JPH11503005A - 表面修飾されたアフィニティ分離膜 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 抗体又は酵素又は細胞受容体の補体のような親和性リガンド（６）が二官能性のスペーサー及び／又は二官能性の結合剤から形成されたひも（４）の一の末端に共有結合し、他の末端は高フラックス半透性ヒドロゲル膜（１）の内部孔表面（３）に共有結合し、これは蛋白質、細胞又は細胞フラグメントのような生物学的分子を溶液から分離するための親和性支持体を製造する。膜の孔は、利用し得るリガンドの結合能力を最大にするため、固定された蛋白質又は他のリガンドを膜の表面に実質的に制限するように選ばれる排除限界（分子量カットオフ）を有する。また、排除限界は、リガンドを膜へ結合するために使用されるひもが孔内に侵透し、膜の内部孔表面に結合できるように選ばれる。

Description

【発明の詳細な説明】 表面修飾されたアフィニティ分離膜 本発明は、リガンドの結合能力を最大にするための、特に不溶性の生物学的巨 大分子、細胞、及び細胞断片を捕捉するのに使用するためのマトリックス表面か ら外側に配向した親和性リガンドの高度に局在化した表面濃度を支持する半透過 性ヒドロゲル膜親和性マトリックスを有するアフィニティークロマトグラフィー のための親和性支持体に関する。 技術分野 本発明は、生物学的分子、細胞又は細胞フラグメントを溶液からアフィニティ ー分離するために有用である、親和性リガンド、殊に抗体、抗原又は酵素、又は 細胞表面受容体に対する補体のような蛋白質で表面が修飾される高フラックス半 透過性ヒドロゲル膜を含む親和性マトリックスに関する。膜の排除限界（分子量 カットオフ）は、膜の孔に浸入できない生物学的部分に対して利用可能な結合能 力を最大にするため、膜の固定された蛋白質又は他のリガンドが実質的に膜の外 側平面に限定されるように選択される。また、この排除限界は、膜表面における 親和性リガンドの充填密度を最大にするため、リガンドを膜に結合させるために 使用される試薬がその内部孔又はチャネル表面に侵入 し、そこで膜と結合することを可能とさせるように（即ち、その結果、固定され た親和性リガンドは膜の外側平面の表面からのみ広がり、かさ高い結合試薬及び ／又は活性化試薬又はそれらの残基により最少限の立体的障害を受けることにな る）選択される。マトリックスと溶液界面との間の親和性リガンドの配向を限定 することにより、膜の内部への固定試薬の制限されないアクセスと組み合わさっ て、リガンドの認識サイトは、膜の孔構造に侵入できない溶液中の大きな不溶性 補体巨大分子、細胞又は細胞膜に対して最大限利用可能となる。 背景記載 アフィニティークロマトグラフィー用の高分子マトリックス上でのリガンドの 固定は当該分野でよく知られている。 典型的には、既知のマトリックスは（メタ）アクリル酸、（メタ）アクリレー ト、（メタ）アクリルアミド、アガロース、セルロース又は誘導体セルロースの 重合体又は共重合体のような支持高分子ヒドロゲルを有しており、この際、膜の 排除限界は親和性蛋白質又は他のリガンドが膜の内側表面での固定のために膜の 孔構造に容易に侵入できる程度のものである。例えば、ソロモン（Solomon）に 与えられた米国特許第４，９４８，８３６号明細書には、直径が１０００〜２５ ０００Åのチャネル及び空隙を有するマクロ多孔性の ビーズを有するアクリルアミド／アクリレートマトリックス共重合体が記載され ており、ここで１０から１００Åの径の酵素及び基質分子のようなリゲート（li gates）は“マクロ多孔性マトリックスの内側”に到達することができる。可溶 性の酵素又は他のリゲート及びより小さい不溶性のリゲートはかかる膜の内部に 結合された抗体又は他の親和性蛋白質を含む親和性リガンドにアクセスし得る一 方で、２５０００Å又はそれ以上の径の孔／チャネル／空隙は、より大きい不溶 性生物学的巨大分子及び実質的にすべての形成される細胞エレメントを排除する であろう。したがって、これらの支持体の可能なリガンド結合サイトの大部分は これらのリゲートにアクセスできないので、大きな不溶性生物学的巨大分子及び 細胞エレメントに対するこれらのマトリックスの捕捉効率は極めて低く、これら のマトリックスは結果としてこの目的のために多く使用されていない。巨大分子 及び形成された細胞エレメントを収容するための実質上２５０００Åよりも大き い膜孔への拡大は、一般には膜の機械的強度が受け入れがたい程に失なわれるの で可能な選択ではない。 さらに、蛋白質又は他のリガンドを親和性膜上に固定するための既知の方法は 、特にセルロース性膜にこれらの方法を適用することに関して、多くの制限があ る。古典的な方法は、種々の高分子膜と親和性蛋白質の間のウレタン共有結合を 形成させるために活性化剤 としてカルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）を使用することを含む。ＣＤＩは水 中で急速に加水分解されるので、この試薬を使用する当初の膜活性化は中性溶剤 の使用を必要とする。セルロース性及び他のヒドロゲル膜に対して、この中性溶 剤は膜の機械的強度又はその透過性を著しく損なうことなく膜の水膨潤状態を保 持する能力を有していなければならない。中性の、水混和性溶剤を使用する他の クロマトグラフィー用ヒドロゲルに関して当該分野で知られているように、溶剤 交換によるセルロースの脱水が、その結果、考慮されなければならない（発明者 の未公開データ）。しかしながら、十分な脱水をもたらす条件下でセルロース繊 維に関してアセトン又はアセトニトリルのような一般の中性溶剤を使用すると、 膜の機械的（特に張力）強度の損失及び透過性の損失が生じ、これを親和性リガ ンドの固定用支持用膜として使用することを不適切なものとする。さらに、検討 したセルロース膜において、セルロースと蛋白質の間のウレタン結合は極めて強 固に膜表面に蛋白質を結合するので、蛋白質の意味のある結合特性が傷つけられ る。さらに、本発明によるセルロース膜は、蛋白質の固定に先立って、上述の表 面限定反応を促進するため、好適にはプラスチックの収納箱中に入れられる。多 くの他の有用なプラスチックは有機溶剤により損傷を受けるから、中性溶剤とと もに使用するための適当な収納材料は限定される。 従って、結合／活性化試薬の膜内部への浸入を可能にしつつ、親和性蛋白質を 膜の外側表面に実質的に限定する分子量カットオフを有する、親和性リガンドを 固定するための機械的に強固な高フラックスの親和性マトリックスを提供するこ とが望ましい。好ましくは、親和性膜の全体結合能力を最大にするために、膜は 、膜の外側表面から蛋白質又はその他のリガンドを空間的に位置させることを促 進し、この蛋白質又は他のリガンドを実質的に専ら膜と溶液界面の間に配向させ る、膜及びリガンドを共有的に結合する二官能性のスペーサー（spacer）分子又 はひもを有する。最も好ましくは、結合試薬はすべての水性溶剤系において親和 性蛋白質を固定するために選択される。 図面の簡単な説明 図面において、唯一の図は本発明による膜の代表的な断面図であり、マトリッ クス膜１の名目上の外側表面２、膜１の内部孔／空隙／チャネル表面（以後、内 部孔表面という）３、及び膜１と固定された親和性蛋白質分子６の間のスペーサ ー結合４を示している。 発明の開示 本発明は、リガンドの結合能力を最大にする、特にイムノアフィニティーの利 用において使用するため、膜表面から溶液界面へ広がる親和性リガンドの高度に 局在化した外側表面濃度を支持する、水不溶性の高フラックス半透膜性ヒドロゲ ル膜を有する親和性マトリ ックスを含む、アフィニティークロマトグラフィーのための親和性支持体に関す る。膜は、親和性リガンドが膜内に侵入するのを制限しつつ、結合試薬が膜内部 に侵入することを可能とする孔径（排除限界）が選ばれる。マトリックスは、誘 導化（活性化及び親和性リガンドへの結合）のために利用できる官能基、特に遊 離ヒドロキシル基又はアミノ基を有する上述の親和性マトリックスを含み；好ま しいマトリックスの例は、セルロース、誘導化セルロース、及びキトサン及び芳 香族ポリアミド、又は適当なＮＭＷＣＯ（後記参照）及び適当な遊離官能基、特 にアミン又はヒドロキシル基を有する他の膜である。好ましくは、このマトリッ クスは、スペーサー分子及び適宜二官能性結合剤、特にジエポキシドを介して、 すべての水性溶剤系を使用して、親和性蛋白質又は他のリガンドに共有結合する 遊離ヒドロキシル基を含む中空ファイバーのセルロース性膜である。本発明の親 和性支持体は、膜の孔に侵入できない不溶性の生物学的巨大分子、細胞及び細胞 フラグメントを捕捉するために既知のアフィニティークロマトグラフィー方法に おいて特に使用される。 発明を実施するための最良の形態 １．親和性マトリックス 本発明のマトリックスは、リガンドを固定するための遊離反応性基、特に遊離 ヒドロキシル基を有する、薄い、半透膜性、高フラックス、水不溶性、水和され たヒドロゲル膜から成る。典型的なヒドロゲルは、既知のセルロース、誘導体セ ルロース、及びキトサンマトリックスを含む。他の水膨潤性、水不溶性の、ビニ ルアルコール共重合体と例えばエチレンとの重合体（ＥＶＡＬ重合体として、Ｅ ＶＡＬＣＡ、パサデナ、Ｔｘから入手される）は、選択された結合用反応剤と反 応させるのに利用可能なヒドロキシル基又は他の官能性基を有しており、本明細 書で記載した基準及び機能を満たす膜を提供する場合には、使用できる。約６か ら約１５μｍ、最も好ましくは約１０×１０^-6ｍの乾燥壁厚を有するセルロース 性、中空ファイバー膜又はフィルムが好ましい。膜は非対称又は均一な構造を有 していてもよい；非対称膜が使用される場合には、リガンド結合はより密度の高 い表面上で実施される。膜の水圧透過性は好ましくは約２ｍｌ／分−ｍ²−Ｈｇ 及び２００ｍｌ／分−ｍ²−Ｈｇの間ににある。膜の透過性は本分野で既知のよ うに選択された分子量カットオフ（後記参照）により変化し、上述の範囲より透 過性をより小さいものに減少させるカット−オフは、もし通過流が不満足なレベ ルまで減少する場合には推しょうされず；同様に、膜の機械的強度に著しく悪影 響を与える上記範囲より上のカットオフも推しょうされない。膜は実質的に平板 形状、キャピラリーチューブ状の形状又は他のいずれかの有用な形状のものとし 得る。“セルロース性膜”という用語は、本明細書に おいて、セルロース又はセロビオースの繰り返し単位当たり少くとも約１個のヒ ドロキシル基をもつ、完全には置換されていない（即ち、適宜スペーサー分子を 介して、リガンドの有用な量が膜に共有結合するのに十分な残留ヒドロキシル基 を有する）セルロース、特に一般に商業的に入手可能であり、かつ出発セルロー スの一般に比較的高い分子量のためにアルカリ溶液中で良好な安定性を有する再 生された銅アンモニアにより誘導されたセルロース性膜に関する。当該分野で既 知のように、銅アンモニア法によりフィルム又はファイバーを製造するためには 、セルロースは銅複合体としてアルカリ溶液に溶解され、固体を沈澱させるため に銅の平衡を移動させてヒドロゲルとして再生される。他方法は、セルロースを キサンテート誘導体として溶解させ、当該分野で既知のように酸溶液で生成物を 再生させることである。本発明の方法において有用な膜を提供するためのセルロ ースの再生に関して、より最近になって記述された他の溶剤系には、ＬｉＣｌを 含有するジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）又はニトロソアミンを含有するジメチ ルホルムアミド（ＤＭＦ）を含まれる。膜の相応の物理的及び化学的特性が実質 的に保持される限り、本発明における再生セルロース性膜を与えるいずれの溶剤 系も有用である。 更に、本発明の実施において使用するための膜は、親和性リガンドを膜の内部 表面（孔／空隙／チャネル 表面）上に固定することから実質的に排除するために選択される名目上の（平均 ）分子量カットオフ（ＮＭＷＣＯ）を有する。知られているように、このカット オフ又は排除限界は内側膜構造に容易に拡散し得る最大分子を定義する。こうし て、親和性蛋白質又は他のリガンドは、図示されるように膜／溶液界面を形成す る膜の概念上の外側表面から直接又は間接（スペーサー）結合を介して実質的に 完全に外方に向けてスペーサーが与えられる。選択された蛋白質又は他のリガン ドに依存して、一般的なＮＭＷＣＯ限界は典型的には約１００，０００ドルトン から出発して、より小さい限界に減少する。多くの蛋白質リガンド、とりわけ抗 体にとり、典型的な出発ＮＭＷＣＯ限界は約６５０００ダルトンである。再度、 圧倒的なＮＭＷＣＯを有するセルロース性及び関連する膜の製造は当該分野で既 知である。上記で述べたように、より低いＮＭＷＣＯ限界は、選択された親和性 リガンドを排除しつつ、結合／活性化試薬が膜内の遊離のヒドロキシル基又は他 の官能基に結合するため膜の内部に浸入可能のように（透過性及び機械的強度を 考慮しつつ、前記参照）選択される。想定される親和性リガンドは巨大分子であ り、一方、試薬はそうでないので、これは容易に達成される。約５００ｘの大き さの程度のリガンドと反応剤のＮＭＷＣＯ差異は典型的なものである。 親和性マトリックスの名目上の外側表面は、一般に 遊離ヒドロキシル基又は他の官能基を有しており、結合試薬のいくつかは膜を製 造するのに使用される結合反応の過程でこれらの基に結合するであろう；膜の名 目上の表面からの親和性リガンドの外側のスペースを変化させる、これらと膜と の反応のランダムな過程は、生成膜のアフィニティー分離を最大にすることが知 られている重要な要素である、膜の外側表面上で複合体を形成するのに利用され るリガンドの密度を著しく増大させることが見い出された（例えば、J．Chromat og．４５８：６７〜７７，１９８８，６８頁を参照）。 ２．親和性リガンド アフィニティークロマトグラフィー用の本発明の膜上に固定するのに有用な親 和性リガンド及び他のリガンドは当該分野で極めて良く知られており、それ自体 は本発明の一部を構成しない。典形的なリガンドは、成長因子、酵素、酵素基質 、抗原、及びモノ−又はポリクローン抗体、特にはＩｇＧ又はＩｇＭを含む。重 要なリガンドの基は、細胞表面受容体又はその他の細胞表面決定基に相補的な生 物学的分子又はそれらのフラグメントを含む；細胞表面レクチン受容体を保持す る細胞又は細胞のフラグメントを捕捉するためのレクチンリガンドが典型的であ る。相補的な親和性リガンドを使用することにより完全な又はフラグメントの細 胞に存在する結合領域を有する抗体又は抗原を生物学 的溶液、特に血液から免疫捕捉することが特に想定される。蛋白質リガンドは、 糖蛋白質又は炭水化物側鎖を有しない蛋白質であってもよく、結合メカニズムは 以下に記載されるように相応して選ばれる。典型的な親和性蛋白質は、分離され た、合成された、又は遺伝子操作により適宜修飾された自然に得られる蛋白質、 特に単鎖蛋白質を含む。リガンドは、リゲートの回収が想定される場合には、当 該分野で知られているようにリゲートとの非可逆的結合が最少となるように選択 されるべきである。 本明細書で使用される“親和性蛋白質”という用語は、リガンドがリゲートに 結合する必須の認識領域を有する蛋白質フラグメント（ポリペプチド）を含み、 これはしばしば、より特異的であり、その結果しばしば好ましい。 ３．親和性マトリックス及びリガンド結合。 親和性リガンドは、親和性リガンドの結合特性を実質的に維持しつつ、膜の機 械的及び水圧特性を実質的に保持するいずれかの方法により、マトリックス膜の 残留ヒドロキシル基又は他の官能基に直接的に又は間接的に結合し得る。典型的 には、当該分野において知られているように、リガンド又はマトリックスの共有 的なカップリング又はマトリックスへのスペーサー分子のリガンド架橋に先立ち 、マトリックスの遊離官能基は活性化又は修飾される。先行技術は種々の親和性 マトリックスをリガンドに結合するための方法の記載を十分に有している。記載 されているマトリックスの活性化／修飾及びリガンド／スペーサーのカップリン グの方法の典型例は、Affinity Chromatography：apractical approach；Dean ら編；ＩＲＬプレス社， P．O．Box １，Eysham，Oxford ox ８ １JJ，英国， １９８５；及び Affinity Chromatography：Bioselective Adsorption on Inert Matrices； Elving ら編；John Wiley and Sons，ニューヨーク，１９８１にみ られる（これらはともに参考として本明細書にとり入れられる）。これらのテキ ストに記載されている、又は当該分野で知られている他の、選択されたリガンド を選択されたマトリックスにカップリングさせるための多くの方法が、本発明の 実施において有用である。 本発明において、マトリックスとリガンドの間の結合は好適には、膜と親和性 蛋白質又は他のリガンドを結合させる二官能性のスペーサー剤又は“ひも（leas h）”を含み；より好ましくは、さらに、膜とスペーサー剤、又はスペーサー剤 とリガンドを結合する二官能性の結合剤又はその両方を含む。しかしながら、又 、マトリックスは、（スペーサー剤を省略して）二官能性結合剤を介してリガン ドに結合できるか、又はリガンドに直接結合できるが、これらの便宜的方法は立 体障害のためリガンドの結合能力を減ずるであろう。又、好ましくは、使用され る結合反応は、凝集又は隣接 する固定された親和性蛋白質と架橋するのを最少にし、そのことによりその可能 な結合能力を最大にするために、すべての水性溶剤にて、特に約４.５から約９. ５のｐＨ域で完了される。 糖蛋白質を固定するために、当該分野で知られているように、遊離のビシナル ヒドロキシル基がアルデヒドに酸化され、マトリックススペーサーに、又は結合 剤に結合される。炭水化物基を含有しないもの（非糖蛋白質）を固定するために 、種々の戦略が採用しうる。例えば、アミノカプロン酸のようなアミノ酸をジエ ポキシド反応剤末端のスペーサーの遊離エポキシドと反応させることができる。 このスペーサーはこれに提供される蛋白質のいずれかのアミノ基と急速反応させ るため、多くのいずれかの水溶性カルボジイミド化合物で活性化することができ る。 本発明の例示的な態様において、セルロース性膜の遊離ヒドロキシル基は膜の 水酸基と反応する少くとも１個の末端第一級アミノ又はヒドラジド官能基を含有 する二官能性のスペーサーを介して抗体のような蛋白質リガンドに結合される。 スペーサーの残留末端官能基は、蛋白質リガンドの遊離アミノ又はカルボキシル 官能基と、又は、さらに糖蛋白質の遊離ヒドロキシル基と反応させるために選択 される。膜、スペーサー及び／又はリガンド反応性基は、当該分野で既知のよう に、反応に先立ってしばしば修飾又は活性化される。 これらの態様のための好都合のスペーサー分子は、Ｃ原子数１〜６のアルキルジ アミン及びＣ−原子数１〜６のジヒドラジドのようなジアミン及びジヒドラジド 、及びベーターアラニンヒドラジド、これらはリガンドと結合するための遊離ア ミノ及びヒドラジド基を提供する、又はＣ−原子数４〜６のアルキルアミノ酸、 これらはリガンドと結合するために遊離のカルボキシル基を提供する、を含む。 これらのスペーサーの末端アミノ又はヒドラジノ官能基は当該分野で既知の方 法によりセルロース性膜に容易にカップリングされる。例えば、膜のビシナルヒ ドロキシル基は、過ヨウ素酸塩、引き続くエチレングリコールクエンチにより酸 化し得る。得られたアルデヒド基は、次に、スペーサーの末端アミノ基又はヒド ラジド基と縮合させて、それぞれ以下の図に示されるように、膜とシッフ塩基又 はヒドラゾン結合を形成させる： この代わりに、マトリックスのヒドロキシル基は当該分野で知られているよう にして活性化させ、スペーサー剤のアミノ又はヒドラジド遊離基で部分的に又は 全面的に置換可能な活性中間体を形成させることもできる。マトリックスとウレ タン結合する図式中のカルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）の使用が例示される ： これらの図式は、特にセルロース性及び類似のヒドロゲル膜が使用されるとき は、欠点を有する。ＣＤＩ又は他の活性剤による活性化は中性溶剤の使用を必要 とするので、反応性アルデヒド基を提供するためのマトリックスの酸化はマトリ ックスの機械的及び／又は水圧特性に悪影響を与えがちである。 したがって、本発明の実施において膜特性に著しく 悪影響を与えない条件下でセルロース性膜にスペーサーを結合させることが好ま しい。膜の酸化は、膜をスペーサーに結合させるための穏和な条件下で膜のヒド ロキシル基及びスペーサーの官能基と反応性である適当な二官能性の試薬を使用 することにより回避される。さらに又、この方法は、リガンドを膜から離れさせ 、かつ結合補体に対するリガンドの認識箇所の露出を改善する。これらの態様の ための典形的な二官能性の結合剤は、Ｃ−原子数２〜４のジアルデヒド、特にグ ルタルアルデヒド、及びＣ−原子数２〜４のジグリシジルエーテル（ＥＤＧＤＥ ）のようなジエポキシドを含む。一の態様において、ジアルデヒドはアセタール 結合を形成するために膜の遊離ヒドロキシル基と反応し、残りのアルデヒド官能 基は次いでアミノ−又はヒドラジド−末端スペーサーと縮合する。本発明の特に 好ましい態様において、ジエポキシドは水酸化ナトリウムのような酸性又は塩基 性触媒の存在下でセルロース性（セルロース又はセルロース誘導体）マトリック スの遊離ヒドロキシル基と反応してマトリックスとエーテル結合を形成し、この 間、他のエポキシドは二官能性スペーサーの１個の末端基とその後反応するため に保存される。例えば、結合剤の残りの遊離エポキシ基は、既知のように、スペ ーサーの末端第一級アミノ又はヒドラジド基と反応可能であり、又、上述のジア ミン、ジヒドラジド又はアルキルアミノ酸の１種のよ うにリガンドとも反応可能である。このジエポキシド経路は、次の反応スキーム に示されるように、膜の酸化を回避し、かつ水性溶剤系を用い、そのことにより 膜の強度及び水圧特性を保持するので、好ましい。 スペーサーの遠位末端の官能基（即ち、スペーサーをリガンドに結合させるの に使用される官能基）は、リガンドの生物学的特性をひどく傷つけない条件下で 選択されたリガンドと反応させるために選ばれる。例えば、蛋白質リガンドに含 まれるリジンのようなアミノ酸の親核的アミノ機能により置換可能な遠位末端基 を含むことができる。遠位末端のヒドロキシル基、アミノ又はヒドラジド基は、 スペーサーと蛋白質リガンドの間でウレタン又は尿素結合を形成させるために蛋 白質の第一級アミノ官能基と反応させる際のＣＤＩによるのと同様にして、活性 化され得る。スペーサーの 遠位末端アミノ又はヒドラジド基は、シッフ塩基又はヒドラゾン結合のために糖 蛋白質の酸化されたヒドロキシル基と縮合させることができ、又は水溶性カルボ ジイミド又は他の活性化剤により活性化された蛋白質アミノ酸の遊離カルボキシ ル基と反応させることができる。逆に、遠位末端ヒドロキシル基は蛋白質の第一 級アミノ基と反応させるために酸化又は活性化させることができ、遠位末端カル ボキシル基は、例えば、以下の反応式に示されるように、リガンドの第一級アミ ノ官能基との反応のためにエチルジメチルアミノプロピルカルボジイミド（ＥＤ ＡＣ）触媒のような水溶性カルボジイミドで活性化しうる。 特に、すべての水性溶剤を使用する方法により、生物学的活性を保持する穏和 な条件下で蛋白質のような感受性のあるリガンドに結合し得るスペーサーを使用 することが好ましい。糖蛋白質リガンドにとっては、上述のように全ての水性系 でジエポキシド−修飾されたセルロース及びリガンドの炭水化物側鎖と反応しう るジアミン又はジヒドラジドスペーサーが特に有用である。糖蛋白質及び炭水化 物側鎖を欠いている蛋白質の両方にとっては、蛋白質のアミノ官能基による活性 化された基の置換が水性溶剤中で起こるので、マトリックスに結合したＣＤＩ− 活性化ジアミン又はジヒドラジドも有用である。非糖蛋白質にとっては、遊離の 末端第一級アミノ基を介してエポキシで修飾したマトリックスに、及びリガンド のアミノ基（尿素結合）と活性化された遊離カルボキシル官能基の反応によりリ ガンドに結合したアミノ酸スペーサーの使用が特に好都合である。 所望ならば、スペーサー／リガンド結合を促進するために、又はマトリックス とリガンドの間のひもを延長するために、上述の手法に従って又は当該分野で既 知の他の手法に従って二官能性の結合剤も又スペーサーとリガンドの間に導入す ることができる。 リガンドは、又、上述の手法又は当該分野で既知の他の手法に従って、マトリ ックスに直接結合させることもでき、又、上述のジエポキシド又はジアルデヒド のような二官能性の結合試薬を介して間接的に結合させることもできる。 マトリックス、二官能性の結合剤、スペーサー及びリガンドの反応の順序は重 要ではない。しかしながら、その後の結合反応においてリガンドの生物学的特性 に影響を与える可能性を避けるために、通常、最終工程で感受性のリガンドを結 合させるのが望ましい。上述の結合反応又は当該分野で知られている他の反応を 使用する上述のセルロース性膜に代えて、反応性官能基、殊に遊離の第一級アミ ノ官能基を有するポリアミドを含む他の適当なヒドロゲルマトリックスを使用す ることができる。 利用 リガンドは、意図した用途のための適当な配列で、好適には配置された中空フ ァイバー膜（中空ファイバーの輪状のスペース内）及びファイバー内に固定され る。結合されない細胞の溶出は、当該分野で既知のようにして実施することがで きる。例えば、膜を横断して流れる液の増大した粘度による非結合細胞又は非結 合細胞フラグメントに対する剪断応力の利用が例示される；もし結合された細胞 の回収が望ましいときは、溶出を促進するため適当な酵素による場合のようにし て結合細胞を前処理することが有用かもしれない。 以下の実施例は、本発明の実施の例示である。 実施例 例１ ニュートラーゼ（Neutrase）を固定するためのＣＤＩの使用、引き続いての１ ，６−ジアミノヘキサン又はアミノカプロン酸とのカップリングによるセルロー スの活性化 ニュートラーゼ酵素を結合するためのファイバーから出たひもを製造するため 、セルロースファイバーの２個のモジュールをカルボジイミドで、そして、次に １，６−ジアミノヘキサン又はアミノカプロン酸で活性化した。これは、ジアミ ノヘキサンと反応させるために酵素上の活性化されたカルボン酸基を使用するこ とにより又はアミノカプロン酸と反応させるために酵素上のアミノ基を使用する ことのいずれかによりなされた。酵素上のカルボン酸基又はアミノカプロン酸上 のそれは、２個の実験のための中間体を形成するためにカルボジイミドと反応さ せた。両方の反応のために、ファイバー上のひもは酵素とアミド結合を形成した 。固定した酵素は、乳清蛋白質を固着させる際に反応性であった；後者は膜のマ トリックスに侵入するには大きすぎ、このため、活性酵素が膜と溶液の界面で固 定されたことを示していた。 各モジュールをアセトン中０.１ＭのＣＤＩで３０分間再び還流した。この中 に各々約１５〜２０分間空気を吹き込むことによりアセトンを除去した。各モジ ュール中に１，６−ジアミノヘキサンの１％溶液又は アミノカプロン酸の１％溶液を２.５時間循環させた；両方の溶液はｐＨ８.５の 重炭酸緩衝液０.１Ｍ中で製造した。このモジュールを緩衝液１００ｍｌ及び次 に脱イオン水ですすいだ。粗酵素溶液５０ｍｌ、これは２回希釈され、かつ水に 対して透析されたものであるが、これを水と０.５ｇのカルボジイミドにて１％ 溶液としたもので２回希釈した。この酵素を各々のモジュールで１時間再循環し た。各酵素溶液からのサンプルは可動相で５回希釈し、かつアテニュエーション ７でＨＰＬＣ上に５０μｌを注入した。透析された粗酵素溶液のサンプルを可動 相で１０回希釈し、どの位多くの酵素が固定されたのかを測定するためにＥＤＡ Ｃ添加及び水希釈の前にアテニュエーション７でＨＰＬＣに５０μｌを注入した 。このモジュールを次に、酵素活性に関して乳清溶液とアッセイした。 例２ Ｗ／ＣＤＩ、アミノカプロン酸及び続いてのＢＯＰ試薬、トリエチルアミン及 びＮ−ヒドロキシスクシンイミドによるセルロースモジュールの活性化 この実験はアミノカプロン酸のひも及び次にｎ−ヒドロキシスクシンイミド基 をひもの末端に結合させるために実施した。結合後、トリプシン及びキモトリプ シンをファイバー上に固定させ、乳清蛋白質を使用して酵素活性を試験した。こ れらの蛋白質の開裂は、酵素活性がマトリックスと浴用溶液の間の界面に局在し ていることを示している。 ３個のセルロースモジュールを脱イオン水１５０ｍｌでリンスし、かつ水を５ 段階でアセトンに代えた：次に乾燥アセトン中の０.１モルＣＤＩ １００ｍｌを 室温で１時間再循環させた。この溶液を排水させ、次に乾燥アセトン１００ｍｌ でリンスし、過剰のアセトンを空気を吹き込んで乾燥させた。モジュールは、０ .１モルの重炭酸緩衝液ｐＨ８.５又はｐＨ１１の１００ｍｌでリンスした。次に ０.１モルの重炭酸緩衝液中の０.２モルのアミノカプロン酸をｐＨ８.５で２個 のモジュールに、ｐＨ１１で１個のモジュールに再循環させた。 水は上述したのと同じ段階勾配で再びアセトンに交換し、最後は乾燥アセトン で交換した。 以下の溶液を室温で１時間循環させた： ２２ｍｇ ＢＯＰ試薬（４４２ｇ／モル） １４μｌ トリエチルアミン（１９／０１.１９ｇ／モル） ５８０ｍｇ ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（１１５.１ｇ／モル） これらは５０ｍｌの乾燥アセトン中に加え、この溶液に水分が存在しないよう にするため、少量の無水硫酸ナトリウムを添加した。 ファイバーをとり出し、乾燥アセトンでリンスし、過剰のものをそれぞれのモ ジュールに空気を吹き込ん で除去した。このモジュールを冷たい１０ｍＭの酢酸ナトリウムｐＨ４.５の１ ５０ｍｌでリンスし、次いで０.１モルの硼酸緩衝液１５０ｍｌでｐＨ８.５にて リンスした。 ４ｍｇ／ｍｌトリプシン２５ｍｌの２個の溶液（１個はｐＨ１１のモジュール に対して、及び他のものはｐＨ８.５のモジュールに対する）及びｐＨ８.５のモ ジュールに対する４ｍｇ／ｍｌのキモトリプシン溶液２５ｍｌを冷室で４時間再 循環させた。各々のモジュールは０.１モルの硼酸緩衝液ｐＨ８.５の５０ｍｌで リンスし、その後冷室に保存した。 各モジュールの活性の試験 各カラムは、０.０７Ｍ トリス−ＨＣｌ緩衝液ｐＨ７.５で平衡化した。２個 の異なる流速で（単一パス）、各モジュールを通して３.７５％の乳清蛋白溶液 を連続的にポンプ供給し、２時間後に、各々のユニットからの溶出物のサンプル を集めた。各サンプルは可動相で３０倍に希釈し、ＴＳＫゲルエクスクルージョ ンカラムにおいてアテニュエーション４，２８０ｎｍで５０μｌを注入した。他 の乳清試料は、又、各モジュールを通して２時間再循環させた。トリス緩衝液中 の３.７５％乳清１０ｍｌを再循環させ、そして各溶液から１時間後及び２時間 後にサンプルを採取した。この試料は上記のようにして製造した。各カラムに対 する流速を試験し、以下の結果を得た。 ひもを結合するためにｐＨ１１が使用されたときは、モジュールでは酵素活性 が観察されなかった。しかしながら、ｐＨ８.５ではすべての酵素が活性であっ た。中程度の及び遅い２個の流速に関して、ｐＨ８.５で固定されたひもを有す るトリプシンはキモトリプシンよりも高い速度でペプチドを製造した。中程度の 速度に関して、トリプシンはキモトリプシンよりも約９倍早く、ペプチドを製造 したが、それぞれ０.９０３ｍｇ／分及び０.０６７ｍｇ／分であった。比活性は 、恐らく減少した生成物抑制のために、より早い単一パスの流れにおいてより高 かった。生成物溶液が再循環されたときは、この差異は消失した。活性は利用し うる見かけの表面エリアと相関しているが、このことは酵素が膜と溶液の界面に 局在していることを示している。 例３ 有機溶剤系におけるセルロースの修飾 炭水化物のビーズを修飾する際に、容易に置換される“脱離基”を導入するた めにカルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）が使用されることは既知である。しか しながら、水はＣＤＩから最初のイミダゾール環を急速に加水分解するから、第 一の工程として炭水化物の脱水が必要である。この修飾のためにセルロース性膜 の脱水を実施するために、ＣＤＩをヒドロキシル基と縮合させるのに適した有機 溶剤を評価した。各々の溶 剤に関して、膜は最初に水から純粋の乾燥溶剤へと順次、交換された。次に、Ｃ ＤＩ／膜反応は、それぞれの溶剤に４５分かけて０.１ＭのＣＤＩを添加し、反 応液を排水し、かつ１,６−ヘキサンジアミンを活性箇所にカップリングさせる ことにより、実施した。カップリングは同一の溶剤（“ａ”系）中で又は水性緩 衝液（“ｂ”系）中のいずれかで実施した。最後に、ファイバーを洗い、乾燥さ せ、かつアミン含量及び物理特性を試験した。驚くべきことに、文献中で最も一 般的に使用されている溶剤（即ち、アセトン、アセトニトリル）は、機械的特性 を著しく損った。これらの活性化のために最も良い溶剤系は、以下のデータに示 されるように、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）又はＮＭＰ（Ｎ−メチルピロ リドン）であることが判明した（ＤＭＡはジメチルアセトアミドである）： 例４ １−メチル−２−ピロリジノン及び、次に重炭酸緩衝液中の１，６−ジアミノ ヘキサン中でのＣＤＩと反応したセルロースファイバー 例１及び２において、セルロース構造を脱水するための溶剤として、及びＣＤ Ｉ反応のための溶剤としてアセトンを使用した。得られたファイバーの機械的特 性、特に生成した膜の限外濾過率は、この溶剤の使用により損なわれた。この例 においては、これらの機械的損失を生じない溶剤において同じ化学が達成される ことを示している。ＣＤＩをセルロースと反応させるためにｎ−メチル−ピロリ ジノン（ＮＭＰ）溶剤を使用した。セルロースファイバーを水ですすぎ、次いで ＮＭＰに変化させ、かつ乾燥ＮＭＰで平衡化した。ＮＭＰ中の０.１ＭのＣＤＩ をファイバー上で４５分間反応させた。次に溶液を排水し、０.１Ｍ重炭酸緩衝 液ｐＨ８.５中の１％の１,６−ジアミノヘキサン溶液をファイバーと一晩反応さ せた。溶液を次に排水し、ファイバーは希釈酸ｐＨ４.０ですすぎ、次に水です すいだ。束を分離し、いくつかをインビビション試験及びニンヒドリン分析の水 のために保存し、いくつかは食塩／アジド溶液中に保存し、残部は４２％グリセ ロール／３６％水／２２％イソプロパノール溶液中で乾燥させ、さらに乾燥させ るため２日間懸架した。 ニンヒドリン アッセイ法 ０.５〜５ｍｇのセルロースを検量し、かつ１００μｌの水を添加した。水中 で全容積１００μｌにて、Ｌ−アラニン０〜１６μｌを使用する標準曲線を使用 した。５００μｌのシグマニンヒドリン試薬を各サンプルに添加し、完全に混合 した。各サンプルを１００℃で１５分間加熱し、次いでｎ−プロパノールの５０ ％水溶液２.５ｍｌを添加し、かつ混合した。各サンプルはアラニンを含まない ブランクに対して５７０ｎｍで測定した。 インビビション法の水 ファイバーを水で激しくリンスし、次に１ｃｍの一片に切断した。キャップを したチューブ内でファイバーを遠心分離し、ファイバーから水を払い、このファ イバーを環境水に浸して保存した。２０００ＲＰＭで１０分間遠心分離した。フ ァイバーの重量を測定し、ボトルの中で濡らし、オーブン中で乾燥させ、次に再 び重量を測定した。こうしてファイバーの有していた水の重量が測定された。 ファイバーに結合したアミンの量は、０.１３１４７μモル／ｍｇファイバー であった。これは、ＤＭＡ中のＣＤＩを及び次いで（この実験における重炭酸に 代えて）水中の１，６−ＤＡＨを使用する同一反応における０.１１７７９８μ モル／ｍｇファイバーに例えられる。インビビション値の水に関する結果は、種 種の反応の組み合わせについて以下に示される： インビビションの水が高くなればなる程、この構造体は一層ふくれ、かつ限外 濾過率は一層大きくなる。コントロールファイバーの出発限外濾過率は１３７ｍ ｌ／ｍ²−時−ｍｍＨｇであった。 例５ メタ−過ヨウ素酸ナトリウム、次にアジピン酸ジヒドラジドと反応させたセル ロース この例は、Akzo Faser ＡＧ（Wuppertal，ＦＲＧ）からのセルロース中空ファ イバー及びアジピン酸ジヒドラジドを使用して、“The Derivatization of Oxid ized Polysaccharides for Protein Immobilization and Affinity Chromatogra phy”E．Junowicz 及びS．Charm，Biochimica et Biophysica Acta ４２８，１ ５７−１６５（１９７６）の方法に基づくものであった。 １０ｍｌのガラスピペットに６個のセルロースの束を入れ、ピペットの長さ及 びピペットのいずれかの末端５ｃｍをアルミニウムホイルで被覆した。この束を 脱イオン水ですすぎ、次に排水した。この束を水中で異なる時間、０.２５Ｍの メタ−過ヨウ素ナトリウム（２６.７４ｇ／０.５ｌ）と反応させた：１５，３０ ，４５，６０，７５及び９０分。それぞれの時間の後、束から排水し、それぞれ ６０ｍｌの脱イオン水、２ＭのＮａＣｌ（３５.０６ｇ／０.３ｌ）ですすぎ、最 後に０.０５Ｍの酢酸ナトリウム、ｐＨ４.８（６.８０５ｇ／ｌ）の７０ｍｌで すすいだ。この緩衝液を排水し、それぞれのモジュールは０.１５Ｍのアジピン 酸ジヒドラジドを含む０.０５Ｍの酢酸ナトリウムｐＨ４.８（１５.６８ｇ／０. ３ｌ）と室温で１晩反応させた。すべての束を排水し、２ｌの脱イオン水、次に ２ＭのＮａＣｌ ６０ｍｌで、最後に脱イオン水１ｌですすいだ。各々の束は、 ０.１ＭトリスｐＨ８.２（３.６３ｇ／．３ｌ）中の０.３Ｍ硼素化水素ナトリウ ム（３.４ｇ／．３ｌ）６０ｍｌで室温にて２時間還元した。 各溶液を排水し、脱イオン水１ｌ、２ＭのＮａＣｌ６０ｍｌ、次に脱イオン水 ２ｌですすいだ。 各束をばらばらにし、ニンヒドリン反応でアミン含量を試験した。 残りのファイバーは、３６％水／２２％イソプロパノール／４２％グリセロー ル溶液に４時間浸して乾燥させ、次に過剰のグリセロール溶液を除くためにファ イバーを遠心分離した。 ６０，７５及び９０分の反応後のファイバーは、硬くかつもろかった。４５分 間のこの酸化−結合−反応方法によりファイバーに結合されたジヒドラジンの最 高の量は、０.１４８μｇアミン／ｍｇファイバーであった。これは、０.１３１ μモルアミン／ｍｇファイバーという、ＣＤＩ活性化の後の１，６−ジアミノ ヘキサンの結合の結果に匹敵する。このように、中性溶媒を使用しなくても、同 じアミン結合が達成できる（例３参照）。 酸化による機械的破壊を減少させるために一層短かい酸化時間を使用して、実 験を繰り返した。ヒドラジド末端基の濃度及び機械特性の両方を、酸化時間の関 数として測定した。この方法は−中性溶剤に代えて−水溶液中で実施されるとい う利点を有しているが、過度の機械的特性の損失をもたらすことなく十分量のヒ ドラジドを得るためには、反応条件の注意深いバランスが必要となる。 この化学を使用すると末端のひもの収率は十分である一方、膜の引張強度の受 け入れられない損失及び約３０分より長い反応時間の延長が見られた。 例６ プロタミン結合セルロース中空ファイバーのスケー ルアップ プロタミン結合ファイバーが例３の方法を使用して製造された。ＡＫＺＯ Ｆ ＡＳＥＲ社（Wuppertal，ＦＲＧ）から入手した全部で３束のＲＣ−ＨＰ４００ ファイバー（各々の束当たり１０００のファイバー）を２９ｃｍの長さに切断し 、大きなカラム（直径２.３ｃｍ）上に置いた。これらを次のもので洗った： １００％ Ｈ₂Ｏ ２ｌ ３０％ Ｈ₂Ｏ ７０％ ＮＭＰ １ｌ １００％ ＮＭＰ ４００ｍｌ １００％ 乾燥 ＮＭＰ ４００ｍｌ ＮＭＰ＝Ｎ−メチルピロリジノン 最後の洗浄物は連続した無水硫酸ナトリウムの乾燥カラムに一晩再循環させた 。翌日、０.１ＭのＣＤＩ ２５０ｍｌを合計１時間、室温で再循環させた。最 初に恐らくＣＤＩ中の湿分による僅かな泡形成が生じた。カラムを排水し、乾燥 ＮＭＰ １００ｍｌで洗った。重炭酸緩衝液ｐＨ８.５中の１％プロタミン（ｘ 型）２５０ｍｌを直ちに導入し、室温で２時間、冷室で１週間再循環させた。フ ァイバーの頂部で開始時にくもりが生じたが、すぐに透明となった。このファイ バーをその後、１ｌの脱イオン水で３回洗った。４対のサンプルのそれぞれから １０ｃｍのサンプルをとり、ＢＣＡアッセイを使用してプロタミンを分析した。 その後、束をグリセリン／イソプロパノール／水（４２ ％，２２％，３６％）に浸し、遠心分離し、かつ空気乾燥した。その測定及び結 果は次表に示される。 例７ プロタミン−グルタルアルデヒド−ＮＨ−末端−セルロース及びプロタミン− グルタルアルデヒド−ＡＰＡＨ−末端−セルロース ８個のモジュールを活性化した。モジュールの内部孔側面を脱イオン水５００ ｍｌで洗った後、このモジュールを排水した。セルロース１ｇ当たり２ｇの水と 仮定すると、８個のモジュールは全量で２.５６ｇの水を有していた。 以下のものを組み合わせた： ５ｍｌの０.５Ｍ ＮａＯＨ ２０ｍｇのＮａＢＨ₄ ５ｍｌのＥＧＤＧＥ（Aldrich） モジュールを並列に結合させ、５０℃の水浴上に載置し、かつ上記溶液を１時 間再循環させた後、脱イオン水で十分に洗った。２個のモジュール（Ａ及びＢ） をその後の使用のために冷室に保存した。他の２個のモジュール（Ｃ及びＤ）（ ＡＫＺＯ）は、３−アミノプロピオン酸ヒドラジド（ＡＰＡＨ）：脱イオン水の １：１溶液６ｍｌと再循環させながら室温で１晩反応させた。これらのモジュー ルを排水し、脱イオン水で洗い、かつ再び排水した。これら２個のモジュールを 冷室に保存した。２個の他のモジュール（Ｅ及びＦ）は、濃ＮＨ₄ＯＨ：脱イオ ン水が１：１のもの６ｍｌを室温で再循環させながら１時間反応させた。このモ ジュールを排水し、脱イオン水で洗い、再び排水し、かつ冷室に保存した。 ４個のモジュール（ＣからＦ）は、０.１ＭのＮａＣＮＢＨ₃を含有する０.１ Ｍの硼酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ９.４中の３％グルタルアルデヒドと室温で１ 時間反応させた。このモジュールを排水し、脱イオン水で洗い、再び排水した。 ０.１Ｍの硼酸緩衝液、ｐＨ９.４中の５％プロタミン１５ｍｌを３時間再循環さ せ、そしてｐＨを１０.４に調節した。このモジュールを排水し、脱イオン水で 洗い、再び排水し、かつ冷室に保存した。翌日、このモジュールを０.１Ｍの硼 酸緩衝液、ｐＨ９.４中の０.１Ｍ ＮａＣＮＢＨ₃で室温にて２時間還元し、か つ排水し、脱イオン水で洗い、そして再び排水した。３−アミノプロピオン酸ヒ ドラジドで修飾したモジュールは、ＢＣＡアッセイによれば５３.０μｇプロタ ミン／ｍｇファイバーを得た。アンモニアで修飾したファイバーは、１３.０μ ｇプロタミン／ｍｇファイバーを得た。 例８ プロタミン−グルタルアルデヒド−ＡＰＡＨ−ＥＧＤＧＥ−セルロース ＡＫＺＯ社から入手したクプロファン（Cuprophan）ミニ−モジュール８個を 、それぞれ脱イオン水で内部孔側面及びシェル側面を５００ｍｌの脱イオン水で 洗浄した後、活性化し、かつすすいだ。セルロース１ｇ 当たり水が２ｇであると仮定すると、８個のモジュールは合計２.５６ｇの水を 有していた。 以下のものを組み合わせた： ５ｍｌの０.５ＭのＮａＯＨ ２０ｍｇのＮａＢＨ₄ ５ｍｌのＥＧＤＧＥ（Aldrich） このモジュールは並列に結合させ、５０℃の水中に載置し、上記溶液を１時間 還流し、次いで脱イオン水で十分洗った。２個のモジュールは、室温で一晩再還 流させながら、１３％の３−アミノプロピオン酸ヒドラジド（ＡＰＡＨ）と反応 させた。 このモジュールを脱水し、脱イオン水で洗い、かつ再び脱水した。０.１Ｍの ＮａＣＮＢＨ₃を含むｐＨ９.４の０.１Ｍ硼酸緩衝液中の３％グルタルアルデヒ ド２０ｍｌを室温で３０分間再還流させた。このモジュールを排水し、脱イオン 水で洗い、かつ再び排水した。０.１ＭのＮａＣＮＢＨ₃を含むｐＨ８.５の重炭 酸緩衝液中の１％プロタミン２０ｍｌをｐＨ１０.７に調節し、室温で３時間再 還流した。このモジュールを排水し、脱イオン水で洗い、再び排水し、そして冷 室に保存した。カップリングさせる前後のプロタミン液をＢＣＡ法で分析し、標 準としてプロタミンを使用した。 平均プロタミン値は、１４０マイクログラム／ｍｇファイバーであることがわ かった。 例９ プラスチックケース中に置かれた銅アンモニアセルロース中空ファイバーは、 残留グリセリンを除去するために洗って、室温で乾燥させた。それぞれ１.２８ ｇのセルロースを含む８個のモジュール（Ａ−Ｈ）に０.５Ｍ ＮａＯＨ ５ｍ ｌ、ＮａＢＨ₄ ２０ｍｇ及びエチレングリコールジグリシジルエーテル（ＥＧ ＤＧＥ）５ｍｌを含有する溶液を灌流させた。（並列に接続された）このモジュ ールにこの溶液を５０℃で１時間灌流させ、次いで脱イオン水ですすいだ。 ａ．２個のモジュール（Ａ及びＢ）は、末端ヒドラジド基を有するひもを形成 させるために、３−アミノプロピオン酸ヒドラジドと水の１：１混合物を１２時 間反応させて、修飾した。 ｂ．２個の他のモジュール（Ｃ及びＤ）は、残りのエポキシ基を開裂させて、 アミン末端のひもを形成させるために、濃ＮＨ₄ＯＨと水の１：１希釈物と反応 させた。 ｃ．末端アルデヒド基、これは蛋白質のアミン基と反応するが、これを有し、 膜上に広がるひもを製造するために、４個のモジュールＡ，Ｂ，Ｃ及びＤは、次 に０.１Ｍ ＮａＣＮＢＨ₃を含有する０.１Ｍ硼酸緩衝液（ｐＨ９.４）中の３％ グルタルアルデヒドと反応させた。 ｄ．次に蛋白質リガンドを上記（４）からのモジュールＡ−Ｄ及び上記（１） からのモジュールＥ−Ｈの上で固定した。この実施例において、使用された蛋白 質は血液凝固剤ヘパリンのためのリガンドのプロタミンであった。蛋白質の結合 を実行させるため、０.１Ｍ ＮａＣＮＢＨ₃を含有するｐＨ１０.７の緩衝液中 の１％蛋白質溶液を使用して、モジュールＡ−Ｈのファイバーを３時間灌流した 。 結合したプロタミンは、ファイバーの蛋白質含量を測定することにより決定し た。モジュールＡ及びＢにおいて、平均の結合プロタミン量は１３ｍｇ／ｇセル ロースであった。モジュールＥ−Ｈ上では、平均の結合蛋白質は５ｍｇ／ｇセル ロースであった。蛋白質がエポキシド基によりセルロースに直接反応したときの （即ち、中間のジアルデヒド反応を行わないときの）固定されたプロタミンの収 量（５ｍｇ／ｇセルロース）を、蛋白質がヒドラジド末端ひもと反応したときの 固定されたプロタミン収量（５０ｍｇ／ｇセルロース）及びアミノ末端ひもと反 応させたときのそれ（１３ｍｇ／ｇセルロース）と比較すると、ひもの効果的な 作用が理解できる。 例１０ セルロース膜の孔構造に浸入するには余りに大きすぎる免疫グロブリンが、上 記（１ａ）に記載されたひも手法を使用して固定された。銅アンモニア変性セル ロース中空ファイバーを上記のようにしてＥＧＤＧＥと反応させ、次にアジピン 酸ジヒドラジド（ＡＡＤＨ）と処理してヒドラジド末端のひもを製造した。 ａ．別個に、既知の方法を使用して、５ｍｌの抗ヒトＩｇＧ抗体（４８ｍｇ） をＮａＩＯ₄で酸化した。この抗体は短い透析により汚染物を除去し、次いで修 飾したファイバーと反応させた。 ｂ．固定された抗体の活性は、増大する濃度のヒト−ＩｇＧでファイバーのア リコートをチャレンジして試験し、結合した抗体の量を平衡濃度の関数として測 定した。その結果は次のとおりである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．１以上の固定された親和性リガンドで表面修飾された高フラックス半透過性 ヒドロゲル膜から成る親和性マトリックスを含むアフィニティー分離のための親 和性支持体において、上記膜が親和性リガンドを固定するための遊離の残留官能 基、及び、固定されたリガンドをマトリックスの名目上の外側表面の外方へ実質 的に制限するのに十分な程度に小さく、かつ、マトリックスの内部孔内にカップ リングするためにリガンド固定用の固定試薬がマトリックスの内部孔へ侵入する ことを可能とする程度に大きな名目上の分子量カットオフを有していることを特 徴とする、上記親和性支持体。 ２．膜がセルロース膜である請求項１記載の親和性支持体。 ３．膜が再生されたセルロース膜である請求項２記載の親和性支持体。 ４．親和性リガンドが固定試薬により膜にカップリングされている請求項１記載 の親和性支持体。 ５．固定試薬が： ａ）二官能性のスペーサー剤、 ｂ）二官能性のカップリング剤、又は ｃ）膜にカップリングされた二官能性結合剤に結合された二官能性のスペー サー剤 を含むものである請求項４記載の親和性支持体。 ６．固定試薬が膜にカップリングされ、かつ二官能性スペーサー剤にカップリン グされた二官能性結合剤を含むものである請求項４記載の親和性支持体。 ７．スペーサー剤がジアミン、ジヒドラジド、β−アラニンヒドラジド又はアミ ノ酸である請求項５記載の親和性支持体。 ８．スペーサー剤がジアミン、ジヒドラジド、β−アラニンヒドラジド又はアミ ノ酸である請求項６記載の親和性支持体。 ９．二官能性結合剤がジエポキシド又はジアルデヒドである請求項５記載の親和 性支持体。 10．二官能性結合剤がジエポキシド又はジアルデヒドである請求項６記載の親和 性支持体。 11．二官能性結合剤がジエポキシドである請求項５記載の親和性支持体。 12．二官能性結合剤がジエポキシドである請求項６記載の親和性支持体。 13．親和性リガンドが蛋白質である請求項１記載の親和性支持体。 14．蛋白質が糖蛋白質である請求項１２記載の親和性支持体。 15．蛋白質が炭水化物基を有しないものである請求項１２記載の親和性支持体。 16．膜がセルロース性膜であり、親和性リガンドが蛋 白質である請求項５記載の親和性支持体。 17．膜がセルロース性膜であり、親和性リガンドが蛋白質である請求項６記載の 親和性支持体。 18．膜がセルロース性膜であり、親和性リガンドが蛋白質である請求項７記載の 親和性支持体。 19．膜がセルロース性膜であり、親和性リガンドが蛋白質である請求項８記載の 親和性支持体。 20．膜がセルロース性膜であり、親和性リガンドが蛋白質である請求項１１記載 の親和性支持体。 21．膜がセルロース性膜であり、親和性リガンドが蛋白質である請求項１２記載 の親和性支持体。 22．二官能性スペーサー剤がＣ−原子数１〜６のアルキルアミノ酸である請求項 １５記載の親和性支持体。 23．親和性リガンドが細胞表面決定基に対する補体である請求項１記載の親和性 支持体。 24．親和性リガンドが細胞表面受容体である請求項２３記載の親和性支持体。 25．膜がセルロース性膜であり、親和性リガンドが細胞表面決定基である請求項 ５記載の親和性支持体。 26．膜がセルロース性膜であり、親和性リガンドが細胞表面決定基である請求項 ６記載の親和性支持体。 27．膜がセルロース性膜であり、親和性リガンドが細胞表面決定基である請求項 ７記載の親和性支持体。 28．膜がセルロース性膜であり、親和性リガンドが細 胞表面決定基である請求項８記載の親和性支持体。 29．膜がセルロース性膜であり、親和性リガンドが細胞表面決定基である請求項 １１記載の親和性支持体。 30．膜がセルロース性膜であり、親和性リガンドが細胞表面決定基である請求項 １２記載の親和性支持体。 31．リガンドが蛋白質である請求項１記載の親和性支持体。 32．リガンドが細胞表面決定基に対する補体である請求項１記載の親和性支持体 。 33．親和性リゲートを親和力により捕捉するための方法において、請求項１の親 和性支持体にリゲートの溶液をさらすことから成ることを特徴とする、親和性リ ゲートの親和力により捕捉のための方法。 34．リゲートが細胞又は細胞フラグメントである請求項３４記載の方法。 35．膜がセルロース性膜である請求項３５記載の方法。