェルの底部の面積の約２５％未満、約１５％未満、約１０％未満、約５％未満、約２％未満又は約１％未満であり得る。ビオチン提示共有結合官能基化領域の面積は、約３５ｍｍ２、約２０ｍｍ２、約１２ｍｍ２、約５ｍｍ２未満、約２ｍｍ２又は約１ｍｍ２未満の面積を有し得る。一部の実施形態では、ビオチン提示共有結合官能基化領域は、約０．５ｍｍから約４．０ｍｍ（例えば、約１．０ｍｍから約３．５ｍｍ又は約１．５ｍｍから約３．０ｍｍ）の寸法を有し得る。ビオチン提示共有結合官能基化領域は、実質的に円形であり得、且つ約０．５ｍｍから約４．０ｍｍ（例えば、約１．０ｍｍから約３．５ｍｍ又は約１．５ｍｍから約３．０ｍｍ）の直径を有し得る。
[00185] 本方法は、１つ又は複数のウェルの各々の底部の複数の領域をビオチン含有試薬と接触させて、１つ又は複数のウェルの各々に複数のビオチン提示領域を形成することをさらに含む。
[00186] 一部の実施形態では、反応性基に連結したビオチン部分を含む試薬は、銅依存性クリックカップリング試薬であり得る。ビオチン含有の銅依存性クリックカップリング試薬と反応性部分（例えば、アジド部分）との反応後、ウェルプレートの表面をチオール含有試薬又は銅キレート化試薬と接触させることにより、銅依存性試薬のそれ以上の反応を停止することができる。銅依存性クリックカップリング試薬を無効化した後、表面遮断リガンドを含む試薬で表面を処理することにより、図６Ａに示すように、明らかに異なる領域が形成され得るが、蛍光標識結合ペアで標識された共有結合官能基化領域１９３、共有結合官能基化領域１９５及び共有結合官能基化領域１９７は、随意の試薬位置の正確な制御を示し、これらは、約１．０ｍｍから最大約３〜４ｍｍの直径を有する（図６Ｂを参照されたい）。
[00187] 表面遮断リガンドの各々は、本明細書に記載される任意の表面遮断リガンドであり得、表面遮断リガンドの任意の好適な混合物を用い得る。一部の実施形態では、表面遮断リガンドは、親水性又は負荷電部分を含み得る。一部の変形形態では、表面遮断リガンドは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分を含み得る。
[00188] 一部の実施形態では、本方法は、１つ又は複数のウェルの各々の１つ又は複数の表面を、接着刺激をもたらすように構成されたリガンドを含む試薬と接触させることをさらに含み得る。これは、典型的に、ビオチン提示領域の導入後に実施され得る。様々な実施形態では、接着刺激をもたらすリガンドは、ビオチン提示領域以外の表面の部分に導入される。
[00189] ウェルプレートの表面のストレプトアビジン提示共有結合官能基化領域の作製。ストレプトアビジン提示共有結合官能基化領域を有する表面を含むウェルプレートの作製方法は、ウェルプレートの表面の一部を、反応性基に連結したストレプトアビジン官能基を含む試薬又は反応性部分に連結したビオチン部分を含む試薬と接触させることであって、反応性基は、表面の反応性部分（例えば、アジド又はアルキニル部分）と反応するように構成され、試薬が、反応性部分に連結したビオチン部分を含むとき、続いて表面の部分をストレプトアビジンと接触させ、それによりウェルプレートのストレプトアビジン提示官能基化領域を形成する、接触させることを含む。本方法は、ウェルプレートの表面を、表面の反応性部分（アジド又はアルキニル）と反応するように構成される反応性基に連結した表面遮断リガンドを含む試薬と接触させて、表面の遮断リガンド修飾領域を形成することをさらに含み得る。反応性基に連結したビオチン部分を含む試薬を使用する場合、ストレプトアビジンの導入は、ビオチン提示表面の導入後に行い、ストレプトアビジンは、ビオチン部分に結合する。
[00190] 一部の実施形態では、遮断リガンド修飾領域及びストレプトアビジン提示領域は、表面全体を覆い得る。様々な実施形態では、遮断リガンド修飾領域及びストレプトアビジン提示領域は、表面の非重複領域であり得る。ウェルプレートの表面の部分と試薬とを接触させることは、ウェルプレートの１つ又は複数のウェルの各々における表面を接触させることをさらに含み得る。
[00191] 一部の他の実施形態では、接触させることは、対応するウェルの底部表面における１つ又は複数のウェルの各々を、反応性基に連結したストレプトアビジン部分を含む試薬又は反応性部分に連結したビオチン部分を含む試薬と接触させることを含み得る。一部の実施形態では、ストレプトアビジン提示共有結合官能基化領域は、対応するウェルの底部表面上のみに形成され得る。
[00192] ストレプトアビジン提示共有結合官能基化領域は、少なくとも５０／ｕｍ２、例えば約５０ストレプトアビジン基／ｕｍ２から約８×１０５／ｕｍ２、約１×１０２／ｕｍ２から約８×１０５／ｕｍ２；約５０／ｕｍ２から約５×１０５／ｕｍ２；約１×１０２／ｕｍ２から約１×１０５／ｕｍ２；約５０／ｕｍ２から約５×１０４／ｕｍ２；約１×１０２／ｕｍ２から約１×１０４／ｕｍ２；約１×１０２／ｕｍ２から約５×１０３／ｕｍ２；約１×１０２／ｕｍ２から約１×１０３／ｕｍ２；約５０／ｕｍ２から約５×１０２／ｕｍ２；約５０／ｕｍ２から約１×１０２／ｕｍ２；又はストレプトアビジン基／ｕｍ２の数についてこれらの間の任意の数値のストレプトアビジン官能基の密度を有し得る。
[00193] 一部の他の実施形態では、ストレプトアビジン提示共有結合官能基化領域は、少なくとも１つのウェルの底部の面積の約５０％未満の面積を有し得る。一部の実施形態では、ストレプトアビジン提示共有結合官能基化領域の面積は、少なくとも１つのウェルの底部の面積の約２５％未満、約１５％未満、約１０％未満、約５％未満、約２％未満又は約１％未満であり得る。ストレプトアビジン提示共有結合官能基化領域の面積は、約３５ｍｍ２、約２０ｍｍ２、約１２ｍｍ２、約５ｍｍ２、約２ｍｍ２又は約１ｍｍ２未満の面積を有し得る。一部の実施形態では、ストレプトアビジン提示共有結合官能基化領域は、約０．５ｍｍから約４．０ｍｍ（例えば、約１．０ｍｍから約３．５ｍｍ又は約１．５ｍｍから約３．０ｍｍ）の寸法を有し得る。一部の実施形態では、ストレプトアビジン提示共有結合官能基化領域は、実質的に円形であり得、且つ約０．５ｍｍから約４．０ｍｍ（例えば、約１．０ｍｍから約３．５ｍｍ又は約１．５ｍｍから約３．０ｍｍ）の直径を有し得る。
[00194] 一部の実施形態では、接触させることは、１つ又は複数のウェルの各々の底部の複数の領域を、反応性基に連結したストレプトアビジンを含む試薬又は反応性基に連結したビオチン部分を含む試薬と接触させる（続いてストレプトアビジンと反応させて、導入したばかりのビオチン部分と結合させる）ことにより、１つ又は複数のウェルの各々に複数のストレプトアビジン提示領域を形成することを含む。
[00195] 一部の実施形態では、反応性基に連結したストレプトアビジン部分を含む試薬又は反応性基に連結したビオチン部分を含む試薬は、銅依存性クリックカップリング試薬であり得、反応に続いてウェルプレートの表面をチオール含有試薬又は銅キレート化試薬と接触させることにより、銅依存性試薬を不活性化することができる。これは、１つ又は複数のウェルの各々を処理することを含み得、その場合、銅依存性クリックカップリング反応が実施される。続いて、表面遮断リガンドを含む試薬と表面を接触させることを含む、表面遮断リガンドを導入する反応を実施し得る。
[00196] 表面遮断リガンドの各々は、本明細書に記載される任意の表面遮断リガンドであり得、表面遮断リガンドの任意の好適な混合物を用い得る。一部の実施形態では、表面遮断リガンドは、親水性又は負荷電部分を含み得る。一部の変形形態では、表面遮断リガンドは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分を含み得る。
[00197] 一部の実施形態では、本方法は、１つ又は複数のウェルの各々の１つ又は複数の表面を、接着刺激をもたらすように構成されたリガンドを含む試薬と接触させることをさらに含み得る。これは、典型的に、ストレプトアビジン提示領域の導入後に実施され得る。様々な実施形態では、接着刺激をもたらすリガンドは、ストレプトアビジン提示領域以外の表面の部分に導入される。
[00198] ウェルプレートの表面のストレプトアビジン提示共有結合官能基化領域の作製。ストレプトアビジン提示共有結合官能基化領域を有する表面を含むウェルプレートを作製する別の方法は、表面に反応性部分提示（例えば、アジド又はアルキニル）共有結合官能基化領域を形成することを含み、この場合、表面の反応性部分提示共有結合官能基化領域は、ＵＶ不安定性連結部分をさらに含むが、それ以外には前述と同様に実施される。次に、表面を、反応性基に連結したストレプトアビジン部分を含む試薬又は反応性部分に連結したビオチン部分を含む試薬と接触させることであって、反応性基は、反応性部分提示表面の反応性部分と反応するように構成される、接触させることにより、ストレプトアビジン提示官能基化領域又はビオチン提示官能基化表面を形成することと、試薬が、反応性部分に連結したビオチン部分を含むとき、続いてウェルプレートの部分をストレプトアビジンと接触させこととを含む。次に、表面の一部を除く全表面を露出させるように構成されたマスクを用いて、表面をＵＶ照射に暴露する。これにより、ストレプトアビジンのＵＶ不安定性リンカー又はビオチン修飾表面リガンドがＵＶ照射に曝露されたあらゆる箇所でストレプトアビジンのＵＶ不安定性リンカー又はビオチン修飾表面リガンドが切断され、その結果、ウェルプレートのストレプトアビジン提示共有結合官能基化領域を形成する。
[00199] 一部の実施形態では、反応性部分提示共有結合修飾表面を形成することは、反応性部分含有（例えば、アジド又はアルキニル）カップリング試薬をウェルプレートの表面の表面露出部分（例えば、酸化物）部分と反応させることを含み、反応性部分含有カップリング試薬は、ＵＶ不安定性結合部分をさらに含む。ウェルプレートの表面は、表面の酸化物部分を反応性部分含有カップリング試薬と接触させる前にプラズマクリーニングに付され得る。
[00200] ウェルプレートの表面を、反応性基に連結したストレプトアビジン部分を含む試薬又はビオチン部分を含む試薬と接触させることは、ウェルプレートの１つ又は複数のウェルの各々における表面を接触させることを含み得る。
[00201] １つ又は複数のウェルの各々を、対応するウェルの底部表面において、反応性基に連結したストレプトアビジン部分を含む試薬又は反応性部分に連結したビオチン部分を含む試薬と接触させ、それにより対応するウェルの底部表面上にストレプトアビジン提示共有結合官能基化領域を形成することができる。一部の実施形態では、ストレプトアビジン提示共有結合官能基化領域は、対応するウェルの底部表面上のみに形成され得る。ストレプトアビジン提示共有結合官能基化領域は、少なくとも５０／ｕｍ２、例えば約５０ストレプトアビジン基／ｕｍ２から約８×１０５／ｕｍ２、約１×１０２／ｕｍ２から約８×１０５／ｕｍ２；約５０／ｕｍ２から約５×１０５／ｕｍ２；約１×１０２／ｕｍ２から約１×１０５／ｕｍ２；約５０／ｕｍ２から約５×１０４／ｕｍ２；約１×１０２／ｕｍ２から約１×１０４／ｕｍ２；約１×１０２／ｕｍ２から約５×１０３／ｕｍ２；約１×１０２／ｕｍ２から約１×１０３／ｕｍ２；約５０／ｕｍ２から約５×１０２／ｕｍ２；約５０／ｕｍ２から約１×１０２／ｕｍ２；又はストレプトアビジン基／ｕｍ２の数についてこれらの間の任意の数値のストレプトアビジン官能基の密度を有し得る。
[00202] リンパ球活性化共有結合官能基化領域を有する表面を含むウェルプレートの作製。ウェルプレートの表面のリンパ球活性化共有結合官能基化領域を作製する方法は、ウェルプレートのストレプトアビジン提示共有結合官能基化領域を、結合部分をそれぞれ含む複数の一次活性化分子であって、一次活性化分子の結合部分は、ストレプトアビジンの結合部位と結合するように構成される、一次活性化分子と接触させることにより、リンパ球活性化共有結合官能基化領域を提供することを含む。本方法は、ウェルプレートの表面を、反応性基に連結した表面遮断リガンドであって、反応性基は、表面の反応性部分と反応するように構成される、表面遮断リガンドを含む試薬と接触させて、表面の遮断リガンド修飾領域を形成することをさらに含む。遮断リガンド修飾領域及びリンパ球活性化共有結合官能基化領域は、表面全体を覆い得る。一部の実施形態では、遮断リガンド修飾領域及びリンパ球活性化共有結合官能基化領域は、表面の非重複領域であり得る。
[00203] ウェルプレートの１つ又は複数のウェルの各々におけるストレプトアビジン提示共有結合官能基化領域表面を複数の一次活性化分子と接触させ得る。一部の実施形態では、１つ又は複数のウェルの各々を接触させることは、対応するウェルの底部表面で１つ又は複数のウェルの各々を複数の一次活性化分子と接触させて、対応するウェルの底部表面にリンパ球活性化共有結合官能基化領域を形成することをさらに含み得る。
[00204] 一部の実施形態では、リンパ球活性化共有結合官能基化領域は、対応するウェルの底部表面上のみに形成され得る。任意選択で、リンパ球活性化共有結合官能基化領域は、１つ又は複数のウェルの側壁上に形成されなくてもよい。
[00205] このように導入されたリンパ球活性化共有結合官能基化領域は、１つ又は複数のウェルの底部の面積の約５０％未満の面積を有し得る。一部の実施形態では、リンパ球活性化共有結合官能基化領域の面積は、１つ又は複数のウェルの底部の面積の約２５％未満、約１５％未満、約１０％未満、約５％未満、約２％未満又は約１％未満であり得る。
[00206] 一部の実施形態では、リンパ球活性化共有結合官能基化領域の面積は、約３５ｍｍ２、約２０ｍｍ２、約１２ｍｍ２、約５ｍｍ２、約２ｍｍ２又は約１ｍｍ２未満の面積を有し得る。リンパ球活性化共有結合官能基化領域は、約０．５ｍｍから約４．０ｍｍ（例えば、約１．０ｍｍから約３．５ｍｍ又は約１．５ｍｍから約３．０ｍｍ）の寸法を有し得る。様々な実施形態では、リンパ球活性化共有結合官能基化領域は、実質的に円形であり得、且つ約０．５ｍｍから約４．０ｍｍ（例えば、約１．０ｍｍから約３．５ｍｍ又は約１．５ｍｍから約３．０ｍｍ）の直径を有し得る。
[00207] 一部の実施形態では、１つ又は複数のウェルの各々における複数のリンパ球活性化共有結合官能基化領域は、各ウェル内の２つ以上の位置でウェルプレートのストレプトアビジン提示共有結合官能基化領域を一次活性化分子と接触させることにより導入することができる。複数のリンパ球活性化共有結合官能基化領域の各々の面積は、１つ又は複数のウェルの底部の面積の約５％未満であり得る。一部の実施形態では、複数のリンパ球活性化共有結合官能基化領域の総面積は、１つ又は複数のウェルの底部の面積の約５０％、約２５％又は約１０％未満であり得る。
[00208] 一部の実施形態では、活性化しようとするリンパ球は、Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞又はＢ細胞であり得る。様々な実施形態では、第１活性化分子は、本明細書に記載される任意の好適な活性化分子であり得る。一部の実施形態では、第１活性化分子は、分化結合分子、細胞表面免疫グロブリン結合分子、Ｔ細胞受容体活性化分子、ＴＮＦ受容体スーパーファミリー結合分子、ケモカイン受容体結合分子、成長因子分子又は接着促進分子の細胞表面クラスターであり得る。一部の変形形態では、複数の第１活性化分子は、ＭＨＣ分子、分化結合活性の細胞表面クラスターを保持するタンパク質若しくはその断片、Ｔ細胞受容体結合活性を保持するタンパク質若しくはその断片、ＴＮＦ受容体スーパーファミリー結合活性を保持するタンパク質若しくはその断片、ケモカイン受容体結合活性を保持するタンパク質若しくはその断片、成長刺激活性を保持するタンパク質若しくはその断片又は接着促進活性を保持するタンパク質若しくはその断片を含み得る。様々な実施形態では、複数の第１活性化分子は、分化結合活性の細胞表面クラスターを保持するタンパク質若しくはその断片、成長刺激活性を保持するタンパク質若しくはその断片又は接着促進活性を保持するタンパク質若しくはその断片を含む。
[00209] 複数の特異的に結合された第１活性化分子リガンドは、リンパ球活性化共有結合官能基化領域において、１平方ミクロン当たり少なくとも約１×１０２分子、１平方ミクロン当たり少なくとも約５×１０２分子、１平方ミクロン当たり少なくとも約１×１０３分子、１平方ミクロン当たり少なくとも約５×１０３分子、１平方ミクロン当たり少なくとも約１×１０４分子、１平方ミクロン当たり少なくとも約５×１０４分子、１平方ミクロン当たり少なくとも約１×１０５分子又は１平方ミクロン当たり約１×１０２から約１×１０５分子の密度を有し得る。
[00210] 本方法は、ウェルプレートのストレプトアビジン提示共有結合官能基化領域を、結合部分をそれぞれ含む複数の第２活性化分子であって、第２活性化分子の結合部分は、ストレプトアビジンの結合部位と結合するように構成される、第２活性化分子と接触させることにより、リンパ球活性化共有結合官能基化領域中において、複数の特異的に結合された第２活性化分子リガンドを提供することをさらに含み得る。
[00211] 第２活性化分子は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）共活性化分子、細胞表面免疫グロブリン結合分子、ＴＮＦ受容体スーパーファミリー結合分子、ケモカイン受容体結合分子、成長因子分子又は接着促進分子であり得る。複数の特異的に結合された共活性化分子リガンドは、リンパ球活性化共有結合官能基化領域において、１平方ミクロン当たり少なくとも約１×１０２分子、１平方ミクロン当たり少なくとも約５×１０２分子、１平方ミクロン当たり少なくとも約１×１０３分子、１平方ミクロン当たり少なくとも約５×１０３分子、１平方ミクロン当たり少なくとも約１×１０４分子、１平方ミクロン当たり少なくとも約５×１０４分子、１平方ミクロン当たり少なくとも約１×１０５分子又は１平方ミクロン当たり約１×１０３から約１×１０５分子の密度を有し得る。
[00212] 本方法は、ウェルプレートの表面を、反応性基に連結した表面遮断リガンドを含む試薬であって、反応性基は、表面の反応性部分と反応するように構成される、試薬と接触させることにより、表面の遮断リガンド修飾領域を提供することをさらに含み得る。一部の実施形態では、遮断リガンド修飾領域及び抗原提示共有結合官能基化領域は、表面全体を覆い得る。一部の実施形態では、遮断リガンド修飾領域及び抗原提示共有結合官能基化領域は、表面の非重複領域であり得る。
[00213] 表面遮断リガンドの各々は、本明細書に記載される任意の好適な表面遮断リガンドであり得る。一部の実施形態では、表面遮断リガンドは、親水性又は負荷電部分を含み得る。一部の実施形態では、表面遮断リガンドは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分を含み得る。
[00214] リンパ球活性化共有結合官能基化領域を有する表面を含むウェルプレートの作製。Ｔ細胞を活性化するためのウェルプレートの抗原提示共有結合官能基化領域を有する表面を含むウェルプレートを作製する方法は、ウェルプレートのストレプトアビジン提示共有結合官能基化領域を、Ｔ細胞のＴ細胞受容体及び結合分子に結合するようにそれぞれ構成された主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子を含む複数の一次活性化分子であって、複数の一次活性化分子の結合部分は、ストレプトアビジンの結合部位に結合するように構成される、複数の一次活性化分子と接触させることと；Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）共活性化分子又は補助ＴＣＲ活性化分子をそれぞれ含む複数の共活性化分子であって、ストレプトアビジンの結合部位に結合するように構成された結合部分をそれぞれさらに含む、複数の共活性化分子をウェルプレートのストレプトアビジン提示共有結合官能基化領域の第２の複数の結合部分と接触させることとを含み、それによりウェルプレートの抗原提示共有結合官能基化領域の複数の特異的に結合された一次活性化分子リガンド及び複数の特異的に結合された共活性化分子リガンドを提供する。
[00215] 本方法は、ウェルプレートの表面を、反応性基に連結された表面遮断リガンドを含む試薬であって、反応性基は、表面の反応性部分と反応するように構成される、試薬と接触させることにより、表面の遮断リガンド修飾領域を提供することをさらに含み得る。遮断リガンド修飾領域及び抗原提示共有結合官能基化領域は、表面全体を覆い得る。一部の実施形態では、遮断リガンド修飾領域及び抗原提示共有結合官能基化領域は、表面の非重複領域であり得る。
[00216] ウェルプレートのストレプトアビジン提示共有結合官能基化領域と、複数の一次活性化分子及び複数の共活性化分子とを接触させることは、ウェルプレートの１つ又は複数のウェルの各々における表面を接触させることを含み得る。一部の実施形態では、１つ又は複数のウェルの各々を接触させることは、対応するウェルの底部表面の１つ又は複数のウェルの各々を複数の一次活性化分子及び複数の共活性化分子と接触させて、対応するウェルの底部表面に抗原提示共有結合官能基化領域を形成することをさらに含み得る。一部の実施形態では、抗原提示共有結合官能基化領域は、対応するウェルの底部表面のみに形成され得る。
[00217] 一部の実施形態では、抗原提示共有結合官能基化領域は、１つ又は複数のウェルの底部の面積の約５０％未満の面積を有し得る。一部の実施形態では、リンパ球活性化共有結合官能基化領域の面積は、１つ又は複数のウェルの底部の面積の約２５％未満、約１５％未満、約１０％未満、約５％未満、約２％未満又は約１％未満である。
[00218] 一部の実施形態では、抗原提示共有結合官能基化領域の面積は、約３５ｍｍ２、約２０ｍｍ２、約１２ｍｍ２、約５ｍｍ２、約２ｍｍ２又は約１ｍｍ２未満の面積を有し得る。一部の実施形態では、抗原提示共有結合官能基化領域は、約０．５ｍｍから約４．０ｍｍ（例えば、約１．０ｍｍから約３．５ｍｍ又は約１．５ｍｍから約３．０ｍｍ）の寸法を有し得る。一部の実施形態では、リンパ球活性化共有結合官能基化領域は、実質的に円形であり得、且つ約０．５ｍｍから約４．０ｍｍ（例えば、約１．０ｍｍから約３．５ｍｍ又は約１．５ｍｍから約３．０ｍｍ）の直径を有し得る。
[00219] ウェルプレートのストレプトアビジン提示共有結合官能基化領域と、複数の一次活性化分子及び複数の共活性化分子とを接触させることは、ウェルプレートの１つ又は複数のウェルの各々における複数のストレプトアビジン提示共有結合官能基化領域を接触させることをさらに含み得、それにより１つ又は複数のウェルに複数の抗原提示共有結合官能基化領域を形成する。一部の実施形態では、複数の抗原提示共有結合官能基化領域の各々の面積は、１つ又は複数のウェルの底部の約５％未満の面積を有し得、さらに、抗原提示共有結合官能基化領域の総面積は、１つ又は複数のウェルの底部の面積の約５０％、約２５％又は約１０％未満である。
[00220] 一部の実施形態では、ＭＨＣ分子は、ＭＨＣクラスＩタンパク質配列及びβミクログロブリンタンパク質配列を含む。一部の実施形態では、ＭＨＣ分子を含む複数の一次活性化分子の各々は、抗原ペプチドをさらに含み得る。抗原ペプチドは、腫瘍関連抗原、ウイルス抗原、細菌抗原、真菌抗原、原生動物抗原などであり得る。一部の実施形態では、腫瘍関連抗原は、ＳＬＣ４５Ａ２、ＴＣＬ１、ＶＣＸ３Ａ、ＭＡＲＴ１又はＮＹＥＳＯ１であり得る。
[00221] 一部の実施形態では、ＭＨＣ分子のタンパク質配列は、タンパク質配列のＣ末端連結を介して表面に連結され得る。例えば、ＭＨＣタンパク質配列は、Ｃ末端ＢｉｒＡタグを含み得る。ＢｉｒＡタグ配列は、部位特異的ビオチン化を可能にする。一部の実施形態では、ＭＨＣ分子は、ビオチン部分を含み、且つストレプトアビジンとの非共有結合相互作用によって表面に結合される。様々な実施形態では、ストレプトアビジンは、それ自体、表面に共有結合される。一部の実施形態では、ストレプトアビジンは、一続きの約５、７、９、１０、１１、１３、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、９０、１００、２００結合長又はそれらの間の任意の数の結合長を介して表面に結合され得る。
[00222] 様々な実施形態では、ストレプトアビジンは、表面と非共有結合され得る。ストレプトアビジンは、ビオチン部分と非共有結合され得、及びビオチン部分は、表面と共有結合され得る。様々な実施形態では、ビオチン部分は、リンカーにより、約５、７、９、１０、１１、１３、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９５、１００、２００結合長又はそれらの間の任意の数の結合長を介して表面に結合され得る。
[00223] 一次活性化分子と共活性化分子との比は、約１：１から約２：１、約１：１又は約３：１から約１：３であり得る。
[00224] 一部の実施形態では、複数の共活性化分子リガンドのＴＣＲ共活性化分子と補助ＴＣＲ活性化分子との比は、約１００：１から約１：１００であり得る。一部の実施形態では、複数の共活性化分子リガンドのＴＣＲ共活性化分子と補助ＴＣＲ活性化分子との比は、１００：１から９０：１、９０：１から８０：１、８０：１から７０：１、７０：１から６０：１、６０：１から５０：１、５０：１から４０：１、４０：１から３０：１、３０：１から２０：１、２０：１から１０：１、１０：１から１：１、３：１から１：３、１：１から１：１０、１：１０から１：２０、１：２０から１：３０、１：３０から１：４０、１：４０から１：５０、１：５０から１：６０、１：６０から１：７０、１：７０から１：８０、１：８０から１：９０、１：９０から１：１００であり得、上記数値の各々は、「約」により修正される。一部の実施形態では、複数の共活性化分子リガンドのＴＣＲ共活性化分子と補助ＴＣＲ活性化分子との比は、約２０：１から約１：２０又は約３：１から約１：３であり得る。
[00225] 複数の特異的に結合された一次活性化分子リガンドは、抗原提示共有結合官能基化領域において、１平方ミクロン当たり少なくとも約１×１０２分子、１平方ミクロン当たり少なくとも約５×１０２分子、１平方ミクロン当たり少なくとも約１×１０３分子、１平方ミクロン当たり少なくとも約５×１０３分子、１平方ミクロン当たり少なくとも約１×１０４分子、１平方ミクロン当たり少なくとも約５×１０４分子、１平方ミクロン当たり少なくとも約１×１０５分子又は１平方ミクロン当たり約１×１０２から約１×１０５分子の密度を有し得る。
[00226] 複数の特異的に結合された共活性化分子リガンドは、抗原提示共有結合官能基化領域において、１平方ミクロン当たり少なくとも約１×１０２分子、１平方ミクロン当たり少なくとも約５×１０２分子、１平方ミクロン当たり少なくとも約１×１０３分子、１平方ミクロン当たり少なくとも約５×１０３分子、１平方ミクロン当たり少なくとも約１×１０４分子、１平方ミクロン当たり少なくとも約５×１０４分子、１平方ミクロン当たり少なくとも約１×１０５分子又は１平方ミクロン当たり約１×１０３から約１×１０５分子の密度を有し得る。
[00227] 一部の実施形態では、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）共活性化分子は、ＣＤ２８結合タンパク質又はＣＤ２８に対する結合能力を保持するその断片を含み得る。ＣＤ２８結合タンパク質又はその断片は、部位特異的Ｃ末端ビオチン部分を含み得る。一部の実施形態では、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）共活性化分子は、ＣＤ８０分子又はＣＤ２８に対する結合活性を保持するその断片を含み得る。一部の実施形態では、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）共活性化分子は、抗ＣＤ２８抗体又はその断片を含み得る。
[00228] 一部の実施形態では、補助ＴＣＲ活性化分子は、ＣＤ２結合タンパク質を含み得る。ＣＤ２結合タンパク質又はその断片は、部位特異的Ｃ末端ビオチン部分をさらに含み得る。一部の実施形態では、補助ＴＣＲ活性化分子は、ＣＤ５８分子又はＣＤ２に対する結合活性を保持するその断片を含み得る。一部の実施形態では、補助ＴＣＲ活性化分子は、抗ＣＤ２抗体又はその断片を含み得る。
[00229] 表面遮断リガンドの各々は、本明細書に記載される任意の好適な表面遮断リガンドであり得る。一部の実施形態では、表面遮断リガンドは、親水性又は負荷電部分を含み得る。一部の実施形態では、表面遮断リガンドは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分を含み得る。
[00230] 前述した共有結合官能基化領域を含む培養プレート／培養フラスコを作製する方法。ウェルプレートの別の実施形態として、培養プレート（例えば、丸底培養プレート）及び／又は培養フラスコは、反応性部分提示（例えば、アジド提示若しくはアルキニル提示）、ビオチン提示、ストレプトアビジン提示、抗原提示及び／又はリンパ球活性化共有結合官能基化領域など、それに導入された共有結合官能基化表面のいずれも有し得る。アジド提示共有結合官能基化領域は、前述したのと同様に培養プレート／フラスコ全体に導入され得る。培養プレート／フラスコは、プラズマクリーニングしても又はしなくてもよい。培養プレート／フラスコの全部又は一部を反応性部分官能基化試薬に曝露して官能基化し得る。任意の種類の好適なスポッティング手段を使用して、培養プレート内に次のビオチン及び／又はストレプトアビジン提示領域を１列の第１領域として導入することができる。マイクロマニピュレータを培養フラスコ内に挿入して、続くビオチン及び／又はストレプトアビジン提示共有結合官能基化領域を１列に導入することができる。培養プレート及び培養フラスコのいずれも、１列の共有結合機能化領域を有することができ、各領域は、本明細書に記載のようにリンパ球を活性化するのに好適なサイズ（例えば、面積）を有し、周囲の領域及び他の表面（例えば、培養フラスコの残った側又は培養プレートの側壁）は、本明細書に記載のように、表面遮断リガンドを導入することにより不動態化され得る。前述したウェルプレートと同様に、活性化及び共活性化分子リガンドを導入し得るか、又は抗原提示又はリンパ球活性化培養プレート／培養フラスコを使用して、本明細書の方法に記載のようにリンパ球を活性化し得る。
[00231] クリックケミストリー及び試薬。非環式アルキンなどのアルキンをアジドと反応させることにより、共有結合を形成することができる。例えば、「クリック」環化反応を実施し得、これは、銅（Ｉ）塩により触媒される。銅（Ｉ）塩を用いて、反応を触媒するが、反応混合物は、任意選択で、反応速度又は程度を増強し得る他の試薬を含み得る。例えば、表面修飾試薬又は官能基化表面のアルキンがシクロオクチンである場合、対応する官能基化表面又は表面修飾試薬のアジドとの「クリック」環化反応は、銅触媒フリーであり得る。これにより、「クリック」環化反応を用いて、表面修飾リガンドを官能基化表面とカップリングして、共有結合修飾表面を形成することができる。
[00232] 銅触媒。任意の好適な銅（Ｉ）触媒を使用することができる。一部の実施形態では、ヨウ化銅（Ｉ）、塩化銅（Ｉ）、臭化銅（Ｉ）又は別の銅（Ｉ）塩を銅（Ｉ）触媒として使用する。他の実施形態では、銅（ＩＩ）塩をアスコルビン酸塩などの還元剤と組み合わせて使用して、銅（Ｉ）種をインサイチュで生成することができる。硫酸銅又は酢酸銅は、好適な銅（ＩＩ）塩の非限定的な例である。他の実施形態では、反応工程中の十分な銅（Ｉ）種を確実にするために、アスコルビン酸塩などの還元剤を銅（Ｉ）と一緒に存在させ得る。銅金属を用いて、やはりＣｕ（ＩＩ）種を生成するレドックス反応中にＣｕ（Ｉ）種を提供することができる。［ＣｕＢｒ（ＰＰｈ３）３］などの銅の配位錯体、銅のシリコタングステン酸塩錯体、［Ｃｕ（ＣＨ３ＣＮ）４］ＰＦ６又は（ＥｔＯ）３Ｐ ＣｕＩを使用し得る。また別の実施形態では、シリカ固定化銅触媒、銅ナノクラスター若しくは銅／酸化第一銅ナノ粒子を触媒として使用し得る。
[00233] 他の反応促進剤。前述したように、酸素が反応物から厳密に排除された場合でも、反応全体を通して、銅（Ｉ）種を維持することができるように、アスコルビン酸ナトリウムなどの還元剤を用い得る。銅（Ｉ）種を安定化するために、他の補助リガンドを反応混合物に含有させ得る。トリアゾリル含有リガンドを使用することができ、こうしたものとして、限定されないが、トリス（ベンジル〜１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）メチルアミン（ＴＢＴＡ）又は３［トリス（３−ヒドロキシプロピルトリアゾリルメチル）アミン（ＴＨＰＴＡ）が挙げられる。反応を促進するために使用することができる別のクラスの補助リガンドは、スルホン化バトフェナントロリントフェナントロリンであり、これは、水溶性でもあり、酸素が排除され得る場合に使用することができる。
使用方法
[00234] ウェルプレートの表面の抗原提示共有結合官能基化領域を用いたＴリンパ球の活性化。Ｔリンパ球（Ｔ細胞）の活性化方法は、複数のＴ細胞をウェルプレートの１又は複数のウェルの表面の抗原提示共有結合官能基化領域と接触させることを含む。抗原提示共有結合官能基化領域は、以下を含み得る：Ｔ細胞のＴ細胞受容体に結合するように構成された主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子（例えば、クラスＩ又はクラスＩＩ）をそれぞれ含む複数の一次活性化分子リガンドであって、１つ又は複数のウェルの表面に各々が連結される複数の一次活性化分子リガンド；並びにＴ細胞受容体（ＴＣＲ）共活性化分子又は補助ＴＣＲ活性化分子をそれぞれ含む複数の共活性化分子リガンドであって、１つ又は複数のウェルの表面に各々が連結された共活性化分子リガンド。活性化の方法は、複数のＴ細胞を表面の抗原提示共有結合官能基化領域と接触させて培養し、それにより複数のＴ細胞の少なくとも一部を活性化Ｔ細胞に変換することをさらに含み得る。一部の実施形態では、抗原提示共有結合官能基化表面と接触させて配置したＴ細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞を含む。
[00234] ウェルプレートの表面の抗原提示共有結合官能基化領域を用いたＴリンパ球の活性化。Ｔリンパ球（Ｔ細胞）の活性化方法は、複数のＴ細胞をウェルプレートの１又は複数のウェルの表面の抗原提示共有結合官能基化領域と接触させることを含む。抗原提示共有結合官能基化領域は、以下を含み得る：Ｔ細胞のＴ細胞受容体に結合するように構成された主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子（例えば、クラスＩ又はクラスＩＩ）をそれぞれ含む複数の一次活性化分子リガンドであって、１つ又は複数のウェルの表面に各々が連結される複数の一次活性化分子リガンド；並びにＴ細胞受容体（ＴＣＲ）共活性化分子又は補助ＴＣＲ活性化分子をそれぞれ含む複数の共活性化分子リガンドであって、１つ又は複数のウェルの表面に各々が連結された共活性化分子リガンド。活性化の方法は、複数のＴ細胞を表面の抗原提示共有結合官能基化領域と接触させて培養し、それにより複数のＴ細胞の少なくとも一部を活性化Ｔ細胞に変換することをさらに含み得る。一部の実施形態では、抗原提示共有結合官能基化表面と接触させて配置したＴ細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞を含む。
[00235] 一部の実施形態では、ウェルプレートの１つ又は複数のウェルの表面の抗原提示共有結合官能基化領域は、任意の特徴の組合せを備えた、本明細書に記載のいずれかの抗原提示共有結合官能基化領域である。
[00236] 一部の実施形態では、複数の共活性化分子リガンドは、ＴＣＲ共活性化分子及び補助ＴＣＲ活性化分子を含み得る。複数の共活性化分子リガンドのＴＣＲ共活性化分子と補助ＴＣＲ活性化分子との比は、約１００：１から約１：１００であり得る。複数の共活性化分子リガンドのＴＣＲ共活性化分子と補助ＴＣＲ活性化分子との比は、１００：１から９０：１、９０：１から８０：１、８０：１から７０：１、７０：１から６０：１、６０：１から５０：１、５０：１から４０：１、４０：１から３０：１、３０：１から２０：１、２０：１から１０：１、１０：１から１：１、３：１から１：３、１：１から１：１０、１：１０から１：２０、１：２０から１：３０、１：３０から１：４０、１：４０から１：５０、１：５０から１：６０、１：６０から１：７０、１：７０から１：８０、１：８０から１：９０又は１：９０から１：１００であり得、上記数値の各々は、「約」により修正される。一部の実施形態では、複数の共活性化分子リガンドのＴＣＲ共活性化分子と補助ＴＣＲ活性化分子との比は、約２０：１から約１：２０又は約３：１から約１：３であり得る。
[00237] 一部の実施形態では、複数のＭＨＣ分子は、ＭＨＣクラスＩタンパク質配列及びβミクログロブリンタンパク質配列を含み得る。一部の実施形態では、ＭＨＣ分子のタンパク質配列は、タンパク質配列のＣ末端結合を介して表面の抗原提示共有結合修飾領域に連結され得る。一部の実施形態では、ＭＨＣ分子はさらに、抗原ペプチドを含み得る。一部の実施形態では、抗原ペプチドは、腫瘍関連抗原、ウイルス抗原、細菌抗原、真菌抗原、原生動物抗原などである。一部の実施形態では、腫瘍関連ペプチドは、ＳＬＣ４５Ａ２、ＴＣＬ１、ＶＣＸ３Ａ、ＭＡＲＴ１又はＮＹＥＳＯ１である。様々な実施形態では、ＭＨＣ分子は、ビオチン分子であり、これは、ストレプトアビジンとの非共有結合を介して表面の抗原提示共有結合修飾領域に結合される。
[00238] 一部の実施形態では、ストレプトアビジンは、それ自体、表面の抗原提示共有結合官能基化領域に共有結合され得る。ストレプトアビジンは、一続きの約５、７、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９５、１００、２００結合長又はそれらの間の任意の数の結合長を介して表面に結合され得る。他の実施形態では、ストレプトアビジンは、表面の抗原提示共有結合官能基化領域と非共有結合され得る。一部の実施形態では、ストレプトアビジンは、ビオチン部分と非共有結合され得、及びビオチンは、表面の抗原提示共有結合官能基化領域と共有結合され得る。ビオチン部分は、リンカーにより、一続きの２、約５、７、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９５、１００、２００結合長又はそれらの間の任意の数の結合長を介して表面に結合され得る。
[00239] 一部の実施形態では、複数の共活性化分子リガンドの各々は、表面の抗原提示共有結合官能基化領域に結合され得る。
[00240] 一部の実施形態では、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）共活性化分子は、ＣＤ２８結合タンパク質又はＣＤ２８に対する結合能力を保持するその断片を含み得る。ＣＤ２８結合タンパク質又はその断片は、部位特異的Ｃ末端ビオチン部分をさらに含み得る。一部の他の実施形態では、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）共活性化分子は、ＣＤ８０分子又はＣＤ２８に対する結合活性を保持するその断片を含み得る。Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）共活性化分子は、抗ＣＤ２８抗体又はその断片を含み得る。
[00241] 様々な実施形態では、補助ＴＣＲ活性化分子は、ＣＤ２結合タンパク質を含み得る。ＣＤ２結合タンパク質又はその断片は、部位特異的Ｃ末端ビオチン部分をさらに含み得る。様々な実施形態では、補助ＴＣＲ共活性化分子は、ＣＤ５８分子又はＣＤ２との結合活性を保持するその断片を含み得る。一部の実施形態では、補助ＴＣＲ活性化分子は、抗ＣＤ２抗体又はその断片を含み得る。
[00242] 特異的に結合した一次活性化分子リガンドは、表面の抗原提示共有結合官能基化領域において、１平方ミクロン当たり少なくとも約１×１０２分子、１平方ミクロン当たり少なくとも約５×１０２分子、１平方ミクロン当たり少なくとも約１×１０３分子、１平方ミクロン当たり少なくとも約５×１０３分子、１平方ミクロン当たり少なくとも約１×１０４分子、１平方ミクロン当たり少なくとも約５×１０４分子、１平方ミクロン当たり少なくとも約１×１０５分子又は１平方ミクロン当たり約１×１０２から約１×１０５分子の密度を有し得る。特異的に結合した共活性化分子リガンドは、表面の抗原提示共有結合官能基化領域において、１平方ミクロン当たり少なくとも約１×１０２分子、１平方ミクロン当たり少なくとも約５×１０２分子、１平方ミクロン当たり少なくとも約１×１０３分子、１平方ミクロン当たり少なくとも約５×１０３分子、１平方ミクロン当たり少なくとも約１×１０４分子、１平方ミクロン当たり少なくとも約５×１０４分子、１平方ミクロン当たり少なくとも約１×１０５分子又は１平方ミクロン当たり約１×１０３から約１×１０５分子の密度を有し得る。一部の実施形態では、共有結合修飾表面上の一次活性化分子リガンドと共活性化分子リガンドとの比は、約１：１０から約２：１、約１：５から約２：１、約１：２から約２：１、約１：１０から約１：１、約１：５から約１：１、約１：１から約２：１又は約１：２から約１：１であり得る。一部の実施形態では、複数の共活性化分子リガンドのＴＣＲ共活性化分子と補助ＴＣＲ活性化分子との比は、約３：１から約１：３であり得る。一部の実施形態では、複数の共活性化分子リガンドのＴＣＲ共活性化分子と補助ＴＣＲ活性化分子との比は、約２：１から約１：２であり得る。他の実施形態では、複数の共活性化分子リガンドのＴＣＲ共活性化分子と補助ＴＣＲ活性化分子との比は、約１：１であり得る。
[00243] 本方法は、複数のＴ細胞を、ＩＣＡＭ分子を含む複数の接着刺激分子リガンドと接触させることを含み得、複数の接着刺激分子リガンドの各々は、ウェルプレートの表面の抗原提示共有結合官能基化領域以外の領域に結合する。一部の実施形態では、複数の接着刺激分子リガンドは、ウェルプレートの表面の抗原提示共有結合官能基化領域以外の領域に共有結合される。
[00244] 一部の実施形態では、本方法は、複数のＴ細胞を複数の成長刺激分子リガンドと接触させることをさらに含み得る。成長刺激分子リガンドの各々は、成長因子受容体リガンドを含み得る。一部の実施形態では、成長因子受容体リガンドは、ＩＬ−２１又はその断片を含み得る。
[00245] 一部の実施形態では、複数のＴ細胞を複数の成長刺激分子リガンドと接触させることは、少なくとも１日の第１培養期間後に実施され得る。抗原提示合成表面と接触させてＴ細胞を培養することは、約４日から約７日の期間にわたって実施され得る。
[00246] 一部の実施形態では、本方法は、表面の抗原提示共有結合官能基化領域と接触させて第１活性化期間を完了することと；第２培養期間にわたり、複数の活性化Ｔ細胞を表面の抗原提示共有結合官能基化領域と接触させて培養し、それにより拡大された複数の活性化Ｔ細胞を取得することとをさらに含む。第２培養期間中、第２の複数の成長刺激分子リガンドを添加し得る。残りの第２培養期間にわたり、複数のＩＬ−２分子と複数のＩＬ−７分子とを添加して、活性化Ｔ細胞と接触させ得る。一部の実施形態では、第２培養中、表面の抗原提示共有結合官能基化領域と接触させて培養することは、約４日から約７日の期間にわたって実施され得る。
[00247] 本方法は、表面の抗原提示共有結合官能基化領域と接触させて第２活性化期間を完了することと；第３培養期間にわたり、拡大された複数の活性化Ｔ細胞を表面の抗原提示共有結合官能基化領域と接触させて培養し、それにより複数の高度に活性化したＴ細胞を取得することとをさらに含む。第３培養期間中、第３の複数の成長刺激分子リガンドを添加し得る。一部の実施形態では、残りの第３培養期間にわたり、複数のＩＬ−２分子と複数のＩＬ−７分子とを添加して、活性化Ｔ細胞と接触させ得る。表面の抗原提示共有結合官能基化領域と接触させて培養することは、約４日から約７日の第３期間にわたって実施され得る。
[00248] 表現型及び産物。一部の実施形態では、活性化されるＴリンパ球は、ＣＤ８＋Ｔリンパ球、例えばナイーブＣＤ８＋リンパ球を含む。一部の実施形態では、活性化されるＴリンパ球は、ＣＤ８＋Ｔリンパ球、例えばナイーブＣＤ８＋リンパ球について濃縮され得る。代わりに、一部の実施形態では、活性化されるＴリンパ球は、ＣＤ４＋Ｔリンパ球、例えばナイーブＣＤ４＋リンパ球を含み得る。一部の実施形態では、活性化されるＴリンパ球は、ＣＤ４＋Ｔリンパ球、例えばナイーブＣＤ４＋リンパ球について濃縮され得、例えばクラスＩＩ制限的抗原に対して特異的なＴ細胞が望まれる場合、ＣＤ４＋Ｔリンパ球が使用され得る。
[00249] 一部の実施形態では、本方法は、ＣＤ４５ＲＯ＋である活性化Ｔリンパ球を生産する。一部の実施形態では、本方法は、ＣＤ２８陽性である活性化Ｔリンパ球を生産する。一部の実施形態では、本方法は、ＣＤ２８＋ＣＤ４５ＲＯ＋である活性化Ｔリンパ球を生産する。一部の実施形態では、本方法は、ＣＤ１９７＋である活性化Ｔリンパ球を生産する。一部の実施形態では、本方法は、ＣＤ１２７＋である活性化Ｔリンパ球を生産する。一部の実施形態では、本方法は、ＣＤ２８、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ１２７及びＣＤ１９７又は少なくとも上記マーカの３つの任意の組合せ又は少なくとも上記マーカの２つの任意の組合せについて陽性である活性化Ｔリンパ球を生産する。上記の表現型のいずれかを有する活性化Ｔリンパ球は、さらに、ＣＤ８＋であり得る。一部の実施形態では、ＣＤ２８＋である上記表現型のいずれかは、ＣＤ２８高表現型を含む。
[00250] 一部の実施形態では、本方法は、抗原特異的Ｔ細胞を含むＴ細胞の集団を生産し、抗原特異的Ｔ細胞の少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％又は９８％は、ＣＤ４５ＲＯ＋／ＣＤ２８高細胞であり、上記の値の各々は、「約」により修正され得る。
[00251] 代わりに又は加えて、一部の実施形態では、本方法は、Ｔ細胞の集団を生産し、Ｔ細胞の少なくとも１％、１．５％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％若しくは１０％は、抗原特異的Ｔ細胞であるか；又はＴ細胞の１％〜２％、２％〜３％、３％〜４％、４％〜５％、５％〜６％、６％〜７％、７％〜８％、８％〜９％、９％〜１０％、１０％〜１１％若しくは１１％〜１２％は、抗原特異的Ｔ細胞であり、上記の値の各々は、「約」により修正され得る。Ｔ細胞の集団の含量は、抗原提示表面との接触、任意選択でさらなる拡大ステップを後に実施する方法の「未処理」産物に基づいて決定することができる（即ち特定の表現型を有する産物Ｔ細胞を濃縮若しくは分離する前／それらを行うことなく）。抗原特異性及び／又はＴ細胞マーカ表現型の決定により、死滅細胞を排除することができる。一部の実施形態では、本方法は、抗原特異的であるＴ細胞の画分が出発集団に対して増加したＴ細胞の集団を提供する。
[00252] 本明細書に記載の方法を使用して活性化した細胞を用いる対象の処置。癌の処置が必要な対象を処置する方法は、対象から複数のＴリンパ球（Ｔ細胞）を採取することと；複数のＴ細胞を、抗原提示共有結合官能基化領域を含むウェルプレートの表面と接触させることであって、抗原提示共有結合官能基化領域は、複数のＴ細胞の各々のＴ細胞に結合するように構成される複数の主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子（例えば、クラスＩ又はクラスＩＩ）を含み、ＭＨＣ分子は、対象の癌に特異的な抗原を含む、接触させることと；複数の活性化Ｔ細胞を生産することであって、活性化は、対象の癌に対して特異的であるように構成される、生産することと；非活性化細胞から複数の特異的活性化Ｔ細胞を分離することと；複数の抗原特異的活性化Ｔ細胞を対象に導入することとを含む。
[00253] 抗原提示共有結合官能基化領域を含む表面を有するウェルプレートは、本明細書に記載の抗原提示共有結合官能基化領域を含むウェルプレートであり得るか、又は任意の特徴の組合せを有し得る。抗原提示共有結合官能基化領域を含む表面を有するウェルプレートは、本明細書に記載のいずれかの方法により且つ任意のステップの組合せで作製することができる。
[00254] 癌の処置が必要な対象を処置する方法は、対象から複数のＴリンパ球（Ｔ細胞）を採取することと；本明細書に記載のいずれかの方法と同様の方法によって複数の活性化Ｔ細胞を生産することであって、活性化は、対象の癌に対して特異的であるように構成される、生産することと；非活性化細胞から複数の特異的活性化Ｔ細胞を分離することと；複数の抗原特異的活性化Ｔ細胞を対象に導入することとを含む。
[00255] また、癌の処置が必要な対象を処置するための薬剤の製造を目的とする複数の特異的活性化Ｔリンパ球の使用であって、複数の特異的活性化Ｔリンパ球は、本明細書に記載の方法によって生産されている、使用も提供される。また、癌の処置が必要な対象を処置するための薬剤の製造を目的とする複数の特異的活性化リンパ球の使用であって、複数の特異的活性化リンパ球は、本明細書に記載の方法によって生産されている、使用も提供される。また、タンパク質欠乏障害又は免疫障害の処置が必要な対象を処置するための薬剤の製造を目的とする複数の特異的活性化リンパ球の使用であって、複数の特異的活性化リンパ球は、本明細書に記載の方法によって生産されている、使用も提供される。
[00256] 一部の実施形態では、複数の特異的活性化リンパ球の分離は、特異的活性化リンパ球の表面バイオマーカを検出することをさらに含み得る。
[00257] 一部の実施形態では、特異的活性化リンパ球は、オートロガス（即ちそれらを投与しようとする対象に由来する）であり、本明細書に記載の表面及び方法を用いて急速に拡大させることができる。
[00258] 様々な実施形態では、複数の特異的活性化Ｔリンパ球又はその集団の作製方法は、活性化Ｔリンパ球を急速に拡大して、活性化Ｔリンパ球の拡大集団を提供することをさらに含み得る。一部の実施形態では、急速な拡大は、非活性化Ｔリンパ球から特異的活性化Ｔリンパ球を分離した後に実施され得る。十分なレベルのＴリンパ球の産生は、本明細書に記載されるか又は当技術分野で公知の急速拡大方法を用いて達成することができる。例えば、以下の実施例を参照されたい；Riddell、米国特許第５，８２７，６４２号；Riddell et al.、米国特許第６，０４０，１７７号及びYee and LI、ＰＣＴ出願番号国際公開第２００９／０４５３０８Ａ２号。
[00259] ヒト対象の処置でのＴ細胞の使用（例えば、養子細胞療法のための）が当技術分野で知られている。本明細書に記載の方法に従って作製された細胞をこうした方法に使用することができる。例えば、ＭＡＲＴ−１抗原特異的Ｔ細胞を含む腫瘍浸潤リンパ球を用いる養子細胞療法が臨床で試験されている（Powell et al., Blood 105:241-250, 2005）。また、抗ＣＤ３モノクローナル抗体及びＩＬ−２で共活性化したＴ細胞の投与は、Chang et al., J. Clinical Oncology 21:884-890, 2003に記載された。癌の処置を目的とするＴ細胞投与についてのさらなる例及び／又は論考は、以下に提供されている：Dudley et al. Science 298:850-854, 2002；Roszkowski et al., Cancer Res 65(4): 1570-76, 2005；Cooper et al. Blood 101: 1637-44, 2003；Yee、米国特許出願公開第２００６／０２６９９７３号；Yee and Li、ＰＣＩ特許出願公開番号国際公開第２００９／０４５３０８Ａ２号；Gruenberg et al.、米国特許出願公開第２００３／０１７０２３８号：Rosenberg、米国特許第４，６９０，９１５号：並びにAlajez et al., Blood 105:4583-89, 2005。
[00260] ＮＫ細胞又はＮＫ ＣＡＲ細胞の治療的使用への関心が増してきたため、これらの細胞型は、EBioMedicine 39:1-2, 2019に記載されるように、多様な血液及び固形腫瘍について試験が行われている。
[00261] Ｂリンパ球は、近年、血友病などのタンパク質欠損障害及び他の免疫療法を含む多様な適用のための治療用タンパク質の送達の目的で、操作Ｂ細胞のような使用について報告されている。
[00262] 一部の実施形態では、細胞は、本明細書に記載の活性化方法で使用されるように、まずその培地からそれらを採取し、次に洗浄した後、細胞を培地中において且つ治療有効量での投与（「薬学的に許容される」アーナ）に好適な容器システム中に濃縮することにより製剤化される。好適なインフュージョン培地は、任意の等張培地製剤、典型的には通常の塩水、Normosoi R（Abbott）又はPlasma-Lyte A（Baxter）であり得るが、５％デキストロース水溶液又は乳酸リンゲル液も使用することができる。インフュージョン培地にヒト血清アルブミンを補充することができる。
[00263] 一部の実施形態では、組成物中の細胞の数は、少なくとも１０９個又は少なくとも１０１０個であり、一部の実施形態では、単一用量は、少なくとも１千万個、１億個、１０億個又は１００億個を含み得る。投与される細胞の数は、適応症特異的、患者特異的（例えば、患者のサイズ）であり、また投与される細胞の純度及び表現型によっても変動し得る。細胞の数は、それに含まれる細胞の型同様、組成物が意図される最終用途に応じて変動し得る。例えば、特定の抗原に特異的な細胞が望まれる場合、その集団は、７０％を超える、一般に８０％、８５％及び９０〜９５％を超える細胞を含有することになる。本明細書に記載の使用の場合、細胞は、一般に１リットル以下であり、５００ｍＬ以下であり得、さらに２５０ｍＬ又は１００ｍＬ以下であり得る。従って、所望の細胞の密度は、１０６細胞／ｍｉ超、１０７細胞／ｍｉ超又は１０８細胞／ｍｉ超であり得る。免疫細胞の臨床的に関連する数は、１０９、１０１０又は１０１１細胞と累積的に同等以上である複数の注入に配分することができる。
[00264] 一部の実施形態では、本明細書に記載されるＴリンパ球又は本明細書に記載の方法に従って作製されるＴリンパ球を用いて、腫瘍又は癌細胞に対する免疫を個体に付与することができる。「免疫」とは、リンパ球が活性化された抗原に対して、癌細胞又は腫瘍に関連する１つ又は複数の身体的症状の軽減を意味する。これらの細胞は、注入により投与され得るが、各注入は、少なくとも１０６〜１０１０細胞／ｍ２の範囲、例えば少なくとも１０７〜１０９細胞／ｍ２の範囲である。細胞は、単回注入又は特定の時間にわたる複数回注入によって投与され得る。しかし、個体によって応答性は変わり得ると予想されることから、注入される細胞の種類及び量並びに注入の回数及び複数回注入が行われる時間の範囲は、担当医によって決定され、検査により決定することができる。
[00265] 細胞を患者に戻した後、これらの方法を使用して、ＩＬ−２１及びＩＬ−２を含み得るサイトカインで患者を処置することにより、それらの生存能力を維持することができる（Bear et al., Cancer Immunol. lmmunother.50＼2.69-74, 2001；及びSchultze et al, Br. J. Haematol. 113:455-60, 2001）。別の実施形態では、患者への投与前にＩＬ−２１の存在下で細胞を培養する。例えば、Yee、米国特許出願公開第２００６／０２６９９７３号を参照されたい。ＩＬ−２１は、活性化Ｔ細胞を含む集団中のＴ細胞存在比率を、それ以上抗原特異的Ｔ細胞を濃縮することなく、拡大及び養子移入のために十分高いレベルまで増加することができる。従って、こうしたステップは、治療法までの時間をさらに短くし、及び／又は選択及び／又はクローニングの必要性をなくすことができる。
キット
[00266] 抗原提示共有結合官能基化領域を含む表面を有するウェルプレートを作製するためのキット。抗原提示共有結合官能基化領域を有する表面を含むウェルプレートを作製するためのキットは、ビオチン提示共有結合官能基化領域を含む表面を有するウェルプレート；及びストレプトアビジンを含む表面官能基化試薬を含む。一部の実施形態では、ビオチン提示共有結合官能基化領域を含む表面を含むウェルプレートは、本明細書に記載されるビオチン提示共有結合官能基化領域を含む表面を有する任意のウェルプレートであり得、任意の特徴の組合せを有する。
[00266] 抗原提示共有結合官能基化領域を含む表面を有するウェルプレートを作製するためのキット。抗原提示共有結合官能基化領域を有する表面を含むウェルプレートを作製するためのキットは、ビオチン提示共有結合官能基化領域を含む表面を有するウェルプレート；及びストレプトアビジンを含む表面官能基化試薬を含む。一部の実施形態では、ビオチン提示共有結合官能基化領域を含む表面を含むウェルプレートは、本明細書に記載されるビオチン提示共有結合官能基化領域を含む表面を有する任意のウェルプレートであり得、任意の特徴の組合せを有する。
[00267] 一部の実施形態では、キットは、Ｔ細胞のＴ細胞受容体に結合するように構成された複数の主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子（例えば、クラスＩ又はクラスＩＩ）を含む第１活性化試薬をさらに含み、さらに、ＭＨＣ分子は、ストレプトアビジンの結合部位に結合するように構成される。一部の実施形態では、複数のＭＨＣ分子の各々は、少なくとも１つのビオチン官能基をさらに含み得る。
[00268] 一部の実施形態では、キットは、ストレプトアビジンの結合部位に結合するようにそれぞれ構成された共活性化分子を含む試薬をさらに含み得、共活性化分子の各々は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）共活性化分子又は補助ＴＣＲ活性化分子であり得る。一部の実施形態では、複数の共活性化分子は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）共活性化分子及び補助ＴＣＲ活性化分子を含み得る。一部の実施形態では、共活性化分子を含む試薬を含む容器は、約２０：１から約１：２０のＴＣＲ共活性化分子と補助ＴＣＲ活性化分子との比を含み得る。一部の実施形態では、ＴＣＲ共活性化分子は、ＣＤ２８受容体のアゴニストであり得る。一部の実施形態では、補助ＴＣＲ活性化分子は、ＣＤ２受容体のアゴニストである。
[00269] 一部の実施形態では、キットは、アジド部分と反応するように構成された反応性部分に連結した表面遮断部分を含む表面遮断試薬をさらに含み得る。一部の実施形態では、表面遮断部分は、親水性又は負荷電部分を含み得る。一部の実施形態では、表面遮断試薬は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分を含み得る。
[00270] 一部の実施形態では、キットは、成長刺激分子を含む試薬をさらに含み得、各成長刺激部分は、成長因子受容体リガンドを含む。一部の実施形態では、成長因子受容体リガンドは、ＩＬ−２１又はその断片を含み得る。一部の実施形態では、キットは、ＩＬ−７又はＩＬ−２を含む第２成長刺激分子をさらに含み得る。
[00271] ウェルプレートを作製するためのキット。他の変形形態では、抗原提示共有結合官能基化領域を有する表面を含むウェルプレートを作製するためのキットは、アジド提示共有結合官能基化領域を含む表面と；第１表面官能基化試薬とを含むウェルプレートを含む。一部の実施形態では、アジド提示共有結合官能基化領域を有する表面を含むウェルプレートは、本明細書に記載されるいずれかと同様にアジド提示共有結合官能基化領域を有する表面を含む任意のウェルプレートであり得る。
[00272] 一部の実施形態では、第１表面官能基化試薬は、反応性基に連結したビオチン部分を含む試薬を含み得、反応性基は、表面のアジド部分と反応するように構成される。一部の実施形態では、キットは、ストレプトアビジンを含む第２表面官能基化試薬をさらに含み得、これは、ビオチン部分と結合するように構成される。
[00273] 一部の実施形態では、第１表面官能基化試薬は、反応性部分に連結したストレプトアビジン部分を含み、反応性基は、アジド部分と反応するように構成される。
[00274] 一部の実施形態では、キットは、アジド部分と反応するように構成された反応性基に連結した表面遮断部分を含む表面遮断試薬をさらに含み得る。一部の実施形態では、表面遮断部分は、親水性又は負荷電部分を含み得る。一部の実施形態では、表面遮断試薬は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分を含み得る。
[00275] 一部の実施形態では、キットは、Ｔ細胞のＴ細胞受容体に結合するように構成された複数の主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子（例えば、クラスＩ又はクラスＩＩ）を含む第１活性化試薬をさらに含み、さらに、ＭＨＣ分子は、ストレプトアビジンの結合部位に結合するように構成される。一部の実施形態では、複数のＭＨＣ分子の各々は、少なくとも１つのビオチン官能基をさらに含み得る。
[00276] 一部の実施形態では、キットは、ストレプトアビジンの結合部位に結合するようにそれぞれ構成された共活性化分子を含む試薬をさらに含み得、共活性化分子の各々は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）共活性化分子又は補助ＴＣＲ活性化分子であり得る。一部の実施形態では、複数の共活性化分子は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）共活性化分子及び補助ＴＣＲ活性化分子を含み得る。一部の実施形態では、共活性化分子を含む試薬を含む容器は、約２０：１から約１：２０のＴＣＲ共活性化分子と補助ＴＣＲ活性化分子との比を含み得る。一部の実施形態では、ＴＣＲ活性化分子は、ＣＤ２８受容体のアゴニストであり得る。一部の実施形態では、補助ＴＣＲ活性化分子は、ＣＤ２受容体のアゴニストである。
[00277] 一部の実施形態では、キットは、成長刺激分子を含む試薬をさらに含み得、各成長刺激部分は、成長因子受容体リガンドを含む。一部の実施形態では、成長因子受容体リガンドは、ＩＬ−２１又はその断片を含み得る。一部の実施形態では、キットは、ＩＬ−７又はＩＬ−２を含む第２成長刺激分子をさらに含み得る。
[00278] ウェルプレートを作製するためのキット。Ｔリンパ球（Ｔ細胞）の抗原特異的活性化のための抗原提示共有結合官能基化領域を有する表面を含むウェルプレートを作製するためのキットは、ストレプトアビジン提示共有結合官能基化領域を有する表面を含むウェルプレートと；Ｔ細胞のＴ細胞受容体と結合するように構成される複数の主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子（例えば、クラスＩ又はクラスＩＩ）を含む第１活性化試薬とを含み、さらに、ＭＨＣ分子は、ストレプトアビジンの結合部位に結合するように構成される。一部の実施形態では、ストレプトアビジン提示共有結合官能基化領域を有する表面を含むウェルプレートは、本明細書に記載されるストレプトアビジン提示共有結合官能基化領域を有する表面を含む任意のウェルプレートと同様であり得、任意の特徴の組合せを有し得る。
[00279] 一部の実施形態では、複数のＭＨＣ分子の各々は、少なくとも１つのビオチン官能基を含み得る。
[00280] 一部の実施形態では、キットは、ストレプトアビジンの結合部位に結合するように構成された結合部位をそれぞれ有する複数の共活性化分子を含む試薬をさらに含み得、共活性化分子の各々は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）共活性化分子又は補助ＴＣＲ活性化分子を含む。
[00281] 一部の実施形態では、キットは、ストレプトアビジンの結合部位に結合するようにそれぞれ構成された共活性化分子を含む試薬をさらに含み得、共活性化分子の各々は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）共活性化分子又は補助ＴＣＲ活性化分子を含む。一部の実施形態では、複数の共活性化分子は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）共活性化分子及び補助ＴＣＲ活性化分子を含む。一部の実施形態では、共活性化分子を含む試薬を含む容器は、約２０：１から約１：２０のＴＣＲ共活性化分子と補助ＴＣＲ活性化分子との比を含み得る。一部の実施形態では、ＴＣＲ共活性化分子は、ＣＤ２８受容体のアゴニストであり得る。一部の実施形態では、補助ＴＣＲ活性化分子は、ＣＤ２受容体のアゴニストである。
[00282] 一部の実施形態では、キットは、アジド部分と反応するように構成された反応性基に連結した表面遮断部分を含む表面遮断試薬をさらに含み得る。一部の実施形態では、表面遮断部分は、親水性又は負荷電部分を含み得る。一部の実施形態では、表面遮断試薬は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分を含み得る。
[00283] 一部の実施形態では、キットは、成長刺激分子を含む試薬をさらに含み得、各成長刺激部分は、成長因子受容体リガンドを含む。一部の実施形態では、成長因子受容体リガンドは、ＩＬ−２１又はその断片を含み得る。一部の実施形態では、キットは、ＩＬ−７又はＩＬ−２を含む第２成長刺激分子をさらに含み得る。
実施例
[00284] 実験１．ウェルプレートの作製。ポリスチレンウェルプレート（Falcon 96 Well Round Bottom、Falcon 96 Well Flat Bottom、Falcon 6 Well Flat Bottom、Costar 96 Well V Bottom）を酸素プラズマクリーナ（Nordson March AP-300）内に配置し、５０ｍＴｏｒｒまで排気した後、１９０ｍＴｏｒｒの圧力まで４４０ｓｓｃｍにおいて酸素でパージした。プレートを１００Ｗプラズマで６０秒間処理した。
[00284] 実験１．ウェルプレートの作製。ポリスチレンウェルプレート（Falcon 96 Well Round Bottom、Falcon 96 Well Flat Bottom、Falcon 6 Well Flat Bottom、Costar 96 Well V Bottom）を酸素プラズマクリーナ（Nordson March AP-300）内に配置し、５０ｍＴｏｒｒまで排気した後、１９０ｍＴｏｒｒの圧力まで４４０ｓｓｃｍにおいて酸素でパージした。プレートを１００Ｗプラズマで６０秒間処理した。
[00285] 実験２．プレートの化学蒸着（ＣＶＤ）。７−アジドヘプチル−トリメトキシシランを自社で合成した。３つの２０ｍＬアルミニウムパンに３００ｍｇのシランを充填し、３つを３３３ｍｇのＭｇＳＯ４（Ｈ２Ｏ）７で充填した。各試薬の１つのパンを真空オーブン内の３つの棚の各々に配置した。ウェルプレート及びウィットネスサンプルを各棚に配置した。オーブンを密閉し、２５０ｍＴｏｒｒまで排気した。温度を７５℃まで上昇させてから、ＣＶＤを一晩（約１８時間）進行させた。ＣＶＤ工程後、オーブンをパージし、ウェルプレート及びウィットネスサンプルを取り出した。
[00286] 実験３．ジベンジルシクロオクチニル（ＤＢＣＯ）−ポリエチレングリコール１３（ＰＥＧ１３）−ストレプトアビジン（ＳＡＶ）を用いたアジド修飾ウェルプレートの処理により、官能基化の限定領域を有する官能基化ウェルプレートを取得した。５μＭ溶液のＤＢＣＯ−ＰＥＧ１３−ＳＡＶは、２０１８年７月２０日に出願されたＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１８／０４３１４６号（この開示内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載の通りに合成した。ＤＢＣＯ−ＰＥＧ１３−ＳＡＶは、ストレプトアビジンに共有結合されたポリエチレングリコールリンカー（１３ＰＥＧ単位）を介して連結したジベンゾシクロオクチニルカップリング部分を有するカッパーレス（copper-less）クリック試薬であり、ＰＢＳ／０．０２％アジ化ナトリウム中で調製して、図１Ｂに概略を示すように、ウェルプレートに共有結合されたＳＡＶを取得した。ＤＢＣＯ−ＰＥＧ１３−ＳＡＶ溶液は、２５０ｎＬから５０ｕＬの範囲の量でウェルに添加し、各ウェルの側壁とは接触せずに、ウェルの底部のみと接触するようにした。３０分のインキュベーション後、２００ｕＬ ＰＢＳ／アジドでウェルを２回洗浄した後、吸引した。続いて、ＰＢＳ／アジド中の１．５ｍＭ ＤＢＣＯ−ＰＥＧ ５Ｋ（Creative PEGWorks、カタログ番号ＰＬＳ−９９７９）の溶液をウェルに添加して、これらのウェルを完全に満たした。ＤＢＣＯ−ＰＥＧ−５ｋ表面遮断試薬、即ち分子量５０００Ｄａのポリエチレングリコール表面遮断リガンドを含有するカッパーレスクリック試薬は、ウェル底部のストレプトアビジン修飾領域の外側（及びその周囲）に存在した残りのアジド官能基と反応した。
[00287] 実験４．リンパ球活性化共有結合官能基化ウェルプレートを用いた活性化Ｔ細胞の作製
[00288] ウェルプレートの作製：様々な比の一次及び共活性化リガンドを有するウェルプレートのウェルを備えた共有結合官能基化ウェルプレートをＴ細胞の活性化のために作製した。ストレプトアビジン官能基化プレートは、実験５の記載と同様に作製したが、領域を大幅に制限することなく、各ウェルの底部にビオチン−ストレプトアビジン官能基化を適用した（即ち、官能基化の面積は、ウェルの底部表面のほぼ全面積に及んだ）点が異なる。
[00288] ウェルプレートの作製：様々な比の一次及び共活性化リガンドを有するウェルプレートのウェルを備えた共有結合官能基化ウェルプレートをＴ細胞の活性化のために作製した。ストレプトアビジン官能基化プレートは、実験５の記載と同様に作製したが、領域を大幅に制限することなく、各ウェルの底部にビオチン−ストレプトアビジン官能基化を適用した（即ち、官能基化の面積は、ウェルの底部表面のほぼ全面積に及んだ）点が異なる。
活性化リガンド官能基化：ビオチン共役抗ＣＤ３（一次刺激）、抗ＣＤ２８及び抗ＣＤ２（共刺激）抗体の保存溶液を１００ｕｇ／ｍＬで調製し、ＰＢＳ中に様々な比で混合した（図３Ａ）。最終合計抗体濃度は、５０ｕｇ／ｍＬであった。５０ｕＬの各活性化リガンド溶液を個別のウェルに添加し、室温で３０分間結合させた。次に、マイクロプレートウェルをＰＢＳで１回洗浄した後、Ｔ細胞を刺激するために使用するまで４℃で保持した。
[00290] 刺激のためのＴ細胞の作製：市販のヒトＴ細胞濃縮キット（EasySep（商標）, StemCell Technologies、カタログ番号１９０５１）を用いて、ＣＤ３＋Ｔ細胞をＰＢＭＣから濃縮した。活性化プレートの各ウェルに、１０％ヒトＡＢ血清（Corning（商標）, Fisherカタログ番号ＭＴ３５０６０ＣＩ）、２ｍＭ GlutaMAX（商標）（Thermo Fisher、カタログ番号３５０５００６１）、５０ｕＭ ２−メルカプトエタノール（Thermo Fisher、カタログ番号３１３５００１０）、２５ｎｇ／ｍＬのＩＬ−７及び１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−１５（R&D Systems、カタログ番号２０７−ＩＬ／ＣＦ；２４７−ＩＬＢ−００５）を添加した２００ｕＬのＴ細胞培地（Advanced RPMI 1640（Gibco（商標）, Thermo Fisher、カタログ番号１２−６３３−０１２）中で２００，０００ＣＤ３＋Ｔ細胞を平板培養した。Ｔ細胞を１：１比の抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８でコーティングしたビーズ（Thermo Fisher、カタログ番号１１１６１Ｄ）で活性化した対照条件（条件１２）を加えた。細胞を４日間培養し、その時点で、各ウェルからの５０ｕＬの細胞を新しい未処理丸底９６ウェルマイクロプレート（Corning、カタログ番号３８７９）に移し、１５０ｕＬの新鮮なＴ細胞培地を添加した。また、４日目に、各ウェルからの５０ｕＬのサンプルを回収して、各ウェル中のＴ細胞の数を測定した。７日目に、１００ｕＬの細胞を各ウェルから取り出し、１００ｕＬのＴ細胞培地と取り換えた。１０日目に、細胞がインタクトなままの１００ｕＬの培地を各ウェルから取り出し、１００ｕＬのＴ細胞培地と取り換えた。１１日目に、各ウェルから２００ｕＬのサンプルを回収して、各ウェル中のＴ細胞の数を測定し、Ｔ細胞上のＣＤ２８及び抗ＣＤ２７の表面発現を評価した。図３Ｂ、３Ｃ及び３Ｄに示すように（平均値及び範囲を記載する）、一次刺激リガンド（ＣＤ３）と共刺激リガンドとの比を変更することにより、４日目（図３Ｂ）及び１１日目（図３Ｃ）の効果的なＴ細胞拡大並びにＣＤ２７及びＣＤ２８の共発現（図３Ｄ）をもたらすことができる。この実験は、官能基化ウェルプレートのウェルに結合した活性化分子リガンドに応じて、リンパ球活性化が達成され得ること並びにＣＤ３／ＣＤ２８標識ビーズ（図３Ａの条件１２）を用いて観察されたものと比較して類似レベルの活性化及び拡大を達成し得ることを立証するものである。
[00291] 実験５．ストレプトアビジン提示共有結合官能基化ウェルの作製。図１Ｂに示すように、ＤＢＣＯ−ＰＥＧ４−ビオチン／ＤＢＣＯ−ＰＥＧ５−酸を用いたアジド修飾ウェルプレート（実験１及び２で作製した通り）の処理を実施した。１０％ＤＢＣＯ−ＰＥＧ４−ビオチン（Broadpharm、カタログ番号ＢＰ−２２２９５）溶液、例えばビオチンと共有結合されたポリエチレングリコールリンカー（４ＰＥＧ単位）を介して連結したカッパーレスクリックジベンゾシクロオクチニルカップリング部分を０．２ｍＭビオチン含有クリック試薬溶液として調製したが、これは、１．８ｍＭ ＤＢＣＯ−ＰＥＧ５−酸（Broadpharm、カタログ番号ＢＰ−２４９５６）、カルボン酸部分と共有結合されたポリエチレングリコールリンカー（５ＰＥＧ単位）を介して連結したカッパーレスクリックジベンゾシクロオクチニルカップリング部分もさらに含有し、ＰＢＳ／０．０２％アジ化ナトリウム中に調製された。ＰＥＧ５−酸クリック試薬は、表面遮断リガンドとして機能した。他の比を用いて、ウェル底部に導入されるビオチン部分の密度を変動させ得る。この溶液を、２５０ｎＬから５０μＬの範囲の量でウェルに添加し、それによりウェル底部のそれぞれより大きい領域に共有結合ビオチン部分が得られた。３０分のインキュベーション後、ウェルを２００ｕＬのＰＢＳ／アジドで２回洗浄してから、吸引した。ストレプトアビジンの２マイクロモル溶液を調製し、ウェルに添加した。図１Ａに示すように、ストレプトアビジンをビオチンに非共有結合させ、ビオチンは、それ自体、ウェルの表面に共有結合された。ビオチンを含有するクリック試薬の様々な量を使用して、ストレプトアビジンを含有する異なるサイズの領域が得られた。１５分のインキュベーション後、ＰＢＳ／アジド中１．５ｍＭ ＤＢＣＯ−ＰＥＧ ５Ｋ（Broadpharm、カタログ番号ＢＰ−２２４６１）の溶液をウェルに添加し、ウェルを満たした後、各ウェル内（即ちストレプトアビジンとＰＥＧ５−カルボン酸部分との組合せにより修飾される領域の外側）に依然として存在する残留アジド反応性部分と反応させた。
[00292] 実験６．領域限定抗原提示Ｔリンパ球活性化ウェルプレートの作製。実験１及び２に記載のように、化学蒸着を用いて、標準的ポリスチレン組織培養マイクロプレート（Corning）をプラズマ処理及び官能基化して、アジドを提示させた。自動液体操作ロボット（OpenTrons）を用いて、官能基化９６ウェル丸底マイクロプレートの中央に、ＰＢＳ中２マイクロモルのＤＢＣＯ共役ストレプトアビジン（図１Ｂのように、表面に共有結合されたＳＡＶ）の１ｕＬ液滴を配分し、ウェルの底部に直径約１ｍｍのストレプトアビジン官能基化領域を形成した。ウェルの壁にはストレプトアビジンを導入しなかった。スポッティングした液滴をBiosafety Cabinet内のマイクロプレート表面上で乾燥させた。残ったアジド基を不動態化するために、ウェルをＤＢＣＯ−ＰＥＧ３０００の１．５ｍＭ溶液で充填し、それによりウェル内（即ちウェル底部上のストレプトアビジン修飾領域の外側）の表面の残り部分にＰＥＧ３０００表面遮断リガンドを導入した。この溶液を室温で１５分間ウェルに適用した。次に、ウェルをＰＢＳで１回すすいで、未反応のＤＢＣＯ−ＰＥＧ３，０００を除去した。
[00293] Ｔ細胞活性化リガンドを表面に結合するために、ビオチン共役ペプチド−ＨＬＡ（一次刺激）、抗ＣＤ２８抗体及び抗ＣＤ２抗体（共刺激）の混合物をバッファー（２ｍＭ ＥＤＴＡ及び０．５％ウシ血清アルブミンを含むＰＢＳ）中に様々な濃度で混合した。ペプチド−ＨＬＡの場合、４つの３倍段階希釈物を調製して、マイクロプレートに添加した。抗ＣＤ２８及び抗ＣＤ２抗体について、４つの９倍段階希釈物を調製した。（図４Ａを参照されたい）。この実験の場合、抗ＣＤ２８：抗ＣＤ２の比は、１：１であったが、Ｔ細胞を刺激するために、それ以外の比も好適に使用され得る。図４Ａに示すように、ペプチド−ＨＬＡ及び抗体の段階希釈物をさらに１６チューブのバッファー中に希釈して、ペプチド−ＨＬＡの最終濃度が、７．５ｕｇ／ｍＬから０．２８ｕｇ／ｍＬの範囲であり、共刺激抗体の最終濃度が、１５ｕｇ／ｍＬから０．０２ｕｇ／ｍＬ（総抗体濃度）まで変動するようにした。４０ｕＬの各活性化リガンド溶液を６ウェルに添加し、室温で３０分間結合させた。マイクロプレートウェルをＰＢＳで１回洗浄した後、Ｔ細胞を刺激するために使用するまで４℃で保持した。
[00294] マイクロプレートでＴ細胞を活性化するために、市販のＣＤ８＋Ｔ細胞単離キット（StemCell Technologies）を用いて、ＣＤ８＋Ｔ細胞をＰＢＭＣから濃縮した。活性化プレートの各ウェルに、ＣＤ８＋Ｔ細胞について濃縮した２００，０００細胞を、３０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−２１（R&D Systems）を含む２００ｕＬのＴ細胞培地（１０％ヒトＡＢ血清（Corning）、２ｍＭ GlutaMAX（ThermoFisher）、５０ｕＭ ２−メルカプトエタノール（Thermo Fisher）を添加したAdvanced RPMI（Thermo Fisher））中で平板培養した。細胞をインキュベータ内で４８時間培養した後、１５０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−２１を含む５０ｕＬのＴ細胞培地を各ウェルに添加し、培養を続けた。５日後、５０ｕＬの培地を各ウェルから取り出し、前述のように作製した新しい活性化ウェルプレートに細胞を移した。１５０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−２１を含む５０ｕＬのＴ細胞培地を各ウェルに添加し、培養を続けた。翌日、５０ｕＬの培地を各ウェルから取り出し、１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−７と５０ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を含む５０ｕＬのＴ細胞培地を各ウェルに添加した。翌日、５０ｕＬの培地を再度各ウェルから取り出し、１５０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−２１を含む５０ｕＬのＴ細胞培地を各ウェルに添加した。培養を５日間継続し、この時点で、サンプルを各ウェルから回収して、各ウェル内の抗原特異的Ｔ細胞の数を決定し、抗原特異的Ｔ細胞上のＣＤ２８及びＣＤ１２７の表面発現を評価した。図４Ａ、４Ｂ及び４Ｃに示すように、有効な抗原特異的活性化（図４Ａ）、ＣＤ１２７発現（図４Ｂ）及びＣＤ２８発現（図４Ｃ）を取得するために、一次刺激リガンド（ＭＨＣ）と共刺激リガンドとの比を変更することができる。
[00295] 実験７．ウェルの底部表面に抗原提示共有結合官能基化表面を有するウェル内のＴリンパ球の抗原特異的活性化。９６ウェル、丸底、組織培養処理マイクロプレート（Corning）を実験１及び２のように官能基化して、各ウェルの底部表面に、アジド提示共有結合官能基化表面を導入した。０．０５ｍＬの０．５ｍＭ硫酸銅、０．１ｍＭアスコルビン酸ナトリウム及び５ｍＭアルキン−ＰＥＧ４−ビオチンをウェルの底部に添加することにより、各ウェルの底部にビオチン提示共有結合官能基化表面を導入したが、これは、各ウェルの底部表面全体を官能基化した。
[00296] 残留アジドを不動態化し、且つウェルのビオチン官能基化領域を、付着させた官能基化混合物の初めにスポッティングした限定領域に制限するために、０．２ｍＬの不動態化溶液（ＰＢＳ中の５ｍＭ ＤＢＣＯ−ＰＥＧ４−カルボン酸）を各ウェルに添加した。この不動態化反応を室温で３０分間進行させた。不動態化溶液を除去し、ウェルを０．２ｍＬのＰＢＳで１回洗浄した後、進行させた。次に、ビオチン提示共有結合官能基化領域を有する各ウェルに０．０５ｍＬのＰＢＳ中０．２５ｍｇ／ｍＬストレプトアビジンを添加することにより、ストレプトアビジン提示共有結合官能基化領域を導入した。室温で３０分後、吸引によりストレプトアビジン溶液を除去し、ウェルを０．２ｍＬのＰＢＳで２回すすいだ。
[00297] ウェルの底部表面への抗原提示共有結合官能基化活性化領域の導入：ストレプトアビジン提示共有結合官能基化領域を有する各ウェルに、ＰＢＳ−ＢＳＡ中０．０５ｍＬの０．８３マイクログラム／ｍＬ ＭＡＲＴ１ ｐＨＬＡ（部位特異的ビオチン化用のＣ末端ＢｉｒＡタグを有する抗原ペプチドロード部位特異的ビオチン化モノマーＭＨＣ分子であり、ＭＨＣ分子は、ＭＨＣに事前ロードされたＭＡＲＴ１抗原ペプチドを含んだ）溶液を添加した。３０分後、吸引によりｐＨＬＡ混合物を除去してから、０．０５ｍＬの共刺激官能基化混合物を各ウェルに添加した。共刺激官能基化混合物は、２．５マイクログラム／ｍＬのビオチン化抗ＣＤ２８と２．５マイクログラム／ｍＬのビオチン化抗ＣＤ２とから構成された。室温で３０分後、共刺激官能基化混合物を吸引により除去した後、抗原提示共有結合官能基化領域を有するウェルを０．２ｍＬのＰＢＳ−ＢＳＡで２回すすいだ。これにより、各処理ウェルの底部にＴ細胞活性化領域が提供され、抗原提示リガンドと共刺激リガンド（抗ＣＤ２８、抗ＣＤ２）がＴ細胞活性化について提示された。
[00298] 続いて、活性化のための抗原提示領域を有する表面を含むウェル内での抗原特異的Ｔ細胞の拡大を合成抗原提示ビーズ（２０１８年７月２０日に出願されたＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１８／０４３１４６号（この開示内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載される通りに作製した）による拡大と比較した。EasySep（商標）Human CD8+ T Cell Isolation Kit（StemCell Technologies）を用いて、製造者の推奨手順に従い、末梢血単核細胞からＣＤ８＋Ｔ細胞を単離した。濃縮したＣＤ８＋Ｔ細胞を、３０ナノグラム／ｍＬのＩＬ−２１を含む増殖培地（R&D Systems）中に１ｅ６／ｍＬで再懸濁させた。増殖培地は、１０％ヒトＡＢ血清（Corning CellGro）と、GlutaMAX（Thermo Fisher）及び５０マイクロモルβ−メルカプトエタノール（Thermo Fisher）とを添加したAdvanced RPMI 1640 Medium（Thermo Fisher）から構成された。
[00299] 次に、抗原提示領域又は合成抗原提示ビーズを有するウェル内での刺激のために、ＣＤ８＋Ｔ細胞を２つのサンプルに分割した。ビーズ刺激のために、ＭＡＲＴ１特異的合成抗原提示ビーズを細胞に１：１比で添加した。標準９６ウェル丸底組織培養マイクロプレートの各ウェルに、２００，０００個の細胞を平板培養した。抗原提示共有結合官能基化領域刺激のために、前述のように作製したマイクロプレートのＭＡＲＴ１特異的抗原提示共有結合官能基化ウェルの１ウェル当たり２００，０００個の細胞を平板培養した。続いて、プレートを標準５％ＣＯ２、３７℃インキュベータ内で２日間インキュベートした。２日の培養後、ＩＬ−２１を１５０ナノグラム／ｍＬまで増殖培地中で希釈した。追加培養のために、培地で希釈した５０マイクロリットルのＩＬ−２１を各ウェルに添加し、プレートをインキュベータに戻した。
[00300] 計７日の培養後、ＭＡＲＴ１特異的合成抗原提示活性化ビーズ又はウェルの抗原提示共有結合官能基化領域で細胞を再刺激した。ビーズによる再刺激の場合、プレートの各ウェルから、０．０５の培地を除去した。ＩＬ−２１を新鮮な培地中に１５０ｎｇ／ｍＬまで希釈し、合成抗原提示活性化ビーズをＩＬ−２１／培地混合物に４ｅ６ビーズ／ｍＬの最終密度で添加した。５０マイクロリットルのこのＩＬ−２１／ビーズ／培地混合物を各ウェルに添加し、それによりさらに２ｅ５ビーズが各ウェルに添加された。
[00301] 抗原提示共有結合官能基化領域を含む表面を有するウェルにおける再刺激のために、５０マイクロリットルの培地をプレートの各ウェルから除去した。ウェル中の細胞を反復ピペット操作により再懸濁させ、残った量を、前述のように作製した抗原提示共有結合官能基化領域をその中に含むウェルを有する新しいウェルプレートに移した。ＩＬ−２１を新鮮な増殖培地中に１５０ｎｇ／ｍＬまで希釈し、５０マイクロリットルのこのＩＬ−２１／増殖培地混合物を、抗原提示共有結合官能基化領域を含む表面を有する新しいウェルプレートの各ウェルに添加した。
[00302] 翌日、両セットのウェルプレートをインキュベータから取り出し、５０マイクロリットルの培地を各ウェルから再度除去した。ＩＬ−２（R&D Systems）を新鮮な培地中に５０単位／ｍＬまで希釈した。ＩＬ−２を含有するこの培地に、ＩＬ−７（R&D Systems）を１２．５ｎｇ／ｍＬの最終濃度において添加した。５０マイクロリットルのこのＩＬ−２／ＩＬ−７／培地混合物を各ウェルに添加し、両セットのウェルプレートをインキュベータに戻した。
[00303] 翌日、両セットのウェルプレートをインキュベータから取り出し、５０マイクロリットルの培地を各ウェルから再度除去した。ＩＬ−２１を新鮮な培地中に１５０ナノグラム／ｍＬまで希釈した。５０マイクロリットルのこのＩＬ−２１／培地混合物を各ウェルに添加し、ウェルをインキュベータに戻した。
[00304] さらに５日間細胞を培養した後、抗原特異的Ｔ細胞拡大及びメモリー前駆体表面マーカ（ＣＤ２８及びＣＤ１２７）の発現について細胞を分析した。
[00305] 結果：合成抗原提示ビーズをロードしたウェル同様に、抗原提示共有結合官能基化活性化領域を含む表面を有するウェルは、抗原提示領域活性化のＦＡＣ結果５２０と比較して、ビーズに基づく活性化についてのＦＡＣ結果５１０により示される通り、概して、ＭＡＲＴ１特異的Ｔ細胞を拡大することができた（図５Ａ）。抗原提示共有結合官能基化領域を含むほぼ全てのウェルで、高い数の抗原特異的Ｔ細胞が得られ、抗原特異的Ｔ細胞の総数は、合成抗原提示ビーズから得られた細胞産物５３０と比較して、抗原提示領域により産生される細胞５４０について約２倍低かった（図５Ｂ）。しかし、メモリー前駆体表現型マーカＣＤ２８及びＣＤ１２７の発現を調べたところ、合成抗原提示ビーズの使用により産生された抗原特異的Ｔ細胞についてみられる発現（それぞれ図５Ｃの５５０（ＣＤ２８発現）及び図５Ｄの５７０（ＣＤ１２７発現））のレベルと比較して、抗原提示活性化領域を有するウェルを用いて産生された抗原特異的Ｔ細胞でのこれらのマーカの発現（それぞれ図５Ｃの５６０（ＣＤ２８発現）及び図５Ｄの５８０（ＣＤ１２７の発現））の減少が観察された。これは、抗原提示活性化領域を有するウェルが、抗原特異的Ｔ細胞の拡大を支持することができると同時に、これらの細胞は、合成抗原提示ビーズを用いて拡大させた細胞よりも分化していることを示唆するものであった。これらの結果はさらに、合成抗原提示活性化領域を有するウェル中での刺激の面積の制限が、抗原特異的Ｔ細胞刺激などの一部の細胞活性化について有利となり得ることも示唆した。
[00306] 実験８．共有結合官能基化領域のサイズ制御。標準的組織培養マイクロプレートの底部表面上の様々な面積のＴ細胞抗原を特異的に活性化するために、リンパ球活性化領域（この場合、抗原提示共有結合官能基化領域を含むウェルを有するウェルプレートを作製するために、最初に、標準９６ウェル丸底組織培養マイクロプレート（Corning）を実験１及び２に記載の通り、７−アジドヘプチルトリメチルシランで官能基化した。次に、０．５ｍＭ硫酸銅、０．１ｍＭアスコルビン酸ナトリウム及び５ｍＭアルキン−ＰＥＧ４−ビオチンからなるマイクロプレート官能基化混合物を水中に調製した。自動液体操作ロボット（OpenTrons）を用いて、コーティングされたマイクロプレートのウェルの中心に、官能基化混合物の０．２５、０．５、１、２、４及び８マイクロリットルの液滴を配分した。マイクロプレートを室温で４５分保持して、アルキンビオチンをマイクロプレートと反応させた。残留アジドを不動態化させ、且つウェルのビオチン官能基化領域を、付着させた官能基化混合物の初めにスポッティングした限定領域に制限するために、０．２ｍＬの不動態化溶液（ＰＢＳ中の５ｍＭ ＤＢＣＯ−ＰＥＧ４−カルボン酸）を各ウェルに添加した。この不動態化反応を室温で３０分間進行させた。不動態化溶液を除去し、ウェルを０．２ｍＬのＰＢＳで１回洗浄した後、進行させた。
[00307] ウェル底部に形成されたビオチン提示共有結合官能基化領域のそれぞれの面積を測定するために、ＰＢＳ中のAlexa Fluor 488（ThermoFisherカタログ番号Ｓ１１２２３）に共役した０．０１ｍｇ／ｍＬストレプトアビジン０．０５ｍＬで、ウェルを室温で３０分染色した。ストレプトアビジン染色溶液を洗い流し、較正用スライドで較正しておいた倒立蛍光顕微鏡（EVOS, ThermoFisher）でスポットを撮像した。次に、いくつかの方向に沿ってパッチの画像全体にImageJで線を引き、それらの長さを平均することにより、得られた円形スポットの面積を測定した。続いて、円の半径をその面積と関係させる式を用いて、スポットの面積を算出した。
[00308] 結果。官能基化混合物の量を増加することにより、得られる官能基化領域のサイズが概して増加した（図６Ａ）。官能基化液滴体積と官能基化面積との関係を定量するために、０．２５、０．５、１又は２マイクロリットルの液滴の蛍光スポット面積を測定した。続いて、液滴体積に対するスポット面積の線形当てはめを計算した（図６Ｂ）。次に、この当てはめを使用して、４マイクロリットル及び８マイクロリットルの液滴を用いて作製した官能基化領域について面積を推定した。共有結合官能基化領域の各々についてこれらの直接測定した面積及び間接的に測定した面積を次の実施例に使用した。
[00309] 実験９．ウェルの底部表面の中央領域に制限された、活性化のための限定領域を有するストレプトアビジン官能基化ウェルプレートの作製。実験１及び２に記載の通りに、標準的な９６ウェル丸底組織培養マイクロプレート（Corning）をまずＣＶＤにより７−アジドヘプチルトリメチルシランでコーティングした。次に、０．５ｍＭ硫酸銅、０．１ｍＭアスコルビン酸ナトリウム及び５ｍＭアルキン−ＰＥＧ４−ビオチン（Click Chemistry Tools、カタログ番号ＴＡＴ１０５−１００）からなるマイクロプレート官能基化混合物を水中に調製した。自動液体操作ロボット（OpenTrons）を用いて、コーティング済マイクロプレートのウェルの中央に、マイクロプレート官能基化混合物の１．００マイクロリットルの液滴を配分した。これにより、実験８の結果に基づき、各ウェルの底部に約２ｍｍ径のスポットが形成された。図６Ｂ。マイクロプレートを室温で４５分保持して、アルキン−ＰＥＧ４−ビオチン試薬のアルキン官能基をマイクロプレートと反応させた。残留アジドを不動態化させ、且つウェルのビオチン官能基化領域を初期の約２ｍｍ径スポットに制限するために、０．２ｍＬの不動態化溶液（ＰＢＳ中の５ｍＭ ＤＢＣＯ−ＰＥＧ４−カルボン酸（Sigma Aldrich、カタログ番号７５９９０２−５ｍｇ））を各ウェルに添加した。この不動態化反応を室温で３０分間進行させた。不動態化溶液を除去し、ウェルを０．２ｍＬのＰＢＳで２回洗浄した後、進行させた。
[00310] ビオチン共役ペプチド−ＨＬＡ（ｐＨＬＡ、一次刺激）及び共刺激抗体の結合のためのウェルを作製するために、０．０５ｍＬの０．２５ｍｇ／ｍＬストレプトアビジンを各ウェルに添加し、室温で３０分インキュベートした。各ウェルを０．２ｍＬのＰＢＳで２回洗浄することにより、余剰のストレプトアビジンを除去した。
[00311] 実験１０．Ｔ細胞活性化種による領域限定ストレプトアビジン提示ウェルプレートの官能基化。各ウェルのストレプトアビジン提示官能基化スポット上にｐＨＬＡ（部位特異的ビオチン化のためのＣ末端ＢｉｒＡタグを有し、ＭＨＣにプレロードしたＭＡＲＴ１抗原ペプチドを有する抗原ペプチドロード部位特異的ビオチン化モノマーＭＨＣ分子）をロードするために、０．０５ｍＬの、０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳ中０．８３マイクログラム／ｍＬのビオチン化ｐＨＬＡ溶液を各ストレプトアビジン官能基化ウェルに添加した。室温で３０分後、ｐＨＬＡ溶液を除去し、０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳ中ビオチン化抗ＣＤ２８抗体（Biolegend、カタログ番号３０２９０４、２．５マイクログラム／ｍＬ）とビオチン化抗ＣＤ２抗体（Biolegend、カタログ番号２３００２０４０、２．５マイクログラム／ｍＬ）とを各ウェルに添加した。３０分後、各ウェルを０．２ｍＬのＰＢＳ−ＢＳＡで２回洗浄することにより、官能基化試薬を除去した。処理したウェルは、初めにスポッティングした面積に限定される抗原提示共有結合官能基化活性化領域をそれぞれ含んだ。Ｔ細胞を刺激した同じ日に官能基化マイクロプレートを作製し、細胞を平板培養するまで４℃で貯蔵した。
[00312] 実験１１．標準ウェルプレート内の合成抗原提示活性化ビーズの存在下での刺激及び拡大と比較した、限定活性化領域を有する官能基化ウェルプレートのウェル内でのＴ細胞抗原特異的刺激及び拡大。EasySep（商標）Human CD8+ T Cell Isolation Kit（StemCell Technologies）を用いて、製造者の推奨手順に従い、末梢血単核細胞からＣＤ８＋Ｔ細胞を単離した。濃縮したＣＤ８＋Ｔ細胞を、３０ナノグラム／ｍＬのＩＬ−２１（R&D Systems）を含む増殖培地中に１ｅ６／ｍＬで再懸濁させた。増殖培地は、１０％ヒトＡＢ血清（Corning CellGro）と、GlutaMAX（Thermo Fisher）及び５０マイクロモルのβ−メルカプトエタノール（Thermo Fisher）を添加したAdvanced RPMI 1640 Medium（Thermo Fisher）から構成された。
[00313] 次に、標準ウェルプレート内又は実験１０の領域限定抗原提示活性化ウェルプレート内での抗原提示活性化ビーズによる刺激のために、ＣＤ８＋Ｔ細胞を２つのサンプルに分割した。抗原提示活性化ビーズ刺激のために、ＭＡＲＴ１抗原提示活性化ビーズ（２０１８年７月２０日に出願されたＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１８／０４３１４６号（この開示内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載の通りに作製）を細胞に１：１比で添加した。標準９６ウェル丸底組織培養マイクロプレートの各ウェルに、２００，０００個の細胞を平板培養した。領域限定抗原提示活性化ウェルプレート刺激のために、実験１０に記載のように作製した領域限定抗原提示活性化ウェルプレートの１ウェル当たり２００，０００個の細胞を平板培養した。続いて、プレートを標準５％ＣＯ２、３７℃インキュベータ内で２日間インキュベートした。２日の培養後、ＩＬ−２１を１５０ナノグラム／ｍＬまで増殖培地中で希釈した。培地で希釈した５０マイクロリットルのＩＬ−２１を各ウェルに添加し、さらに培養するためにプレートをインキュベータに戻した。
[00314] 計７日の培養後、細胞を再刺激した。抗原提示活性化ビーズによる再刺激の場合、プレートの各ウェルから、５０マイクロリットルの培地を除去した。ＩＬ−２１を新鮮な培地中で１５０ｎｇ／ｍＬまで希釈し、抗原提示活性化ビーズをＩＬ−２１／培地混合物に４ｅ６ビーズ／ｍＬの最終密度で添加した。５０マイクロリットルのこのＩＬ−２１／ビーズ／培地混合物を各ウェルに添加し、それによりさらに２ｅ５抗原提示活性化ビーズが各ウェルに添加された。
[00315] 領域限定抗原提示活性化ウェルプレートの再刺激のために、５０マイクロリットルの培地をプレートの各ウェルから除去した。ウェル中の細胞を反復ピペット操作により再懸濁させ、残った量（１ウェル当たり約０．２ｍＬ）を、新しく作製した領域限定抗原提示活性化ウェルプレート（実験９に記載のように作製）に移した。ＩＬ−２１を新鮮な増殖培地中で１５０ｎｇ／ｍＬまで希釈し、５０マイクロリットルのこのＩＬ−２１／増殖培地混合物を、新しく作製した領域限定抗原提示活性化ウェルプレートの各ウェルに添加した。
[00316] 翌日、プレートをインキュベータから取り出し、５０マイクロリットルの培地を各ウェルから再度除去した。ＩＬ−２（R&D Systems）を新鮮な培地中に５０単位／ｍＬまで希釈した。ＩＬ−２を含有するこの培地に、ＩＬ−７（R&D Systems）を１２．５ｎｇ／ｍＬの最終濃度において添加した。５０マイクロリットルのこのＩＬ−２／ＩＬ−７／培地混合物を両セットのウェルプレートの各ウェルに添加し、ウェルプレートをインキュベータに戻した。
[00317] 翌日、プレートをインキュベータから取り出し、５０マイクロリットルの培地を各ウェルから再度除去した。ＩＬ−２１を新鮮な培地中に１５０ナノグラム／ｍＬまで希釈した。５０マイクロリットルのこのＩＬ−２１／培地混合物を両方のウェルプレートの各ウェルに添加し、ウェルプレートをインキュベータに戻した。
[00318] さらに５日間細胞を培養した後、領域限定抗原提示活性化ウェルプレート及び抗原提示活性化ビーズウェルプレートの各セットからの細胞を、抗原特異的Ｔ細胞拡大及びメモリー前駆体表面マーカ（ＣＤ２８及びＣＤ１２７）の発現について分析した。
[00319] 特性決定。２ラウンドの刺激後に、抗原提示活性化ビーズ及び領域限定抗原提示活性化ウェルプレートの各ウェルから、５０マイクロリットルのサンプルを採取した。細胞を洗浄バッファー（ＰＢＳ＋２％ウシ胎仔血清＋５ｍＭ ＥＤＴＡ）で１回洗浄した。次に、ＣＤ４に対する抗体（Brilliant Violet（商標）510, BioLegendカタログ番号３００５４５）、ＣＤ８に対する抗体（PerCP-Cy5.5, BioLegend Cat No. 344709）、ＣＤ２８に対する抗体（FITC, BioLeendカタログ番号３０２９０６）、ＣＤ４５ＲＯに対する抗体（APC, BioLegendカタログ番号３０４２１０）、ＣＤ１２７に対する抗体（BV420, BioLegendカタログ番号３５１３０９）並びに抗原特異的Ｔ細胞をマークする４量体試薬（pMHC tetramer, PE）の混合物で細胞を染色した。細胞を室温の暗所で３０分染色した後、洗浄バッファーで１回洗浄した。続いて、１ウェル当たり０．０１ｍＬのCountBright（商標）Beads（ThermoFisherカタログ番号Ｃ３６９５０）を含む０．１５ｍＬの洗浄バッファー中に細胞を再懸濁させた。次に、High Throughput Sample（BD Biosciences）を含むFACSCelestaフローサイトメーター（Becton Dickinson and Co.）で細胞集団を分析した。サンプル中の総細胞数を、製造者の推奨プロトコルに従い、サンプル中で収集した細胞及びCountBrightビーズの数から計算した。フローサイトメトリーサンプルをFlowJo（FlowJo）で分析して、抗原特異的Ｔ細胞存在比率及びメモリー前駆体マーカ（ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ６２Ｌ及びＣＤ１２７）の発現を決定した。
[00320] フローサイトメトリーサンプルを、抗原特異的Ｔ細胞存在比率についてFlowJo（FlowJo）フローサイトメトリー分析で分析した。この分析から、領域限定抗原提示活性化ウェルプレートが、一貫して高い数の抗原特異的Ｔ細胞を生産したことがわかる（図６Ｂ）。フローサイトメトリー分析は、領域限定抗原提示活性化ウェルプレートが、抗原提示活性化ビーズを用いた活性化と比較して、同等数の抗原特異的Ｔ細胞を生産することを示した（図７Ａ）。図７Ｃは、抗原提示活性化ビーズを用いて１ウェル当たり産生された抗原陽性Ｔ細胞の数に対する、領域限定活性化ウェル中で１ウェル当たり産生された抗原陽性Ｔ細胞の数のグラフによる比較を示す。加えて、抗原特異的Ｔ細胞をＣＤ１２７の発現及び高レベルのＣＤ２８について分析したところ、領域限定抗原提示活性化ウェルプレートが、メモリー前駆体Ｔ細胞のこれらのマーカを発現した抗原特異的Ｔ細胞の同等以上の画分をもたらしたことを認めた（図７Ｄ）。従って、領域限定抗原提示活性化ウェルプレートでの刺激は、高度に生産性であり、優れたセントラルメモリー表現型（例えば、メモリー前駆体Ｔ細胞を示す）を有する活性化Ｔ細胞を産生し、及びそれは、合成抗原提示活性化ビーズを用いた活性化と均等である。
[00321] 実験１２．細胞産物収率及び表現型と抗原提示官能基化領域面積の比較。Ｔ細胞の活性化のための抗原提示共有結合官能基化領域を含むウェルを有するウェルプレートを作製し、その面積は、約１ｓｑｍｍから約２３ｓｑｍｍの範囲であった。図８Ａに示すように、以下の６つの異なるサイズの領域を作製した：１ｍｍ２；１．７ｍｍ２；３．３ｍｍ２；５．５ｍｍ２；１１．５ｍｍ２；及び２３ｍｍ２（図８Ａの各グラフ図上方のラベルが、領域のサイズを明示する）。共有結合官能基化領域のサイズは、実験８に記載のプロセスと同様に、異なる量の０．５ｍＭ硫酸銅、０．１ｍＭアスコルビン酸ナトリウム及び５ｍＭアルキン−ＰＥＧ４−ビオチンを、実験１及び２のように作製したアジド提示共有結合官能基化表面を有する丸底９６ウェルマイクロプレートのウェルに付着させることによって調節した。前述した（実験８及び９）通りの残留アジド部分の不動態化後、実験８及び９に前述した通り、ストレプトアビジンをビオチン提示共有結合官能基化領域に結合させた。一次活性化分子ｐＨＬＡ（部位特異的ビオチン化用のＣ末端ＢｉｒＡタグを有し、ＭＨＣにプレロードされたＭＡＲＴ１抗原ペプチドを有する、抗原ペプチドロード部位特異的ビオチン化モノマーＭＨＣ分子）と、共活性化分子（共刺激抗体ビオチン化抗ＣＤ２８及びビオチン化抗ＣＤ２）とを、ウェルの各々の底部表面上に、得られたストレプトアビジン提示共有結合官能基化領域に結合させて、実験１０に記載のように、ウェルの各々の底部表面上に抗原提示共有結合官能基化領域を形成した。
[00322] 様々なサイズの抗原提示共有結合官能基化活性化領域を有するウェル内でのＴ細胞活性化及び拡大。上の実験１１に記載の通り、抗原特異的Ｔ細胞を活性化し、拡大させた。第２の、ウェルプレートの表面の新しい抗原提示共有結合官能基化領域が第２ラウンドの刺激に必要となった場合、ウェルプレートの各ウェルに、同じサイズの活性化領域を組み合わせた。両方のラウンドの刺激の完了後、０．０５ｍＬの細胞サンプルを各ウェルから採取し、抗原特異的Ｔ細胞の存在比率並びに抗原特異的Ｔ細胞でのＣＤ２８及びＣＤ１２７の発現を決定した。
[00323] 結果。図８Ａ〜８Ｄに示すように、刺激及び拡大は、およそ１ｍｍ２又はわずかにそれを上回る面積を有するウェルの抗原提示活性化領域に認められた。しかし、抗原特異的Ｔ細胞の収率は、概して、約１ｍｍ２（細胞産物の１．２９％が抗原特異的であった）から２３ｍｍ２（細胞産物の３４．８％が抗原特異的、且つＣＤ８高であった）へと増加した。フローサイトメトリーゲートカットオフより下の集団は抗原特異的であるが、選択したゲート閾値に対して下方制御されたＣＤ８を有し、図８Ｂに示すように、産生された抗原特異的Ｔ細胞の量は、活性化（抗原提示領域）の面積に関して概ね線形であったことに留意されたい。抗原特異的Ｔ細胞におけるＣＤ２８の発現は、抗原提示領域の面積とは独立に、一貫して高かった（図８Ｃ）。しかし、抗原提示領域の面積が増加するにつれ、抗原特異的Ｔ細胞によるＣＤ１２７の発現も増加し、これは、大きい面積を有する抗原提示領域ほど、少なくともある程度まで、ＣＤ１２７＋Ｔ細胞の拡大が良好に支持されることを示す（図８Ｄ）。図８Ｄにおいて、抗原特異的Ｔ細胞によるＣＤ１２７の発現増大は、抗原提示活性化領域の面積が約２５ｍｍ２から約３０ｍｍ２を超えると、水平状態になる傾向がある。これは、約１ｍｍ２から約５０ｍｍ２又は約３ｍｍ２から約３０ｍｍ２の面積を有する抗原提示共有結合官能基化領域が、メモリー前駆体マーカＣＤ１２７の高レベルの発現を維持しながら、抗原特異的Ｔ細胞の最適化拡大を提供することを示すものである。この結果は、実験７に記載され、図５Ａ〜５Ｄに示すように、抗原提示活性化／刺激の面積を制限せずに産生されたＴ細胞の表現型と完全に対照的である。従って、１００ｍｍ２未満、７５ｍｍ２未満又は５０ｍｍ２未満の面積を有する抗原提示活性化領域はＣＤ１２７の、高レベルの発現を維持するＴ細胞の産生に関して、有利となり得る。
[00324] 特徴又は要素が本明細書において別の特徴又は要素「上」にあるものとして述べられるとき、これは、直接他の特徴若しくは要素上にあり得るか、又は介在する特徴及び／又は要素が存在し得る。対照的に、特徴又は要素が別の特徴又は要素「上に直接」あるものとして述べられるとき、介在する特徴又は要素は、存在しない。また、特徴又は要素が別の特徴又は要素と「連結」、「結合」又は「カップリング」されるものとして述べられるとき、これは、他の特徴若しくは要素と直接連結、結合若しくはカップリングし得るか、又は介在する特徴若しくは要素が存在し得ることが理解されるであろう。対照的に、特徴又は要素が別の特徴又は要素と「直接連結」、「直接結合」又は「直接カップリング」されるものとして述べられるとき、介在する特徴又は要素は、存在しない。１つの実施形態に関して説明又は図示される場合でも、そのように説明又は図示された特徴及び要素を他の実施形態に適用することができる。また、別の特徴と「隣接して」配置される構造物又は特徴への参照は、隣接する特徴と重なるか又はその下に位置する部分を含み得ることも当業者に理解されるであろう。
[00325] 本明細書に使用される用語は、特定の実施形態を説明することを目的とするに過ぎず、本発明を限定することを意図するものではない。例えば、本明細書で使用される場合、単数形「１つの（a）」、「１つの（an）」及び「その」は、文脈から明らかに別のことが指示されない限り、複数形も同様に含むことが意図される。さらに、用語「含む」及び／又は「含むこと」は、本明細書で使用される場合、表示される特徴、ステップ、操作、要素及び／又は成分の存在を明示するが、その１つ又は複数の他の特徴、ステップ、操作、要素、成分及び／又は群の存在又は追加を排除しないことも理解されるであろう。本明細書で使用される場合、用語「及び／又は」は、関連する列記項目の１つ又は複数の任意の及びあらゆる組合せを含み、「／」のように略される場合もある。
[00326] 「の下」、「下方」、「下部」、「の上」、「上部」などの空間に関する用語は、本明細書において、図に描かれるように、別の要素又は特徴に対する１つの要素又は特徴の関係を表す目的で説明を容易にするために使用され得る。空間に関する用語は、図に描かれる方向に加えて、使用又は操作中の装置の異なる方向を包含することが意図されることが理解されるであろう。例えば、図面中の装置が逆転すると、他の要素又は特徴の「下」又は「下方」として表された要素は、他の要素又は特徴の「上」に配向され得る。従って、例示的用語「の下」は、上及び下の方向のいずれも包含し得る。それ以外にも、装置を別の方向に（９０°又は他の方向に回転して）配向させ得、本明細書に使用される空間に関する記述子もそれに応じて解釈される。同様に、用語「上に向かって」、「下に向かって」、「鉛直方向」、「水平方向」などの用語も、文脈から明らかに別のことが指示されない限り、本明細書ではあくまで説明の目的で使用される。
[00327] 様々な特徴／要素（ステップを含め）を説明するために、用語「第１」及び「第２」が本明細書で用いられ得るが、これらの特徴／要素は、文脈から別のことが指示されない限り、これらの用語によって限定されるべきではない。これらの用語は、１つの特徴／要素を別の特徴／要素から区別するために使用され得る。従って、本発明の教示内容から逸脱することなく、以下に述べる第１特徴／要素は、第２特徴／要素と称される場合もあり、また同様に、以下に述べる第２特徴／要素は、第１特徴／要素と称される場合もある。
[00328] 本明細書、それに続く特許請求の範囲全体を通して、文脈から別の解釈が要求されない限り、用語「含む」並びに「含む」及び「含むこと」などの変化形は、様々な構成要素が方法及び製品（例えば、デバイス及び方法を含む組成物及び装置）と併せて使用され得ることを意味する。例えば、用語「含むこと」は、表示される任意の要素又はステップの包含を意味するが、他の任意の要素又はステップの排除を意図しないことが理解されるであろう。
[00329] 実施例での使用を含めて且つ別に明示されない限り、本明細書及び特許請求の範囲で使用される場合、全ての数は、たとえ用語が明示されない場合でも、用語「約」又は「およそ」が前置されるのと完全に同様に解釈され得る。語句「約」又は「およそ」は、大きさ及び／又は位置を表す場合、表示される値及び／又は位置が値及び／又は位置の妥当な予想範囲内にあることを示すために使用され得る。例えば、数値は、表示数値（又は数値の範囲）の＋／−０．１％、表示数値（又は数値の範囲）の＋／−１％、表示数値（又は数値の範囲）の＋／−２％、表示数値（又は数値の範囲）の＋／−５％、表示数値（又は数値の範囲）の＋／−１０％などである数値を有し得る。本明細書に記載される任意の数値範囲は、その中に組み込まれるあらゆる部分範囲を含むことが意図される。
[00330] 様々な例示的実施形態が上に記載されているが、特許請求の範囲に記載される本発明の範囲から逸脱することなく、様々な実施形態に対する任意の数の変更形態がなされ得る。例えば、記載される様々な方法ステップが実施される順序は、別の実施形態において多くの場合に変更され得、他の別の実施形態では１つ又は複数の方法ステップが一緒に省略される場合もある。様々な装置及びシステム実施形態の任意の特徴を一部の実施形態に加え得るか、又は別の実施形態に加えなくてもよい。従って、以上の記載は、主として例示の目的で提供されるものであり、特許請求の範囲に記載のような本発明の範囲を限定すると解釈すべきではない。
[00331] 本明細書に含まれる例及び説明は、例示として、しかし限定としてではなく、主題が実施され得る具体的実施形態を示す。記述されるように、本開示の範囲から逸脱することなく、構造及び論理的代替形態及び変更形態がなされ得るように、他の実施形態を使用し得るか又はそれから派生し得る。本明細書における本発明の主題のこうした実施形態は、個別又は集合的に、便宜上、単に用語「発明」と称される場合があり、その場合、実際に開示されるいずれか単一の発明又は発明概念（２つ以上の場合）に対するこの適用の範囲を意図的に限定するものではない。従って、具体的な実施形態が本明細書に例示及び記載されるが、同じ目的を達成するように計算された任意の構成を、示される具体的実施形態の代わりに使用し得る。本開示は、様々な実施形態のあらゆる適応形態又は変形形態を包含することを意図する。前述の実施形態の組合せ及び本明細書に具体的に記載されていない他の実施形態は、上記の説明を検討することで当業者に明らかであろう。
本開示のいくつかの実施形態のリスト。
[00332] １．反応性部分提示共有結合官能基化領域又は活性化部分提示共有結合官能基化領域である第１領域を有する表面を含むウェルプレートであって、反応性部分は、アジド部分、ビオチン部分又はストレプトアビジン部分であり、及び活性化部分は、リンパ球活性化部分であるウェルプレート。
[00332] １．反応性部分提示共有結合官能基化領域又は活性化部分提示共有結合官能基化領域である第１領域を有する表面を含むウェルプレートであって、反応性部分は、アジド部分、ビオチン部分又はストレプトアビジン部分であり、及び活性化部分は、リンパ球活性化部分であるウェルプレート。
[00333] ２．第１領域は、少なくとも０．５ｍｍ２の面積を有する、実施形態１に記載のウェルプレート。特定の具体的な実施形態では、第１領域は、少なくとも０．６ｍｍ２、少なくとも０．７ｍｍ２、少なくとも０．８ｍｍ２、少なくとも０．９ｍｍ２、少なくとも１．０ｍｍ２、少なくとも１．１ｍｍ２、少なくとも１．２ｍｍ２、少なくとも１．３ｍｍ２、少なくとも１．４ｍｍ２、少なくとも１．５ｍｍ２、少なくとも１．６ｍｍ２、少なくとも１．７ｍｍ２、少なくとも１．８ｍｍ２、少なくとも１．９ｍｍ２、少なくとも２．０ｍｍ２、少なくとも２．５ｍｍ２、少なくとも３．０ｍｍ２、少なくとも３．５ｍｍ２、少なくとも４．０ｍｍ２、少なくとも４．５ｍｍ２、少なくとも５．０ｍｍ２、少なくとも６．０ｍｍ２、少なくとも７．０ｍｍ２、少なくとも８．０ｍｍ２、少なくとも９．０ｍｍ２、少なくとも１０ｍｍ２、少なくとも１５ｍｍ２、少なくとも２０ｍｍ２、少なくとも２５ｍｍ２、少なくとも３０ｍｍ２又は前記端点の２つにより形成される任意の範囲の面積を有する。他の具体的実施形態では、第１領域は、約０．５ｍｍ２から約５０ｍｍ２、約１．０ｍｍ２から約４０ｍｍ２、約２ｍｍ２から約３５ｍｍ２、約３ｍｍ２から約３０ｍｍ２又は約４ｍｍ２から約２５ｍｍ２の面積を有する。
[00334] ３．第１領域は、約０．５から約４．０ｍｍ（例えば、約１．０ｍｍから約３．５ｍｍ又は約１．５ｍｍから約３．０ｍｍ）の寸法を有する、実施形態１又は２に記載のウェルプレート。
[00335] ４．第１領域は、実質的に円形であり、且つ約０．５ｍｍから４．０ｍｍ（例えば、約１．０ｍｍから約３．５ｍｍ又は約１．５ｍｍから約３．０ｍｍ）の直径を有する、実施形態１から３のいずれか１つに記載のウェルプレート。
[00336] ５．ウェルプレートの表面は、表面遮断リガンドを含む共有結合修飾領域である第２領域をさらに含み、任意選択で、第２領域は、第１領域を取り囲む、実施形態１から４のいずれか１つに記載のウェルプレート。
[00337] ６．ウェルプレートの表面は、ガラス又はポリスチレンを含む、実施形態１から５のいずれか１つに記載のウェルプレート。
[00338] ７．ウェルプレートの表面は、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ポリエチレン、シクロオレフィンコポリマー又はメラミンを含む、実施形態１から５のいずれか１つに記載のウェルプレート。
[00339] ８．第１領域は、少なくとも５０／ｕｍ２のそれぞれの反応性部分又は活性化部分の密度を有する、実施形態１から７のいずれか１つに記載のウェルプレート。
[00340] ９．第１領域は、炭素、ケイ素、窒素及び酸素から選択される５から約２０個の骨格原子、約１０から約４０個の骨格原子又は約１５から約５０個の骨格原子を有するリンカーを介して表面に共有結合されたそれぞれの反応性部分又は活性化部分を含む、実施形態１から８のいずれか１つに記載のウェルプレート。代わりに、反応性部分又は活性化部分は、一続きの約５、７、９、１０、１１、１３、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、９０、１００、２００結合長のリンカー又はそれらの間の任意の数の結合長を介して表面に共有結合され得る。
[00341] １０．反応性部分は、ストレプトアビジンであり、及びストレプトアビジン官能基は、ウェルプレートの表面の第１領域に共有結合される、実施形態１から９のいずれか１つに記載のウェルプレート。
[00342] １１．反応性部分は、ストレプトアビジンであり、及びストレプトアビジン官能基は、ビオチン部分に非共有結合され、ビオチン部分は、それ自体、ウェルプレートの表面の第１領域に共有結合される、実施形態１から９のいずれか１つに記載のウェルプレート。
[00343] １２．第１領域は、複数の特異的に結合された一次活性化分子リガンドと、複数の特異的に結合された共活性化分子リガンドとを含む活性化部分提示共有結合官能基化領域である、実施形態１から１１のいずれか１つに記載のウェルプレート。
[00344] １３．表面の第１領域上における一次活性化分子リガンドと共活性化分子リガンドとの比は、約１：１０から約２：１、約１：５から約２：１、約１：２から約２：１、約１：１０から約１：１、約１：５から約１：１、約１：１から約２：１又は約１：２から約１：１である、実施形態１２に記載のウェルプレート。
[00345] １４．複数の特異的に結合された一次活性化分子リガンドの各リガンドは、Ｔ細胞のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）に結合するように構成された主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子（例えば、クラスＩ又はクラスＩＩ）を含む、実施形態１２又は１３に記載のウェルプレート。
[00346] １５．ＭＨＣ分子は、ＭＨＣクラスＩタンパク質配列及びβミクログロブリンタンパク質配列を含む、実施形態１４に記載のウェルプレート。
[00347] １６．複数の特異的に結合された一次活性化分子リガンドの各リガンドは、抗原ペプチドをさらに含むＭＨＣ分子を含む、実施形態１４又は１５に記載のウェルプレート。
[00348] １７．抗原ペプチドは、腫瘍関連抗原、ウイルス抗原、細菌抗原、真菌抗原又は原生動物抗原である、実施形態１６に記載のウェルプレート。
[00349] １８．抗原ペプチドは、腫瘍関連抗原であり、任意選択で、腫瘍関連抗原は、ＳＬＣ４５Ａ２、ＴＣＬ１、ＶＣＸ３Ａ、ＭＡＲＴ１又はＮＹＥＳＯ１である、実施形態１７に記載のウェルプレート。
[00350] １９．ＭＨＣ分子は、Ｃ末端結合を介して活性化部分提示共有結合官能基化領域に連結される、実施形態１４から１８のいずれか１つに記載のウェルプレート。
[00351] ２０．複数の特異的に結合された共活性化分子リガンドの各リガンドは、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）共活性化分子又は補助ＴＣＲ活性化分子を含む、実施形態１２から１９のいずれか１つに記載のウェルプレート。
[00352] ２１．複数の共活性化分子リガンドのＴＣＲ共活性化分子と補助ＴＣＲ活性化分子との比は、約１００：１から約１：１００である、実施形態２０に記載のウェルプレート。
[00353] ２２．複数の共活性化分子リガンドのＴＣＲ共活性化分子と補助ＴＣＲ活性化分子との比は、１００：１から９０：１、９０：１から８０：１、８０：１から７０：１、７０：１から６０：１、６０：１から５０：１、５０：１から４０：１、４０：１から３０：１、３０：１から２０：１、２０：１から１０：１、１０：１から１：１、３：１から１：３、１：１から１：１０、１：１０から１：２０、１：２０から１：３０、１：３０から１：４０、１：４０から１：５０、１：５０から１：６０、１：６０から１：７０、１：７０から１：８０、１：８０から１：９０又は１：９０から１：１００であり、上記数値の各々は、「約」により修正される、実施形態２０又は２１に記載のウェルプレート。
[00354] ２３．複数の特異的に結合された共活性化分子リガンドのＴＣＲ共活性化分子と補助ＴＣＲ活性化分子との比は、約２０：１から約１：２０又は約３：１から約１：３である、実施形態２０から２２のいずれか１つに記載のウェルプレート。
[00355] ２４．ＴＣＲ共活性化分子は、ＣＤ２８結合タンパク質又はＣＤ２８に対する結合能力を保持するその断片を含み、任意選択で、ＣＤ２８結合タンパク質又はその断片は、部位特異的Ｃ末端ビオチン部分をさらに含む、実施形態２０から２３のいずれか１つに記載のウェルプレート。
[00356] ２５．ＴＣＲ共活性化分子は、ＣＤ８０分子又はその断片を含み、断片は、ＣＤ２８に対する結合活性を保持する、実施形態２０から２４のいずれか１つに記載のウェルプレート。
[00357] ２６．ＴＣＲ共活性化分子は、抗ＣＤ２８抗体又はその断片を含み、断片は、ＣＤ２８に対する結合活性を保持する、実施形態２０から２５のいずれか１つに記載のウェルプレート。
[00358] ２７．補助ＴＣＲ活性化分子は、ＣＤ２結合タンパク質又はＣＤ２に対する結合活性を保持するその断片を含み、任意選択で、ＣＤ２結合タンパク質又はその断片は、部位特異的Ｃ末端ビオチン部分をさらに含む、実施形態２０から２６のいずれか１つに記載のウェルプレート。
[00359] ２８．補助ＴＣＲ活性化分子は、ＣＤ５８分子又はその断片を含み、断片は、ＣＤ２との結合活性を保持する、実施形態２０から２７のいずれか１つに記載のウェルプレート。
[00360] ２９．補助ＴＣＲ活性化分子は、抗ＣＤ２抗体又はその断片を含み、断片は、ＣＤ２との結合活性を保持する、実施形態２０から２８のいずれか１つに記載のウェルプレート。
[00361] ３０．複数の特異的に結合された一次活性化分子リガンド及び複数の特異的に結合された共活性化分子リガンドは、ウェルプレートのストレプトアビジン提示第１領域のストレプトアビジン官能基に特異的に結合される、実施形態１２から２９のいずれか１つに記載のウェルプレート。
[00362] ３１．複数の特異的に結合された一次活性化分子リガンドは、第１領域において、１平方ミクロン当たり少なくとも約１×１０２分子の密度、及び任意選択で、第１領域において、１平方ミクロン当たり約１×１０２から約１×１０５分子の密度を有する、実施形態１２から３０のいずれか１つに記載のウェルプレート。
[00363] ３２．複数の特異的に結合された共活性化分子リガンドは、第１領域において、１平方ミクロン当たり少なくとも１×１０２分子又は１平方ミクロン当たり約１×１０３から約１×１０５分子の密度を有する、実施形態１２から３１のいずれか１つに記載のウェルプレート。
[00364] ３３．ウェルプレートの１つ又は複数のウェルの各々は、実施形態１から３２のいずれか１つに記載のウェルプレートの表面及びその第１領域を含む（即ち、表面は、単一ウェルの内部表面であり得、及びウェルプレートは、１つ又は複数のこうした表面を有し得る）ウェルプレート。
[00365] ３４．１つ又は複数のウェルの各々の第１領域は、対応するウェルの底部表面上に位置する、実施形態３３に記載のウェルプレート。
[00366] ３５．第１領域各々の面積は、対応するウェルの底部表面の面積の約５０％未満、約２５％未満、約１５％未満、約１０％未満、約５％未満又は約２％未満である、実施形態３２に記載のウェルプレート。
[00367] ３６．表面遮断リガンドの各々は、親水性又は負荷電部分を含む、実施形態５から３５のいずれか１つに記載のウェルプレート。
[00368] ３７．表面遮断リガンドは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分を含む、実施形態３６に記載のウェルプレート。
[00369] ３８．Ｔリンパ球（Ｔ細胞）を活性化する方法であって、複数のＴ細胞をウェルプレートの表面の抗原提示共有結合官能基化領域と接触させることであって、抗原提示共有結合官能基化領域は、複数の一次活性化分子リガンドであって、Ｔ細胞のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）に結合するように構成された主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子（例えば、クラスＩ又はクラスＩＩ）をそれぞれ含み、複数の一次活性化分子リガンドの各々は、表面に結合される、複数の一次活性化分子リガンドと；複数の共活性化分子リガンドであって、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）共活性化分子又は補助ＴＣＲ活性化分子をそれぞれ含み、共活性化分子リガンドの各々は、表面に結合される、複数の共活性化分子リガンドとを含む、接触させることと；複数のＴ細胞を表面の抗原提示共有結合官能基化領域と接触させて培養し、それにより複数のＴ細胞の少なくとも一部を活性化Ｔ細胞に変換することとを含む方法。
[00370] ３９．Ｔ細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞を含む、実施形態３８に記載の方法。
[00371] ４０．抗原提示共有結合官能基化領域は、実施形態１２から３３のいずれか１つに記載のウェルプレートの表面の第１領域である、実施形態３８又は３９に記載の方法。
[00372] ４１．複数の共活性化分子リガンドは、ＴＣＲ共活性化分子及び補助ＴＣＲ活性化分子を含む、実施形態３８から４０のいずれか１つに記載の方法。
[00373] ４２．複数の共活性化分子リガンドのＴＣＲ共活性化分子と補助ＴＣＲ活性化分子との比は、約１００：１から約１：１００である、実施形態３８から４１のいずれか１つに記載の方法。
[00374] ４３．複数の共活性化分子リガンドのＴＣＲ共活性化分子と補助ＴＣＲ活性化分子との比は、１００：１から９０：１、９０：１から８０：１、８０：１から７０：１、７０：１から６０：１、６０：１から５０：１、５０：１から４０：１、４０：１から３０：１、３０：１から２０：１、２０：１から１０：１、１０：１から１：１、３：１から１：３、１：１から１：１０、１：１０から１：２０、１：２０から１：３０、１：３０から１：４０、１：４０から１：５０、１：５０から１：６０、１：６０から１：７０、１：７０から１：８０、１：８０から１：９０又は１：９０から１：１００であり、上記数値の各々は、「約」により修正される、実施形態３８から４２のいずれか１つに記載の方法。
[00375] ４４．複数の共活性化分子リガンドのＴＣＲ共活性化分子と補助ＴＣＲ活性化分子との比は、約２０：１から約１：２０又は約３：１から約１：３である、実施形態３８から４３のいずれか１つに記載の方法。
[00376] ４５．複数のＭＨＣ分子の各分子は、ＭＨＣクラスＩタンパク質配列、βミクログロブリンタンパク質配列及び抗原ペプチドを含む、実施形態３８から４４のいずれか１つに記載の方法。
[00377] ４６．ＭＨＣ分子のタンパク質配列は、タンパク質配列のＣ末端結合を介して表面の抗原提示共有結合官能基化領域に連結される、実施形態４５に記載の方法。
[00378] ４７．ＭＨＣ分子は、ビオチン部分を含み、且つストレプトアビジンとの非共有結合相互作用を介して表面の抗原提示共有結合官能基化領域に結合する、実施形態３８から４６のいずれか１つに記載の方法。
[00379] ４８．ストレプトアビジンは、それ自体、表面の抗原提示共有結合官能基化領域に共有結合される、実施形態４７に記載の方法。
[00380] ４９．ストレプトアビジンは、一続きの約５、７、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９５、１００、２００結合長又はそれらの間の任意の数の結合長を介して表面に結合する、実施形態４８に記載の方法。
[00381] ５０．ストレプトアビジンは、表面の抗原提示共有結合官能基化領域に非共有結合される、実施形態４７に記載の方法。
[00382] ５１．ストレプトアビジンは、ビオチン部分と非共有結合され、及びビオチン部分は、表面の抗原提示共有結合官能基化領域に共有結合される、実施形態４７又は５０に記載の方法。
[00383] ５２．ビオチンは、一続きの約５、７、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９５、１００、２００結合長又はそれらの間の任意の数の結合長を介してリンカーにより表面に結合する、実施形態５１に記載の方法。
[00384] ５３．抗原ペプチドは、腫瘍関連抗原、ウイルス抗原、細菌抗原、真菌抗原又は原生動物抗原である、実施形態３９から５２のいずれか１つに記載の方法。
[00385] ５４．抗原ペプチドは、腫瘍関連抗原であり、任意選択で、腫瘍関連抗原は、ＳＬＣ４５Ａ２、ＴＣＬ１、ＶＣＸ３Ａ、ＭＡＲＴ１又はＮＹＥＳＯ１である、実施形態５３に記載の方法。
[00386] ５５．複数の共活性化分子リガンドの各々は、表面の抗原提示共有結合官能基化領域に結合される、実施形態３８から５４のいずれか１つに記載の方法。
[00387] ５６．Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）共活性化分子は、ＣＤ２８結合タンパク質又はＣＤ２８に対する結合能力を保持するその断片を含む、実施形態３８から５５のいずれか１つに記載の方法。
[00388] ５７．ＣＤ２８結合タンパク質又はその断片は、部位特異的Ｃ末端ビオチン部分をさらに含む、実施形態５６に記載の方法。
[00389] ５８．Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）共活性化分子は、ＣＤ８０分子又はその断片を含み、断片は、ＣＤ２８に対する結合活性を保持する、実施形態３８から５７のいずれか１つに記載の方法。
[00390] ５９．Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）共活性化分子は、抗ＣＤ２８抗体又はその断片を含み、断片は、ＣＤ２８に対する結合活性を保持する、実施形態３８から５８のいずれか１つに記載の方法。
[00391] ６０．補助ＴＣＲ活性化分子は、ＣＤ２結合タンパク質又はＣＤ２に対する結合能力を保持するその断片を含む、実施形態３８から５９のいずれか１つに記載の方法。
[00392] ６１．ＣＤ２結合タンパク質又はその断片は、部位特異的Ｃ末端ビオチン部分をさらに含む、実施形態６０に記載の方法。
[00393] ６２．補助ＴＣＲ活性化分子は、ＣＤ５８分子又はその断片を含み、断片は、ＣＤ２との結合活性を保持する、実施形態３８から６１のいずれか１つに記載の方法。
[00394] ６３．補助ＴＣＲ活性化分子は、抗ＣＤ２抗体又はその断片を含み、断片は、ＣＤ２との結合活性を保持する、実施形態３８から６２のいずれか１つに記載の方法。
[00395] ６４．複数の特異的に結合された一次活性化分子リガンドは、表面の抗原提示共有結合官能基化領域において、１平方ミクロン当たり少なくとも約１×１０２分子の密度、又は任意選択で、表面の抗原提示共有結合官能基化領域において、１平方ミクロン当たり約１×１０２から１×１０５分子の密度を有する、実施形態３８から６３のいずれか１つに記載の方法。
[00396] ６５．複数の特異的に結合された共活性化分子リガンドは、表面の抗原提示共有結合官能基化領域において、１平方ミクロン当たり少なくとも１×１０２から１×１０５分子の密度、又は任意選択で、表面の抗原提示共有結合官能基化領域において、１平方ミクロン当たり約１×１０３から約１×１０５分子の密度を有する、実施形態３８から６４のいずれか１つに記載の方法。
[00397] ６６．表面の抗原提示共有結合官能基化領域における一次活性化分子リガンドと共活性化分子リガンドとの比は、約１：１０から約２：１、約１：５から約２：１、約１：２から約２：１、約１：１０から約１：１、約１：５から約１：１、約１：１から約２：１又は任意選択で約１：２から約１：１である、実施形態３８から６５のいずれか１つに記載の方法。
[00398] ６７．複数の共活性化分子リガンドのＴＣＲ共活性化分子と補助ＴＣＲ活性化分子との比は、約３：１から約１：３である、実施形態３８から６６のいずれか１つに記載の方法。
[00399] ６８．複数の共活性化分子リガンドのＴＣＲ共活性化分子と補助ＴＣＲ活性化分子との比は、約２：１から約１：２である、実施形態３８から６７のいずれか１つに記載の方法。
[00400] ６９．複数の共活性化分子リガンドのＴＣＲ共活性化分子と補助ＴＣＲ活性化分子との比は、約１：１である、実施形態３８から６８のいずれか１つに記載の方法。
[00401] ７０．複数のＴ細胞を複数の接着刺激分子リガンドと接触させることをさらに含み、任意選択で、複数の接着刺激分子リガンドは、ＩＣＡＭ分子を含む、実施形態３９から６９のいずれか１つに記載の方法。
[00402] ７１．複数の接着刺激分子リガンドは、ウェルプレートの表面の抗原提示共有結合官能基化領域以外の領域に共有結合される、実施形態７０に記載の方法。
[00403] ７２．複数のＴ細胞を複数の成長刺激分子リガンドと接触させることをさらに含む、実施形態３８から７１のいずれか１つに記載の方法。
[00404] ７３．成長刺激分子リガンドの各々は、成長因子受容体リガンドを含む、実施形態７２に記載の方法。
[00405] ７４．成長因子受容体リガンドは、ＩＬ−２１又はその断片を含む、実施形態７３に記載の方法。
[00406] ７５．複数の成長刺激分子リガンドと接触させることは、少なくとも１日の第１培養期間後に実施される、実施形態７２から７４のいずれか１つに記載の方法。
[00407] ７６．抗原提示合成表面と接触させて培養することは、約４日から約７日の期間にわたって実施される、実施形態３８から７５のいずれか１つに記載の方法。
[00408] ７７．表面の抗原提示共有結合官能基化領域と接触させて第１活性化期間を完了することと；第２培養期間にわたり、複数の活性化Ｔ細胞を表面の抗原提示共有結合官能基化領域と接触させて培養し、それにより拡大された複数の活性化Ｔ細胞を取得することとをさらに含む、実施形態３８から７６のいずれか１つに記載の方法。
[00409] ７８．第２培養期間中、第２の複数の成長刺激分子リガンドを添加することをさらに含む、実施形態７７に記載の方法。
[00410] ７９．残りの第２培養期間にわたり、複数のＩＬ−２分子と複数のＩＬ−７分子とを添加して、活性化Ｔ細胞と接触させる、実施形態７７又は７８に記載の方法。
[00411] ８０．表面の抗原提示共有結合官能基化領域と接触させて培養することは、約４日から約７日の期間にわたって実施される、実施形態７６から７９のいずれか１つに記載の方法。
[00412] ８１．表面の抗原提示共有結合官能基化領域と接触させて第２活性化期間を完了することと；第３培養期間にわたり、拡大された複数の活性化Ｔ細胞を表面の抗原提示共有結合官能基化領域と接触させて培養し、それにより複数の高度に活性化したＴ細胞を取得することとをさらに含む、実施形態７７から８０のいずれか１つに記載の方法。
[00413] ８２．第３培養期間中、第３の複数の成長刺激分子リガンドを添加することをさらに含む、実施形態８１に記載の方法。
[00414] ８３．残りの第３培養期間にわたり、複数のＩＬ−２分子と複数のＩＬ−７分子とを添加して、活性化Ｔ細胞と接触させる、実施形態８１又は８２に記載の方法。
[00415] ８４．表面の抗原提示共有結合官能基化領域と接触させて培養することは、約４日から約７日の第３期間にわたって実施される、実施形態８１から８３のいずれか１つに記載の方法。
[00416] ８５．活性化Ｔ細胞は、ＣＤ４５ＲＯ＋である、実施形態３８から８４のいずれか１つに記載の方法。
[00417] ８６．活性化Ｔ細胞は、ＣＤ２８陽性である、実施形態３８から８５のいずれか１つに記載の方法。
[00418] ８７．抗原提示官能基化領域の面積は、ウェルプレートのウェルの底部表面の面積の約５０％未満、約２５％未満、約１５％未満、約１０％未満、約５％未満又は約２％未満である、実施形態３８から８６のいずれか１つに記載の方法。
[00419] ８８．リンパ球を活性化する方法であって、複数のリンパ球をウェルプレートの表面の活性化部分提示共有結合官能基化領域と接触させることであって、活性化部分提示共有結合官能基化領域は、表面に連結した複数の一次活性化分子リガンドと；表面に連結した複数の共活性化分子リガンドとを含む、接触させることと；複数のリンパ球を培養し、それにより複数のリンパ球の少なくとも一部を活性化リンパ球に変換することとを含む方法。
[00420] ８９．リンパ球は、Ｂ細胞、Ｔ細胞又はＮＫ細胞を含む、実施形態８８に記載の方法。
[00421] ９０．活性化部分提示共有結合官能基化領域は、実施形態１から１３のいずれか１つに記載のウェルプレートの表面の第１領域である、実施形態８８又は８９に記載の方法。
[00422] ９１．一次活性化分子リガンドは、ＣＤ３結合分子又はＭＨＣ分子（例えば、ＭＨＣクラスＩ又はＭＨＣクラスＩＩ）を含む、実施形態８８から９０のいずれか１つに記載の方法。
[00423] ９２．複数のＭＨＣ分子は、ＭＨＣクラスＩタンパク質配列及びβミクログロブリンタンパク質配列をそれぞれ含む、実施形態９１に記載の方法。
[00424] ９３．ＭＨＣ分子は、抗原ペプチドをさらに含む、実施形態９１又は９２に記載の方法。
[00425] ９４．ＣＤ３結合タンパク質は、抗体又は結合親和性を保持するその断片である、実施形態９３に記載の方法。
[00426] ９５．複数の共活性化分子リガンドは、ＴＣＲ共活性化分子及び補助ＴＣＲ活性化分子を含む、実施形態８８から９４のいずれか１つに記載の方法。
[00427] ９６．複数の共活性化分子リガンドは、ＣＤ２結合分子及び／又はＣＤ２８結合分子を含む、実施形態８８から９５のいずれか１つに記載の方法。
[00428] ９７．２種以上の共活性化分子リガンドは、存在し、異なる共活性化分子リガンドの比は、約２０：１から約１：２０又は約３：１から約１：３である、実施形態９５又は９６に記載の方法。
[00429] ９８．複数の特異的に結合された一次活性化分子リガンドは、表面の活性化部分提示共有結合官能基化領域において、１平方ミクロン当たり少なくとも約１×１０２分子又は１平方ミクロン当たり約１×１０２から約１×１０５分子の密度を有する、実施形態８８から９７のいずれか１つに記載の方法。
[00430] ９９．複数の特異的に結合された共活性化分子リガンドは、表面の活性化部分提示共有結合官能基化領域において、１平方ミクロン当たり少なくとも１×１０２分子、又は１平方ミクロン当たり約１×１０２から約１×１０５分子、又は１平方ミクロン当たり約１×１０３から約１×１０５分子の密度を有する、実施形態８８から９８のいずれか１つに記載の方法。
[00431] １００．活性化部分提示共有結合官能基化領域における一次活性化分子リガンドと共活性化分子リガンドとの比は、約１：１０から約２：１、約１：５から約２：１、約１：２から約２：１、約１：１０から約１：１、約１：５から約１：１、約１：１から約２：１又は約１：２から約１：１である、実施形態８８から９９のいずれか１つに記載の方法。
[00432] １０１．複数のリンパ球を複数の成長刺激分子リガンドと接触させることをさらに含む、実施形態８８から１００のいずれか１つに記載の方法。
[00433] １０２．成長刺激分子リガンドの各々は、成長因子受容体リガンドを含む、実施形態１０１２に記載の方法。
[00434] １０３．成長因子受容体リガンドは、ＩＬ−２１又はその断片を含む、実施形態１０２に記載の方法。
[00435] １０４．複数の成長刺激分子リガンドと接触させることは、少なくとも１日の第１培養期間後に実施される、実施形態１０１から１０３のいずれか１つに記載の方法。
[00436] １０５．活性化部分提示共有結合官能基化領域と接触させて培養することは、約４日から約７日の期間にわたって実施される、実施形態８８から１０４のいずれか１つに記載の方法。
[00437] １０６．活性化部分提示官能基化領域の面積は、ウェルプレートのウェルの底部表面の面積の約２５％未満、約１５％未満、約１０％未満、約５％未満又は約２％未満である、実施形態８９から１０７のいずれか１つに記載の方法。
[00438] １０７．活性化部分提示共有結合官能基化領域を有する表面を含むウェルプレートを作製するキットであって、反応性部分提示共有結合官能基化領域を有する表面を含むウェルプレートであって、反応性部分は、アジド部分、ビオチン部分又はストレプトアビジン部分である、ウェルプレート；及び活性化試薬；並びに任意選択で表面官能基化試薬を含むキット。
[00439] １０８．表面官能基化試薬を含み、表面官能基化試薬は、反応性部分と反応するように構成されたビオチン含有試薬又はストレプトアビジン含有試薬である、実施形態１０７に記載のキット。
[00440] １０９．ビオチン含有試薬及びストレプトアビジン含有試薬の両方を含む、実施形態１０８に記載のキット。
[00441] １１０．反応性部分提示共有結合官能基化領域を有する表面を含むウェルプレートは、実施形態１から１１のいずれか１つに記載のウェルプレート、実施形態３１から３３のいずれか１つに記載のウェルプレート又は実施形態３３から３７のいずれか１つに記載の反応性部分提示共有結合官能基化領域を有するウェルプレートである、実施形態１０７から１０９のいずれか１つに記載のキット。
[00442] １１１．活性化試薬は、Ｔ細胞のＴ細胞受容体と結合するように構成され、且つストレプトアビジンの結合部位又は複数のＣＤ３結合分子に結合するように構成された複数の主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子（例えば、クラスＩ又はクラスＩＩ）を含む一次活性化試薬を含む、実施形態１０７から１１０のいずれか１つに記載のキット。
[00443] １１２．ストレプトアビジンの結合部位に結合するようにそれぞれ構成された複数の共活性化分子を含む共活性化試薬をさらに含み、共活性化分子の各々は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）共活性化分子又は補助ＴＣＲ活性化分子を含む、実施形態１０７から１１１のいずれか１つに記載のキット。
[00444] １１３．複数の共活性化分子は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）共活性化分子及び補助ＴＣＲ活性化分子を含む、実施形態１１２に記載のキット。
[00445] １１４．ストレプトアビジンの結合部位に結合するようにそれぞれ構成された複数の共活性化分子を含む共活性化試薬をさらに含み、共活性化分子の各々は、ＣＤ２結合分子又はＣＤ２８結合分子を含む、実施形態１０７から１１３のいずれか１つに記載のキット。
[00446] １１５．成長刺激分子を含む試薬をさらに含み、成長刺激分子は、成長因子受容体リガンドをそれぞれ含む、実施形態１０７から１１４のいずれか１つに記載のキット。
[00447] １１６．成長因子受容体リガンドは、ＩＬ−２１又はその断片を含む、実施形態１１５に記載のキット。
[00448] １１７．ＩＬ−７又はＩＬ−２を含む第２成長刺激分子をさらに含む、実施形態１１５又は１１６に記載のキット。
[00449] １１８．アジド提示共有結合官能基化領域を有する表面を含むウェルプレート。
[00450] １１９．ウェルプレートの１つ又は複数のウェルの各々は、アジド提示共有結合官能基化領域を有する表面（即ち内部表面）を含む、実施形態１１８に記載のウェルプレート。
[00451] １２０．１つ又は複数のウェルの各々のアジド提示共有結合官能基化領域は、対応するウェルの底部表面に位置する、実施形態１１９に記載のウェルプレート。
[00452] １２１．ウェルプレートの表面又はウェルプレートの１つ又は複数のウェルの表面は、ガラス又はポリスチレンを含む、実施形態１１８から１２０のいずれか１つに記載のウェルプレート。
[00453] １２２．ウェルプレート又は１つ又は複数のウェルの表面は、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ポリエチレン、シクロオレフィンコポリマー又はメラミンを含む、実施形態１１８から１２１のいずれか１つに記載のウェルプレート。
[00454] １２３．アジド提示共有結合官能基化領域は、少なくとも０．５ｍｍ２の面積を有する、実施形態１１８から１２２のいずれか１つに記載のウェルプレート。特定の具体的実施形態では、アジド提示共有結合官能基化領域は、少なくとも１．０ｍｍ２、少なくとも２．０ｍｍ２、少なくとも３．０ｍｍ２、少なくとも４．０ｍｍ２、少なくとも５．０ｍｍ２、少なくとも６．０ｍｍ２、少なくとも７．０ｍｍ２、少なくとも８．０ｍｍ２、少なくとも９．０ｍｍ２、少なくとも１０ｍｍ２、少なくとも１５ｍｍ２、少なくとも２０ｍｍ２、少なくとも２５ｍｍ２、少なくとも３０ｍｍ２、少なくとも３５ｍｍ２、少なくとも４０ｍｍ２、少なくとも４５ｍｍ２、少なくとも５０ｍｍ２、少なくとも７５ｍｍ２、少なくとも１００ｍｍ２、少なくとも１５０ｍｍ２、少なくとも２００ｍｍ２、少なくとも２５０ｍｍ２、少なくとも３００ｍｍ２、少なくとも４００ｍｍ２、少なくとも５００ｍｍ２、少なくとも６００ｍｍ２、少なくとも７００ｍｍ２、少なくとも８００ｍｍ２、少なくとも９００ｍｍ２、少なくとも１，０００ｍｍ２、少なくとも２，０００ｍｍ２、少なくとも３，０００ｍｍ２、少なくとも４，０００ｍｍ２、少なくとも５，０００ｍｍ２、少なくとも６，０００ｍｍ２、少なくとも７，０００ｍｍ２、少なくとも８，０００ｍｍ２、少なくとも９，０００ｍｍ２、少なくとも１０，０００ｍｍ２、少なくとも２０，０００ｍｍ２、少なくとも３０，０００ｍｍ２、少なくとも４０，０００ｍｍ２、少なくとも５０，０００ｍｍ２、少なくとも６０，０００ｍｍ２、少なくとも７０，０００ｍｍ２、少なくとも８０，０００ｍｍ２、少なくとも９０，０００ｍｍ２、少なくとも１００，０００ｍｍ２又はそれを超える（例えば、ウェルプレートのウェル又は２つ以上のウェルの各々の内部表面の実質的に全部）面積を有する。
[00455] １２４．アジド提示共有結合官能基化領域は、少なくとも５０／ｕｍ２のアジド基の密度を有する、実施形態１１８から１２３のいずれか１つに記載のウェルプレート。
[00456] １２５．アジド提示共有結合官能基化領域は、炭素、ケイ素、窒素及び酸素から選択される５個以上の骨格原子を有するリンカーを介して表面に共有結合されたアジド官能基を含む、実施形態１１８から１２４のいずれか１つに記載のウェルプレート。具体的実施形態では、リンカーは、５から約２０個の骨格原子若しくは約１０から４０個の骨格原子又は一続きの約５、７、９、１０、１１、１３、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、９０、１００、２００結合長或いはそれらの間の任意の数の結合長を有し得る。
[00457] １２６．ビオチン提示共有結合官能基化領域を含む表面を含むウェルプレート。特定の実施形態では、表面は、複数のビオチン提示共有結合官能基化領域を含む。
[00458] １２７．ウェルプレートの１つ又は複数のウェルの各々は、１つ（又は複数）のビオチン提示共有結合官能基化領域を有する表面（即ち内部表面）を含む、実施形態１２６に記載のウェルプレート。
[00459] １２８．１つ又は複数のウェルの各々のビオチン提示共有結合官能基化領域は、対応するウェルの底部表面に位置する、実施形態１２７に記載のウェルプレート。
[00460] １２９．ウェルプレートの表面又は１つ若しくは複数のウェルの表面は、ガラス又はポリスチレンを含む、実施形態１２６から１２８のいずれか１つに記載のウェルプレート。
[00461] １３０．ウェルプレートの表面又は１つ若しくは複数のウェルの表面は、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ポリエチレン、シクロオレフィンコポリマー又はメラミンを含む、実施形態１２６から１２９のいずれか１つに記載のウェルプレート。
[00462] １３１．ビオチン提示共有結合官能基化領域は、少なくとも０．５ｍｍ２の面積をそれぞれ有する、実施形態１２６から１３０のいずれか１つに記載のウェルプレート。特定の具体的実施形態では、ビオチン提示共有結合官能基化領域は、少なくとも１．０ｍｍ２、少なくとも２．０ｍｍ２、少なくとも３．０ｍｍ２、少なくとも４．０ｍｍ２、少なくとも５．０ｍｍ２、少なくとも６．０ｍｍ２、少なくとも７．０ｍｍ２、少なくとも８．０ｍｍ２、少なくとも９．０ｍｍ２、少なくとも１０ｍｍ２、少なくとも１５ｍｍ２、少なくとも２０ｍｍ２、少なくとも２５ｍｍ２、少なくとも３０ｍｍ２、少なくとも３５ｍｍ２、少なくとも４０ｍｍ２、少なくとも４５ｍｍ２又は少なくとも５０ｍｍ２の面積をそれぞれ有する。特定の具体的実施形態では、ビオチン提示共有結合官能基化領域は、１００ｍｍ２以下の面積をそれぞれ有する。
[00463] １３２．ビオチン提示共有結合官能基化領域は、少なくとも５０／ｕｍ２のビオチン官能基の密度をそれぞれ有する、実施形態１２６から１３１のいずれか１つに記載のウェルプレート。
[00464] １３３．ビオチン提示共有結合官能基化領域は、炭素、ケイ素、窒素及び酸素から選択される１０個以上の骨格原子を有するリンカーを介して表面に共有結合されたビオチン官能基をそれぞれ含む、実施形態１２６から１３２のいずれか１つに記載のウェルプレート。具体的実施形態では、リンカーは、約１０から約４０個の骨格原子若しくは一続きの約５、７、９、１０、１１、１３、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、９０、１００、２００結合長又はそれらの間の結合長の任意の数を有し得る。
[00465] １３４．ビオチン提示共有結合官能基化領域各々の面積は、１つ又は複数のウェルの各々の底部表面の面積の約５０％未満、約２５％未満、約１５％未満、約１０％未満、約５％未満又は約２％未満である、実施形態１２６から１３３のいずれか１つに記載のウェルプレート。
[00466] １３５．ビオチン提示共有結合官能基化領域は、０．５から４．０ｍｍ（例えば、約１．０ｍｍから約３．５ｍｍ又は約１．５ｍｍから約３．０ｍｍ）の寸法をそれぞれ有する、実施形態１２６から１３４のいずれか１つに記載のウェルプレート。
[00467] １３６．ビオチン提示共有結合官能基化領域は、実質的に円形であり、且つ０．５から４．０ｍｍ（例えば、約１．０ｍｍから約３．５ｍｍ又は約１．５ｍｍから約３．０ｍｍ）の直径をそれぞれ有する、実施形態１２６から１３５のいずれか１つに記載のウェルプレート。
[00468] １３７．ストレプトアビジン提示共有結合官能基化領域を含む表面を含むウェルプレート。特定の実施形態では、表面は、複数のストレプトアビジン提示共有結合官能基化領域を含む。
[00469] １３８．ウェルプレートの１つ又は複数のウェルの各々は、１つ（又は複数）のストレプトアビジン提示共有結合官能基化領域を有する表面（即ち内部表面）を含む、実施形態１３７に記載のウェルプレート。
[00470] １３９．１つ又は複数のウェルの各々のストレプトアビジン提示共有結合官能基化領域は、対応するウェルの底部表面に位置する、実施形態１３８に記載のウェルプレート。
[00471] １４０．ウェルプレート又は１つ若しくは複数のウェルの表面は、ガラス又はポリスチレンを含む、実施形態１３７から１３９のいずれか１つに記載のウェルプレート。
[00472] １４１．ウェルプレート又は１つ若しくは複数のウェルの表面は、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ポリエチレン、シクロオレフィンコポリマー又はメラミンを含む、実施形態１３７から１４０のいずれか１つに記載のウェルプレート。
[00473] １４２．ストレプトアビジン提示共有結合官能基化領域は、少なくとも０．５ｍｍ２の面積をそれぞれ有する、実施形態１３７から１４１のいずれか１つに記載のウェルプレート。特定の具体的実施形態では、ストレプトアビジン提示共有結合官能基化領域は、少なくとも１．０ｍｍ２、少なくとも２．０ｍｍ２、少なくとも３．０ｍｍ２、少なくとも４．０ｍｍ２、少なくとも５．０ｍｍ２、少なくとも６．０ｍｍ２、少なくとも７．０ｍｍ２、少なくとも８．０ｍｍ２、少なくとも９．０ｍｍ２、少なくとも１０ｍｍ２、少なくとも１５ｍｍ２、少なくとも２０ｍｍ２、少なくとも２５ｍｍ２、少なくとも３０ｍｍ２、少なくとも３５ｍｍ２、少なくとも４０ｍｍ２、少なくとも４５ｍｍ２又は少なくとも５０ｍｍ２の面積をそれぞれ有する。特定の具体的実施形態では、ストレプトアビジン提示共有結合官能基化領域は、１００ｍｍ２以下の面積をそれぞれ有する。
[00474] １４３．ストレプトアビジン提示共有結合官能基化領域は、少なくとも５０／ｕｍ２のストレプトアビジン官能基の密度をそれぞれ有する、実施形態１３７から１４２のいずれか１つに記載のウェルプレート。
[00475] １４４．ストレプトアビジン官能基は、ウェルプレート又はウェルプレートの１つ若しくは複数のウェルの表面の共有結合官能基化領域にそれぞれ共有結合される、実施形態１３７から１４３のいずれか１つに記載のウェルプレート。
[00476] １４５．ストレプトアビジン官能基は、ビオチン部分とそれぞれ非共有結合され、このビオチン部分は、それ自体、ウェルプレート又はウェルプレートの１つ若しくは複数のウェルの表面の共有結合官能基化領域に共有結合される、実施形態１３７から１４４のいずれか１つに記載のウェルプレート。
[00477] １４６．ストレプトアビジン提示共有結合官能基化領域は、１つ又は複数のウェルの各々の底部表面の面積の約５０％未満の面積をそれぞれ有する、実施形態１３８から１４５のいずれか１つに記載のウェルプレート。
[00478] １４７．ストレプトアビジン提示共有結合官能基化領域各々の面積は、１つ又は複数のウェルの各々の底部の面積の約２５％未満、約１５％未満、約１０％未満、約５％未満又は約２％未満である、実施形態１３８から１４６のいずれか１つに記載のウェルプレート。
[00479] １４８．ストレプトアビジン提示共有結合官能基化領域は、０．５から４．０ｍｍ（例えば、約１．０ｍｍから約３．５ｍｍ又は約１．５ｍｍから約３．０ｍｍ）の寸法をそれぞれ有する、実施形態１３７から１４７のいずれか１つに記載のウェルプレート。
[00480] １４９．ストレプトアビジン提示共有結合官能基化領域は、実質的に円形であり、且つ０．５から４．０ｍｍ（例えば、約１．０ｍｍから約３．５ｍｍ又は約１．５ｍｍから約３．０ｍｍ）の直径をそれぞれ有する、実施形態１３７から１４８のいずれか１つに記載のウェルプレート。
[00481] １５０．ウェルプレートの表面は、複数のビオチン提示又はストレプトアビジン提示共有結合官能基化領域を含む、実施形態１２６から１４９のいずれか１つに記載のウェルプレート。
[00482] １５１．複数のビオチン提示又はストレプトアビジン提示共有結合官能基化領域は、ウェルプレートのウェルの底部にクラスター形成される、実施形態１５０に記載のウェルプレート。
[00483] １５２．複数のビオチン提示又はストレプトアビジン提示共有結合官能基化領域の各々の面積は、１つ又は複数のウェルの各々の底部の面積の約５％未満、約２％未満又は約１％未満であり、さらに、複数の領域の総面積は、１つ又は複数のウェルの各々の底部の面積の約５０％未満又は約２５％未満である、実施形態１５１に記載のウェルプレート。
[00484] １５３．ストレプトアビジン提示共有結合官能基化領域は、炭素、ケイ素、窒素及び酸素から選択される１０個以上の骨格原子を有するリンカーを介して表面に共有結合されたストレプトアビジン官能基を含む、実施形態１３７から１５２のいずれか１つに記載のウェルプレート。具体的実施形態では、リンカーは、約１０から約５０個の骨格原子若しくは一続きの約５、７、９、１０、１１、１３、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、９０、１００、２００結合長又はそれらの間の任意の数の結合長を有し得る。
[00485] １５４．ウェルプレート又は１つ若しくは複数のウェルの各々の表面は、表面遮断リガンドを含む第２共有結合修飾領域をさらに含む、実施形態１２６から１５３のいずれか１つに記載のウェルプレート。
[00486] １５５．表面遮断リガンドの各々は、親水性又は負荷電部分を含む、実施形態１５４に記載のウェルプレート。
[00487] １５６．表面遮断リガンドは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分を含む、実施形態１５４又は１５５に記載のウェルプレート。
[00488] １５７．第２共有結合修飾領域は、接着刺激部分を提供する少なくとも１つのリガンドをさらに含む、実施形態１５４から１５６のいずれか１つに記載のウェルプレート。
[00489] １５８．ストレプトアビジン官能基は、実施形態１２２から１２９のいずれか１つに記載の表面の共有結合官能基化領域に共有結合又は非共有結合される、実施形態１３７から１５７のいずれか１つに記載のウェルプレート。
[00490] １５９．Ｔ細胞を活性化するためにウェルプレートの抗原提示共有結合官能基化領域を有する表面を含むウェルプレート。
[00491] １６０．ウェルプレートの１つ又は複数のウェルの各々は、抗原提示共有結合官能基化領域を有する表面を含む、実施形態１５９に記載のウェルプレート。
[00492] １６１．１つ又は複数のウェルの各々の抗原提示共有結合官能基化領域は、対応するウェルの底部表面に位置する、実施形態１５９又は１６０に記載のウェルプレート。
[00493] １６２．抗原提示共有結合官能基化領域は、複数の特異的に結合された一次活性化分子リガンドと、複数の特異的に結合された共活性化分子リガンドとを含む、実施形態１５９から１６１のいずれか１つに記載のウェルプレート。
[00494] １６３．複数の特異的に結合された一次活性化分子リガンドは、Ｔ細胞のＴ細胞受容体と結合するように構成された主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子（例えば、クラスＩ又はクラスＩＩ）をそれぞれ含む、実施形態１６２に記載のウェルプレート。
[00495] １６４．ＭＨＣ分子は、ＭＨＣクラスＩタンパク質配列及びβミクログロブリンタンパク質配列を含む、実施形態１６３に記載のウェルプレート。
[00496] １６５．ＭＨＣ分子を含む複数の一次活性化分子の各々は、抗原ペプチド及び任意選択で腫瘍関連抗原、ウイルス抗原、細菌抗原、真菌抗原又は原生動物抗原をさらに含む、実施形態１６３又は１６４に記載のウェルプレート。
[00497] １６６．抗原ペプチドは、腫瘍関連抗原であり、任意選択で、腫瘍関連抗原は、ＳＬＣ４５Ａ２、ＴＣＬ１、ＶＣＸ３Ａ、ＭＡＲＴ１又はＮＹＥＳＯ１である、実施形態１６５に記載のウェルプレート。
[00498] １６７．ＭＨＣ分子のタンパク質配列は、タンパク質配列のＣ末端結合を介して抗原提示合成表面に連結される、実施形態１６３から１６６のいずれか１つに記載のウェルプレート。
[00499] １６８．複数の特異的に結合された共活性化分子リガンドは、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）共活性化分子又は補助ＴＣＲ活性化分子をそれぞれ含む、実施形態１６２から１６７のいずれか１つに記載のウェルプレート。
[00500] １６９．複数の共活性化分子リガンドのＴＣＲ共活性化分子と補助ＴＣＲ活性化分子との比は、約１００：１から約１：１００である、実施形態１６８に記載のウェルプレート。
[00501] １７０．複数の共活性化分子リガンドのＴＣＲ共活性化分子と補助ＴＣＲ活性化分子との比は、１００：１から９０：１、９０：１から８０：１、８０：１から７０：１、７０：１から６０：１、６０：１から５０：１、５０：１から４０：１、４０：１から３０：１、３０：１から２０：１、２０：１から１０：１、１０：１から１：１、３：１から１：３、１：１から１：１０、１：１０から１：２０、１：２０から１：３０、１：３０から１：４０、１：４０から１：５０、１：５０から１：６０、１：６０から１：７０、１：７０から１：８０、１：８０から１：９０又は１：９０から１：１００であり、上記数値の各々は、「約」により修正される、実施形態１６８から１６９のいずれか１つに記載のウェルプレート。
[00502] １７１．複数の共活性化分子リガンドのＴＣＲ共活性化分子と補助ＴＣＲ活性化分子との比は、約２０：１から約１：２０又は約３：１から約１：３である、実施形態１６８から１７０のいずれか１つに記載のウェルプレート。
[00503] １７２．ＴＣＲ共活性化分子は、ＣＤ２８結合タンパク質又はＣＤ２８に対する結合能力を保持するその断片を含む、実施形態１６８から１７１のいずれか１つに記載のウェルプレート。
[00504] １７３．ＣＤ２８結合タンパク質又はその断片は、部位特異的Ｃ末端ビオチン部分をさらに含む、実施形態１７２に記載のウェルプレート。
[00505] １７４．Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）共活性化分子は、ＣＤ８０分子又はその断片を含み、断片は、ＣＤ２８に対する結合活性を保持する、実施形態１６８から１７３のいずれか１つに記載のウェルプレート。
[00506] １７５．Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）共活性化分子は、抗ＣＤ２８抗体又はその断片を含む、実施形態１６８から１７４のいずれか１つに記載のウェルプレート。
[00507] １７６．補助ＴＣＲ活性化分子は、ＣＤ２結合タンパク質を含む、実施形態１６８から１７５のいずれか１つに記載のウェルプレート。
[00508] １７７．ＣＤ２結合タンパク質又はその断片は、部位特異的Ｃ末端ビオチン部分をさらに含む、実施形態１７６に記載のウェルプレート。
[00509] １７８．補助ＴＣＲ活性化分子は、ＣＤ５８分子又はその断片を含み、断片は、ＣＤ２との結合活性を保持する、実施形態１６８から１７９のいずれか１つに記載のウェルプレート。
[00510] １７９．補助ＴＣＲ活性化分子は、抗ＣＤ２抗体又はその断片を含む、実施形態１６８から１７８のいずれか１つに記載のウェルプレート。
[00511] １８０．複数の特異的に結合された一次活性化分子リガンド及び複数の特異的に結合された共活性化分子リガンドは、実施形態１から１１、実施形態３１から３３のいずれか１つ又は実施形態１３７から１５９のいずれか１つに記載のウェルプレートのストレプトアビジン提示共有結合官能基化領域のストレプトアビジン官能基に特異的に結合される、実施形態１６６から１７９のいずれか１つに記載のウェルプレート。
[00512] １８１．複数の特異的に結合された一次活性化分子リガンドは、抗原提示共有結合官能基化領域において、１平方ミクロン当たり少なくとも約１×１０２分子又は１平方ミクロン当たり約１×１０２から約１×１０５分子の密度を有する、実施形態１６６から１８０のいずれか１つに記載のウェルプレート。
[00513] １８２．複数の特異的に結合された共活性化分子リガンドは、抗原提示共有結合官能基化領域において、１平方ミクロン当たり約１×１０２から約１×１０５分子又は１平方ミクロン当たり約１×１０３から約１×１０５分子の密度を有する、実施形態１６６から１８１のいずれか１つに記載のウェルプレート。
[00514] １８３．アジド提示共有結合官能基化領域を有する表面を含むウェルプレートを作製する方法であって、
[00515] ウェルプレートの表面の一部の酸化物部分をアジド含有カップリング試薬と接触させることと；
[00516] ウェルプレートのアジド提示共有結合官能基化領域を形成することと
を含む方法。
[00515] ウェルプレートの表面の一部の酸化物部分をアジド含有カップリング試薬と接触させることと；
[00516] ウェルプレートのアジド提示共有結合官能基化領域を形成することと
を含む方法。
[00517] １８４．表面の部分の酸化物部分をアジド含有カップリング試薬と接触させる前にウェルプレートの表面をプラズマクリーニングすることをさらに含む、実施形態１８３に記載の方法。
[00518] １８５．接触を行う際、アジド含有カップリング試薬は、気相で存在する、実施形態１８３又は１８４に記載の方法。
[00519] １８６．アジド含有カップリング試薬は、５から９炭素の炭素骨格を有するリンカーを含む、実施形態１８３から１８５のいずれか１つに記載の方法。
[00520] １８７．リンカーは、７炭素の炭素骨格を有する、実施形態１８６に記載の方法。
[00521] １８８．ウェルプレートの表面は、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ポリエチレン、シクロオレフィンコポリマー又はメラミンを含む（又はそれから構成されるか若しくは実質的にそれから構成される）、実施形態１８３から１８７のいずれか１つに記載の方法。
[00522] １８９．アジド提示共有結合官能基化領域は、少なくとも５０／ｕｍ２のアジド基の密度を有する、実施形態１８３から１８８のいずれか１つに記載の方法。
[00523] １９０．ウェルプレートの表面の部分の酸化物部分をアジド含有カップリング試薬と接触させることは、ウェルプレートの１つ又は複数のウェルの各々の表面をアジド含有カップリング試薬と接触させ、それにより１つ又は複数のウェルの各々にアジド提示共有結合官能基化領域を有する表面を形成することを含む、実施形態１８３から１８９のいずれか１つに記載の方法。
[00524] １９１．１つ又は複数のウェルの表面を接触させることは、対応するウェルの底部表面をアジド含有カップリング試薬と接触させ、それにより１つ又は複数のウェルの各々の底部表面にアジド提示共有結合官能基化領域を形成することを含む、実施形態１９０に記載の方法。
[00525] １９２．１つ又は複数のウェルの各々の底部表面を接触させることは、底部表面のみを接触させ、それにより１つ又は複数のウェルの各々の底部表面のみにアジド提示共有結合官能基化領域を形成することを含む、実施形態１９１に記載の方法。
[00526] １９３．ビオチン提示共有結合官能基化領域を有する表面を含むウェルプレートを作製する方法であって、
[00527] 反応性基に連結したビオチン部分を含む試薬とウェルプレートの表面の一部を接触させることであって、反応性基は、表面の反応性部分と反応するように構成される、接触させることにより、ウェルプレートのビオチン提示官能基化領域を形成することと、
[00528] 反応性基に連結した表面遮断リガンドを含む試薬とウェルプレートの表面を接触させることであって、反応性基は、表面の反応性部分と反応するように構成される、接触させることにより、表面の遮断リガンド修飾領域を提供することと
を含む方法。
[00527] 反応性基に連結したビオチン部分を含む試薬とウェルプレートの表面の一部を接触させることであって、反応性基は、表面の反応性部分と反応するように構成される、接触させることにより、ウェルプレートのビオチン提示官能基化領域を形成することと、
[00528] 反応性基に連結した表面遮断リガンドを含む試薬とウェルプレートの表面を接触させることであって、反応性基は、表面の反応性部分と反応するように構成される、接触させることにより、表面の遮断リガンド修飾領域を提供することと
を含む方法。
[00529] １９４．遮断リガンド修飾領域及びビオチン提示領域は、表面全体を覆い、任意選択で、遮断リガンド修飾領域及びビオチン提示領域は、表面の非重複領域である、実施形態１９３に記載の方法。
[00530] １９５．反応性基に連結したビオチン部分を含む試薬とウェルプレートの表面の一部を接触させることは、ウェルプレートの１つ又は複数のウェルの各々における表面を接触させることを含む、実施形態１９３又は１９４に記載の方法。
[00531] １９６．１つ又は複数のウェルの各々を接触させることは、対応するウェルの底部表面における１つ又は複数のウェルの各々を、反応性基に連結したビオチン部分を含む試薬と接触させ、それにより対応するウェルの底部表面にビオチン提示共有結合官能基化領域を生成することをさらに含む、実施形態１９５に記載の方法。
[00532] １９７．ビオチン提示共有結合官能基化領域は、対応するウェルの底部表面のみに形成される、実施形態１９６に記載の方法。
[00533] １９８．ビオチン提示共有結合官能基化領域は、少なくとも５０／ｕｍ２のビオチン官能基の密度を有する、実施形態１９３から１９７のいずれか１つに記載の方法。
[00534] １９９．ビオチン提示共有結合官能基化領域は、１つ又は複数のウェルの各々の底部の面積の約５０％未満の面積を有する、実施形態１９３から１９８のいずれか１つに記載の方法。
[00535] ２００．ビオチン提示共有結合官能基化領域の面積は、１つ又は複数のウェルの各々の底部の面積の約２５％未満、約１５％未満、約１０％未満、約５％未満、約２％未満又は約１％未満である、実施形態１９３から１９９のいずれか１つに記載の方法。
[00536] ２０１．ビオチン提示共有結合官能基化領域の面積は、約３５ｍｍ２、約２０ｍｍ２、約１２ｍｍ２、約５ｍｍ２、約２ｍｍ２又は約１ｍｍ２未満の面積を有する、実施形態１９３から２００のいずれか１つに記載の方法。
[00537] ２０２．ビオチン提示共有結合官能基化領域は、約０．５ｍｍから約４．０ｍｍ（例えば、約１．０ｍｍから約３．５ｍｍ又は約１．５ｍｍから約３．０ｍｍ）の寸法を有する、実施形態１９３から２０１のいずれか１つに記載の方法。
[00538] ２０３．ビオチン提示共有結合官能基化領域は、実質的に円形であり、且つ約０．５ｍｍから約４．０ｍｍ（例えば、約１．０ｍｍから約３．５ｍｍ又は約１．５ｍｍから約３．０ｍｍ）の直径を有する、実施形態１９３から２０２のいずれか１つに記載の方法。
[00539] ２０４．反応性基に連結したビオチン部分を含む試薬と１つ又は複数のウェルの各々の底部の複数の領域を接触させ、それにより１つ又は複数のウェルの各々に複数のビオチン提示領域を生成することをさらに含む、実施形態１９６から２０３のいずれか１つに記載の方法。
[00540] ２０５．反応性基に連結したビオチン部分を含む試薬は、銅依存性クリックカップリング試薬である、実施形態１９３から２０４のいずれか１つに記載の方法。
[00541] ２０６．銅依存性クリックカップリング試薬と表面の部分の接触後且つ表面遮断リガンドを含む試薬と表面を接触させる前に、ウェルプレートの表面をチオール含有試薬又は銅−キレート化試薬と接触させることをさらに含む、実施形態２０５に記載の方法。
[00542] ２０７．表面遮断リガンドの各々は、親水性又は負荷電部分を含む、実施形態１９３から２０６のいずれか１つに記載の方法。
[00543] ２０８．表面遮断リガンドは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分を含む、実施形態１９３から２０７のいずれか１つに記載の方法。
[00544] ２０９．１つ又は複数のウェルの各々の１つ又は複数の表面を、接着刺激をもたらすように構成されたリガンドを含む試薬と接触させることをさらに含み、接触させることは、１つ又は複数のウェルの各々の表面を、反応性基に連結したビオチン部分を含む試薬と接触させた後に実施され、それにより、１つ又は複数のウェルのビオチン提示領域の外側において、接着刺激をもたらすように構成されたリガンドを配置する、実施形態１９６から２０８のいずれか１つに記載の方法。
[00545] ２１０．反応性部分は、ウェルプレートの１つ又は複数のウェル内に配置される、実施形態１９３から２０９のいずれか１つに記載の方法。
[00546] ２１１．表面の反応性部分は、アジド又はアルキニル反応性部分を含む、実施形態１９３７から２１０４のいずれか１つに記載の方法。
[00547] ２１２．ウェルプレートは、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ポリエチレン、シクロオレフィンコポリマー又はメラミンを含む、実施形態１９３から２１１のいずれか１つに記載の方法。
[00548] ２１３．ストレプトアビジン提示共有結合官能基化領域を有する表面を含むウェルプレートを作製する方法であって、ウェルプレートの表面の一部を、反応性基に連結したストレプトアビジン官能基を含む試薬又は反応性基に連結したビオチン部分を含む試薬と接触させることであって、反応性基は、表面の反応性部分と反応するように構成され、試薬が、反応性基に連結したビオチン部分を含むとき、続いて表面の部分をストレプトアビジンと接触させ、それによりウェルプレートのストレプトアビジン提示官能基化領域を形成する、接触させることと、ウェルプレートの表面を、表面の反応性部分と反応するように構成される反応性基に連結した表面遮断リガンドを含む試薬と接触させて、表面の遮断リガンド修飾領域を提供することとを含む方法。
[00549] ２１４．遮断リガンド修飾領域及びストレプトアビジン提示領域は、表面全体を覆い、任意選択で、遮断リガンド修飾領域及びストレプトアビジン提示領域は、表面の非重複領域である、実施形態２１３に記載の方法。
[00550] ２１５．ウェルプレートの表面の部分と、反応性基に連結したストレプトアビジン部分を含む試薬又はビオチン部分を含む試薬とを接触させることは、ウェルプレートの１つ又は複数のウェルの各々における表面を接触させることを含む、実施形態２１３又は２１４に記載の方法。
[00551] ２１６．１つ又は複数のウェルの各々を接触させることは、対応するウェルの底部表面における１つ又は複数のウェルの各々を、反応性基に連結したストレプトアビジン部分を含む試薬又は反応性基に連結したビオチン部分を含む試薬と接触させ、それにより対応するウェルの底部表面上にストレプトアビジン提示共有結合官能基化領域を生成することをさらに含む、実施形態２１５に記載の方法。
[00552] ２１７．ストレプトアビジン提示共有結合官能基化領域は、対応するウェルの底部表面上のみに形成される、実施形態２１６に記載の方法。
[00553] ２１８．ストレプトアビジン提示共有結合官能基化領域は、少なくとも５０／ｕｍ２のストレプトアビジン官能基の密度を有する、実施形態２１３から２１７のいずれか１つに記載の方法。
[00554] ２１９．ストレプトアビジン提示共有結合官能基化領域は、１つ又は複数のウェルの各々の底部の面積の約５０％未満の面積を有する、実施形態２１３から２１８のいずれか１つに記載の方法。
[00555] ２２０．ストレプトアビジン提示共有結合官能基化領域の面積は、１つ又は複数のウェルの各々の底部の面積の約２５％未満、約１５％未満、約１０％未満、約５％未満、約２％未満又は約１％未満である、実施形態２１３から２１９のいずれか１つに記載の方法。
[00556] ２２１．ストレプトアビジン提示共有結合官能基化領域の面積は、約３５ｍｍ２、約２０ｍｍ２、約１２ｍｍ２、約５ｍｍ２、約２ｍｍ２又は約１ｍｍ２未満の面積を有する、実施形態２１３から２２０のいずれか１つに記載の方法。
[00557] ２２２．ストレプトアビジン提示共有結合官能基化領域は、約０．５ｍｍから約４．０ｍｍ（例えば、約１．０ｍｍから約３．５ｍｍ又は約１．５ｍｍから約３．０ｍｍ）の寸法を有する、実施形態２１３から２２１のいずれか１つに記載の方法。
[00558] ２２３．ストレプトアビジン提示共有結合官能基化領域は、実質的に円形であり、且つ約０．５ｍｍから約４．０ｍｍ（例えば、約１．０ｍｍから約３．５ｍｍ又は約１．５ｍｍから約３．０ｍｍ）の直径を有する、実施形態２１３から２２２のいずれか１つに記載の方法。
[00559] ２２４．反応性基に連結したストレプトアビジン部分を含む試薬又は反応性基に連結したビオチン部分を含む試薬と１つ又は複数のウェルの各々の底部の複数の領域を接触させ、それにより１つ又は複数のウェルの各々に複数のストレプトアビジン提示領域を生成することをさらに含む、実施形態２１３から２２３のいずれか１つに記載の方法。
[00560] ２２５．反応性基に連結したストレプトアビジン部分を含む試薬又は反応性基に連結したビオチン部分を含む試薬は、銅依存性クリックカップリング試薬である、実施形態２１３から２２４のいずれか１つに記載の方法。
[00561] ２２６．銅依存性クリックカップリング試薬と表面の部分の接触後且つ表面遮断リガンドを含む試薬と表面を接触させる前に、ウェルプレートの表面をチオール含有試薬又は銅−キレート化試薬と接触させることをさらに含む、実施形態２２５に記載の方法。
[00562] ２２７．表面遮断リガンドの各々は、親水性又は負荷電部分を含む、実施形態２１３から２２６のいずれか１つに記載の方法。
[00563] ２２８．表面遮断リガンドは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分を含む、実施形態２１３から２２７のいずれか１つに記載の方法。
[00564] ２２９．１つ又は複数のウェルの各々の１つ又は複数の表面を、接着刺激をもたらすように構成されたリガンドを含む試薬と接触させることをさらに含み、接触させることは、１つ又は複数のウェルの各々の表面を、反応性基に連結したストレプトアビジン部分を含む試薬又はビオチン部分を含む試薬と接触させた後に実施され、それにより、１つ又は複数のウェルのストレプトアビジン提示領域の外側において、接着刺激をもたらすように構成されたリガンドを配置する、実施形態２１５から２２８のいずれか１つに記載の方法。
[00565] ２３０．反応性部分は、ウェルプレートの１つ又は複数のウェル内に配置される、実施形態２１３から２２９のいずれか１つに記載の方法。
[00566] ２３１．表面の反応性部分は、アジド又はアルキニル反応性部分を含む、実施形態２１３から２３０のいずれか１つに記載の方法。
[00567] ２３２．ウェルプレートは、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ポリエチレン、シクロオレフィンコポリマー又はメラミンを含む、実施形態２１３から２３１のいずれか１つに記載の方法。
[00568] ２３３．ストレプトアビジン提示共有結合官能基化領域を有する表面を含むウェルプレートを作製する方法であって、表面に反応性部分提示共有結合官能基化表面を形成することと；反応性基に連結したストレプトアビジン部分を含む試薬又は反応性基に連結したビオチン部分を含む試薬と表面を接触させることであって、反応性基は、反応性部分提示表面の反応性部分と反応するように構成され、それによりストレプトアビジン提示官能基化領域又はビオチン提示官能基化表面を形成し、試薬が、反応性基に連結したビオチン部分を含む場合、続いてウェルプレートの部分をストレプトアビジンと接触させ、さらに、表面の反応性部分提示共有結合官能基化リガンド又はビオチン提示官能基化表面は、ＵＶ不安定性連結部分を含む、接触させることと；表面の一部を除く全表面を露出させるように構成されたマスクを介してＵＶ照射に表面を曝露することと；露出したストレプトアビジン又はビオチン修飾表面リガンドのＵＶ不安定性リンカーを切断することにより、ウェルプレートのストレプトアビジン提示共有結合官能基化領域を形成することとを含む方法。
[00569] ２３４．反応性部分提示共有結合官能基化表面を形成することは、反応性部分含有カップリング試薬をウェルプレートの表面の酸化物部分と反応させることを含み、反応性部分含有カップリング試薬は、ＵＶ不安定性連結部分をさらに含む、実施形態２３３に記載の方法。
[00570] ２３５．表面の酸化物部分を反応性部分含有カップリング試薬と接触させる前にウェルプレートの表面をプラズマクリーニングすることをさらに含む、実施形態２３３又は２３４に記載の方法。
[00571] ２３６．反応性基に連結したストレプトアビジン部分を含む試薬又はビオチン部分を含む試薬とウェルプレートの表面を接触させることは、ウェルプレートの１つ又は複数のウェルの各々における表面を接触させることを含む、実施形態２３３から２３５のいずれか１つに記載の方法。
[00572] ２３７．１つ又は複数のウェルの各々を接触させることは、対応するウェルの底部表面における１つ又は複数のウェルの各々を、反応性基に連結したストレプトアビジン部分を含む試薬又は反応性基に連結したビオチン部分を含む試薬と接触させ、それにより対応するウェルの底部表面にストレプトアビジン提示共有結合官能基化領域を生成することをさらに含む、実施形態２３６に記載の方法。
[00573] ２３８．ストレプトアビジン提示共有結合官能基化領域は、対応するウェルの底部表面のみに形成される、実施形態２３７に記載の方法。
[00574] ２３９．ストレプトアビジン提示共有結合官能基化領域は、少なくとも５０／ｕｍ２のストレプトアビジン官能基の密度を有する、実施形態２３３から２３８のいずれか１つに記載の方法。
[00575] ２４０．表面の反応性部分は、アジド部分又はアルキニル部分を含む、実施形態２３３から２３９のいずれか１つに記載の方法。
[00576] ２４１．ストレプトアビジン提示共有結合官能基化領域を形成することは、ストレプトアビジン提示共有結合官能基化領域をウェルプレートの１つ又は複数のウェルの底部のみに形成することを含む、実施形態２３６から２４０のいずれか１つに記載の方法。
[00577] ２４２．Ｔ細胞を活性化するための抗原提示共有結合官能基化領域を有する表面を含むウェルプレートを作製する方法であって、ウェルプレートのストレプトアビジン提示共有結合官能基化領域を、Ｔ細胞のＴ細胞受容体及び結合部分に結合するように構成された主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩ分子をそれぞれ含む複数の一次活性化分子であって、複数の一次活性化分子の結合部分は、ストレプトアビジンの結合部位に結合するように構成される、複数の一次活性化分子と接触させることと；Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）共活性化分子又は補助ＴＣＲ活性化分子をそれぞれ含む複数の共活性化分子であって、ストレプトアビジンの結合部位に結合するように構成された結合部分をそれぞれさらに含む、複数の共活性化分子をウェルプレートのストレプトアビジン提示共有結合官能基化領域の第２の複数の結合部分と接触させることとを含み、それによりウェルプレートの抗原提示共有結合官能基化領域の複数の特異的に結合された一次活性化分子リガンド及び複数の特異的に結合された共活性化分子リガンドを提供する、方法。
[00578] ２４３．ウェルプレートの表面を、反応性基に連結された表面遮断リガンドを含む試薬であって、反応性基は、表面の反応性部分と反応するように構成される、試薬と接触させることにより、表面の遮断リガンド修飾領域を提供することをさらに含む、実施形態２４２に記載の方法。
[00579] ２４４．遮断リガンド修飾領域及び抗原提示共有結合官能基化領域は、表面全体を覆い、任意選択で、遮断リガンド修飾領域及び抗原提示共有結合官能基化領域は、表面の非重複領域である、実施形態２４３に記載の方法。
[00580] ２４５．ウェルプレートのストレプトアビジン提示共有結合官能基化領域と、複数の一次活性化分子及び複数の共活性化分子とを接触させることは、ウェルプレートの１つ又は複数のウェルの各々における表面を接触させることを含む、実施形態２４２から２４４のいずれか１つに記載の方法。
[00581] ２４６．１つ又は複数のウェルの各々を接触させることは、対応するウェルの底部表面の１つ又は複数のウェルの各々を複数の一次活性化分子及び複数の共活性化分子と接触させ、それにより対応するウェルの底部表面に抗原提示共有結合官能基化領域を生成することをさらに含む、実施形態２４５に記載の方法。
[00582] ２４７．抗原提示共有結合官能基化領域は、対応するウェルの底部表面上のみに形成される、実施形態２４６に記載の方法。
[00583] ２４８．ストレプトアビジン提示共有結合官能基化領域は、少なくとも５０／ｕｍ２のストレプトアビジン官能基の密度を有する、実施形態２４２から２４７のいずれか１つに記載の方法。
[00584] ２４９．抗原提示共有結合官能基化領域は、１つ又は複数のウェルの底部の面積の約５０％未満の面積を有する、実施形態２４５から２４８のいずれか１つに記載の方法。
[00585] ２５０．抗原提示共有結合官能基化領域の面積は、１つ又は複数のウェルの底部の面積の約２５％未満、約１５％未満、約１０％未満、約５％未満、約２％未満又は約１％未満である、実施形態２４５から２４８のいずれか１つに記載の方法。
[00586] ２５１．抗原提示共有結合官能基化領域の面積は、約３５ｍｍ２未満、約２０ｍｍ２未満、約１２ｍｍ２未満、約５ｍｍ２未満、約２ｍｍ２未満又は約１ｍｍ２未満の面積を有する、実施形態２４２から２５０のいずれか１つに記載の方法。
[00587] ２５２．抗原提示共有結合官能基化領域は、約０．５ｍｍから約４．０ｍｍ（例えば、約１．０ｍｍから約３．５ｍｍ又は約１．５ｍｍから約３．０ｍｍ）の寸法を有する、実施形態２４２から２５１のいずれか１つに記載の方法。
[00588] ２５３．抗原提示共有結合官能基化領域は、実質的に円形であり、且つ約０．５ｍｍから約４．０ｍｍ（例えば、約１．０ｍｍから約３．５ｍｍ又は約１．５ｍｍから約３．０ｍｍ）の直径を有する、実施形態２４２から２５２のいずれか１つに記載の方法。
[00589] ２５４．ウェルプレートのストレプトアビジン提示共有結合官能基化領域と、複数の一次活性化分子及び複数の共活性化分子とを接触させることは、ウェルプレートの１つ又は複数のウェルの各々における複数のストレプトアビジン提示共有結合官能基化領域を接触させることをさらに含み、それにより１つ又は複数のウェルに複数の抗原提示共有結合官能基化領域を生成する、実施形態２４５から２５３のいずれか１つに記載の方法。
[00590] ２５５．複数の抗原提示共有結合官能基化領域の各々の面積は、１つ又は複数のウェルの底部の面積の約５％未満であり、さらに、複数の抗原提示共有結合官能基化領域の総面積は、１つ又は複数のウェルの底部の面積の約５０％、約２５％又は約１０％未満である、実施形態２５４に記載のウェルプレート。
[00591] ２５６．表面の反応性部分は、アジド又はアルキニル反応性部分である、実施形態２４２から２５５のいずれか１つに記載の方法。
[00592] ２５７．ウェルプレートは、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ポリエチレン、シクロオレフィンコポリマー又はメラミンを含む、実施形態２４２から２５４のいずれか１つに記載の方法。
[00593] ２５８．ＭＨＣ分子は、ＭＨＣクラスＩタンパク質配列及びβミクログロブリンタンパク質配列を含む、実施形態２４２から２５７のいずれか１つに記載の方法。
[00594] ２５９．ＭＨＣ分子を含む複数の一次活性化分子の各々は、腫瘍関連抗原をさらに含む、実施形態２４２から２５８のいずれか１つに記載の方法。
[00595] ２６０．腫瘍関連抗原は、ＳＬＣ４５Ａ２、ＴＣＬ１、ＶＣＸ３Ａ、ＭＡＲＴ１又はＮＹＥＳＯ１である、実施形態２５９に記載の方法。
[00596] ２６１．ＭＨＣ分子のタンパク質配列は、タンパク質配列のＣ末端結合を介して表面に連結される、実施形態２４２から２６０のいずれか１つに記載の方法。
[00597] ２６２．ＭＨＣ分子は、ビオチン部分を含み、且つストレプトアビジンとの非共有結合相互作用によって表面に結合される、実施形態２４２から２６１のいずれか１つに記載の方法。
[00598] ２６３．ストレプトアビジンは、それ自体、表面に共有結合される、実施形態２４２から２６２のいずれか１つに記載の方法。
[00599] ２６４．ストレプトアビジンは、一続きの約５、７、９、１０、１１、１３、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、９０、１００、２００結合長又はそれらの間の任意の数の結合長を介して表面に結合される、実施形態２４２から２６３のいずれか１つに記載の方法。
[00600] ２６５．ストレプトアビジンは、表面と非共有結合される、実施形態２４２から２６４のいずれか１つに記載の方法。
[00601] ２６６．ストレプトアビジンは、ビオチン部分と非共有結合され、及びビオチン部分は、表面と共有結合される、実施形態２６５に記載の方法。
[00602] ２６７．ビオチンは、リンカーにより、約５、７、９、１０、１１、１３、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９５、１００、２００結合長又はそれらの間の任意の数の結合長を介して表面に結合される、実施形態２６２に記載の方法。
[00603] ２６８．抗原提示共有結合官能基化領域における一次活性化分子リガンドと共活性化分子リガンドとの比は、約１：１０から約２：１、約１：５から約２：１、約１：２から約２：１、約１：１０から約１：１、約１：５から約１：１、約１：１から約２：１又は約１：２から約１：１である、実施形態２４２から２６７のいずれか１つに記載の方法。
[00604] ２６９．複数の共活性化分子リガンドのＴＣＲ共活性化分子と補助ＴＣＲ活性化分子との比は、約１００：１から約１：１００である、実施形態２４２から２６８のいずれか１つに記載の方法。
[00605] ２７０．複数の共活性化分子リガンドのＴＣＲ共活性化分子と補助ＴＣＲ活性化分子との比は、１００：１から９０：１、９０：１から８０：１、８０：１から７０：１、７０：１から６０：１、６０：１から５０：１、５０：１から４０：１、４０：１から３０：１、３０：１から２０：１、２０：１から１０：１、１０：１から１：１、３：１から１：３、１：１から１：１０、１：１０から１：２０、１：２０から１：３０、１：３０から１：４０、１：４０から１：５０、１：５０から１：６０、１：６０から１：７０、１：７０から１：８０、１：８０から１：９０又は１：９０から１：１００であり、上記数値の各々は、「約」により修正される、実施形態２４２から２６９のいずれか１つに記載の方法。
[00606] ２７１．複数の共活性化分子リガンドのＴＣＲ共活性化分子と補助ＴＣＲ活性化分子との比は、約２０：１から約１：２０又は約３：１から約１：３である、実施形態２４２から２７０のいずれか１つに記載の方法。
[00607] ２７２．複数の特異的に結合された一次活性化分子リガンドは、抗原提示共有結合官能基化領域において、１平方ミクロン当たり少なくとも約１×１０２分子又は１平方ミクロン当たり約１×１０２から約１×１０５分子の密度を有する、実施形態２４２から２７１のいずれか１つに記載の方法。
[00608] ２７３．複数の特異的に結合された共活性化分子リガンドは、抗原提示共有結合官能基化領域における抗原提示合成表面上において、１平方ミクロン当たり約１×１０２から約１×１０５分子又は１平方ミクロン当たり約１×１０３から約１×１０５分子の密度を有する、実施形態２４２から２７２のいずれか１つに記載のウェルプレート。
[00609] ２７４．Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）共活性化分子は、ＣＤ２８結合タンパク質又はＣＤ２８に対する結合能力を保持するその断片を含む、実施形態２４２から２７３のいずれか１つに記載の方法。
[00610] ２７５．ＣＤ２８結合タンパク質又はその断片は、部位特異的Ｃ末端ビオチン部分をさらに含む、実施形態２７４に記載の方法。
[00611] ２７６．Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）共活性化分子は、ＣＤ８０分子又はその断片を含み、断片は、ＣＤ２８に対する結合活性を保持する、実施形態２４２から２７３のいずれか１つに記載の方法。
[00612] ２７７．Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）共活性化分子は、抗ＣＤ２８抗体又はその断片を含む、実施形態２４２から２７３のいずれか１つに記載の方法。
[00613] ２７８．補助ＴＣＲ活性化分子は、ＣＤ２結合タンパク質を含む、実施形態２４２から２７７のいずれか１つに記載の方法。
[00614] ２７９．ＣＤ２結合タンパク質又はその断片は、部位特異的Ｃ末端ビオチン部分をさらに含む、実施形態２７８に記載の方法。
[00615] ２８０．補助ＴＣＲ活性化分子は、ＣＤ５８分子又はその断片を含み、断片は、ＣＤ２との結合活性を保持する、実施形態２４２から２７７のいずれか１つに記載の方法。
[00616] ２８１．補助ＴＣＲ活性化分子は、抗ＣＤ２抗体又はその断片を含む、実施形態２４２から２７７のいずれか１つに記載の方法。
[00617] ２８２．表面遮断リガンドの各々は、親水性又は負荷電部分を含む、実施形態２４２から２８１のいずれか１つに記載の方法。
[00618] ２８３．表面遮断リガンドは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分を含む、実施形態２４２から２８２のいずれか１つに記載の方法。
[00619] ２８４．リンパ球活性化共有結合官能基化領域を有する表面を含むウェルプレートを作製する方法であって、ウェルプレートのストレプトアビジン提示共有結合官能基化領域を、結合部分をそれぞれ含む複数の第１活性化分子と接触させることを含み、第１活性化分子の結合部分は、ストレプトアビジンの結合部位と結合するように構成され、それによりリンパ球活性化共有結合官能基化領域を提供する、方法。
[00620] ２８５．ウェルプレートの表面を、反応性基に連結した表面遮断リガンドを含む試薬と接触させることをさらに含み、反応性基は、表面の反応性部分と反応するように構成され、それにより表面の遮断リガンド修飾領域を提供する、実施形態２８４に記載の方法。
[00621] ２８６．遮断リガンド修飾領域及びリンパ球活性化共有結合官能基化領域は、表面全体を覆い、任意選択で、遮断リガンド修飾領域及びリンパ球活性化共有結合官能基化領域は、表面の非重複領域である、実施形態２８５に記載の方法。
[00622] ２８７．ウェルプレートのストレプトアビジン提示共有結合官能基化領域と複数の第１活性化分子とを接触させることは、ウェルプレートの１つ又は複数のウェルの各々における表面を接触させることを含む、実施形態２８４から２８６のいずれか１つに記載の方法。
[00623] ２８８．１つ又は複数のウェルの各々を接触させることは、対応するウェルの底部表面における１つ又は複数のウェルの各々を複数の第１活性化分子と接触させ、それにより対応するウェルの底部表面にリンパ球活性化共有結合官能基化領域を生成することをさらに含む、実施形態２８７に記載の方法。
[00624] ２８９．リンパ球活性化共有結合官能基化領域は、対応するウェルの底部表面のみに形成される、実施形態２８８に記載の方法。
[00625] ２９０．ストレプトアビジン提示共有結合官能基化領域は、少なくとも５０／ｕｍ２のストレプトアビジン官能基の密度を有する、実施形態２８４から２８７のいずれか１つに記載の方法。
[00626] ２９１．リンパ球活性化共有結合官能基化領域は、１つ又は複数のウェルの底部の面積の約５０％未満の面積を有する、実施形態２８７から２９０のいずれか１つに記載の方法。
[00627] ２９２．リンパ球活性化共有結合官能基化領域の面積は、１つ又は複数のウェルの底部の面積の約２５％未満、約１５％未満、約１０％未満、約５％未満、約２％未満又は約１％未満である、実施形態２８７から２９１のいずれか１つに記載の方法。
[00628] ２９３．リンパ球活性化共有結合官能基化領域の面積は、約３５ｍｍ２、約２０ｍｍ２、約１２ｍｍ２、約５ｍｍ２、約２ｍｍ２又は約１ｍｍ２未満の面積を有する、実施形態２８４から２９２のいずれか１つに記載の方法。
[00629] ２９４．リンパ球活性化共有結合官能基化領域は、約０．５ｍｍから約４．０ｍｍ（例えば、約１．０ｍｍから約３．５ｍｍ又は約１．５ｍｍから約３．０ｍｍ）の寸法を有する、実施形態２８４から２９３のいずれか１つに記載の方法。
[00630] ２９５．リンパ球活性化共有結合官能基化領域は、実質的に円形であり、且つ約０．５ｍｍから約４．０ｍｍ（例えば、約１．０ｍｍから約３．５ｍｍ又は約１．５ｍｍから約３．０ｍｍ）の直径を有する、実施形態２８４から２９４のいずれか１つに記載の方法。
[00631] ２９６．ウェルプレートのストレプトアビジン提示共有結合官能基化領域と複数の第１活性化分子とを接触させることは、複数のストレプトアビジン提示共有結合官能基化領域をウェルプレートの１つ又は複数のウェルの各々における複数の第１活性化分子と接触させることをさらに含み、それにより１つ又は複数のウェルの各々に複数のリンパ球活性化共有結合官能基化領域を生成する、実施形態２８４から２９５のいずれか１つに記載の方法。
[00632] ２９７．複数のリンパ球活性化共有結合官能基化領域の各々の面積は、１つ又は複数のウェルの底部の面積の約５％未満であり、さらに、複数のリンパ球活性化共有結合官能基化領域の総面積は、１つ又は複数のウェルの底部の面積の約５０％、約２５％又は約１０％未満である、実施形態２９６に記載のウェルプレート。
[00633] ２９８．表面の反応性部分は、アジド又はアルキニル反応性部分である、実施形態２８４から２９７のいずれか１つに記載の方法。
[00634] ２９９．ウェルプレートは、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ポリエチレン、シクロオレフィンコポリマー又はメラミンを含む、実施形態２８４から２９８のいずれか１つに記載の方法。
[00635] ３００．リンパ球は、Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞又はＢ細胞である、実施形態２８４から２９９のいずれか１つに記載の方法。
[00636] ３０１．複数の第１活性化分子は、分化結合分子、細胞表面免疫グロブリン結合分子、Ｔ細胞受容体分子活性化分子、ＴＮＦ受容体スーパーファミリー結合分子、ケモカイン受容体結合分子、成長因子分子又は接着促進分子の細胞表面クラスターである、実施形態２８４から３００のいずれか１つに記載の方法。
[00637] ３０２．複数の第１活性化分子は、ＭＨＣ分子、分化結合活性の細胞表面クラスターを保持するタンパク質若しくはその断片、細胞表面免疫グロブリン結合能力を保持するタンパク質若しくはその断片、Ｔ細胞受容体結合活性を保持するタンパク質若しくはその断片、ＴＮＦ受容体スーパーファミリー結合活性を保持するタンパク質若しくはその断片、ケモカイン受容体結合活性を保持するタンパク質若しくはその断片、成長刺激活性を保持するタンパク質若しくはその断片又は接着促進活性を保持するタンパク質若しくはその断片を含む、実施形態３０１に記載の方法。
[00638] ３０３．複数の第１活性化分子は、分化結合活性の細胞表面クラスターを保持するタンパク質若しくはその断片、成長刺激活性を保持するタンパク質若しくはその断片又は接着促進活性を保持するタンパク質若しくはその断片を含む、実施形態３０１又は３０２に記載の方法。
[00639] ３０４．複数の特異的に結合された第１活性化分子リガンドは、リンパ球活性化共有結合官能基化領域において、１平方ミクロン当たり少なくとも約１×１０２分子又は１平方ミクロン当たり約１×１０２から約１×１０５分子の密度を有する、実施形態２８４から３０３のいずれか１つに記載の方法。
[00640] ３０５．ウェルプレートのストレプトアビジン提示共有結合官能基化領域を、結合部分をそれぞれ含む複数の第２活性化分子と接触させることをさらに含み、第２活性化分子の結合部分は、ストレプトアビジンの結合部位と結合するように構成され、それにより、リンパ球活性化共有結合官能基化領域中において、複数の特異的に結合された第２活性化分子リガンドを提供する、実施形態２８４から３０４のいずれか１つに記載の方法。
[00641] ３０６．複数の第２活性化分子は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）共活性化分子、細胞表面免疫グロブリン結合分子、成長因子分子、接着促進分子である、実施形態３０５に記載の方法。
[00642] ３０７．複数の特異的に結合された共活性化分子リガンドは、リンパ球活性化共有結合官能基化領域において、１平方ミクロン当たり約１×１０２から約１×１０５分子又は１平方ミクロン当たり約１×１０３から約１×１０５分子の密度を有する、実施形態３０４又は３０５に記載のウェルプレート。
[00643] ３０８．リンパ球活性化共有結合官能基化領域における一次活性化分子リガンドと共活性化分子リガンドとの比は、約１：１０から約２：１、約１：５から約２：１、約１：２から約２：１、約１：１０から約１：１、約１：５から約１：１、約１：１から約２：１又は約１：２から約１：１である、実施形態２８４から３０７のいずれか１つに記載の方法。
[00644] ３０９．遮断リガンド修飾領域及び抗原提示共有結合官能基化領域は、表面全体を覆い、任意選択で、遮断リガンド修飾領域及びリンパ球活性化共有結合官能基化領域は、表面の非重複領域である、実施形態２８５から３０８のいずれか１つに記載の方法。
[00645] ３１０．表面遮断リガンドの各々は、親水性又は負荷電部分を含む、実施形態２８５から３０９のいずれか１つに記載の方法。
[00646] ３１１．表面遮断リガンドは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分を含む、実施形態２８５から３１０のいずれか１つに記載の方法。
[00647] ３１２．抗原提示共有結合官能基化領域を有する表面を含むウェルプレートを作製するためのキットであって、ビオチン提示共有結合官能基化領域を含む表面を有するウェルプレート；及びストレプトアビジンを含む表面官能基化試薬を含むキット。
[00648] ３１３．ビオチン提示共有結合官能基化領域を有する表面を含むウェルプレートは、反応性部分がビオチンである実施形態１から１１のいずれか１つ、又は反応性部分がビオチンである実施形態３１から３３のいずれか１つ、又は実施形態１２６から１３６のいずれか１つに記載のウェルプレートである、実施形態３１２に記載のキット。
[00649] ３１４．Ｔ細胞のＴ細胞受容体と結合するように構成された複数の主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子（例えば、クラスＩ又はクラスＩＩ）を含む第１活性化試薬をさらに含み、さらに、ＭＨＣ分子は、ストレプトアビジンの結合部位と結合するように構成される、実施形態３１２又は３１３に記載のキット。
[00650] ３１５．複数のＭＨＣ分子の各々は、少なくとも１つのビオチン官能基をさらに含む、実施形態３１２から３１４のいずれか１つに記載のキット。
[00651] ３１６．ストレプトアビジンの結合部位と結合するようにそれぞれ構成された複数の共活性化分子を含む試薬をさらに含み、共活性化分子の各々は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）共活性化分子又は補助ＴＣＲ活性化分子を含む、実施形態３１２から３１５のいずれか１つに記載のキット。
[00652] ３１７．複数の共活性化分子は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）共活性化分子及び補助ＴＣＲ活性化分子を含む、実施形態３１６に記載のキット。
[00653] ３１８．複数の共活性化分子を含む試薬を含む容器は、約２０：１から約１：２０のＴＣＲ共活性化分子と補助ＴＣＲ活性化分子との比を含む、実施形態３１７に記載のキット。
[00654] ３１９．ＴＣＲ共活性化分子は、ＣＤ２８受容体のアゴニストである、実施形態３１２から３１８のいずれか１つに記載のキット。
[00655] ３２０．補助ＴＣＲ活性化分子は、ＣＤ２受容体のアゴニストである、実施形態３１２から３１９のいずれか１つに記載のキット。
[00656] ３２１．成長刺激分子を含む試薬をさらに含み、各成長刺激分子は、成長因子受容体リガンドを含む、実施形態３１２から３２０のいずれか１つに記載のキット。
[00657] ３２２．成長因子受容体リガンドは、ＩＬ−２１又はその断片を含む、実施形態３２１に記載のキット。
[00658] ３２３．ＩＬ−７又はＩＬ−２を含む第２成長刺激分子をさらに含む、実施形態３２１又は３２２に記載のキット。
[00659] ３２４．アジド提示共有結合官能基化領域を含む表面と；第１表面官能基化試薬とを含むウェルプレートを含む、抗原提示共有結合官能基化領域を有する表面を含むウェルプレートを作製するためのキット。
[00660] ３２５．アジド提示共有結合官能基化領域を有する表面を含むウェルプレートは、反応性部分がアジドである実施形態１から１１のいずれか１つ、反応性部分がアジドである実施形態３１から３３のいずれか１つ又は実施形態１２２〜１２９のいずれか１つに記載のウェルプレートである、実施形態３２４に記載のキット。
[00661] ３２６．第１表面官能基化試薬は、反応性基に連結したビオチン部分を含む試薬を含み、反応性基は、表面のアジド部分と反応するように構成される、実施形態３２４又は３２５に記載のキット。
[00662] ３２７．ストレプトアビジンを含む第２表面官能基化試薬をさらに含む、実施形態３２６に記載のキット。
[00663] ３２８．第１官能基化試薬は、反応性基に連結したストレプトアビジン部分を含み、反応性基は、アジド部分と反応するように構成される、実施形態３２６又は３２７に記載のキット。
[00664] ３２９．アジド部分と反応するように構成された反応性基に連結した表面遮断部分を含む表面遮断試薬をさらに含む、実施形態３２４から３２８のいずれか１つに記載のキット。
[00665] ３３０．表面遮断部分は、親水性又は負荷電部分を含む、実施形態３２９に記載のキット。
[00666] ３３１．表面遮断試薬は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分を含む、実施形態３２９又は３３０に記載のキット。
[00667] ３３２．Ｔ細胞のＴ細胞受容体と結合するように構成された複数の主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子（例えば、クラスＩ又はクラスＩＩ）を含む第１活性化試薬をさらに含み、さらに、ＭＨＣ分子は、ストレプトアビジンの結合部位と結合するように構成される、実施形態３２４から３３１のいずれか１つに記載のキット。
[00668] ３３３．複数のＭＨＣ分子の各々は、少なくとも１つのビオチン官能基をさらに含む、実施形態３３２に記載のキット。
[00669] ３３４．ストレプトアビジンの結合部位と結合するように構成されたビオチン部分をそれぞれ有する複数の共活性化分子を含む試薬をさらに含み、共活性化分子の各々は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）共活性化分子又は補助ＴＣＲ活性化分子を含む、実施形態３２４から３３３のいずれか１つに記載のキット。
[00670] ３３５．複数の共活性化分子は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）共活性化分子及び補助ＴＣＲ活性化分子を含む、実施形態３３４に記載のキット。
[00671] ３３６．複数の共活性化分子を含む試薬を含む容器は、約２０：１から約１：２０のＴＣＲ共活性化分子と補助ＴＣＲ活性化分子との比を含む、実施形態３３５に記載のキット。
[00672] ３３７．ＴＣＲ共活性化分子は、ＣＤ２８受容体のアゴニストである、実施形態３２４から３３６のいずれか１つに記載のキット。
[00673] ３３８．補助ＴＣＲ活性化分子は、ＣＤ２受容体のアゴニストである、実施形態３２４から３３７のいずれか１つに記載のキット。
[00674] ３３９．成長刺激分子を含む試薬をさらに含み、各成長刺激分子は、成長因子受容体リガンドを含む、実施形態３２４から３３８のいずれか１つに記載のキット。
[00675] ３４０．成長因子受容体リガンドは、ＩＬ−２１又はその断片を含む、実施形態３３９に記載のキット。
[00676] ３４１．ＩＬ−７又はＩＬ−２を含む第２成長刺激分子をさらに含む、実施形態３３９又は３４０に記載のキット。
[00677] ３４２．Ｔリンパ球（Ｔ細胞）の抗原特異的活性化のための抗原提示共有結合官能基化領域を有する表面を含むウェルプレートを作製するためのキットであって、ストレプトアビジン提示共有結合官能基化領域を有する表面を含むウェルプレートと；Ｔ細胞のＴ細胞受容体と結合するように構成される複数の主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子（例えば、クラスＩ又はクラスＩＩ）を含む第１活性化試薬とを含み、さらに、ＭＨＣ分子は、ストレプトアビジンの結合部位に結合するように構成される、キット。
[00678] ３４３．ウェルプレートは、反応性部分がストレプトアビジンである実施形態１から３８のいずれか１つ又は実施形態１４１から１６２のいずれか１つに記載のストレプトアビジン提示共有結合官能基化領域を有する表面を含むウェルプレートである、実施形態３４２に記載のキット。
[00679] ３４４．複数のＭＨＣ分子の各々は、少なくとも１つのビオチン官能基をさらに含む、実施形態３４３に記載のキット。
[00680] ３４５．ストレプトアビジンの結合部位に結合するように構成された結合部位をそれぞれ有する複数の共活性化分子を含む試薬をさらに含み、共活性化分子の各々は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）共活性化分子又は補助ＴＣＲ活性化分子を含む、実施形態３４２から３４４のいずれか１つに記載のキット。
[00681] ３４６．複数の共活性化分子は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）共活性化分子及び補助ＴＣＲ活性化分子を含む、実施形態３４５に記載のキット。
[00682] ３４７．複数の共活性化分子を含む試薬を含む容器は、約２０：１から約１：２０のＴＣＲ共活性化分子と補助ＴＣＲ活性化分子との比を含む、実施形態３４６に記載のキット。
[00683] ３４８．ＴＣＲ共活性化分子は、ＣＤ２８受容体のアゴニストである、実施形態３４２から３４７のいずれか１つに記載のキット。
[00684] ３４９．補助ＴＣＲ活性化分子は、ＣＤ２受容体のアゴニストである、実施形態３４２から３４８のいずれか１つに記載のキット。
[00685] ３５０．成長刺激分子を含む試薬をさらに含み、各成長刺激分子は、成長因子受容体リガンドを含む、実施形態３４２から３４９のいずれか１つに記載のキット。
[00686] ３５１．成長因子受容体リガンドは、ＩＬ−２１又はその断片を含む、実施形態３５０に記載のキット。
[00687] ３５２．ＩＬ−７又はＩＬ−２を含む第２成長刺激分子をさらに含む、実施形態３５０又は３５１に記載のキット。
[00688] ３５３．癌の処置が必要な対象を処置する方法であって、対象から複数のＴリンパ球（Ｔ細胞）を採取することと；複数のＴ細胞を、抗原提示共有結合官能基化領域を含むウェルプレートの表面と接触させることであって、抗原提示共有結合官能基化領域は、複数のＴ細胞の各々のＴ細胞受容体に結合するように構成される複数の主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子（例えば、クラスＩ又はクラスＩＩ）を含み、ＭＨＣ分子は、対象の癌に特異的な抗原を含む、接触させることと；複数の活性化Ｔ細胞を生産することであって、活性化は、対象の癌に対して特異的であるように構成される、生産することと；非活性化細胞から複数の特異的活性化Ｔ細胞を分離することと；複数の抗原特異的活性化Ｔ細胞を対象に導入することとを含む方法。
[00689] ３５４．抗原提示共有結合官能基化領域を有する表面を含むウェルプレートは、リンパ球活性化部分が一次及び共活性化部分を含む実施形態１２から３８のいずれか１つに記載のウェルプレート又は実施形態１５９から１８２のいずれか１つに記載のウェルプレートである、実施形態３５３に記載の方法。
[00690] ３５５．抗原提示共有結合官能基化領域を有する表面を含むウェルプレートは、実施形態２４２から２８３のいずれか１つに記載の方法により作製される、実施形態３５３又は３５４に記載の方法。
[00691] ３５６．癌の処置が必要な対象を処置する方法であって、対象から複数のＴリンパ球（Ｔ細胞）を採取することと；実施形態３８から８７のいずれか１つに記載の方法によって複数の活性化Ｔ細胞を生産することであって、活性化は、対象の癌に対して特異的であるように構成される、生産することと；非活性化細胞から複数の特異的活性化Ｔ細胞を分離することと；複数の抗原特異的活性化Ｔ細胞を対象に導入することとを含む方法。
Claims (65)
- 反応性部分提示共有結合官能基化領域又は活性化部分提示共有結合官能基化領域である第１領域を有する表面を含むウェルプレートであって、前記反応性部分が、アジド部分、ビオチン部分又はストレプトアビジン部分であり、前記活性化部分が、リンパ球活性化部分である、ウェルプレート
- 前記第１領域が、少なくとも０．５ｍｍ２から５０ｍｍ２の面積を有する、請求項１に記載のウェルプレート。
- 前記第１領域が、０．５ｍｍから４．０ｍｍの寸法を有する、請求項１に記載のウェルプレート。
- 前記第１領域が、実質的に円形であり、且つ０．５ｍｍから４．０ｍｍの直径を有する、請求項１に記載のウェルプレート。
- 前記ウェルプレートの前記表面が、表面遮断リガンドを含む共有結合修飾領域である第２領域をさらに含み、前記第２領域が、前記第１領域を取り囲む、請求項１に記載のウェルプレート。
- 前記ウェルプレートの前記表面が、ガラス又はポリスチレンを含む、請求項１から５のいずれか一項に記載のウェルプレート。
- 前記ウェルプレートの前記表面が、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ポリエチレン、シクロオレフィンコポリマー又はメラミンを含む、請求項１から５のいずれか一項に記載のウェルプレート。
- 前記第１領域が、少なくとも５０／ｕｍ２のそれぞれの反応性部分又は活性化部分の密度を有する、請求項１から５のいずれか一項に記載のウェルプレート。
- 前記第１領域が、炭素、ケイ素、窒素及び酸素から選択される５から２０個の骨格原子、１０から４０個の骨格原子又は１５から５０個の骨格原子を有するリンカーを介して前記表面に共有結合されたそれぞれの反応性部分又は活性化部分を含む、請求項１から５のいずれか一項に記載のウェルプレート。
- 前記反応性部分がストレプトアビジンであり、前記ストレプトアビジン官能基が、前記ウェルプレートの前記表面の前記第１領域に共有結合される、請求項１から５のいずれか一項に記載のウェルプレート。
- 前記反応性部分がストレプトアビジンであり、前記ストレプトアビジン官能基が、ビオチン部分に非共有結合され、前記ビオチン部分が、それ自体、前記ウェルプレートの前記表面の前記第１領域に共有結合される、請求項１から５のいずれか一項に記載のウェルプレート。
- 前記第１領域が、複数の特異的に結合された一次活性化分子リガンドと、複数の特異的に結合された共活性化分子リガンドとを含む活性化部分提示共有結合官能基化領域である、請求項１から５のいずれか一項に記載のウェルプレート。
- 前記表面の前記第１領域上における前記一次活性化分子リガンドと前記共活性化分子リガンドとの比が、１：５から２：１又は１：２から１：１である、請求項１２に記載のウェルプレート。
- 前記複数の特異的に結合された一次活性化分子リガンドの各リガンドが、Ｔ細胞のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）に結合するように構成された主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子を含む、請求項１２に記載のウェルプレート。
- 前記ＭＨＣ分子が、ＭＨＣクラスＩタンパク質配列及びβミクログロブリンタンパク質配列を含む、請求項１４に記載のウェルプレート。
- 前記複数の特異的に結合された一次活性化分子リガンドの各リガンドが、抗原ペプチドをさらに含むＭＨＣ分子を含む、請求項１４に記載のウェルプレート。
- 前記抗原ペプチドが、腫瘍関連抗原、ウイルス抗原、細菌抗原、真菌抗原又は原生動物抗原である、請求項１６に記載のウェルプレート。
- 前記抗原ペプチドが、腫瘍関連抗原であり、任意選択で、前記腫瘍関連抗原が、ＳＬＣ４５Ａ２、ＴＣＬ１、ＶＣＸ３Ａ、ＭＡＲＴ１又はＮＹＥＳＯ１である、請求項１７に記載のウェルプレート。
- 前記ＭＨＣ分子が、Ｃ末端結合を介して前記活性化部分提示共有結合官能基化領域に連結される、請求項１４に記載のウェルプレート。
- 前記複数の特異的に結合された共活性化分子リガンドの各リガンドが、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）共活性化分子又は補助ＴＣＲ活性化分子を含む、請求項１２に記載のウェルプレート。
- 前記複数の特異的に結合された共活性化分子リガンドの前記ＴＣＲ共活性化分子と前記補助ＴＣＲ活性化分子との比が、３：１から１：３である、請求項２０に記載のウェルプレート。
- 前記ＴＣＲ共活性化分子が、ＣＤ２８結合タンパク質又はＣＤ２８に対する結合能力を保持するその断片を含み、任意選択で、前記ＣＤ２８結合タンパク質又はその断片が、部位特異的Ｃ末端ビオチン部分をさらに含む、請求項２０に記載のウェルプレート。
- 前記ＴＣＲ共活性化分子が、ＣＤ８０分子又はその断片を含み、前記断片は、ＣＤ２８に対する結合活性を保持する、請求項２０に記載のウェルプレート。
- 前記ＴＣＲ共活性化分子が、抗ＣＤ２８抗体又はその断片を含み、前記断片が、ＣＤ２８に対する結合活性を保持する、請求項２０に記載のウェルプレート。
- 前記補助ＴＣＲ活性化分子が、ＣＤ２結合タンパク質又はＣＤ２に対する結合活性を保持するその断片を含み、任意選択で、前記ＣＤ２結合タンパク質又はその断片が、部位特異的Ｃ末端ビオチン部分をさらに含む、請求項２０に記載のウェルプレート。
- 前記補助ＴＣＲ活性化分子が、ＣＤ５８分子又はその断片を含み、前記断片が、ＣＤ２との結合活性を保持する、請求項２０に記載のウェルプレート。
- 前記補助ＴＣＲ活性化分子が、抗ＣＤ２抗体又はその断片を含み、前記断片が、ＣＤ２との結合活性を保持する、請求項２０に記載のウェルプレート。
- 前記複数の特異的に結合された一次活性化分子リガンド及び前記複数の特異的に結合された共活性化分子リガンドが、前記ウェルプレートのストレプトアビジン提示第１領域のストレプトアビジン官能基に特異的に結合される、請求項１２に記載のウェルプレート。
- 前記複数の特異的に結合された一次活性化分子リガンドが、前記第１領域において、１平方ミクロン当たり少なくとも１×１０２分子の密度、及び任意選択で、前記第１領域において、１平方ミクロン当たり１×１０２から１×１０５分子の密度を有する、請求項１２に記載のウェルプレート。
- 前記複数の特異的に結合された共活性化分子リガンドが、前記第１領域において、１平方ミクロン当たり少なくとも１×１０２分子、及び任意選択で、前記第１領域において、１平方ミクロン当たり１×１０３から１×１０５分子の密度を有する、請求項１２に記載のウェルプレート。
- ウェルプレートであって、前記ウェルプレートの１つ又は複数のウェルの各々が、請求項１から５のいずれか一項に記載のウェルプレートの前記表面及びその前記第１領域を含む、ウェルプレート。
- 前記１つ又は複数のウェルの各々の前記第１領域が、前記対応するウェルの底部表面上に位置する、請求項３１に記載のウェルプレート。
- それぞれの第１領域の面積が、前記対応するウェルの前記底部表面の面積の約２５％未満である、請求項３２に記載のウェルプレート。
- Ｔリンパ球（Ｔ細胞）を活性化する方法であって、
複数のＴ細胞をウェルプレートの表面の抗原提示共有結合官能基化領域と接触させることであって、前記抗原提示共有結合官能基化領域が、Ｔ細胞のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）に結合するように構成された主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子をそれぞれ含む複数の一次活性化分子リガンドであって、各々が、前記表面に結合される、複数の一次活性化分子リガンドと；Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）共活性化分子又は補助ＴＣＲ活性化分子をそれぞれ含む複数の共活性化分子リガンドであって、各々が、前記表面に結合される、複数の共活性化分子リガンドと、を含むことと；
前記複数のＴ細胞を前記表面の前記抗原提示共有結合官能基化領域と接触させて培養し、それにより前記複数のＴ細胞の少なくとも一部を活性化Ｔ細胞に変換することとと、
を含む方法。 - 前記Ｔ細胞が、ＣＤ８＋Ｔ細胞を含む、請求項３４に記載の方法。
- 前記抗原提示共有結合官能基化領域が、請求項１２から３０のいずれか一項に記載のウェルプレートの表面の第１領域である、請求項３４に記載の方法。
- 前記複数の共活性化分子リガンドが、ＴＣＲ共活性化分子及び補助ＴＣＲ活性化分子を含む、請求項３４又は３５に記載の方法。
- 前記複数の共活性化分子リガンドの前記ＴＣＲ共活性化分子と前記補助ＴＣＲ活性化分子との比が、３：１から１：３である、請求項３７に記載の方法。
- 前記複数のＭＨＣ分子の各分子が、ＭＨＣクラスＩタンパク質配列、βミクログロブリンタンパク質配列及び抗原ペプチドを含む、請求項３４又は３５に記載の方法。
- 前記抗原ペプチドが、腫瘍関連抗原、ウイルス抗原、細菌抗原、真菌抗原又は原生動物抗原である、請求項３９に記載の方法。
- 前記抗原ペプチドが、腫瘍関連抗原であり、任意選択で、前記腫瘍関連抗原は、ＳＬＣ４５Ａ２、ＴＣＬ１、ＶＣＸ３Ａ、ＭＡＲＴ１又はＮＹＥＳＯ１である、請求項４０に記載の方法。
- 前記Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）共活性化分子が、ＣＤ２８結合タンパク質又はＣＤ２８に対する結合能力を保持するその断片を含む、請求項３４又は３５に記載の方法。
- 前記Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）共活性化分子が、ＣＤ８０分子若しくはその断片を含み、前記断片が、ＣＤ２８に対する結合活性を保持するか；又は前記Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）共活性化分子が、抗ＣＤ２８抗体若しくはその断片を含み、前記断片が、ＣＤ２８に対する結合活性を保持する、請求項３４又は３５に記載の方法。
- 前記補助ＴＣＲ活性化分子が、ＣＤ２結合タンパク質又はＣＤ２に対する結合能力を保持するその断片を含む、請求項３４又は３５に記載の方法。
- 前記補助ＴＣＲ活性化分子が、ＣＤ５８分子若しくはその断片を含み、前記断片が、ＣＤ２との結合活性を保持するか；又は前記補助ＴＣＲ活性化分子が、抗ＣＤ２抗体若しくはその断片を含み、前記断片が、ＣＤ２との結合活性を保持する、請求項３４又は３５に記載の方法。
- 前記複数の特異的に結合された一次活性化分子リガンドが、前記表面の前記抗原提示共有結合官能基化領域において、１平方ミクロン当たり少なくとも１×１０２分子の密度、又は任意選択で、前記表面の前記抗原提示共有結合官能基化領域において、１平方ミクロン当たり１×１０２から１×１０５分子の密度を有する、請求項３４又は３５に記載の方法。
- 前記複数の特異的に結合された共活性化分子リガンドが、前記表面の前記抗原提示共有結合官能基化領域において、１平方ミクロン当たり少なくとも１×１０２分子、又は任意選択で、前記表面の前記抗原提示共有結合官能基化領域において、１平方ミクロン当たり１×１０３から１×１０５分子の密度を有する、請求項３４又は３５に記載の方法。
- 前記表面の前記抗原提示共有結合官能基化領域における前記一次活性化分子リガンドと前記共活性化分子リガンドとの比が、１：５から２：１又は任意選択で１：２から１：１である、請求項３４又は３５に記載の方法。
- 前記複数の共活性化分子リガンドの前記ＴＣＲ共活性化分子と前記補助ＴＣＲ活性化分子との比が、３：１から１：３である、請求項３４又は３５に記載の方法。
- 前記複数のＴ細胞を複数の接着刺激分子リガンドと接触させることをさらに含み、任意選択で、前記複数の接着刺激分子リガンドが、ＩＣＡＭ分子を含む、請求項３４又は３５に記載の方法。
- 前記複数のＴ細胞を複数の成長刺激分子リガンドと接触させることをさらに含む、請求項３４又は３５に記載の方法。
- 前記成長刺激分子リガンドの各々が、成長因子受容体リガンドを含む、請求項７２に記載の方法。
- 前記成長因子受容体リガンドが、ＩＬ−２１又はその断片を含む、請求項７３に記載の方法。
- 前記複数の成長刺激分子リガンドと接触させることが、少なくとも１日の第１培養期間後に実施される、請求項５１に記載の方法。
- 前記抗原提示合成表面と接触させて培養することが、約４日から約７日の期間にわたって実施される、請求項３４又は３５に記載の方法。
- 前記活性化Ｔ細胞が、ＣＤ４５ＲＯ＋及び／又はＣＤ２８陽性である、請求項３４又は３５に記載の方法。
- 前記抗原提示官能基化領域の面積が、前記ウェルプレートのウェルの底部表面の面積の約２５％未満である、請求項３４又は３５に記載の方法。
- リンパ球を活性化する方法であって、
複数のリンパ球をウェルプレートの表面の活性化部分提示共有結合官能基化領域と接触させることであって、前記活性化部分提示共有結合官能基化領域が、前記表面に結合された複数の一次活性化分子リガンドと；前記表面に結合された複数の共活性化分子リガンドとを含むことと；
前記複数のリンパ球を培養し、それにより前記複数のリンパ球の少なくとも一部を活性化リンパ球に変換することと
を含む方法。 - 前記リンパ球が、Ｂ細胞、Ｔ細胞又はＮＫ細胞を含む、請求項５８に記載の方法。
- 前記活性化部分提示共有結合官能基化領域が、請求項１から１３のいずれか一項に記載のウェルプレートの表面の第１領域である、請求項５８又は５９に記載の方法。
- 前記活性化部分提示官能基化領域の面積が、前記ウェルプレートのウェルの底部表面の面積の２５％未満である、請求項５８又は５９に記載の方法。
- 活性化部分提示共有結合官能基化領域を有する表面を含むウェルプレートを作製するキットであって、
反応性部分提示共有結合官能基化領域を含む表面を含むウェルプレートであって、反応性部分が、アジド部分、ビオチン部分又はストレプトアビジン部分である、ウェルプレート；及び
活性化試薬；並びに
任意選択で、表面官能基化試薬
を含むキット。 - 前記表面官能基化試薬を含み、前記表面官能基化試薬が、前記反応性部分と反応するように構成されたビオチン含有試薬又はストレプトアビジン含有試薬である、請求項６２に記載のキット。
- 前記活性化試薬が、Ｔ細胞のＴ細胞受容体と結合するように構成され、且つストレプトアビジンの結合部位又は複数のＣＤ３結合分子に結合するように構成された複数の主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子を含む一次活性化試薬を含む、請求項６２又は６３に記載のキット。
- ストレプトアビジンの結合部位に結合するようにそれぞれ構成された複数の共活性化分子を含む共活性化試薬をさらに含み、前記共活性化分子の各々が、ＣＤ２結合分子又はＣＤ２８結合分子を含む、請求項６４に記載のキット。
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US201862734924P | 2018-09-21 | 2018-09-21 | |
| US62/734,924 | 2018-09-21 | ||
| US201962893712P | 2019-08-29 | 2019-08-29 | |
| US62/893,712 | 2019-08-29 | ||
| PCT/US2019/052228 WO2020061499A1 (en) | 2018-09-21 | 2019-09-20 | Functionalized well plate, methods of preparation and use thereof |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2022502017A true JP2022502017A (ja) | 2022-01-11 |
| JPWO2020061499A5 JPWO2020061499A5 (ja) | 2022-09-27 |
Family
ID=69888950
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2021515077A Pending JP2022502017A (ja) | 2018-09-21 | 2019-09-20 | 官能基化ウェルプレート、その作製及び使用方法 |
Country Status (11)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US11993766B2 (ja) |
| EP (1) | EP3853352A4 (ja) |
| JP (1) | JP2022502017A (ja) |
| KR (1) | KR20210063362A (ja) |
| CN (1) | CN112996905A (ja) |
| AU (1) | AU2019343994A1 (ja) |
| CA (1) | CA3112813A1 (ja) |
| IL (1) | IL281640A (ja) |
| SG (1) | SG11202102489XA (ja) |
| TW (1) | TW202027761A (ja) |
| WO (1) | WO2020061499A1 (ja) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20200026878A (ko) | 2017-06-06 | 2020-03-11 | 지머젠 인코포레이티드 | 균류 균주를 개량하기 위한 htp 게놈 공학 플랫폼 |
| US11028401B2 (en) | 2018-06-06 | 2021-06-08 | Zymergen Inc. | Manipulation of genes involved in signal transduction to control fungal morphology during fermentation and production |
| US11479779B2 (en) | 2020-07-31 | 2022-10-25 | Zymergen Inc. | Systems and methods for high-throughput automated strain generation for non-sporulating fungi |
| EP4277974A1 (en) * | 2021-01-12 | 2023-11-22 | Berkeley Lights, Inc. | Systems, apparatuses, and methods for cellular therapeutics manufacture |
| WO2023161961A1 (en) * | 2022-02-24 | 2023-08-31 | Lymphon Biologics Pvt. Ltd. | A system and method for t cell activation and immunomodulation |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2012184233A (ja) * | 2002-07-12 | 2012-09-27 | Johns Hopkins Univ | 独自のクローン形質のリンパ球受容体に結合する試薬および方法 |
| JP2016516406A (ja) * | 2013-03-15 | 2016-06-09 | ラッシュ・ユニバーシティ・メディカル・センター | 有足突起培養物およびその使用 |
| JP2017513891A (ja) * | 2014-04-25 | 2017-06-01 | ブルーバード バイオ， インコーポレイテッド | 養子細胞療法薬を製造するための改善された方法 |
| WO2017161210A1 (en) * | 2016-03-17 | 2017-09-21 | Bronevetsky Yelena | Selection and cloning of t lymphocytes in a microfluidic device |
Family Cites Families (99)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4690915A (en) | 1985-08-08 | 1987-09-01 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Adoptive immunotherapy as a treatment modality in humans |
| JP2618497B2 (ja) | 1989-10-03 | 1997-06-11 | 鐘淵化学工業株式会社 | 腫瘍障害細胞誘導剤および腫瘍障害細胞誘導デバイス |
| US5827642A (en) | 1994-08-31 | 1998-10-27 | Fred Hutchinson Cancer Research Center | Rapid expansion method ("REM") for in vitro propagation of T lymphocytes |
| ATE240119T1 (de) | 1995-03-08 | 2003-05-15 | Scripps Research Inst | Antigen präsentierendes system und aktivierung von t-zellen |
| ES2288760T3 (es) | 1996-04-25 | 2008-01-16 | Bioarray Solutions Ltd. | Ensamblaje electrocinetico controlado por luz de particulas proximas a superficies. |
| US6294063B1 (en) | 1999-02-12 | 2001-09-25 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Method and apparatus for programmable fluidic processing |
| US6942776B2 (en) | 1999-05-18 | 2005-09-13 | Silicon Biosystems S.R.L. | Method and apparatus for the manipulation of particles by means of dielectrophoresis |
| AU4328801A (en) | 2000-02-24 | 2001-09-03 | Xcyte Therapies Inc | Simultaneous stimulation and concentration of cells |
| JP2004511753A (ja) | 2000-05-04 | 2004-04-15 | イエール ユニバーシティー | タンパク質活性のスクリーニング用タンパク質チップ |
| US20030007894A1 (en) | 2001-04-27 | 2003-01-09 | Genoptix | Methods and apparatus for use of optical forces for identification, characterization and/or sorting of particles |
| ITTO20010411A1 (it) | 2001-05-02 | 2002-11-02 | Silicon Biosystems S R L | Metodo e dispositivo per l'esecuzione di test e saggi ad alta processivita' ed alto valore biologico su cellule e/o composti. |
| WO2003067210A2 (en) * | 2001-07-10 | 2003-08-14 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Methods and compositions for detecting the activation state of the multiple proteins in single cells |
| US20030170238A1 (en) | 2002-03-07 | 2003-09-11 | Gruenberg Micheal L. | Re-activated T-cells for adoptive immunotherapy |
| US7312085B2 (en) | 2002-04-01 | 2007-12-25 | Fluidigm Corporation | Microfluidic particle-analysis systems |
| US6984485B2 (en) | 2002-04-23 | 2006-01-10 | Beckman Coulter, Inc. | Polymer-coated substrates for immobilization of biomolecules and cells |
| US7507579B2 (en) | 2002-05-01 | 2009-03-24 | Massachusetts Institute Of Technology | Apparatus and methods for simultaneous operation of miniaturized reactors |
| WO2004017042A2 (en) * | 2002-08-16 | 2004-02-26 | Zyomyx, Inc. | Methods and reagents for surface functionalization |
| US7790443B2 (en) | 2002-08-27 | 2010-09-07 | Vanderbilt University | Bioreactors with substance injection capacity |
| WO2004065618A2 (en) | 2003-01-16 | 2004-08-05 | Thermogenic Imaging | Methods and devices for monitoring cellular metabolism in microfluidic cell-retaining chambers |
| US20050274456A1 (en) | 2003-02-03 | 2005-12-15 | Roitman Daniel B | Fluid-channel device with covalently bound hard and soft structural components |
| US7666361B2 (en) | 2003-04-03 | 2010-02-23 | Fluidigm Corporation | Microfluidic devices and methods of using same |
| US20040248205A1 (en) * | 2003-04-16 | 2004-12-09 | Stern Lawrence J. | Major histocompatibility complex (MHC)-peptide arrays |
| US20060240548A1 (en) | 2003-06-26 | 2006-10-26 | Mordechai Deutsch | Materials for constructing cell-chips, cell-chip covers, cell-chips coats, processed cell-chips and uses thereof |
| US20050164402A1 (en) | 2003-07-14 | 2005-07-28 | Belisle Christopher M. | Sample presentation device |
| JP4328168B2 (ja) | 2003-10-02 | 2009-09-09 | ソニー株式会社 | 毛細管現象を利用する物質間の相互作用検出部と該検出部を用いる方法及びバイオアッセイ用基板 |
| US9040090B2 (en) | 2003-12-19 | 2015-05-26 | The University Of North Carolina At Chapel Hill | Isolated and fixed micro and nano structures and methods thereof |
| WO2005072399A2 (en) | 2004-01-29 | 2005-08-11 | Massachusetts Institute Of Technology | Microscale sorting cytometer |
| WO2005080606A1 (en) | 2004-02-18 | 2005-09-01 | Xiaochuan Zhou | Fluidic devices and methods for multiplex chemical and biochemical reactions |
| WO2005100541A2 (en) | 2004-04-12 | 2005-10-27 | The Regents Of The University Of California | Optoelectronic tweezers for microparticle and cell manipulation |
| FR2872912B1 (fr) | 2004-07-09 | 2007-03-02 | Centre Nat Rech Scient Cnrse | Nouveau systeme microfluidique et procede de capture de cellules |
| WO2006011378A1 (ja) | 2004-07-27 | 2006-02-02 | Nsk Ltd. | ステアリングコラム装置 |
| US20060091015A1 (en) | 2004-11-01 | 2006-05-04 | Applera Corporation | Surface modification for non-specific adsorption of biological material |
| EP1814580B1 (en) | 2004-11-24 | 2016-08-10 | Fred Hutchinson Cancer Research Center | Methods of using il-21 for adoptive immunotherapy and identification of tumor antigens |
| TWI265864B (en) | 2005-05-20 | 2006-11-11 | Univ Nat Cheng Kung | Hydrophilic surface structure of non-hydrophilic substrate and fabricating method for the same |
| ES2865180T3 (es) | 2005-07-07 | 2021-10-15 | Univ California | Aparato para formación de cultivo celular |
| WO2007102839A2 (en) | 2005-10-27 | 2007-09-13 | Applera Corporation | Optoelectronic separation of biomolecules |
| US8124015B2 (en) | 2006-02-03 | 2012-02-28 | Institute For Systems Biology | Multiplexed, microfluidic molecular assay device and assay method |
| WO2007108205A1 (ja) | 2006-03-17 | 2007-09-27 | Sanyo Chemical Industries, Ltd. | 細胞培養用担体 |
| US8137626B2 (en) | 2006-05-19 | 2012-03-20 | California Institute Of Technology | Fluorescence detector, filter device and related methods |
| EP2027257A4 (en) | 2006-05-24 | 2010-10-20 | Agency Science Tech & Res | BIOACTIVE SURFACE FOR HEPATOCYTE-BASED APPLICATIONS |
| CN101529251B (zh) | 2006-11-01 | 2014-04-02 | 贝克曼考尔特公司 | 用于亲合分析的结合性表面 |
| US20080153134A1 (en) | 2006-12-22 | 2008-06-26 | Willy Wiyatno | Methods and apparatus for generating hydrophilic patterning of high density microplates using an amphiphilic polymer |
| US8157434B2 (en) | 2007-01-19 | 2012-04-17 | Fluidigm Corporation | High efficiency and high precision microfluidic devices and methods |
| WO2008119066A1 (en) | 2007-03-28 | 2008-10-02 | The Regents Of The University Of California | Single-sided lateral-field and phototransistor-based optoelectronic tweezers |
| WO2008121375A2 (en) * | 2007-03-29 | 2008-10-09 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Modified surfaces for immobilization of active molecules |
| ATE554859T1 (de) | 2007-05-24 | 2012-05-15 | Univ California | Integrierte fluidische vorrichtungen mit magnetischer sortierung |
| WO2009045308A2 (en) | 2007-10-03 | 2009-04-09 | Fred Hutchinson Cancer Research Center | Enhanced generation of cytotoxic t-lymphocytes by il-21 mediated foxp3 suppression |
| JP5404638B2 (ja) | 2007-11-07 | 2014-02-05 | ザ ユニヴァーシティ オブ ブリティッシュ コロンビア | マイクロ流体デバイスおよびその使用方法 |
| EP2279238A2 (en) | 2008-04-21 | 2011-02-02 | Cell Kinetics, Ltd. | Flat cell carriers with cell traps |
| CN101275114A (zh) | 2008-04-22 | 2008-10-01 | 北京大学 | 一种微流细胞培养阵列及其应用 |
| KR100991752B1 (ko) | 2008-07-15 | 2010-11-03 | 한국과학기술원 | 단일 평면 광전자 소자를 이용한 미세입자 구동장치 및구동방법 |
| GB2464300A (en) | 2008-10-10 | 2010-04-14 | Univ Dublin City | Microfluidic multiplexed cellular and molecular analysis device and method |
| EP2414539B1 (en) | 2009-04-03 | 2020-12-16 | The Regents of The University of California | Apparatus and method for sorting cells and other biological particulates |
| US20100273681A1 (en) | 2009-04-27 | 2010-10-28 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Combinatorial chemistry reaction cell with optical tweezers |
| GB0909923D0 (en) | 2009-06-09 | 2009-07-22 | Oxford Gene Tech Ip Ltd | Picowell capture devices for analysing single cells or other particles |
| US20130146459A1 (en) | 2009-06-16 | 2013-06-13 | Massachusetts Institute Of Technology | Multiphase non-linear electrokinetic devices |
| JP2011000079A (ja) | 2009-06-19 | 2011-01-06 | Univ Of Tokyo | 粒子を操作する方法及びマイクロ流体装置 |
| US20110186165A1 (en) | 2009-10-05 | 2011-08-04 | Borenstein Jeffrey T | Three-dimensional microfluidic platforms and methods of use and manufacture thereof |
| US8651158B2 (en) | 2009-11-17 | 2014-02-18 | The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Navy | Processing microtitre plates for covalent immobilization chemistries |
| CN103180730B (zh) | 2010-05-14 | 2016-03-02 | 综合医院公司 | 鉴定肿瘤特异性新抗原的组合物和方法 |
| WO2011149032A1 (ja) | 2010-05-26 | 2011-12-01 | 東ソー株式会社 | 生体試料固定装置 |
| TW201144805A (en) | 2010-06-08 | 2011-12-16 | Academia Sinica | Microfluidic device |
| CN101947124B (zh) | 2010-06-25 | 2012-07-04 | 博奥生物有限公司 | 一种集成式微流控芯片装置及其使用方法 |
| US10087408B2 (en) | 2010-07-07 | 2018-10-02 | The University Of British Columbia | System and method for microfluidic cell culture |
| US20130115606A1 (en) | 2010-07-07 | 2013-05-09 | The University Of British Columbia | System and method for microfluidic cell culture |
| US9188593B2 (en) | 2010-07-16 | 2015-11-17 | The University Of British Columbia | Methods for assaying cellular binding interactions |
| WO2012037030A2 (en) | 2010-09-14 | 2012-03-22 | The Regents Of The University Of California | Method and device for isolating cells from heterogeneous solution using microfluidic trapping vortices |
| US9511151B2 (en) * | 2010-11-12 | 2016-12-06 | Uti Limited Partnership | Compositions and methods for the prevention and treatment of cancer |
| US8581167B2 (en) | 2010-11-16 | 2013-11-12 | Palo Alto Research Center Incorporated | Optically patterned virtual electrodes and interconnects on polymer and semiconductive substrates |
| US9891157B2 (en) | 2010-12-03 | 2018-02-13 | Cellply S.R.L. | Microanalysis of cellular function |
| US10571475B2 (en) | 2010-12-03 | 2020-02-25 | Cellply S.R.L. | Rapid screening of monoclonal antibodies |
| CN103889556A (zh) | 2011-01-06 | 2014-06-25 | Gpb科学有限责任公司 | 在引入亲和性和大小两者的微流体芯片上的循环肿瘤细胞捕获 |
| WO2012109068A2 (en) | 2011-02-11 | 2012-08-16 | Corning Incorporated | Enzyme cleavable cell release polymeric surface |
| TWI438273B (zh) | 2011-03-08 | 2014-05-21 | Univ Chang Gung | High-throughput perfusative microfluidic cell culture wafers for miniaturized three-dimensional cell culture |
| US9902990B2 (en) | 2011-05-27 | 2018-02-27 | The University Of British Columbia | Microfluidic cell trap and assay apparatus for high-throughput analysis |
| US9227200B2 (en) | 2011-06-03 | 2016-01-05 | The Regents Of The University Of California | Microfluidic devices with flexible optically transparent electrodes |
| ES2797448T3 (es) | 2011-08-01 | 2020-12-02 | Bio Rad Laboratories | Sistema de captura de células |
| US9050593B2 (en) | 2011-11-23 | 2015-06-09 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Self-loading microfluidic device and methods of use |
| US10626435B2 (en) | 2012-03-28 | 2020-04-21 | Northeastern University | Nanofluidic device for isolating, growing, and characterizing microbial cells |
| TWI512383B (zh) | 2012-07-04 | 2015-12-11 | Ind Tech Res Inst | 光學感應式介電泳裝置 |
| US9702873B2 (en) | 2012-08-13 | 2017-07-11 | Uvic Industry Partnerships Inc. | System for trapping, interacting and modifying single protein molecules using a double-nanohole structure |
| US9857333B2 (en) | 2012-10-31 | 2018-01-02 | Berkeley Lights, Inc. | Pens for biological micro-objects |
| US9403172B2 (en) | 2012-11-08 | 2016-08-02 | Berkeley Lights, Inc. | Circuit based optoelectronic tweezers |
| US9453838B2 (en) | 2013-03-12 | 2016-09-27 | Asociación Centro de Investigación Cooperative en Biomateriales | Methods for making microarrays and their uses |
| AU2014245806B2 (en) | 2013-03-28 | 2019-10-31 | The University Of British Columbia | Microfluidic devices and methods for use thereof in multicellular assays of secretion |
| IL283153B2 (en) | 2013-10-22 | 2023-04-01 | Berkeley Lights Inc | Microfluidic devices with isolation pens and methods for testing microbiological items using them |
| SG11201602336UA (en) | 2013-10-22 | 2016-05-30 | Berkeley Lights Inc | Micro-fluidic devices for assaying biological activity |
| US9889445B2 (en) | 2013-10-22 | 2018-02-13 | Berkeley Lights, Inc. | Micro-fluidic devices for assaying biological activity |
| WO2016094308A1 (en) | 2014-12-08 | 2016-06-16 | Berkeley Lights, Inc. | Microfluidic device comprising lateral/vertical transistor structures and process of making and using same |
| WO2016094715A2 (en) | 2014-12-10 | 2016-06-16 | Berkeley Lights, Inc. | Movement and selection of micro-objects in a microfluidic apparatus |
| CN116869964A (zh) * | 2014-12-24 | 2023-10-13 | 耐克西缪恩有限公司 | 用于免疫疗法的纳米颗粒组合物和方法 |
| CA3176115A1 (en) | 2015-04-22 | 2016-10-27 | Berkeley Lights, Inc. | Microfluidic device for culturing biological cells and methods of use thereof |
| US10799865B2 (en) | 2015-10-27 | 2020-10-13 | Berkeley Lights, Inc. | Microfluidic apparatus having an optimized electrowetting surface and related systems and methods |
| CN108698814A (zh) | 2015-12-30 | 2018-10-23 | 伯克利之光生命科技公司 | 用于光学驱动的对流和移位的微流体设备、试剂盒及其方法 |
| CA3020976A1 (en) | 2016-04-15 | 2017-10-19 | Berkeley Lights, Inc. | Methods, systems and kits for in-pen assays |
| CN109070083A (zh) | 2016-04-22 | 2018-12-21 | 贝克顿迪金森公司 | 用于阵列产生的高密度沉积 |
| SG11201809539RA (en) | 2016-05-26 | 2018-12-28 | Berkeley Lights Inc | Covalently modified surfaces, kits, and methods of preparation and use |
| AU2017298545B2 (en) | 2016-07-21 | 2022-10-27 | Berkeley Lights, Inc. | Sorting of T lymphocytes in a microfluidic device |
| AU2018304543A1 (en) | 2017-07-21 | 2020-02-13 | Berkeley Lights, Inc. | Antigen-presenting synthetic surfaces, covalently functionalized surfaces, activated T cells, and uses thereof |
-
2019
- 2019-09-20 CA CA3112813A patent/CA3112813A1/en active Pending
- 2019-09-20 WO PCT/US2019/052228 patent/WO2020061499A1/en unknown
- 2019-09-20 KR KR1020217011117A patent/KR20210063362A/ko unknown
- 2019-09-20 EP EP19861403.4A patent/EP3853352A4/en active Pending
- 2019-09-20 SG SG11202102489XA patent/SG11202102489XA/en unknown
- 2019-09-20 TW TW108133970A patent/TW202027761A/zh unknown
- 2019-09-20 CN CN201980074146.1A patent/CN112996905A/zh active Pending
- 2019-09-20 JP JP2021515077A patent/JP2022502017A/ja active Pending
- 2019-09-20 AU AU2019343994A patent/AU2019343994A1/en active Pending
- 2019-09-20 US US16/578,026 patent/US11993766B2/en active Active
-
2021
- 2021-03-18 IL IL281640A patent/IL281640A/en unknown
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2012184233A (ja) * | 2002-07-12 | 2012-09-27 | Johns Hopkins Univ | 独自のクローン形質のリンパ球受容体に結合する試薬および方法 |
| JP2016516406A (ja) * | 2013-03-15 | 2016-06-09 | ラッシュ・ユニバーシティ・メディカル・センター | 有足突起培養物およびその使用 |
| JP2017513891A (ja) * | 2014-04-25 | 2017-06-01 | ブルーバード バイオ， インコーポレイテッド | 養子細胞療法薬を製造するための改善された方法 |
| WO2017161210A1 (en) * | 2016-03-17 | 2017-09-21 | Bronevetsky Yelena | Selection and cloning of t lymphocytes in a microfluidic device |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| TW202027761A (zh) | 2020-08-01 |
| WO2020061499A8 (en) | 2020-05-07 |
| SG11202102489XA (en) | 2021-04-29 |
| US11993766B2 (en) | 2024-05-28 |
| US20200123491A1 (en) | 2020-04-23 |
| EP3853352A1 (en) | 2021-07-28 |
| AU2019343994A1 (en) | 2021-05-13 |
| CN112996905A (zh) | 2021-06-18 |
| EP3853352A4 (en) | 2022-08-10 |
| CA3112813A1 (en) | 2020-03-26 |
| IL281640A (en) | 2021-05-31 |
| WO2020061499A1 (en) | 2020-03-26 |
| KR20210063362A (ko) | 2021-06-01 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP2022502017A (ja) | 官能基化ウェルプレート、その作製及び使用方法 | |
| JP7497054B2 (ja) | 抗原提示細胞模倣足場およびそれを作製および使用するための方法 | |
| US11976105B2 (en) | Antibody/T-cell receptor chimeric constructs and uses thereof | |
| JP7340638B2 (ja) | Ｍｈｃ－ｅ拘束性エピトープ、結合分子ならびに関連する方法および使用 | |
| JP7194020B2 (ja) | 細胞の培養方法ならびにそのためのキットおよび装置 | |
| KR20200054160A (ko) | 입양 세포 요법을 사용한 치료를 위한 물품 제조 및 방법 | |
| KR20220101641A (ko) | 세포 선택 및/또는 자극 장치 및 사용 방법 | |
| KR20220004028A (ko) | 동종 car t 세포를 제조하는 방법 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20220915 |
|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20220915 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20230630 |
|
| A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20230630 |
|
| A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20230921 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20240202 |