JP2008528966A

JP2008528966A - クロマトグラフィー媒体

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Publication number: JP2008528966A
Application number: JP2007552130A
Authority: JP
Inventors: ナンドゥ・デオールカル; ロバート・シー・バス; ジョゼフ・エム・ムラドシッチ; ポール・エイ・ブイス
Original assignee: Avantor Performance Materials LLC; Mallinckrodt Baker Inc
Current assignee: Avantor Performance Materials LLC
Priority date: 2005-01-25
Filing date: 2005-12-16
Publication date: 2008-07-31
Anticipated expiration: 2025-12-16
Also published as: TW200637876A; US20140194543A1; DK1841527T3; JP5094417B2; CA2595735A1; AU2005325711A1; MY144940A; DE602005016972D1; WO2006081002A3; TWI398453B; NZ556639A; CA2595735C; BRPI0519950B1; BRPI0519950A2; ES2332008T3; KR20070102685A; IL184761A0; WO2006081002A2; ATE444119T1; MX2007008832A

Abstract

本発明は、新規ポリマー性クロマトグラフィー媒体、好ましくは混合態様のポリマー性クロマトグラフィー媒体の製造および使用に関する。本発明によると、ポリエチレンイミンで誘導体化されたポリマー性粒子、好ましくは適切な反応物でさらに官能化されたそのようなポリエチレンイミン誘導体化ポリマー性粒子を使用して、ポリマー性媒体を製造する。ポリマー性クロマトグラフィー媒体は、生体物質分離に特に有用である。

Description

発明の分野
本発明は、ペプチド、タンパク質および抗体などの様々な生体分子の分離および精製のための、新規クロマトグラフィー媒体、好ましくは混合態様のポリマー性クロマトグラフィー媒体の製造および使用に関する。より具体的には、本発明は、新規クロマトグラフィー媒体、好ましくは混合陰イオン交換剤、混合陰イオン−陽イオン交換剤および疎水性交換剤を開示する。そのクロマトグラフィー媒体は、ポリエチレンイミンによるポリマーの修飾およびそれらの官能化により製造される。これらの混合態様のポリマー性媒体が、増強された分離能力およびタンパク質結合量を提供することが、予想外に見出された。

発明の背景
イオン交換クロマトグラフィー媒体によるタンパク質混合物の分析は、documented, Pete Gagnon, "Purification Tools for Monoclonal Antibodies", Validated Biosystems, Inc., (1996）などにより十分に文書で報告されている。より最近になって、タンパク質をベースとする薬物およびワクチンの発展は、より大きい規模のタンパク質混合物の精製の必要性を高めた。この領域で利用できるイオン交換クロマトグラフィー媒体が非常に望まれている。

かかるクロマトグラフィー媒体物質、特に第一級および第二級アミン官能性を含有する陰イオン交換剤を製造する１つのやり方は、多孔性シリカ物質の内表面をポリエチレンイミン（ＰＥＩ）で被覆することによる。例えば、シリカ粒子の内表面のポリエチレンイミンによる被覆、これに続く架橋による不動化は、Alpert and Regnier, J. Chromatogr. 185, 375 - 392 (1979）に開示され、このやり方で製造された材料の合成オリゴヌクレオチドのクロマトグラフィー的分離のための使用は、Lawson et al., Anal. Biochem. 133, 85-93 (1983）に記載されている。

同様に、ＰＥＩ被覆多孔性シリカ粒子またはポリエチレンイミノプロピル−トリメトキシシランの共有結合により得られる制御多孔性（controlled pore）ガラス粒子は、JT Baker Chemical Co のＵＳ４,５４０,４８６に開示されている。同特許は、ＰＥＩ被覆シリカの環状カルボン酸無水物との反応による、弱塩基／弱酸の混合された官能性を有するクロマトグラフィー樹脂の形成を開示している。これらの物質は、クロマトグラフィーカラムで使用されるとき、チトクロムＣ、アルファ１−酸糖タンパク質、オボアルブミンおよびベータ−ラクトグロブリン（弱塩基媒体）または、オボアルブミン、チトクロムＣ、ヘモグロビンおよびリゾチーム（弱塩基／弱酸混合媒体）の混合物を分離できる。ＰＥＩ誘導体化された多孔性シリカまたはそのカルボキシル化された変形物の免疫グロブリンＧの精製における効力は、JT Baker Chemical Co のＵＳ４,６０６,８２５でも立証された。

上記のＰＥＩ被覆シリカのアシル化形態は、JT Baker Chemical Co のＵＳ４,７２１,５７３に開示の通り、スルホン基の導入により、弱酸／強酸官能性媒体にさらに変換できる。このスルホン化媒体を充填したカラムは、チトクロムＣ、ヘモグロビン、リゾチームおよびオボアルブミンの混合物の分離、並びにハイブリドーマ細胞培養培地のタンパク質成分の分離を可能にする。

ＰＥＩが共有結合しているシリカ粒子は、モノアシルクロリドまたは直鎖状カルボン酸無水物（ここで、アシル基は直鎖状炭化水素鎖、フェニル基または置換フェニル基であり得る）との反応により、疎水性クロマトグラフィー媒体に変換することもできる。塩化ブチリルを使用してこのやり方で製造されたシリカをベースとする弱塩基／逆相クロマトグラフィー媒体は、JT Baker Chemical CoのＵＳ４,５５１,２４５に開示の通り、チトクロムＣ、ミオグロビン、リゾチーム、オボアルブミンおよびアルファ−キモトリプシノーゲンを分離する。

ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）腕の末端にイオン交換基を有するアガロースビーズは、Amersham のＷＯ９８／５８７３２で開示された。しかしながら、本発明と異なり、ＰＶＡスペーサー腕は、製品にいかなるイオン交換量も実現せず、また、それ自体、混合態様の製品における官能性を１つも提供しない。

シリカをベースとするクロマトグラフィー充填物の主な欠点の１つは、それらが高ｐＨで安定性を欠くということである。これは、１Ｎ水酸化ナトリウムでの装置の処理は一般的な滅菌実務であるので、薬物の精製を含む適用に特に当てはまる。

発明の要旨
本発明は、高ｐＨでの安定性の欠如を最小化または回避できるクロマトグラフィー媒体を提供する。本発明はまた、混合態様のクロマトグラフィー媒体も提供する。この不安定性の問題を回避する１つの可能なやり方は、ポリマーの表面でＰＥＩにより誘導体化された（即ち、架橋されていない）ポリマー性の支持体をベースとし、その表面誘導体化媒体が、官能化剤とポリマー性樹脂の表面上のポリエチレンイミンの末端アミノ基との反応によりさらに官能化されていてもよいクロマトグラフィー充填物を使用することであると見出された。本発明によると、好ましくは、例えば、混合された第一級、第二級および第三級アミン交換部位を有する媒体、弱陰イオンおよび弱陽イオン交換部位の両方を有する媒体、弱陰イオン、弱陽イオンおよび強陽イオン交換部位を有する媒体、弱陰イオンおよび疎水性（逆相）交換部位を有する媒体、および弱陰イオンおよび強陰イオンを有する媒体などの、混合態様の媒体が提供され得る。さらに、そのようなポリエチレンイミンにより誘導体化されたポリマー性のクロマトグラフィー媒体、およびそれの官能化された誘導体をベースとするものは、色々な独特の分離特性を提供することが予想外に見出される。本発明のある態様では、生体物質分離（bioseparation）用のポリマー性クロマトグラフィー媒体が提供される。現行のクロマトグラフィー媒体は単純なイオン交換剤であるので、本発明は現行のポリマー性クロマトグラフィー媒体と製造方法および媒体の特性により異なる。また、本発明の媒体は、製造方法、組成、使用および性能の観点で現行のシリカをベースとする媒体と異なる。驚くべきことに、本発明により製造されるポリマー性の混合態様の媒体は、増強された分離および結合量を有する。

図面の簡単な説明
本発明は、添付の図面により例示説明されるが、これらに限定されない。図面中、
図１は、実施例１に従い製造された媒体およびＰＥＩシリカ媒体を使用し、実施例３４の操作によるタンパク質の分離の、ＵＶ検出器により記録された溶出プロフィールのグラフである；
図２は、実施例９に従い製造された媒体および混合態様のシリカ媒体を使用し、実施例３５の操作によるタンパク質の分離の、ＵＶ検出器により記録された溶出プロフィールのグラフである；
図３ａおよび３ｂは、実施例１９により製造された媒体およびシリカ媒体を使用し、実施例３７の操作によるタンパク質の分離の、ＵＶ検出器により記録された溶出プロフィールのグラフである；
図４は、実施例２０により製造された媒体を使用し、実施例３８の操作によるタンパク質の分離の、ＵＶ検出器により記録された溶出プロフィールのグラフである；
図５は、実施例２２により製造された媒体を使用し、実施例３９の操作によるタンパク質の分離の、ＵＶ検出器により記録された溶出プロフィールのグラフである；
図６は、実施例２３により製造された媒体を使用し、実施例４０の操作によるタンパク質の分離の、ＵＶ検出器により記録された溶出プロフィールのグラフである；
図７は、実施例４１の操作により測定された、実施例７により製造された媒体の酸安定性のグラフである；そして、
図８は、実施例４２の操作により測定された、実施例７により製造された媒体の塩基安定性のグラフである。

発明の詳細な説明
本発明は、新規ポリマー性クロマトグラフィー媒体、好ましくは混合態様のポリマー性クロマトグラフィー媒体の製造および使用に関する。本発明によると、ポリマー性媒体は、ポリエチレンイミンで誘導体化されたポリマー性粒子を使用して、好ましくはかかるポリエチレンイミン誘導体化ポリマー性粒子を適切な反応物でさらに官能化して、製造される。

タンパク質のクロマトグラフィー的分離に使用されるポリマー性材料は、好ましくは、以下のような一定の特性を有する。
１）孔サイズが、樹脂粒子を出入りするタンパク質程度の大分子の迅速な拡散を可能にするほど、十分に大きい；
２）タンパク質と非官能化ポリマーとの間の相互作用が、「非特異的相互作用」を回避し、所望のタンパク質の高収率での回収を可能にするために、弱くあるべきである；
３）樹脂粒子が、クロマトグラフィー操作で遭遇する圧力下で、圧縮および流速の低下を回避するために、堅固であるべきである；そして、
４）樹脂は、分離方法において遭遇する全ての条件下で化学的に安定であるべきである。

ポリエチレンイミンにより表面で誘導体化しようとするポリマー性樹脂粒子は、ポリエチレンイミンで誘導体化され得る任意の適するポリマー性樹脂粒子であり得、かかるポリエチレンイミン誘導体化ポリマーまたはそのさらに官能化された誘導体は、クロマトグラフィー分離媒体として有用である。本発明によると、ポリエチレンイミンによる誘導体化に適するポリマー性樹脂粒子の例には、セルロース、アガロース、エポキシ化またはハロゲン化ポリスチレン、エポキシ化またはハロゲン化ポリアクリレートまたはポリメタクリレート、およびエポキシ化またはハロゲン化ポリジビニルベンゼンが含まれるが、これらに限定されない。例えば、孔形成剤の存在下で製造されたエチレングリコールジメタクリレート（Showa Denko のＵＳ４,１１８,３４７）、ペンタエリスリトールトリメタクリレート（Toyo Soda のＵＳ４,２５６,８４２）、トリメチロールプロパントリメタクリレート（Rohm および Haas のＵＳ４,５８２,８６０）またはグリセロールジメタクリレート（Mitsubishi のＵＳ２,２５４,６３４）などの多孔性ポリ（メト）アクリレートなどの、複数のポリマー化可能な二重結合を有する（メタ）アクリル酸モノマーをベースとする高度架橋樹脂は、所望の特性を有する物質を提供すると示された。さらに、ポリマー形成混合物への官能性モノマーの添加は、最終生成物に、他の分子が共有結合の形成を介して結合できる官能基を与える。かかるモノマーの例は、グリセロールメタクリレート（−ＯＨ基）（Mitsubishi のＵＳ２,２５４,６３４、１９９３）、ジメチルアミノエチルメタクリレート（第三級アミン）またはグリシジルメタクリレート（Showa Denko のＵＳ４,１１８,３４７、Toyo Soda のＵＳ４,２５６,８４２、Rohm および Haas のＵＳ４,５８２,８６０）である。ＰＥＩ表面誘導体化ポリマー性樹脂粒子との反応に適する官能化剤の例として、例えば、グルタル酸およびコハク酸無水物などの環状カルボン酸無水物、マレイン酸無水物などの不飽和カルボン酸無水物などの酸無水物、ナトリウムメタ−重亜硫酸塩などの重亜硫酸塩などのスルホン化剤、塩化ブチリルおよび酢酸または酪酸無水物などのアルキル塩化物または無水物、並びに（３−クロロ−２−ヒドロキシプロピル）トリメチルアンモニウムクロリドなどの第４級アンモニウム官能性を含有するアルキル塩化物、並びにこれらの官能化剤の混合物がある。

本発明のある実施態様では、混合された第一級および第二級および第三級アミン部位を有する陰イオン交換剤は、ポリエチレンイミンをエポキシまたはクロロ、ブロモ、ヨード基などのハロ基を有するポリマー性支持体と反応させることにより製造される。そのようなポリマー性支持体は、ポリ（メタ）アクリレート、セルロース、ポリスチレン−ジビニルベンゼンおよびアガロースなどの任意の適する合成ポリマーまたは天然ポリマー樹脂であり得る。そのような購入できる樹脂の例は、Tosoh Biosciences Toyopearl AF-epoxy 650M、エポキシ活性化 Sepharose 6B である。これらの物質は、化学的に安定なアルファ−ヒドロキシアミノ基の形成を介して、様々な分子量のポリエチレンイミンの末端アミノ基の１つと反応できる。以下の実施例１ないし５に従いこのやり方で製造される物質の特性のいくつかを、表１にまとめる。

第２の実施態様では、弱陰イオンおよび弱陽イオン交換部位を有する混合態様の媒体は、実施例６ないし１０に従い、ＰＥＩ官能化ポリマー性ビーズを、グルタル酸またはコハク酸無水物などの環状カルボン酸無水物と反応させることにより製造される。

第３の実施態様では、弱陰イオン、弱陽イオンおよび強陽イオン部位を有する混合態様の媒体は、実施例１１ないし１３に記載の通り、ＰＥＩ誘導体化ポリマーを不飽和カルボン酸無水物と反応させ、続いてスルホン化することにより製造された。

第４の実施態様では、弱陰イオンおよび疎水性（逆相）部位を有する混合態様の媒体は、ＰＥＩ誘導体化ポリマーをアルキル塩化物（実施例１４ないし１８）または一塩基酸無水物（実施例１９ないし２４）と反応させることにより製造された。塩化ブチリルとの反応は、トルエンまたはジオキサンを溶媒として使用して、２時間、室温で実施した。反応の副生成物として産生される塩酸を捕捉するために、トリエチルアミンを使用した。

第５の実施態様では、混合態様の媒体は、下記の実施例２０−２２に記載の通り、１−メトキシ−２−プロパノール中、３時間、６０℃で実施されるＰＥＩ被覆樹脂の酪酸無水物との反応により得られる。

疎水性部分がメチル基またはメチルおよびブチル基の組合せである混合態様の弱塩基／逆相樹脂は、実施例２４（酢酸無水物）または実施例２０および２３（混合された無水物）に各々示す通り、酢酸無水物または酪酸および酢酸無水物の連続的添加の使用により製造できる。こうして、反応剤の１種または組合せを使用することにより、疎水性を変更し、適切なものを選択することが可能である。

第６の実施態様では、弱陰イオンおよび強陰イオン（第四級アンモニウム）部位を有する混合態様の媒体は、末端の第四級アンモニウム官能基を含有するＰＥＩ誘導体化ポリマーをアルキル塩化物と反応させることにより製造された。より具体的には、下記の実施例２５ないし３０に示す通りに、ＰＥＩ誘導体化ポリマーを、（３−クロロ−２−ヒドロキシプロピル）トリメチルアンモニウムクロリドと、水性水酸化ナトリウム中、７０−８０℃で反応させる。

本発明によると、これらのポリマー性混合態様のクロマトグラフィー媒体は、増強された分離能力並びに高い容量および安定性を与えることが、予想外に見出された。例えば、図１に示す通り、ポリマー性混合態様の陰イオン交換媒体は、リゾチーム、免疫グロブリンＧ、ウシ血清アルブミン、ベータ−ラクトグロブリンＡおよびベータ−ラクトグロブリンＢを分離できるが、一方、ＰＥＩ−シリカをベースとする媒体は、これらの全てのタンパク質を分離できない。図２に示す通り、混合態様の陽イオン交換媒体は、ＢＳＡ、ＩｇＧ、チトクロム−Ｃおよびリゾチームを効率的に分離できるが、一方、混合態様のシリカ媒体は、これらの全てのタンパク質を分離できない。

実施例
実施例１
３５ミクロンの直径の平均粒子サイズを有するエポキシ保有メタクリレートポリマー１２ｇおよびジオキサン２５０ｍｌを、漏斗、撹拌機、還流冷却器および陽圧窒素流入口を備えた１Ｌ丸底フラスコに入れ、３０分間撹拌し、樹脂を膨潤させる。ポリエチレンイミン（ＰＥＩ、平均分子量６００ダルトン）２０ｇを添加し、さらなるジオキサン１５０ｍｌで漏斗をすすぐ。撹拌混合物を終夜還流する。混合物を冷却させた後、混合物を濾過フラスコに移し、濾液を除き、ジオキサンで１回、メタノールで３回洗浄し、真空下、６０℃で乾燥させる。元素分析：５７.８％Ｃ、７.４％Ｈおよび５.６％Ｎ。

実施例２
エポキシ保有メタクリレートポリマー５ｇおよびジオキサン１５０ｍｌを、撹拌機および還流冷却器を備えた５００ｍｌの丸底フラスコに入れる。ＰＥＩ（平均分子量１２００ダルトン）３０ｇを添加し、混合物を終夜還流する。冷却させた後、混合物を濾過フラスコに移し、濾液を除き、ジオキサンで２回、メタノールで３回洗浄し、乾燥させる。元素分析：５５.７％Ｃ、７.８％Ｈ、５.５％Ｎ。

実施例３
エポキシ担持メタクリレートポリマー５ｇおよびジオキサンと水の５０／５０混合物１５０ｍｌを、撹拌機および還流冷却器を備えた５００ｍｌの丸底フラスコに入れる。ＰＥＩ（平均分子量１２００ダルトン）３０ｇを添加し、混合物を終夜還流する（８９℃）。冷却させた後、混合物を濾過フラスコに移し、濾液を除き、ジオキサンで２回、メタノールで３回洗浄し、乾燥させる。元素分析は、最終生成物が５７.５％Ｃ、７.４％Ｈ、２.５％Ｎを含有することを示す。

実施例４
エポキシ保有メタクリレートポリマー５ｇおよび平均分子量１０,０００ダルトンのＰＥＩの３０重量％ジオキサン溶液１００ｍｌを、撹拌機、窒素流入口および還流冷却器を備えた丸底フラスコ２５０ｍｌに入れ、撹拌した混合物を終夜還流する。冷却させた後、混合物を濾過フラスコに移し、濾液を除き、６０℃の水で３回、メタノールで３回洗浄し、６０℃の真空オーブン中で終夜乾燥させる。元素分析は、最終生成物が５６.５％Ｃ、７.８％Ｈ、６.４％Ｎを含有することを示す。

実施例５
エポキシ保有メタクリル酸樹脂５ｇおよび平均分子量１０,０００ダルトンのＰＥＩの３０重量％水溶液１００ｍｌを、撹拌機および還流冷却器を備えた２５０ｍｌの丸底フラスコに入れ、撹拌した混合物を１７時間半撹拌する。冷却させた後、混合物を濾過フラスコに移し、濾液を除き、水で３回、メタノールで３回洗浄し、６０℃の真空オーブン中で終夜乾燥させる。元素分析は、最終生成物が５６.９％Ｃ、７.５％Ｈおよび３.２％Ｎを含有することを示す。

表１の結果が示す通り、系における水の存在は、窒素取込みに有害な影響を有するが、一方、乾燥ジオキサン中で様々な分子量のＰＥＩを樹脂と反応させる場合、近似の窒素含有量が得られる（ＰＥＩのポリマーに対する割合が実施例１より低いにも拘わらず）。

表１．窒素取込みに対する溶媒およびＰＥＩの分子量の影響

表１の結果がさらに示す通り、純粋なジオキサン中で実施される反応は、ジオキサン／水混合物または純粋な水とは対照的に、最終生成物の窒素含有量により示される通り、より高度の官能化をもたらす。純粋なジオキサンを溶媒として使用するとき（表１の第１列）、ＰＥＩの分子量が６００から１０,０００ダルトンに増えても、有意に高いレベルの窒素取込みは見られない。

実施例６：
実施例１の通りに製造したＰＥＩポリマー３０ｇを、同体積の１００％エタノールで２回、同体積の１−メトキシ−２−プロパノールで２回洗浄し、残留水分を除去する。次いで、ポリマーを１−メトキシ−２−プロパノール４５０ｍｌ中でスラリー化し、オーバーヘッド撹拌機、還流冷却器および陽圧窒素流入口を備えたフラスコに移し、６０℃に加熱する。９５％グルタル酸無水物１９.４３ｇ（ＰＥＩ樹脂の窒素含有量をベースとして１当量）の溶液を添加した後、温度を６０＋／−２℃に２時間半維持する。次いで、反応混合物を濾過フラスコに移し、濾液を除き、残っている固体を、１−メトキシ−２−プロパノール１００ｍｌで１回、メタノール１００ｍｌで２回、保存溶液（エタノール：水２０：８０ｖ／ｖ、または、２％ベンジルアルコールを含む１００ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ４.５）１００ｍｌで２回、洗浄する。タンパク質の特徴解析およびクロマトグラフィー分離のために、生成物を各々の保存溶液中で保存した。元素分析は、最終生成物が％Ｃ＝５５.１、％Ｎ＝４.６を含有することを示す。

実施例７
実施例１の通りに製造されたＰＥＩ被覆ポリマー７３.７ｇ、１−メトキシ−２−プロパノール２２５ｍｌおよびコハク酸無水物１４.４ｇを、６０＋／−２℃に加熱し、その温度で２時間半維持する。次いで、反応混合物を濾過フラスコに移し、濾液を除き、残っている固体を、１−メトキシ−２−プロパノール１００ｍｌで１回、メタノール１００ｍｌで２回、実施例５に記載の通りの保存バッファー溶液１００ｍｌで２回洗浄する。元素分析は、最終生成物が５３.０８％Ｃ、７.１３％Ｈおよび４.８６％Ｎを含有することを示す。

実施例８
実施例７の通りに、但し、コハク酸無水物投入量は１７.３４ｇで、反応を実施した。元素分析は、最終生成物が５３.１８％Ｃ、７.９７％Ｈおよび５.１８％Ｎを含有することを示す。

実施例９
実施例１の通りに製造したＰＥＩ被覆ポリマー１１ｇを、同体積の１００％エタノールで２回、同体積のジオキサンで２回洗浄し、残留水分を除去する。次いで、樹脂をジオキサン約２００ｍｌでスラリー化し、窒素流入管を備えた３口フラスコに移し、５０−６０℃に加熱する。１時間後、グルタル酸無水物７ｇを添加し、温度を６０＋／−２℃で２時間半維持する。次いで、反応混合物を濾過フラスコに移し、濾液を除き、残っている固体をジオキサンで３回、メタノールで３回洗浄し、真空下で乾燥させる。元素分析は、最終生成物が５６.６４％Ｃ、７.５４％Ｈおよび４.３６％Ｎを含有することを示す。

実施例１０
実施例９の通りに、但し、実施例１に従い製造したＰＥＩポリマー１０ｇおよびコハク酸無水物６.６ｇを使用して、反応を実施した。元素分析は、最終生成物が５４.４６％Ｃ、７.９６％Ｈおよび４.６％Ｎを含有することを示す。
表２．弱陰イオンおよび弱陽イオン交換部位を有する媒体の製造

１−Ｍ−２−Ｐ＝１−メトキシ−２−プロパノール

実施例１１
実施例１に従い製造したＰＥＩポリマー８６.５ｇおよびメトキシ−２−プロパノール８６５ｍｌを、撹拌機および還流冷却器を備えた２Ｌの丸底フラスコに入れ、３０分間撹拌する。マレイン酸無水物２３.７ｇを添加し、混合物を２.５時間６０℃で撹拌する。混合物を冷却させた後、混合物を濾過フラスコに移し、濾液を除き、メトキシ−２−プロパノールで１回、水で３回、メタノールで３回洗浄する。元素分析は、最終生成物が％Ｃ５５.６、％Ｎ４.９、％Ｈ７.１、％Ｓ０を含有することを示す。

実施例１２
実施例１１によるマレイン酸導入樹脂８６.５ｇを、０.０１Ｎ水酸化ナトリウム９００ｍｌ中、メタ重亜硫酸ナトリウム（sodium meta-bisulfite）１９０ｇの存在下で、６時間８０＋／−２℃で加熱する。反応混合物を冷却させた後、混合物を濾過フラスコに移し、濾液を除き、メトキシ−２−プロパノールで１回、水で３回、メタノールで３回洗浄し、その後の使用のために保存バッファー中で保存する。元素分析は、最終生成物が％Ｃ４９.８、％Ｎ４.６、％Ｈ６.８、％Ｓ２.１を含有することを示す。

実施例１３
実施例１２の通りに、但し、２０時間８０＋／−２℃で、反応を実施した。元素分析は、最終生成物が％Ｃ５０.２、％Ｎ４.５、％Ｈ６.８、％Ｓ２.１を含有することを示す。

８時間の反応後（３.８％Ｓ、実施例１２）および２０時間の反応後（３.４０％Ｓ、実施例１３）に得られたサンプルの硫黄含有量の比較は、反応が８時間後に完了することを示す。

実施例１４
実施例１に従い製造したＰＥＩ官能化ポリマー３０ｇを、１００％エタノール１２０ｍｌで２回、トルエン１２０ｍｌで２回洗浄し、残っている水分を除去する。次いで、この物質をトルエン３００ｍｌ中でスラリー化し、塩化ブチリル９.２９ｇ（樹脂の窒素含有量をベースとして１当量）およびトリエチルアミン９.２４ｇを添加し、反応を２時間２５＋／−２℃で進行させた。次いで、樹脂を濾過フラスコに移し、トルエン３００ｍｌ、メタノール３００ｍｌ、ＤＩ水３００ｍｌで２回、メタノール３００ｍｌで３回、ｐＨ５の保存バッファー（１０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４.５）３００ｍｌで２回洗浄した。元素分析は、最終生成物が、５３.７％Ｃ、７.５％Ｈおよび５.６％Ｎを含有することを示す。

実施例１５
実施例１４の通りに、但し、溶媒はジオキサン４５０ｍｌで、反応を実施した。元素分析は、最終生成物が、５４.７％Ｃ、８.０％Ｈおよび５.５％Ｎを含有することを示す。

実施例１６
実施例１４の通りに、但し、塩化ブチリル１３.３ｇおよびトリエチルアミン１３.２ｇを使用して、反応を実施した。元素分析は、最終生成物が、５３.６％Ｃ、７.９％Ｈおよび４.５％Ｎを含有することを示す。

実施例１７
実施例１４の通りに、但し、塩化ブチリル１９ｇおよびトリエチルアミン１８ｇを使用して、反応を実施した。元素分析は、最終生成物が、５５.４％Ｃ、７.８％Ｈおよび４.２％Ｎを含有することを示す。

実施例１８
実施例１４の通りに、但し、塩化ブチリル２５.３ｇおよびトリエチルアミン２４ｇを使用して、反応を実施した。元素分析は、最終生成物が、５５.０％Ｃ、７.９％Ｈおよび４.５％Ｎを含有することを示す。

トルエンを溶媒として使用して得られる結果のいくつかを表３にまとめる。
表３．ＰＥＩ被覆樹脂の塩化ブチリルとのトルエン中での反応（２時間、室温で）

表３の結果が示す通り、官能化剤量の増加は、官能化レベルの上昇をもたらす（対応する生成物の窒素含有量の減少により示される通り）。

実施例１９
実施例１に記載の通りに製造し、１−メトキシ−２−プロパノール２００ｍｌ中で膨潤させたＰＥＩ官能化ポリマー６０ｇ、１−メトキシ−２−プロパノール６００ｍｌ、酪酸無水物５６.３ｇ（１.５モル濃度過剰）およびトリエチルアミン３６ｇを、３時間６０＋／−２℃で反応させる。反応混合物を濾過フラスコに移し、濾液を除き、１−メトキシ−２−プロパノール５００ｍｌで１回、メタノール５００ｍｌで１回、ＤＩ水５００ｍｌで２回、保存バッファー５００ｍｌで２回洗浄する。元素分析は、最終生成物が、５４.６％Ｃ、７.９％Ｈおよび４.８％Ｎを含有することを示す。

実施例２０
実施例１の通りに製造し、１−メトキシ−２−プロパノール２００ｍｌ中で膨潤させたＰＥＩ官能化ポリマー６０ｇ、１−メトキシ−２−プロパノール６００ｍｌ、酪酸無水物６.２ｇおよびトリエチルアミン４.０ｇを、３時間６０＋／−２℃で反応させる。この時点で、酢酸無水物２４.２ｇを添加し、同じ温度でさらに３時間反応を進行させた。反応混合物を濾過フラスコに移し、排液し、１−メトキシ−２−プロパノール５００ｍｌで１回、メタノール５００ｍｌで１回、ＤＩ水５００ｍｌで２回、保存バッファー５００ｍｌで２回洗浄する。元素分析は、最終生成物が、５３.７％Ｃ、７.７％Ｈおよび４.７％Ｎを含有することを示す。

実施例２１
実施例１９の通りに、但し、酪酸無水物６.２６ｇおよびトリエチルアミン４.０ｇを使用して、反応を実施した。元素分析は、最終生成物が、５３.７％Ｃ、７.９％Ｈおよび４.８％Ｎを含有することを示す。

実施例２２
実施例１９に記載の通りに、但し、酪酸無水物１.５２ｇおよびトリエチルアミン１.０ｇを使用して、反応を実施した。最終生成物の元素分析は、５４.６％Ｃ、８.３％Ｈおよび５.０％Ｎである。

結果のいくつかを表４にまとめる。
表４．ＰＥＩ被覆樹脂の酪酸無水物との１−メトキシ−２−プロパノール中での反応（３時間、６０℃）

表３および４の結果の比較は、塩化ブチリルで得られるものと同様の置換レベルを、酪酸無水物で、かなり低い化学量論的量の剤を使用して達成できることを示す。

実施例２３
実施例２０の通りに、但し、酪酸無水物１.５２ｇおよびトリエチルアミン１.０ｇおよび酢酸無水物１０.７ｇを使用して、反応を実施した。元素分析は、最終生成物が、５５.４％Ｃ、７.９％Ｈおよび４.９％Ｎを含有することを示す。

実施例２４
実施例１の通りに製造し、１−メトキシ−２−プロパノール２０ｍｌ中で膨潤させたＰＥＩ官能化ポリマー６０ｇ、１−メトキシ−２−プロパノール５００ｍｌおよび酢酸無水物１４.０７ｇを、６時間、６０＋／−２℃で反応させる。反応混合物を濾過フラスコに移し、濾液を除き、１−メトキシ−２−プロパノール５００ｍｌで１回、０.１ＮＮａＯＨ５００ｍｌで２回、ＤＩ水５００ｍｌで２回、および保存バッファー５００ｍｌで２回洗浄する。元素分析は、最終生成物が、５３.８％Ｃ、７.５％Ｈおよび５.３％Ｎを含有することを示す。

実施例２５
実施例１の通りに製造したＰＥＩ官能化ポリマー８０ｇを、８時間、８０℃で、０.５Ｎ水酸化ナトリウム５００ｍｌ中、（３−クロロ−２−ヒドロキシプロピル）トリメチルアンモニウムクロリドの６０％溶液５９ｇと反応させる。反応混合物を濾過フラスコに移し、０.１Ｎ水酸化ナトリウムで２回、ＤＩ水で２回、保存バッファーで１回洗浄する。洗浄および乾燥の後、樹脂は、以下の元素分析を有する：５４.２％Ｃ、８.４％Ｈおよび５.９％Ｎ。

実施例２６
実施例２５の通りに、但し、水酸化ナトリウム溶液は０.０５Ｎで、反応を実施した。洗浄および乾燥の後、樹脂は以下の元素分析を有する：５１.９％Ｃ、７.６％Ｈおよび５.３％Ｎ。

実施例２７
実施例２５の通りに、但し、反応を１６時間継続して、反応を実施した。洗浄および乾燥の後、樹脂は以下の元素分析を有する：５３.４％Ｃ、８.４％Ｈおよび５.７％Ｎ。

実施例２８
実施例２６の通りに、但し、反応を１６時間継続して、実施した。洗浄および乾燥の後、樹脂は以下の元素分析を有する：５２.８％Ｃ、８.１％Ｈおよび５.７％Ｎ。

実施例２９
実施例２５の通りに、但し、（３−クロロ−２−ヒドロキシプロピル）トリメチルアンモニウムクロリド６０％溶液の樹脂に対する比を、０.７３に代えて、０.４として、反応を実施した。洗浄および乾燥の後、樹脂は以下の元素分析を有する：５３.７２％Ｃ、７.３２％Ｈおよび６.０４％Ｎ。

実施例３０
実施例２５の通りに、但し、（３−クロロ−２−ヒドロキシプロピル）トリメチルアンモニウムクロリド６０％溶液の樹脂に対する比を、０.７３に代えて、１.２として、反応を実施した。洗浄および乾燥の後、樹脂は以下の元素分析を有する：５３.７２％Ｃ、７.３２％Ｈおよび６.０４％Ｎ。

表５．ＰＥＩ被覆樹脂の（３−クロロ−２−ヒドロキシプロピル）トリメチルアンモニウムクロリドとの反応

実施例３１
実施例１に従い製造したＰＥＩ官能化ポリマー１６０ｇを、５時間４０℃で、ホルムアルデヒド１１１.８ｇ、アセトニトリル４００ｍｌおよびナトリウムシアノボロヒドリド２５.９ｇと反応させる。反応後、ポリマーをアセトニトリル４８０ｍｌ、ＤＩ水４８０ｍｌおよびメタノール４８０ｍｌで３回洗浄し、保存バッファー中でさらなる使用のために保存した。（元素分析％Ｃ＝５５.２、％Ｎ＝５.８）

実施例３２
実施例３１に従い製造したポリマー２５ｍｇおよびアセトニトリル２００ｍｌを、オートクレーブに入れた（Parr 4840 温度制御装置を備えた Parr series 4500 ベンチ据付型加圧反応器）。ポリマーを１２０ＲＰＭで撹拌しながら、塩化メチルガスを入れ、６０ＰＳＩに加圧した。反応を５時間８０℃で継続した。反応後、生成物を、アセトニトリル６０ｍｌ、０.１Ｎ水酸化ナトリウム１２０ｍｌ、ＤＩ水１２０ｍｌ、保存バッファー２４０ｍｌで洗浄し、保存バッファー中で保存した。

実施例３３
実施例１に従い製造したＰＥＩ修飾ポリマー７１ｇを、０.５Ｎ水酸化ナトリウム５００ｍｌと混合し、３−（ジメチルアミノ）プロピルクロリド４９ｇと、５０−１００ＲＰＭ、８０℃で８時間撹拌しながら、反応させた。反応後、生成物を水酸化ナトリウム５００ｍｌで２回、ＤＩ水５００ｍｌで２回、保存バッファー５００ｍｌで２回洗浄し、さらなる使用のためにバッファー中で保存した。元素分析−％Ｃ：５５.４、％Ｎ：６.２。

実施例３４
タンパク質のクロマトグラフィー分離
実施例１の通りに製造されたクロマトグラフィー媒体および JT Baker のＰＥＩシリカ媒体（製品番号７２６４、ロットＮ１６０８４）を、４.６ｘ１００ｍｍのクロマトグラフィーカラムに詰めた。２０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６.２）中の、１ｍｇ／ｍｌリゾチーム、２ｍｇ／ｍｌウサギ免疫グロブリンＧ、２ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミンおよび各２ｍｇ／ｍｌのベータ−ラクトグロブリンＡおよびＢの溶液２００μｌをカラムに注入し、流速１ｍｌ／分、および２０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６.２）１００％から１.０Ｍ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６.２）１００％への３０分間のグラジエントを使用して、溶出する。タンパク質の溶出をＵＶ検出器により２８０ｎｍで記録する（図１）。

実施例３５
タンパク質のクロマトグラフィー分離
実施例９の通りに製造したクロマトグラフィー媒体を４.６ｘ１００ｍｍのクロマトグラフィーカラムに詰める。２０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６.２）中の、４ｍｇ／ｍｌＢＳＡ、２ｍｇ／ｍｌウサギＩｇＧ、２ｍｇ／ｍｌチトクロム−ｃおよび２ｍｇ／ｍｌリゾチーム溶液の溶液２００μｌをカラムに注入し、１ｍｌ／分の流速、および、２０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６.２）１００％から、１ｍｏｌｅ／ｌの酢酸ナトリウムを含有する同じ溶離液（ｐＨ６.２）１００％への４０分間のグラジエントを使用して溶出する。この実施例の媒体および比較用のシリカをベースとする混合態様の媒体（JT Baker 製品番号７２６９）によるタンパク質の溶出を、２８０ｎｍのＵＶ検出器により記録する（図２）。

実施例３６
容量の比較
実施例９に従い製造されたクロマトグラフィー媒体およびシリカをベースとする製品の容量を測定し、比較した。カラム（４.６ｍｍｘ５０ｍｍ）に媒体を詰めた。ｐＨ５.６、６.２および６.９の２０ｍＭ酢酸ナトリウム中のＩｇＧ溶液（１ｍｇ／ｍｌ）を、様々な直線速度（ｃｍ／時間）でカラムに適用した。２８０ｎｍでＵＶを監視することにより漏出(breakthrough)を決定した。カラム中の媒体の漏出点容量を、１０％漏出で決定した（表７）。

表７：混合態様の媒体およびシリカ媒体の漏出点容量

実施例３７
実施例１９に従い製造したクロマトグラフィー媒体およびシリカ媒体（J T Baker 製品番号７２８５）を、７.７５ｍｍｘ１００ｍｍカラムに詰めた。２５ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７.０＋１.７Ｍ硫酸アンモニウム中の、２ｍｇ／ｍｌのチトクロムＣ、リボヌクレアーゼ、リゾチームおよびオボアルブミンの溶液２００ｕｌを注入した。２５ｍｍリン酸ナトリウム＋１.７Ｍ硫酸アンモニウム１００％から２５ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７.０）１００％への６０分間の線状グラジエントにより、タンパク質をカラムから溶出した。溶出プロフィールを２８０ｎｍのＵＶにより監視した（図３Ａおよび３Ｂ）。

実施例３８
実施例２０に従い製造したクロマトグラフィー媒体を、７.７５ｍｍｘ１００ｍｍカラムに詰めた。２５ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７.０＋１.７Ｍ硫酸アンモニウム中のチトクロムＣ、リボヌクレアーゼ、リゾチームおよびオボアルブミンの２ｍｇ／ｍｌ溶液２００ｕｌを注入した。２５ｍｍリン酸ナトリウム＋１.７Ｍ硫酸アンモニウム１００％から２５ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７.０）１００％への６０分間の線状グラジエントにより、タンパク質をカラムから溶出した。溶出プロフィールを２８０ｎｍのＵＶにより監視した（図４）。

実施例３９
実施例２２に従い製造したクロマトグラフィー媒体を、７.７５ｍｍｘ１００ｍｍカラムに詰めた。２５ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７.０＋１.７Ｍ硫酸アンモニウム中の、チトクロムＣ、リボヌクレアーゼ、リゾチームおよびオボアルブミンの２ｍｇ／ｍｌ溶液２００ｕｌを注入した。２５ｍｍリン酸ナトリウム＋１.７Ｍ硫酸アンモニウム１００％から２５ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７.０）１００％への６０分間の線状グラジエントにより、タンパク質をカラムから溶出した。溶出プロフィールを２８０ｎｍのＵＶにより監視した（図５）。

実施例４０
実施例２３に従い製造したクロマトグラフィー媒体を、７.７５ｍｍｘ１００ｍｍカラムに詰めた。２５ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７.０＋１.７Ｍ硫酸アンモニウム中の、２ｍｇ／ｍｌのチトクロムＣ、リボヌクレアーゼ、リゾチームおよびオボアルブミンの溶液２００ｕｌを注入した。２５ｍｍリン酸ナトリウム＋１.７Ｍ硫酸アンモニウム１００％から２５ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７.０）１００％への６０分間の線状グラジエントにより、タンパク質をカラムから溶出した。溶出プロフィールを２８０ｎｍのＵＶにより監視した（図６）。

実施例４１
実施例７に従い製造されたポリマー媒体を、１.０ｃｍｘ１０ｃｍカラムに詰めた。最初に、カラム容積の１０倍のバッファーＡ（０.０５ＭＭＥＳ、ｐＨ５.６）を通すことにより、カラムを平衡化した。平衡化後、ウサギグロブリン（０.５ｍｇ／ｍｌ）およびリゾチーム（０.２５ｍｇ／ｍｌ）を含有するタンパク質溶液０.５ｍｌを注入した。バッファーＡ１００％からバッファーＢ（１Ｍ塩化ナトリウムを含むバッファーＡ）１００％への４０分間の線状グラジエントを流すことにより、タンパク質をカラムから溶出した。最初のタンパク質分離の実施後、１０ｍＭリン酸５００ｍｌを１ｍｌ／分で４８時間にわたり循環させることにより、カラムを洗浄した。洗浄後、タンパク質分離を再度実施し、カラムの酸安定性を判定した（図７）。カラムを４８時間までリン酸で洗浄する前後でＩｇＧおよびリゾチームの保持時間に変化がないので、このデータは、ポリマー性混合態様の媒体の酸性条件下での優れた安定性を示す。

実施例４２
実施例７に従い製造したポリマー媒体を、１.０ｃｍｘ１０ｃｍカラムに詰めた。最初に、カラム容積の１０倍のバッファーＡ（０.０５ＭＭＥＳ、ｐＨ５.６）を通すことにより、カラムを平衡化した。平衡化後、ウサギグロブリン（０.５ｍｇ／ｍｌ）およびリゾチーム（０.２５ｍｇ／ｍｌ）を含有するタンパク質溶液０.５ｍｌを注入した。バッファーＡ１００％からバッファーＢ（１Ｍ塩化ナトリウムを含むバッファーＡ）１００％への４０分間の線状グラジエントを流すことにより、タンパク質をカラムから溶出した。最初のタンパク質分離の実施後、０.１Ｍ水酸化ナトリウム５００ｍｌを１ｍｌ／分で２４および４８時間にわたり循環させることにより、カラムを洗浄した。洗浄後、タンパク質分離を再度実施し、カラムの塩基安定性を判定した（図８）。カラムを４８時間まで水酸化ナトリウムで洗浄する前後でＩｇＧおよびリゾチームの保持時間に変化がないので、このデータは、ポリマー性混合態様の媒体の塩基性条件下での優れた安定性を示す。

実施例４３
実施例１、２５、２６、２７、２８、２９、３０および３２に従い製造したクロマトグラフィー媒体の容量を測定し、比較した。カラム（４.６ｍｍｘ５０ｍｍ）に媒体を詰めた。２０ｍＭＣＡＰＳ（３−［シクロヘキシルアミノ］−１−１プロパンスルホン酸）ｐＨ１１中のＢＳＡ溶液（１ｍｇ／ｍｌ）を、流速１ｍｌ／分でカラムにアプライした。２８０ｎｍでＵＶを監視することにより、漏出を判定した。カラム中の媒体の漏出点容量を、１０％漏出で判定した。ＢＳＡのカラムへの負荷後、カラムをＣＡＰＳバッファーで洗浄し、次いで、１Ｍ塩化ナトリウムを使用して、吸着されたＢＳＡを溶出し、飽和容量を算出した（表８）。

表８容量の比較

本明細書では、特定の実施態様を参照して本発明を説明した。本明細書で開示した発明の概念の精神および範囲から逸脱することなく、変更、改変および変形を成し得ることが理解されよう。従って、添付の特許請求の範囲の精神および範囲に含まれる全てのそのような変更、改変および変形が包含されると企図している。

図１は、実施例１によって製造された媒体およびＰＥＩシリカ媒体を使用し、実施例３４の操作によるタンパク質の、ＵＶ検出器により記録された分離溶出プロフィールのグラフである。図２は、実施例９によって製造された媒体および混合態様のシリカ媒体を使用し、実施例３５の操作によるタンパク質の分離の、ＵＶ検出器により記録された溶出プロフィールのグラフである。図３ａおよび３ｂは、実施例１９により製造された媒体およびシリカ媒体を使用し、実施例３７の操作によるタンパク質の分離の、ＵＶ検出器により記録された溶出プロフィールのグラフである。図４は、実施例２０により製造された媒体を使用し、実施例３８の操作によるタンパク質の分離の、ＵＶ検出器により記録された溶出プロフィールのグラフである。図５は、実施例２２により製造された媒体を使用し、実施例３９の操作によるタンパク質の分離の、ＵＶ検出器により記録された溶出プロフィールのグラフである。図６は、実施例２３により製造された媒体を使用し、実施例４０の操作によるタンパク質の分離の、ＵＶ検出器により記録された溶出プロフィールのグラフである。図７は、実施例４１の操作により測定された、実施例７により製造された媒体の酸安定性のグラフである。図８は、実施例４２の操作により測定された、実施例７により製造された媒体の塩基安定性のグラフである。

Claims

ポリマーの表面でポリエチレンイミンにより誘導体化されたポリマー性樹脂粒子を含む、クロマトグラフィー媒体。
ポリマー性粒子が、セルロース、アガロース、エポキシ化またはハロゲン化ポリスチレン、エポキシ化またはハロゲン化ポリアクリレートまたはポリメタクリレート、およびエポキシ化またはハロゲン化ポリジビニルベンゼンからなる群から選択されるポリマーを含む、請求項１に記載のクロマトグラフィー媒体。
ポリマー性粒子が、エポキシ化またはハロゲン化ポリスチレン、エポキシ化またはハロゲン化ポリアクリレートまたはポリメタクリレート、およびエポキシ化またはハロゲン化ポリジビニルベンゼンからなる群から選択されるポリマーを含む、請求項２に記載のクロマトグラフィー媒体。
ポリマーの表面でポリエチレンイミンにより誘導体化されたポリマー性樹脂粒子が、官能化剤と、ポリマー性樹脂表面上のポリエチレンイミンの末端アミノ基との反応により官能化される、請求項１に記載のクロマトグラフィー媒体。
ポリマーの表面でポリエチレンイミンにより誘導体化されたポリマー性樹脂粒子が、官能化剤と、ポリマー性樹脂表面上のポリエチレンイミンの末端アミノ基との反応により官能化される、請求項３に記載のクロマトグラフィー媒体。
官能化剤が、酸無水物、スルホン化剤、アルキル塩化物、および第四級アンモニウム官能性を含有するアルキル塩化物、並びにこれらの混合物からなる群から選択される、請求項４に記載のクロマトグラフィー媒体。
官能化剤が、環状カルボン酸無水物、不飽和カルボン酸無水物、重亜硫酸塩、アルキル塩化物、アルキル無水物、第四級アンモニウム官能性を含有するアルキル塩化物およびこれらの混合物からなる群から選択される、請求項６に記載のクロマトグラフィー媒体。
官能化剤が、グルタル酸無水物、コハク酸無水物、マレイン酸無水物、ナトリウムメタ−重亜硫酸塩、塩化ブチリル、酢酸無水物、酪酸無水物、（３−クロロ−２−ヒドロキシプロピル）トリメチルアンモニウムクロリドおよびこれらの混合物からなる群から選択される、請求項７に記載のクロマトグラフィー媒体。
媒体が混合態様である、請求項１に記載のクロマトグラフィー媒体。
媒体が混合態様である、請求項４に記載のクロマトグラフィー媒体。
混合態様の媒体が、混合された第一級、第二級および第三級アミン交換部位を有する媒体、弱陰イオンおよび弱陽イオン交換部位の両方を有する媒体、弱陰イオン、弱陽イオンおよび強陽イオン交換部位を有する媒体、弱陰イオンおよび疎水性（逆相）交換部位を有する媒体、弱陰イオンおよび強陰イオンを有する媒体からなる群から選択される、請求項１０に記載のクロマトグラフィー媒体。
請求項１に記載のクロマトグラフィー媒体を詰めた、クロマトグラフィー用カラム。
請求項３に記載のクロマトグラフィー媒体を詰めた、クロマトグラフィー用カラム。
請求項５に記載のクロマトグラフィー媒体を詰めた、クロマトグラフィー用カラム。
請求項８に記載のクロマトグラフィー媒体を詰めた、クロマトグラフィー用カラム。
溶液を請求項１２に記載のクロマトグラフィーカラムに通し、溶液の成分を溶出することを含む、溶液の成分の分離方法。
溶液を請求項１３に記載のクロマトグラフィーカラムに通し、溶液の成分を溶出することを含む、溶液の成分の分離方法。
溶液を請求項１４に記載のクロマトグラフィーカラムに通し、溶液の成分を溶出することを含む、溶液の成分の分離方法。
溶液を請求項１５に記載のクロマトグラフィーカラムに通し、溶液の成分を溶出することを含む、溶液の成分の分離方法。
溶液がタンパク質を含有する溶液である、請求項１７に記載の方法。