JP2004045120A - 液体クロマトグラフ用カラム材料 - Google Patents

Abstract

【課題】特定の細胞を簡単、大量に分離、回収できる材料を提供すること。
【解決手段】リガンドと前記リガンドを固定化するための基材を含むリガンド固定化材料であって、基材に固定化したリガンドが外部刺激により脱離できる液体クロマトグラフ用カラム材料。
【選択図】なし

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、液体中の有用物質あるいは病因物質を分離濃縮するための、さらに該材料を再利用するための、基材に固定化したリガンドが外部刺激により脱離することを特徴とするリガンド固定化材料に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
近年、リガンド、特に抗体を用いて抗体と相互作用する細胞を選択的に分離する、あるいは濃度の薄い細胞を濃縮する試みがなされており、抗体を基材に固定化した材料を用い、培養細胞などの細胞群を流すことにより、抗体と相互作用するある特定の細胞だけを選択的に分離濃縮する技術が検討されている。ただし、このような技術はある特定の抗体と相互作用する細胞が除去されるだけであり、それらの細胞を担体表面から回収し、利用するためには、抗体を変性させる条件、例えばｐＨ４以下にする等の処理が必要であり、そのような条件下では細胞障害がおこるため、細胞の機能を維持したまま分離濃縮することは困難である。
【０００３】
細胞障害を生じない条件下で、特定の細胞を回収する技術としては、フローサイトメトリーによる方法や、最近では磁気ビーズ法などがあげられるが、いずれも少量の細胞を対象としており、細胞と標識抗体とを反応させた後、分離作業をするという非常に煩雑な操作が必要であり、目的の細胞を大量に回収する際は、時間、コストがかかるという問題があった。また、抗体から細胞を分離する技術としてある特別な配列のペプチドと抗体の組み合わせを利用して、細胞との結合をペプチドで置き換えることにより細胞を回収する技術が知られているが、この場合は前記の細胞との置き換えが可能であるペプチド配列が既知の抗体に限定される。
【０００４】
また、従来のイオン交換クロマトグラフやキレートクロマトグラフあるいは疎水クロマトグラフは、選択性が低いため、特定の細胞を選択的に分離濃縮することができなかったり、あるいは、細胞との結合力が低いため、細胞の分離は細胞を傷害しない穏和な条件で可能であるが、回収率が低いという欠点を有している。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明では、上記従来技術の欠点を解消するものであり、特定の細胞を簡単、大量に分離、回収できる材料を提供することを目的としてしている。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成するために、本発明は下記構成を有する。
（１）リガンドと前記リガンドを固定化するための基材を含むリガンド固定化材料であって、基材に固定化したリガンドが外部刺激により脱離できる液体クロマトグラフ用カラム材料。
（２）該基材が繊維あるいは多孔質膜であることを特徴とする請求項１に記載の液体クロマトグラフ用カラム材料。
（３）該基材が海島型繊維であることを特徴とする（１）に記載の液体クロマトグラフ用カラム材料
（４）該基材がポリスチレン、ポリスルホン、ポリメチルメタクリレート、ポリエステルおよびそれらの誘導体からなる群より１つ以上選ばれた物質からなることを特徴とする（１）〜（３）のいずれかに記載の液体クロマトグラフ用カラム材料。
（５）アミノ基を有することを特徴とする（１）〜（４）のいずれかに記載の液体クロマトグラフ用カラム材料。
（６）前記アミノ基がポリエチレンイミン由来であることを特徴とする（５）に記載の液体クロマトグラフ用カラム材料。
（７）前記リガンドと前記基材とが化学結合を介して固定化されており、前記化学結合が前記外部刺激によって切断することにより前記リガンドが脱離可能であることを特徴とする（１）〜（６）のいずれかに記載の液体クロマトグラフ用カラム材料。
（８）前記外部刺激が還元剤による還元反応であることを特徴とする（１）〜（７）のいずれかに記載の液体クロマトグラフ用カラム材料。
（９）前記リガンドと前記基材がジスルフィド結合を介して結合されていることを特徴とする（１）〜（８）のいずれかに記載の液体クロマトグラフ用カラム材料。
（１０）前記リガンドと前記基材が架橋剤によって固定されており、前記架橋剤の両末端の官能基が、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド基、ピリジルジスルフィド基およびマレイミド基からなる群より選ばれることを特徴とする（１）〜（９）のいずれかに記載の液体クロマトグラフ用カラム材料
（１１）該架橋剤がＮ−スクシンイミジル　３−（２−ピリジルジチオ）−プロピオネートであることを特徴とする（１０）に記載の液体クロマトグラフ用カラム材料。
（１２）前記基材が表面にアミノ基を有するものであり、前記リガンドがメルカプト基を有するものであって、前記アミノ基と前記メルカプト基を外部刺激により切断可能な架橋剤を利用して架橋されたものであることを特徴とする（１）〜（８）のいずれかに記載の液体クロマトグラフ用カラム材料。
（１３）前記リガンドに２−ピリジル−ジスルフィド基が１モル以上１０モル以下で導入されていることを特徴とする（１２）に記載の液体クロマトグラフ用カラム材料。
（１４）前記リガンドにメルカプト基が１モル以上１０モル以下で導入されていることを特徴とする（１２）に記載の液体クロマトグラフ用カラム材料。
（１５）前記リガンドが抗体あるいはレセプターであることを特徴とする（１）〜（１４）のいずれかに記載の液体クロマトグラフ用カラム材料
（１６）細胞分離用あるいは細胞濃縮用に用いられることを特徴とする（１）〜（１５）のいずれかに記載の液体クロマトグラフ用カラム材料。
（１７）（１）〜（１６）のいずれかに記載の液体クロマトグラフ用カラム材料を用いた細胞の分離濃縮方法。
（１８）（１）〜（１６）のいずれかに記載の液体クロマトグラフ用カラム材料を用いた細菌毒素の分離濃縮方法。
【０００７】
【発明の実施の形態】
本発明において、基材に固定化したリガンドを脱離させる外部刺激として、たとえば光、熱、ｐＨ、塩濃度、化学反応などがあげられるが、リガンドの安定性や吸着対象物への傷害性を考慮すると、化学反応により化学結合を切断してリガンドが脱離される材料が好ましい。化学的な結合が切断される反応としては、加水分解反応、酸化反応、還元反応、酵素反応などが挙げられるが、水中での安定性や細胞のバイアビリティ維持が必要であることから還元反応が最も好ましい。特に、ジスルフィド結合を還元剤による還元反応により切断させる反応は、タンパク質のリフォールディングなど生体内で良く行われる反応であり、リガンドを脱離する反応として好適に用いられうる。このような還元反応をおこす還元剤としてジチオスレイトール、メルカプトエタノール、システイン、還元型グルタチオンなどがあげられるが、これらに限定されない。
【０００８】
リガンドは、ターゲット物質と相互作用をもつものであれば、合成品、天然物の限定はされないが、抗体やレセプターなどを好ましく用いることができる。抗体を用いるのであれば、たとえば抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ４抗体、抗ＣＤ２８抗体、抗ＣＤ３４抗体、抗ＣＤ１９９抗体、抗ＣＣＲ４抗体、抗低比重リポ蛋白質（ＬＤＬ）抗体、抗酸化ＬＤＬ抗体、抗β２ミクログロブリン抗体、抗黄色ブドウ球菌毒素抗体などを用いることができ、目的によってその他のものも含めて種々選定することができる。
【０００９】
また、レセプターを使用するのであれば、例えばＣＣＲ３，ＣＣＲ４等のサイトカインレセプターやＦｃγ，Ｆｃε等のイムノグロブリンレセプター、ＲＡＧＥ，ＬＤＬレセプター等のスカベンジャ−レセプター等，Ｔ細胞レセプターや主要組織適合性抗原等の細胞認識レセプター等を用いることができるがこれらに限定されるものではない。
【００１０】
これらの抗体、レセプターは単独で用いても良いし、複数の抗体やレセプターを組み合わせて用いることもできる。
【００１１】
ターゲット物質として、無機物、タンパク質、ＤＮＡ、脂質、糖、細胞、ウィルスを挙げることができ、これらの物質を除去、回収する際は、リガンドを脱離させればよく、そのようにして回収したターゲット物質を分析することが可能である。また、細胞の場合は分離回収後に培養し、分析などに利用できる。回収時に使用する外部刺激によりターゲット物質が変性、分解あるいは傷害されてしまい回収後に活性を示さない場合が考えられるため、温和な外部刺激により切断されるリガンド結合構造が好ましい。このような外部刺激による切断の例としては酵素による特異的な配列の切断や還元剤によるジスルフィド結合の還元切断が考えられる。また、ジスルフィド結合の場合はリガンド脱離後の材料を再生・再利用することも可能である。
【００１２】
リガンドがタンパク質である場合は、タンパク質自身もジスルフィド結合を有することもあるので、リガンドを直接材料に固定しても良い。
【００１３】
基材にジスルフィド結合を介してリガンドを固定化する方法としては、たとえばメルカプト基同士の酸化反応やあるいはジスルフィド交換反応を利用してジスルフィド結合を形成させる反応を利用できる。ジスルフィド交換反応を利用する場合は、ピリジルジスルフィド基とメルカプト基の反応が好適に用いられる。ピリジルジスルフィド基をもつ基材を用いる場合は、リガンドにピリジルジスルフィド基を導入して、還元し、生成するメルカプト基を用いて基材に固定化することができ、リガンドが抗体である場合は、抗体をペプシンで消化し、抗体の可変部位のみに精製して、リガンドに生成するメルカプト基を用いて基材に固定化することができる。この際、リガンドにピリジルジスルフィド基を導入して、還元する場合、リガンドが抗体である場合は、酢酸緩衝液中などで還元することにより抗体自身の還元を抑えることができる。メルカプト基をもつ基材を用いる場合は、リガンドにピリジルジスルフィド基を導入したものと反応させればよい。
【００１４】
ジスルフィド交換反応を利用する方法としては、ピリジルジスルフィド基の交換反応を利用できる架橋剤を用いることが好ましく、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド基とピリジルジスルフィド基を持つような架橋剤を利用することができる。このような架橋剤として、Ｎ−スクシンイミジル　３−（２−ピリジルジチオ）−プロピオネート、スルフォスクシンイミジル６−［３’（２−ピリジルジチオ）−プロピオンアミド］ヘキサノエート、スクシンイミジル６−［３’（２−ピリジルジチオ）−プロピオンアミド］ヘキサノエートなどが挙げられる。このような架橋剤を利用することによりメルカプト基を有していないリガンドに対してもジスルフィド基を付加することが可能であり、このジスルフィド基を利用して基材にリガンドを固定化できる。
【００１５】
外部刺激によって解離する官能基の密度は高い方が望ましいが、反応に用いる架橋剤の濃度や反応時間により制御することができるので、適宜選ぶことができる。リガンドへのピリジルジスルフィド基の導入率はリガンド１モル当たり１モル以上であることが必要であるが、導入率を上げるためにピリジルジスルフィド化剤の仕込量を上げると、リガンドがタンパク質の場合は失活したり、凝集したりするおそれがあり、仕込量はリガンド１モルあたり１０モル以下が望ましい。
【００１６】
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド基をもつ架橋剤を用いる場合は基材の表面にアミノ基が必要である。基材表面にアミノ基がない場合は、基材表面にアミノ基を導入する必要があり、官能基をアミノ基に変換する反応か、あるいはアミノ基を持つポリマーや低分子物質を結合させることにより達成できる。
【００１７】
材料にアミノ基を含有させる方法として、繊維に対してあらかじめアミンと反応する活性基の官能基を導入し、それに続いてアミンの誘導体を含有する溶液に浸漬または付着させてアミノ基を導入することが出来る。また、繊維を編地状やフェルト状に加工したものに活性基を導入し、アミノ基を含有する溶液に浸漬または付着させて固定化することも可能である。
【００１８】
アミンと反応する活性基としてはクロロメチル基、クロロアセトアミドメチル基、エポキシ基などが利用される。あらかじめ、ポリエチレンイミンなどのアミノ基含有物質に外部刺激により解離する基を導入しておく方法も好ましく用いられる。ジスルフィド基を利用する場合は、メルカプト基を有するアミノ基含有物質を固定化に用いてもよい。
【００１９】
アミンの誘導体としては、ポリマーであってもモノマーであってもよい。モノマーの場合は、アンモニア、エチレンジアミン、テトラエチレンペンタミン、デンドリマー、アグマチンなどが用いられる。アミノ基含有ポリマーの例としては、ポリアルキレンイミン、ポリアリルアミン、ポリビニルアミン、ポリリジン、アジリジン（エチレンイミン）化合物を有するポリマー、ポリエチレンイミン誘導体、キトサン、およびそれらに置換基の導入されたもの、およびこれらを構成するモノマー単位からなる共重合体などが挙げられ、アミノ基量の多いポリマーが好適に用いられる、特にポリエチレンイミンでは分子量６００以上の直鎖状、分岐状のものが好ましく用いられる。
【００２０】
また、ポリエチレンイミン誘導体として、ポリエチレンイミンをアルキル化、カルボキシル化、フェニル化、リン酸化、スルホン化、メルカプト化、ピリジルジスルフィド化などによってアミノ基をさらに所望の割合で化学修飾したものが用いられる。
【００２１】
アミノ基含有ポリマーの中でも毒性の低さ、入手のしやすさ、取り扱いのしやすさなどから、分岐状のポリエチレンイミンが好適に用いられる。
【００２２】
本発明の基材は特に限定しないが、耐薬品性や耐熱性あるいは安価であることを考えると、有機高分子化合物が好ましい。例えば、ポリ塩化ビニル、セルロース、キトサン、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート、ポリカーボネート、ポリスルホン、ポリウレタン、ポリエステル、ポリアミド、ポリエチレン、ポリプロピレンおよびそれらの誘導体が挙げられる。液体処理カラムとして用いる場合には、ビーズ、繊維、中空繊維、糸束、ヤーン、ネット、編地、織物等が用いられるが、表面積が大きくかつ細胞を流した場合にも詰まることなく、流路抵抗の低いことを考慮すると、繊維、編地、織物、中空糸、多孔質膜が好ましく用いられる。
【００２３】
本発明に係る液体クロマトグラフ用カラム材料の製造方法をポリスチレン繊維に精製ヒト免疫グロブリンＧを固定化する場合を例に説明する。
【００２４】
（１）メルカプト基を有するポリスチレン繊維の作製
ポリスチレン繊維にＮ−メチロール−α−クロロアセトアミドとニトロベンゼン、９８％硫酸、パラホルムアルデヒドの混合液中でを１０℃で２時間反応させ、繊維をニトロベンゼンで洗浄し、メタノールで反応を停止させ、クロロアミドメチル化架橋ポリスチレン繊維を得る。ポリエチレンイミンをジメチルスルフォキシドに溶解し、この溶液にクロロアミドメチル化架橋ポリスチレン繊維を加え攪拌する。反応は３０℃で３時間行い、その後、ジメチルスルフォキシド、メタノール、純水で洗浄する。ここで得られたアミノ基を含有する繊維を、Ｎ−スクシンイミジル　３−（２−ピリジルジチオ）−プロピオネート（以下ＳＰＤＰ）を溶解したリン酸緩衝液に０．５時間浸漬し、リン酸緩衝液で洗浄した後、洗浄した繊維を１００ｍＭのジチオスレイトールを含むリン酸緩衝液で還元し、表面にメルカプト基を有するポリスチレン繊維を得ることができる。
【００２５】
（２）抗体のＳＰＤＰ化
ＮａＣｌを０．１５ｍＭ含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解した精製ヒト免疫グロブリンＧに、ＳＰＤＰを溶解したジメチルスルホキシド溶液を抗体１モルに対して１０モル添加し、室温で３０分反応させた後、精製し、ＳＰＤＰ化免疫グロブリンＧを得ることができる。
【００２６】
（３）ポリスチレン繊維への抗体固定化
表面にメルカプト基を有するポリスチレン繊維をＳＰＤＰ化免疫グロブリンＧを含むリン酸緩衝液中に室温で１時間浸漬することにより、ジスルフィド結合を介して免疫グロブリンＧを固定化したポリスチレン繊維を作製することができる。
【００２７】
以上のような方法で、基材に固定化したリガンドが外部刺激により脱離できる液体クロマトグラフ用カラム材料が作製できるが、この製造方法に限定されない。
【００２８】
また、本発明に係る液体クロマトグラム材料の使用方法を細胞の分離濃縮方法、細胞毒素の分離濃縮に用いる場合を例に説明する。
【００２９】
（４）液体クロマトグラム材料の作製方法
例えば、抗体として抗ヒトＣＤ４モノクローナル抗体を使用して（２）と同様の方法でＳＰＤＰ化し、このＳＰＤＰ化抗ヒトＣＤ４モノクローナル抗体を含むリン酸緩衝液中に、上記（１）で作製したような表面にメルカプト基を有するポリスチレン繊維を浸漬し、抗体をポリスチレン繊維にジスルフィド結合を介して固定化して抗ヒトＣＤ４モノクローナル抗体固定化繊維を得る。得られた繊維を筒状のカラムに充填した。
【００３０】
（５）細胞の分離濃縮方法
（４）で得られたカラムにヘパリンを含むヒト末梢血３ｍｌを通過処理させ、処理後のカラムをリン酸緩衝液で洗浄した後、ジチオスレイトールを含むリン酸緩衝液を６ｍｌ通過させることにより、ＣＤ４陽性率９割以上の細胞群を得ることができる。
【００３１】
（６）細胞毒素の分離濃縮方法
抗体としてウサギ抗黄色ブドウ球菌腸管毒素Ａ抗体を使用し、（４）と同様の方法でこの抗体を固定したカラムを作製し、このカラムに精製黄色ブドウ球菌外毒素Ａを含む低脂肪牛乳を室温で１５分循環させるとことにより黄色ブドウ球菌腸管毒素Ａを繊維表面へ吸着させた後、ジチオスレイトールを含むリン酸緩衝液を用いてジスルフィド結合を還元して、還元溶液を回収し、毒素含有液をえることができた。この液をさまざまな測定に使用することが出来る。
【００３２】
以下に実施例を用いて詳細に説明を加えるが、発明の内容は実施例に限定されるものではない。
【００３３】
【実施例】
１．メルカプト基を導入した修飾ポリスチレン繊維の作成
５０重量比の海成分（４６重量比のポリスチレンと４重量比のポリプロピレンの混合物）と５０重量比の島成分（ポリプロピレン）とからなる海島型複合繊維（厚さ：２．６デニール、島の数１６）を、３５ｇのＮ−メチロール−α−クロロアセトアミド、２３２．５ｇのニトロベンゼン、２３２．５ｇの９８％硫酸、０．５ｇのパラホルムアルデヒドの混合液を１０℃で２時間反応させた。繊維をニトロベンゼンで洗浄し、メタノールで反応を停止させた。これによりクロロアミドメチル化架橋ポリスチレン繊維（以下ＡＭＰＳｔ繊維と略す）を得た。得られたＡＭＰＳｔ繊維を編地とした（以下ＡＭＰＳｔ編地と略す）。ポリエチレンイミン（分子量１万、和光純薬製）０．５７ｇを、トリエチルアミン０．９５ｇ、ジメチルスルフォキシド４８．５ｇに溶解し、この溶液に上で作製したＡＭＰＳｔ編地を１．０２ｇ（クロロ含量２．６ｍｍｏｌ相当）加え攪拌した。反応は３０℃で３時間行った。その後ジメチルスルフォキシド、メタノール、純水で洗浄し、アミノ基を含有するＡＭＰＳｔ編地１を得た。
【００３４】
上記のＡＭＰＳｔ編地１をＮａＣｌを０．１５ｍＭ含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）にＮ−スクシンイミジル　３−（２−ピリジルジチオ）−プロピオネート（ピアース社製、以下ＳＰＤＰ）を２７ｍＭに溶解したジメチルスルホキシド溶液に０．５時間浸漬した（室温）。反応させたＡＭＰＳｔ編地１をリン酸緩衝液洗浄した後、洗浄した材料を１００ｍＭのジチオスレイトールを含むリン酸緩衝液で還元し、その後１００ｍｌの上記リン酸緩衝液で洗浄し、表面にメルカプト基をもつをＡＭＰＳｔ編地２を得た。
【００３５】
２．マウス抗ヒトＨＬＡＤＲ蛋白抗体およびウサギ抗黄色ブドウ球菌腸管毒素Ａ抗体へのピリジルジスルフィド基導入
０．１５ｍＭのＮａＣｌを含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に１．１ｍｇ／ｍｌとなるようにマウス抗ヒトＨＬＡＤＲ蛋白抗体（ＩｇＧ２ａ）（シグマ社）を溶解した溶液に、ジメチルスルフォキシドに溶解した２７ｍＭのＳＰＤＰを抗体１モルに対してＳＰＤＰが１０モルになるように添加し、室温で３０分反応させた。その後、ＰＤ−１０カラム（ファルマシア社製）でゲル濾過し高分子量分画のみを分画してＳＰＤＰ化ＩｇＧを精製した。ＳＰＤＰ化ＩｇＧをメルカプトエタノールで還元して生成するチオピリジン濃度を３４３ｎｍの吸収で測定して算出したＳＰＤＰ化率は２．２ｍｏｌＳＰＤＰ／１ｍｏｌＩｇＧであった。
【００３６】
また、０．１５ｍＭのＮａＣｌを含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に１．０ｍｇ／ｍｌとなるようにウサギ抗黄色ブドウ球菌腸管毒素Ａポリクローナル抗体（トキシンテクノロジー社）を溶解した溶液に、ジメチルスルホキシドに溶解した２７ｍＭのＳＰＤＰを抗体１モルに対してＳＰＤＰが１０モルになるように添加し、室温で３０分反応させた。その後、ＰＤ−１０カラム（ファルマシア社製）でゲル濾過し高分子量分画のみを分画してＳＰＤＰ化ＩｇＧを精製した。ＳＰＤＰ化ＩｇＧをメルカプトエタノールで還元して生成するチオピリジン濃度を３４３ｎｍの吸収で測定して算出したＳＰＤＰ化率は３．２ｍｏｌＳＰＤＰ／１ｍｏｌＩｇＧであった。
【００３７】
（実施例１）
１．で作製したメルカプト基が導入されたＡＭＰＳｔ編地２を２．で得られたＳＰＤＰ化マウス抗ヒトＨＬＡＤＲ蛋白ＩｇＧ（ＳＰＤＰ化率：２．２ｍｏｌＳＰＤＰ／１ｍｏｌＩｇＧ）を含むリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に室温で１８時間浸漬し、基材のメルカプト基とＩｇＧのＳＰＤＰを反応させて、抗体をＡＭＰＳｔ編地２にジスルフィド結合を介して固定化し、実施例１の液体クロマトグラフ用カラム材料を作製した。ＳＰＤＰとメルカプト基の反応時に生成してくるピリジン−２−チオンの濃度を３４３ｎｍの吸収で測定することにより、固定化ＩｇＧの量を定量したところ、１ｇの実施例１あたり、２５μｇのＩｇＧが固定化されていた。
【００３８】
抗凝固剤としてヘパリンを使用し、ヘパリン濃度を１ｕｎｉｔ／ｍｌとして健常人より５０ｍｌ採血した。血液をＲＰＭＩ培地で１０倍に希釈後、実施例１の液体クロマトグラフ用カラム材料（抗ヒトＨＬＡＤＲ抗体固定化繊維）を１ｇ充填したカラム中を室温で１５分循環させるとことにより、ＨＬＡＤＲ陽性細胞を繊維表面へ吸着した。吸着後、ＲＰＭＩ培地５０ｍｌでカラムを洗浄後、外部刺激として２５ｍＭジチオスレイトールおよび０．１５ｍＭのＮａＣｌ含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）を２０ｍｌ用いてジスルフィド結合を還元した。還元は室温で１５分行った。還元後、還元溶液を回収し、細胞懸濁液とした。
【００３９】
細胞懸濁液を遠心し、細胞を沈殿させた後に０．１５ｍＭのＮａＣｌを含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）を１ｍｌ用いて細胞を再懸濁した後、２．で用いた抗ヒトＨＬＡＤＲ抗体およびＦＩＴＣ（フルオレッセンスイソチオシアネート）標識した抗マウスＩｇＧ２ａ抗体を用いて細胞をＨＬＡＤＲ特異的に蛍光標識した。その後、細胞を洗浄後に０．１５ｍＭのＮａＣｌ含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）を２．５ｍｌ用いて懸濁したのちフローサイトメーター（ベクトンデッキンソン社）により解析したところ、ＨＬＡＤＲ陽性細胞群が純度６０％で回収できていることが示された。
【００４０】
（実施例２）
１．で作製したメルカプト基が導入されたＡＭＰＳｔ編地２を２．で得られたＳＰＤＰ化ウサギ抗黄色ブドウ球菌腸管毒素Ａポリクローナル抗体（ＳＰＤＰ化率：３．２ｍｏｌＳＰＤＰ／１ｍｏｌＩｇＧ）を含むリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に室温で１８時間浸漬し、基材のメルカプト基とＩｇＧのＳＰＤＰを反応させて、抗体をＡＭＰＳｔ編地２にジスルフィド結合を介して固定化し、実施例２の液体クロマトグラフ用カラム材料を作製した。ＳＰＤＰとメルカプト基の反応時に生成してくるピリジン−２−チオンの濃度を３４３ｎｍの吸収で測定することにより固定化ＩｇＧの量を定量したところ、１ｇの実施例２あたり、２２μｇのＩｇＧが固定化されていた。
【００４１】
低脂肪牛乳５０ｍｌに濃度が１ｎｇ／ｍｌになるように精製黄色ブドウ球菌外毒素Ａ（トキシンテクノロジー社）を添加した。添加後、実施例２の液体クロマトグラム用カラム材料を１ｇ充填したカラム中を室温で１５分循環させるとことにより黄色ブドウ球菌腸管毒素Ａを繊維表面へ吸着した。吸着後、０．１５ｍＭのＮａＣｌ含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）５０ｍｌでカラムを洗浄後、外部刺激として２５ｍＭジチオスレイトールおよび０．１５ｍＭのＮａＣｌ含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）を２ｍｌ用いてジスルフィド結合を還元した。還元は室温で１５分行った。還元後、還元溶液を回収し、毒素含有液とした。
【００４２】
毒素含有液中の黄色ブドウ球菌腸管毒素Ａの濃度を酵素免疫学的に測定したところ１１ｎｇ／ｍｌであり濃度として１１倍濃縮されていることが示された。また、多量の夾雑物が存在する牛乳中より夾雑物の少ないリン酸緩衝液へ溶媒置換することも可能であった。
【００４３】
【発明の効果】
本発明により、液体中の有用物質や病因物質を特異的に分離回収することが可能であり、詳細な分析などに利用でき、抗体脱離後の材料は再利用することもできる材料を提供することを可能とする技術を提供する。この発明により、牛乳に混入した細菌毒素を濃縮し、検出可能にすること、あるいは血液中の特定の表面抗原特異的な細胞の分離濃縮を煩雑な操作なしで行うことが可能となった。

Claims (18)

1. リガンドと前記リガンドを固定化するための基材を含むリガンド固定化材料であって、基材に固定化したリガンドが外部刺激により脱離できる液体クロマトグラフ用カラム材料。
2. 該基材が繊維あるいは多孔質膜であることを特徴とする請求項１に記載の液体クロマトグラフ用カラム材料。
3. 該基材が海島型繊維であることを特徴とする請求項１に記載の液体クロマトグラフ用カラム材料。
4. 該基材がポリスチレン、ポリスルホン、ポリメチルメタクリレート、ポリエステルおよびそれらの誘導体からなる群より１つ以上選ばれた物質からなることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の液体クロマトグラフ用カラム材料。
5. アミノ基を有することを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の液体クロマトグラフ用カラム材料。
6. 前記アミノ基がポリエチレンイミン由来であることを特徴とする請求項５に記載の液体クロマトグラフ用カラム材料。
7. 前記リガンドと前記基材とが化学結合を介して固定化されており、前記化学結合が前記外部刺激によって切断することにより前記リガンドが脱離可能であることを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載の液体クロマトグラフ用カラム材料。
8. 前記外部刺激が還元剤による還元反応であることを特徴とする請求項１〜７のいずれかに記載の液体クロマトグラフ用カラム材料。
9. 前記リガンドと前記基材がジスルフィド結合を介して結合されていることを特徴とする請求項１〜８のいずれかに記載の液体クロマトグラフ用カラム材料。
10. 前記リガンドと前記基材が架橋剤によって固定されており、前記架橋剤の両末端の官能基が、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド基、ピリジルジスルフィド基およびマレイミド基からなる群より選ばれることを特徴とする請求項１〜９のいずれかに記載の液体クロマトグラフ用カラム材料。
11. 該架橋剤がＮ−スクシンイミジル　３−（２−ピリジルジチオ）−プロピオネートであることを特徴とする請求項１０に記載の液体クロマトグラフ用カラム材料。
12. 前記基材が表面にアミノ基を有するものであり、前記リガンドがメルカプト基を有するものであって、前記アミノ基と前記メルカプト基を外部刺激により切断可能な架橋剤を利用して架橋されたものであることを特徴とする請求項１〜８のいずれかに記載の液体クロマトグラフ用カラム材料。
13. 前記リガンドに２−ピリジル−ジスルフィド基が１モル以上１０モル以下で導入されていることを特徴とする請求項１２に記載の液体クロマトグラフ用カラム材料。
14. 前記リガンドにメルカプト基が１モル以上１０モル以下で導入されていることを特徴とする請求項１２に記載の液体クロマトグラフ用カラム材料。
15. 前記リガンドが抗体あるいはレセプターであることを特徴とする請求項１〜１４のいずれかに記載の液体クロマトグラフ用カラム材料。
16. 細胞分離用あるいは細胞濃縮用に用いられることを特徴とする請求項１〜１５のいずれかに記載の液体クロマトグラフ用カラム材料。
17. 請求項１〜１６のいずれかに記載の液体クロマトグラフ用カラム材料を用いた細胞の分離濃縮方法。
18. 請求項１〜１６のいずれかに記載の液体クロマトグラフ用カラム材料を用いた細菌毒素の分離濃縮方法。