KR101279305B1 - 크로마토그래피 매질 - Google Patents

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KR101279305B1
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난두 데오르카
로버트 씨. 버스
조셉 엠. 믈라도시크
폴 에이. 부이스
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아반토르 퍼포먼스 머티리얼스, 인크.
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Abstract

본 발명은 신규한 중합체성 크로마토그래피 매질 및 바람직하게는 혼합식 중합체성 크로마토그래피 매질의 제조 및 용도에 관한 것이다. 본 발명에 따라서, 중합체성 매질은 폴리에틸렌이민으로 유도체화된 중합체성 입자 및 바람직하게는 적절한 반응물로 추가적으로 관능화된 폴리에틸렌이민 유도체화된 중합체성 입자를 사용하여 제조된다. 중합체성 크로마토그래피 매질은 특히 생체분리에 유용하다.
중합체성 크로마토그래피 매질, 폴리에틸렌이민

Description

크로마토그래피 매질 {CHROMATOGRAPHIC MEDIA}
본 발명은 펩티드, 단백질 및 항체와 같은 다양한 생체분자의 분리 및 정제를 위한 신규한 크로마토그래피 매질, 바람직하게는 혼합식 중합체성 크로마토그래피 매질의 제조 및 용도에 관한 것이다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 신규한 크로마토그래피 매질, 바람직하게는 혼합 음이온 교환제, 혼합 음이온-양이온 교환제 및 소수성 교환제를 개시한다. 크로마토그래피 매질은 폴리에틸렌이민에 의한 중합체의 변형 및 그의 관능화(functionalization)에 의하여 제조된다. 예상치 않게도, 이러한 혼합식 중합체성 매질은 향상된 분리능 및 단백질 결합 용량을 제공한다는 것이 밝혀졌다.
이온 교환 크로마토그래피 매질에 의한 단백질 혼합물의 분석은 문헌[Pete Gagnon, "Purification Tools for Monoclonal Antibodies", Validated Biosystems, Inc., (1996)] 등에서 알려져 있다. 더욱 최근에는, 단백질 혼합물의 대규모 정제를 위하여 단백질-기재 약물 및 백신의 개발의 필요성이 증가되어 왔다. 이러한 분야에서 이온 교환 크로마토그래피 매질을 사용할 수 있게 되는 것이 매우 필요하다.
이러한 크로마토그래피 매질 물질, 특히 1차 및 2차 아민 관능기를 함유하는 음이온 교환제 제조의 한 방법은, 폴리에틸렌이민(PEI)으로 다공성 실리카 물질의 내면을 코팅하는 것에 의한 것이다. 예를 들어, 실리카 입자의 내면을 폴리에틸렌이민으로 코팅하고 가교를 통하여 고정화하는 것은 문헌[Alpert and Regnier, J. Chromatogr. 185, 375 - 392 (1979)]에 개시되어 있고, 합성 올리고뉴클레오티드의 크로마토그래피 분리를 위한 상기 방식으로 제조된 물질의 용도는 문헌[Lawson et al., Anal. Biochem. 133, 85-93 (1983)]에 개시되어 있다.
유사하게, 폴리에틸렌이미노프로필-트리메톡시 실란의 공유 결합에 의하여 수득된 다공성 조절된 유리 입자 또는 PEI 코팅된 다공성 실리카 입자의 제조는 제이티 베이커 케미컬 사(JT Baker Chemical Co.)의 미국 특허 제4,540,486호에 개시되어 있다. 상기 특허는 PEI 코팅된 실리카와 시클릭 카르복실산 무수물과의 반응에 의하여 혼합 약 염기/약 산 관능기를 갖는 크로마토그래피 수지의 형성을 개시한다. 이러한 물질은, 크로마토그래피 칼럼에서 사용된 경우, 시토크롬 C, 알파1-산 글리코단백질, 난알부민 및 베타-락토글로불린 (약 염기 매질) 또는 난알부민, 시토크롬 C, 헤모글로빈 및 리소자임 (혼합 약 염기/약 산 매질)의 혼합물을 분리할 수 있다는 것이 밝혀졌다. PEI 유도체화된 다공성 실리카 또는 그의 카르복실화된 버전의 이뮤노글로불린 G를 정제하는 효능은 제이티 베이커 케미컬 사의 미국 특허 제4,606,825호에서 입증되었다.
상기 기재된 PEI 코팅된 실리카의 아실화된 형태는, 제이티 베이커 케미컬 사의 미국 특허 제4,721,573호에 개시된 바와 같이, 술폰기의 도입에 의하여 추가적으로 혼합 약 산/강 산 관능기 매질로 전환될 수 있다. 이러한 술폰화된 매질로 충전된 칼럼은 시토크롬 C, 헤모글로빈, 리소자임 및 난알부민의 혼합물 뿐만 아니라 하이브리도마 세포 배양 배지의 단백질 성분의 분리를 가능하게 한다.
또한 PEI가 공유 결합된 실리카 입자는 아실기가 선형 탄화수소 사슬, 페닐기 또는 치환된 페닐기일 수 있는 경우에 모노아실 클로라이드 또는 선형 카르복실산 무수물과의 반응에 의하여 소수성 크로마토그래피 매질로 전환될 수 있다. 부티릴 클로라이드를 사용하는 방식으로 제조된 실리카 기재 약 염기/역상 크로마토그래피 매질은, 제이티 베이커 케미컬 사의 미국 특허 제4,551,245호에 개시된 바와 같이, 시토크롬 C, 미오글로빈, 리소자임, 난알부민 및 알파-킴포트립시노겐(chympotrypsinogen)을 분리한다.
폴리비닐알콜(PVA) 암(arm)의 말단에 이온 교환기를 보유하는 아가로스 비드는 아머샴(Amersham)의 WO 98/58732에 개시되어 있다. 하지만, 본 발명과는 다르게, PVA 스페이서 암은 생성물의 이온 교환 용량에 전혀 기여를 하지 않고, 그 안에서 혼합식 생성물 내의 하나의 관능기를 제공하지 않는다.
실리카 기재 크로마토그래피 충전재의 가장 중요한 단점 중 하나는 높은 pH에서 안정성의 결핍이다. 1N 수산화나트륨으로 기기를 처리하는 것이 일반적인 멸균 관행이기 때문에, 이는 특히 약물의 정제와 관련된 분야에 적용하는 경우에 문제가 된다.
발명의 요약
본 발명은 높은 pH에서 안정성의 결핍을 최소화하거나 제거할 수 있는 크로마토그래피 매질을 제공한다. 본 발명은 또한 혼합식 크로마토그래피 매질을 제공 한다. 불안정성 문제를 제거할 수 있는 한 방법은 PEI로 중합체의 표면 상에서 유도체화된 중합체성 지지체 기재의 크로마토그래피 충전재 (즉, 비가교된 것)를 사용하는 것이며, 표면 유도체화된 매질은 중합체성 수지의 표면 상에서 폴리에틸렌이민의 말단 아미노기와 관능화제의 반응에 의해서 추가적으로 관능화될 수 있다. 본 발명에 따라서, 바람직하게는, 예를 들어 혼합된 1차, 2차 및 3차 아민 교환 부위를 갖는 매질, 약 음이온 및 약 양이온 교환 부위를 갖는 매질, 약 음이온, 약 양이온 및 강 양이온 교환 부위를 갖는 매질, 약 음이온 및 소수성 (역상) 교환 부위를 갖는 매질, 및 약 음이온 및 강 음이온을 갖는 매질과 같은 혼합식 매질이 제공될 수 있다. 추가적으로, 예상치 못하게도, 폴리에틸렌이민 유도체화된 중합체성 및 그의 관능화된 유도체-기재 크로마토그래피 매질이 상이하고 고유한 분리 특성을 제공한다는 것이 발견되었다. 본 발명의 한 측면에서 생체분리를 위한 중합체성 크로마토그래피 매질이 제공된다. 유통되는 크로마토그래피 매질은 단순 이온 교환제이므로, 본 발명은 유통되는 중합체성 크로마토그래피 매질과는 매질의 특성 및 제조 방법이 다르다. 또한, 본 발명의 매질은 유통되는 실리카 기재 매질과 제조 방법, 조성물, 용도 및 성능의 면에서 다르다. 놀랍게도, 본 발명에 따라서 제조된 중합체성 혼합식 매질은 향상된 분리 및 결합 용량을 갖는다.
본 발명은 하기 설명된 첨부된 도면에 의하여 예시되지만, 그로 인하여 제한되지는 않는다.
도 1은 UV 탐지기로 기록한, 실시예 1에서 제조된 매질 및 실시예 34의 방법 에 따른 PEI 실리카 매질을 사용한 단백질 분리의 용출 프로파일 그래프이다.
도 2는 UV 탐지기로 기록한, 실시예 9에서 제조된 매질 및 실시예 35의 방법에 따른 혼합식 실리카 매질을 사용한 단백질 분리의 용출 프로파일 그래프이다.
도 3a 및 3b는 UV 탐지기로 기록한, 실시예 19에서 제조된 매질 및 실시예 37의 방법에 따른 실리카 매질을 사용한 단백질 분리의 용출 프로파일 그래프이다.
도 4는 UV 탐지기로 기록한, 실시예 38의 방법에 따라서 실시예 20에서 제조된 매질을 사용한 단백질 분리의 용출 프로파일 그래프이다.
도 5는 UV 탐지기로 기록한, 실시예 39의 방법에 따라서 실시예 22에서 제조된 매질을 사용한 단백질 분리의 용출 프로파일 그래프이다.
도 6은 UV 탐지기로 기록한, 실시예 40의 방법에 따라서 실시예 23에서 제조된 매질을 사용한 단백질 분리의 용출 프로파일 그래프이다.
도 7은 실시예 41의 방법에 따라서 측정된 실시예 7에서 제조된 매질의 산 안정성 그래프이다.
도 8은 실시예 42의 방법에 따라서 측정된 실시예 7에서 제조된 매질의 염기 안정성 그래프이다.
본 발명은 신규한 중합체성 크로마토그래피 매질 및 바람직하게는 혼합식 중합체성 크로마토그래피 매질의 제조 및 용도에 관한 것이다. 본 발명에 따라서, 중합체성 매질은 폴리에틸렌이민으로 유도체화된 중합체성 입자 및 바람직하게는 적절한 반응물로 추가적으로 관능화된 폴리에틸렌이민 유도체화된 중합체성 입자를 사용하여 제조된다.
단백질의 크로마토그래피 분리에 사용되는 중합체성 물질은 바람직하게는 다음과 같은 특성을 갖는다.
1) 공극 크기는 수지 입자의 내부 및 외부로 단백질 정도의 크기의 분자가 빠르게 확산되기에 충분한 정도이며,
2) 단백질 및 비관능화된 중합체의 상호작용은 원하는 단백질을 높은 수득률로 회수하게 하며 "비특이적 상호작용"을 일으키지 않을 정도로 약하며,
3) 수지 입자는 크로마토그래피의 작동 시의 압력 하에서 압착 및 유속의 감소가 일어나지 않을 정도로 단단하며,
4) 수지는 분리 과정에서의 모든 조건 하에서 화학적으로 안정해야 한다.
폴리에틸렌이민으로 표면 유도체화되는 중합체성 수지 입자는 크로마토그래피 분리 매질로 사용하기에 유용한, 폴리에틸렌이민 및 폴리에틸렌이민 유도체화된 중합체 또는 그의 추가적으로 관능화된 유도체로 유도체화될 수 있는 임의의 적합한 중합체성 수지 입자일 수 있다. 본 발명에 따라서 폴리에틸렌이민으로 유도체화되기에 적합한 중합체성 수지 입자의 예로는, 이에 한정되지는 않지만, 셀룰로스, 아가로스, 에폭시화 또는 할로겐화된 폴리스티렌, 에폭시화 또는 할로겐화된 폴리아크릴레이트 또는 폴리메타크릴레이트, 및 에폭시화 또는 할로겐화된 폴리디비닐벤젠을 포함한다. 예를 들어, 에틸렌 글리콜 디메타크릴레이트 (쇼와 덴코(Showa Denko)의 미국 특허 제4,118,347호), 펜타에리트리톨 트리메타크릴레이트 (토요 소다(Toyo Soda)의 미국 특허 제4,256,842호), 트리메틸올 프로판 트리메타크릴레이트 (롬 앤드 하스(Rohm and Haas)의 미국 특허 제4,582,860호) 또는 공극 형성제의 존재 하에서 제조된 글리세롤 디메타크릴레이트 (미쓰비시(Mitsubishi)의 미국 특허 제2,254,634호)와 같은 다수의 중합성 이중 결합을 보유하는 (메트)아크릴 단량체에 기재한 고도로 가교된 수지인 다공성 폴리(메트)아크릴레이트는, 원하는 성질을 갖는 물질을 제공한다는 것이 밝혀졌다. 추가적으로, 중합 혼합물에 관능성 단량체를 첨가하면, 공유 결합의 형성을 통하여 다른 분자가 결합될 수 있는 관능기를 갖는 최종 생성물을 얻을 수 있다. 이러한 단량체의 예로는 글리세롤 메타크릴레이트 (-OH 기) (미쓰비시의 미국 특허 제2,254,634호, 1993), 디메틸아미노에틸 메타크릴레이트 (3차 아민) 또는 글리시딜 메타크릴레이트 (쇼와 덴코의 미국 특허 제4,118,347호, 토요 소다의 미국 특허 제4,256,842호, 롬 앤드 하스의 미국 특허 제4,582,860호)를 들 수 있다. PEI 표면-유도체화된 중합체성 수지 입자와의 반응에 적합한 관능화제의 예로는, 예를 들어, 시클릭 카르복실산 무수물과 같은 산 무수물, 예컨대 글루타르산 무수물 및 숙신산 무수물, 불포화 카르복실산 무수물, 예컨대 말레산 무수물, 술폰화제, 예컨대 비술파이트(bisulfite), 예컨대 소듐 메타-비술파이트, 알킬 클로라이드 또는 무수물, 예컨대 부틸 클로라이드 및 아세트산 무수물 또는 부티르산 무수물, 및 4차 암모늄 관능기를 함유하는 알킬 클로라이드, 예컨대 (3-클로로-2-히드록시프로필)트리메틸암모늄 클로라이드, 및 이러한 관능화제들의 혼합물을 들 수 있다.
본 발명의 한 실시양태에서, 혼합 1차 및 2차 및 3차 아민 부위를 갖는 음이온 교환제는 폴리에틸렌이민을 에폭시기 또는 클로로, 브로모, 요오드기와 같은 할로겐기를 보유하는 중합체성 지지체와 반응시켜 제조한다. 이러한 중합체성 지지체는 임의의 적합한 합성 중합체 또는 천연 중합체 수지, 예컨대 폴리(메트)아크릴레이트, 셀룰로스, 폴리스티렌-디비닐벤젠 및 아가로스일 수 있다. 이러한 상업적으로 입수 가능한 수지의 예로는 토소 바이오사이언스 토요펄(Tosoh Biosciences Toyopearl) AF-에폭시 650M, 에폭시 활성화 세파로스(Sepharose) 6B를 들 수 있다. 이러한 물질은 화학적으로 안정한 알파-히드록시 아미노기의 형성을 통하여 다양한 분자량의 폴리에틸렌이민의 하나의 말단 아미노기와 반응할 수 있다. 하기 실시예 1 내지 5에 따라서, 이러한 방식으로 제조된 물질의 일부 성질을 표 1에 요약하였다.
두 번째 실시양태에서, 약 음이온 및 약 양이온 교환 부위를 갖는 혼합식 매질은 하기 실시예 6 내지 10에서와 같이 PEI 관능화된 중합체성 비드를 글루타르산 무수물 또는 숙신산 무수물과 같은 시클릭 카르복실산 무수물과 반응시켜 제조한다.
세 번째 실시양태에서, 약 음이온, 약 양이온 및 강 양이온 부위를 갖는 혼합식 매질은 실시예 11 내지 13에 기재한 바와 같이 PEI 유도체화된 중합체를 불포화 카르복실산 무수물과 반응시킨 후, 술폰화시켜서 제조한다.
네 번째 실시양태에서, 약 음이온 및 소수성 (역상) 부위를 갖는 혼합식 매질은 PEI 유도체화된 중합체를 알킬 클로라이드 (실시예 14 내지 18) 또는 일염기성 산 무수물 (실시예 19 내지 24)과 반응시켜 제조한다. 부티릴 클로라이드와의 반응은 톨루엔 또는 디옥산을 용매로 사용하여 2 시간 동안 실온에서 수행한다. 반응의 부산물로써 생성되는 염산을 제거하기 위하여 트리에틸아민을 사용한다.
다섯 번째 실시양태에서, 혼합식 매질은 하기 실시예 20 내지 22에서 설명한 바와 같이 1-메톡시-2-프로판올 중에서 3 시간 동안 60℃에서 PEI 코팅된 수지를 부티르산 무수물과 반응시켜 수득한다.
소수성 잔기가 메틸기 또는 메틸 및 부틸기의 조합인 혼합식 약 염기/역상 수지는 실시예 24 (아세트산 무수물) 또는 실시예 20 및 23 (혼합 무수물)에서 각각 설명한 바와 같이, 아세트산 무수물을 사용하거나 또는 부티르산 무수물 및 아세트산 무수물의 순차적 첨가에 의하여 제조될 수 있다. 이로써, 시약들 중의 하나 내지 조합을 사용하여 적절한 소수성의 변화 및 선택이 가능하다.
여섯 번째 실시양태에서, 약 음이온 및 강 음이온 (4차 암모늄) 부위를 갖는 혼합식 매질은 PEI 유도체화된 중합체를 말단 4차 암모늄 관능기를 함유하는 알킬 클로라이드와 반응시켜 제조된다. 더욱 구체적으로, 하기 실시예 25 내지 30에서 설명한 바와 같이 PEI 유도체화된 중합체를 70-80℃의 수산화나트륨 수용액에서 (3-클로로-2-히드록시프로필) 트리메틸암모늄 클로라이드와 반응시킨다.
본 발명에 따라서, 예상치 못하게도 이러한 중합체성 혼합식 크로마토그래피 매질은 향상된 분리능 뿐 아니라 높은 용량 및 안정성을 제공한다는 것이 밝혀졌다. 예를 들어, 도 1에 나타낸 바와 같이, 중합체성 혼합식 음이온 교환 매질은 리소자임, 이뮤노글로불린 G, 소혈청 알부민, 베타-락토글로불린 A 및 베타-락토글로불린 B를 분리할 수 있는데 반하여, PEI-실리카 기재 매질은 이러한 단백질을 모두 분리할 수 없다. 도 2에 나타낸 바와 같이, 혼합식 양이온 교환 매질은 BSA, IgG, 시토크롬-C 및 리소자임을 효율적으로 분리할 수 있는데 반하여, 혼합식 실리카 매질은 이러한 단백질을 모두 분리할 수 없다.
실시예 1
평균 입자 크기가 35 미크론 직경인 12 g의 에폭시 함유 메타크릴레이트 중합체 및 250 ml의 디옥산을 깔때기, 교반기, 환류 콘덴서 및 양성 질소압 유입구를 갖춘 1 L의 둥근 바닥 플라스크에 넣고, 30 분 동안 교반하여 수지가 팽창하게 하였다. 20 g의 폴리에틸렌이민 (PEI, 평균 분자량 600 돌턴)을 첨가하고 깔때기를 추가적인 150 ml의 디옥산으로 헹구었다. 교반된 혼합물을 밤새 환류시켰다. 혼합물을 냉각시킨 후, 혼합물을 여과 플라스크로 옮기고, 배수시키고, 디옥산으로 한 번 세척하고, 메탄올로 세 번 세척하고, 6O℃의 진공 하에서 건조시켰다. 원소 분석: 57.8%C, 7.4 %H 및 5.6 %N.
실시예 2
5 g의 에폭시 보유 메타크릴레이트 중합체 및 150 ml의 디옥산을 교반기 및 환류 콘덴서를 갖춘 500 ml 둥근 바닥 플라스크에 넣었다. 30 g의 PEI (평균 분자량 1200 돌턴)를 첨가하고 혼합물을 밤새 환류시켰다. 냉각시킨 후, 혼합물을 여과 플라스크로 옮기고, 배수시키고, 디옥산으로 두 번 세척하고, 메탄올로 세 번 세척하고 건조시켰다. 원소 분석: 55.7 %C, 7.8 %H, 5.5 %N.
실시예 3
5 g의 에폭시 보유 메타크릴레이트 중합체 및 150 ml의 디옥산 및 물의 50/50 혼합물을 교반기 및 환류기를 갖춘 500 ml 둥근 바닥 플라스크에 넣었다. 30 g의 PEI (평균 분자량 1200 돌턴)를 첨가하고 혼합물을 밤새 환류시켰다 (89℃). 냉각시킨 후, 혼합물을 여과 플라스크로 옮기고, 배수시키고, 디옥산으로 두 번 세척하고, 메탄올로 세 번 세척하고 건조시켰다. 원소 분석은 최종 생성물이 다음을 함유함을 나타낸다: 57.5 %C, 7.4 %H, 2.5 %N.
실시예 4
5 g의 에폭시 보유 메타크릴레이트 중합체 및 디옥산 중 10,000 돌턴 평균 분자량의 PEI의 30 중량% 용액 100 ml를 교반기, 질소 유입구 및 환류 콘덴서를 갖춘 250 ml 둥근 바닥 플라스크에 넣고, 교반된 혼합물을 밤새 환류시켰다. 냉각시킨 후, 혼합물을 여과 플라스크로 옮기고, 배수시키고, 60℃ 물로 세 번 세척하고, 메탄올로 세 번 세척하고, 60℃ 진공 오븐에서 밤새 건조시켰다. 원소 분석은 최종 생성물이 다음을 함유함을 나타낸다: 56.5 %C, 7.8 %H, 6.4 %N.
실시예 5
5 g의 에폭시 보유 메타크릴 수지 및 물 중 10,000 돌턴 평균 분자량의 PEI의 30 중량% 용액 100 ml를 교반기 및 환류 콘덴서를 갖춘 250 ml 둥근 바닥 플라스크에 넣고, 교반된 혼합물을 17 1/2 시간 동안 환류시켰다. 냉각시킨 후, 혼합물을 여과 플라스크로 옮기고, 배수시키고, 물로 세 번 세척하고, 메탄올로 세 번 세척하고, 60℃의 진공 오븐에서 밤새 건조시켰다. 원소 분석은 최종 생성물이 다음을 함유함을 나타낸다: 56.9%C, 7.5 %H 및 3.2 %N.
표 1이 나타내는 바와 같이, 계 내의 물의 존재는 질소 혼입에 불리한 효과 를 갖지만, 다양한 분자량의 PEI가 건조 디옥산에서 수지와 반응하는 경우에는 비슷한 질소 함량이 수득된다 (실시예 1 보다 낮은 중합체에 대한 PEI의 비율이기는 함).
질소 혼입에 대한 용매 및 PEI 분자량의 효과
용매 600 돌턴 PEI 1,200 돌턴 PEI 10,000 돌턴 PEI
디옥산 실시예 1
PEI/중합체= 1.66
5.6 %N		 실시예 2
PEI/중합체= 6
5.5 %N		 실시예 4
PEI/중합체= 6
6.4 %N
물/디옥산
(1:1)		 N/A 실시예 3
PEI/중합체= 6
2.5 %N		 N/A
물 N/A N/A 실시예 5
PEI/겔= 6
3.2 %N
표 1의 결과가 추가적으로 나타내듯이, 순수한 디옥산에서 수행된 반응은, 디옥산/물 혼합물 또는 순수한 물에서와는 반대로, 최종 생성물의 질소 함량에 의해 나타나는 바와 같이 더 높은 정도의 관능화를 제공한다. 순수한 디옥산이 용매로 사용된 경우 (표 1의 첫 번째 행), PEI의 분자량이 600에서 10,000 돌턴으로 증가함에 따라 질소 도입이 현저하게 더 높은 수준으로 나타나지는 않았다.
실시예 6
실시예 1에서 제조한 PEI 중합체 30 g을 그와 동일한 부피의 100 % 에탄올로 두 번 세척하고 그와 동일한 부피의 1-메톡시-2-프로판올로 두 번 세척하여 남아있는 모든 습기를 제거하였다. 이 후, 중합체를 450 ml의 1-메톡시-2-프로판올에서 슬러리화하였고, 상부 교반기, 환류 콘덴서 및 양성 질소압 유입구를 갖춘 플라스크로 옮기고, 60℃로 가열하였다. 19.43 g의 95 % 글루타르산 무수물 용액 (1 당량, PEI 수지의 질소 함량에 기초)을 첨가한 후, 60±2℃의 온도로 2 1/2 시간 동안 유지하였다. 이 후 반응 혼합물을 여과 플라스크로 옮기고, 배수시키고, 남아있는 고체를 100 ml의 1-메톡시-2-프로판올로 한 번, 100 ml 메탄올로 두 번 및 100 ml 저장 용액 (에탄올:물 20:80 v/v, 또는 10O mM 소듐 아세테이트 pH 4.5, 2 % 벤질 알콜)으로 두 번 세척하였다. 특성화 및 단백질의 크로마토그래피 분리를 위하여 생성물을 각각의 저장 용액에 저장하였다. 원소 분석은 최종 생성물이 다음을 함유함을 나타낸다: %C=55.1 , %N=4.6.
실시예 7
실시예 1에서 제조된 73.7 g의 PEI 코팅된 중합체, 225 ml의 1-메톡시-2-프로판올 및 14.4 g의 숙신산 무수물을 60±2℃로 가열하고 동일한 온도로 2 1/2 시간 동안 유지하였다. 이 후 실시예 5에 기재한 바와 같이, 반응 혼합물을 여과 플라스크로 옮기고, 배수시키고, 남아있는 고체를 100 ml의 1-메톡시-2-프로판올로 한 번, 100 ml의 메탄올로 두 번 및 100 ml의 저장 완충 용액으로 두 번 세척하였다. 원소 분석은 최종 생성물이 다음을 함유함을 나타낸다: 53.08 %C, 7.13 %H 및 4.86 %N.
실시예 8
반응은 숙신산 무수물 충전물이 17.34 g이라는 것을 제외하고 실시예 7과 동일하게 수행하였다. 원소 분석은 최종 생성물이 다음을 함유함을 나타낸다: 53.18 %C, 7.97 %H 및 5.18 %N.
실시예 9
실시예 1에서 제조한 11 g의 PEI 코팅된 중합체를 그것과 동일한 부피의 100 % 에탄올로 두 번 및 그것과 동일한 부피의 디옥산으로 두 번 세척하여 남아있는 모든 습기를 제거하였다. 이 후 수지를 약 200 ml 디옥산에서 슬러리화하고, 질소 유입관을 갖춘 삼각 플라스크로 옮기고 50 내지 60℃로 가열하였다. 한 시간 후, 7 g의 글루타르산 무수물을 첨가하고 온도를 60±2℃로 2 1/2 시간 동안 유지하였다. 이 후 반응 혼합물을 여과 플라스크로 옮기고, 배수시키고, 남아있는 고체를 디옥산으로 세 번, 메탄올로 세 번 세척하고 진공 하에서 건조시켰다. 원소 분석은 최종 생성물이 다음을 함유함을 나타낸다: 56.64 %C, 7.54 %H 및 4.36 %N.
실시예 10
반응은 실시예 1에서 제조한 10 g의 PEI 중합체 및 6.6 g의 숙신산 무수물을 사용한 것을 제외하고는 실시예 9와 동일하게 수행하였다. 원소 분석은 최종 생성물이 다음을 함유함을 나타낸다: 54.46 %C, 7.96 %H 및 4.6 %N.
약 음이온 및 약 양이온 교환 부위를 갖는 매질의 제조.
실시예 용매 ml 용매/
g 수지		 무수물 meq. 무수물/ g 수지 온도 ℃ 시간 (hrs) %N
6 1-M-2-P 15 글루타르산 무수물 9.00 60 2.5 4.56- 4.75*
7 1-M-2-P 3.1 숙신산 무수물 46.45 60 2.5 4.86
8 1-M-2-P 3.1 숙신산 무수물 54.84 60 2.5 5.18
9 디옥산 15.9 글루타르산 무수물 3.06 60 2.5 4.36
10 디옥산 17.5 숙신산 무수물 3.77 60 2.5 4.6
1-M-2-P = 1-메톡시-2-프로판올
실시예 11
실시예 1에서 제조한 86.5 g의 PEI 중합체 및 865 ml의 메톡시-2-프로판올을 교반기 및 환류 콘덴서를 갖춘 2 L 둥근 바닥 플라스크에 넣고 30 분 동안 교반하였다. 23.7 g의 말레산 무수물을 첨가하고 혼합물을 2.5 시간 동안 60℃에서 교반하였다. 혼합물을 냉각시킨 후, 혼합물을 여과 플라스크로 옮기고, 배수시키고, 메톡시-2-프로판올로 한 번, 물로 세 번, 메탄올로 세 번 세척하였다. 원소 분석은 최종 생성물이 다음을 함유함을 나타낸다: %C 55.6, %N 4.9. %H 7.1, %S 0.
실시예 12
실시예 11에서 말레산화된 86.5 g의 수지를 900 ml의 0.01 N 수산화나트륨에서 190 g의 소듐 메타-비술파이트의 존재 하에 6 시간 동안 80±2℃에서 가열하였다. 반응 혼합물을 냉각시킨 후, 혼합물을 여과 플라스크로 옮기고, 배수시키고, 메톡시-2-프로판올로 한 번, 물로 세 번, 메탄올로 세 번 세척하고, 이 후의 사용을 위하여 저장 완충액에 저장하였다. 원소 분석은 최종 생성물이 다음을 함유함을 나타낸다: %C 49.8, %N 4.6. %H 6.8, %S 2.1.
실시예 13
반응은, 반응이 20 시간 동안 80±2℃에서 수행된 것을 제외하고 실시예 12에서와 동일하게 수행하였다. 원소 분석은 최종 생성물이 다음을 함유함을 나타낸다: %C 50.2, %N 4.5, %H 6.8, %S 2.1.
8 시간의 반응 후 수득한 시료의 황 함량 (3.8% S, 실시예 12) 및 20 시간의 반응 후의 황 함량 (3.40% S, 실시예 13)의 비교는 반응이 8 시간 후에 종료됨을 나타낸다.
실시예 14
실시예 1에서 제조한 30 g의 관능화된 PEI를 120 ml의 100 % 에탄올로 두 번 및 120 ml의 톨루엔으로 두 번 세척하여 남아있는 습기를 제거하였다. 이 물질을 300 ml의 톨루엔에서 슬러리화하고, 9.29 g 부티릴 클로라이드 (1 당량, 수지의 질소 함량에 기초) 및 9.24 g의 트리에틸아민을 첨가하고, 반응이 2 시간 동안 25±2℃에서 진행되도록 하였다. 이 후 수지를 여과 플라스크로 옮기고, 300 ml의 톨루엔, 300 ml의 메탄올, 300 ml의 Dl 물로 두 번, 300 ml 메탄올로 세 번, 300 ml의 pH 5 저장 완충액 (1O mM 소듐 아세테이트, pH 4.5)으로 두 번 세척하였다. 원소 분석은 최종 생성물이 다음을 함유함을 나타낸다: 53.7 %C, 7.5 %H 및 5.6 %N.
실시예 15
반응은 용매가 450 ml의 디옥산이라는 것을 제외하고 실시예 14에서와 동일하게 수행하였다. 원소 분석은 최종 생성물이 다음을 함유함을 나타낸다: 54.7 %C, 8.0 %H 및 5.5 %N.
실시예 16
반응은 13.3 g의 부티릴 클로라이드 및 13.2 g의 트리에틸아민을 사용한 것을 제외하고는 실시예 14에서와 동일하게 수행하였다. 원소 분석은 최종 생성물이 다음을 함유함을 나타낸다: 53.6 %C, 7.9 %H 및 4.5 %N.
실시예 17
반응은 19 g의 부티릴 클로라이드 및 18 g의 트리에틸아민을 사용한 것을 제외하고는 실시예 14에서와 동일하게 수행하였다. 원소 분석은 최종 생성물이 다음을 함유함을 나타낸다: 55.4 %C, 7.8 %H 및 4.2 %N.
실시예 18
반응은 25.3 g의 부티릴 클로라이드 및 24 g의 트리에틸아민을 사용한 것을 제외하고는 실시예 14에서와 동일하게 수행하였다. 원소 분석은 최종 생성물이 다음을 함유함을 나타낸다: 55.0 %C, 7.9 %H 및 4.5 %N.
톨루엔을 용매로 사용한 결과의 일부를 표 3에 요약하였다.
톨루엔에서 PEI 코팅된 수지와 부티릴 클로라이드의 반응 (실온에서 2 시간)
실시예 관능화제 당량/
N 당량		 C/N %N
14 1 9.59 5.6
16 1.4 11.86 4.5
17 2 13.12 4.2
18 2.7 12.26 4.5
표 3의 결과가 나타내는 바와 같이, 시약의 양을 증가시키면 관능화의 정도가 증가하게 된다 (생성물의 질소 함량이 상응하여 감소하는 것으로 알 수 있음).
실시예 19
36 g의 트리에틸아민, 56.3 g의 부티르산 무수물 (1.5 몰 과량), 600 ml의 1-메톡시-2-프로판올, 200 ml의 1-메톡시-2-프로판올에서 팽창된 실시예 1에서 제조한 60 g의 PEI 관능화된 중합체를 3 시간 동안 60±2℃에서 반응시켰다. 반응 혼합물을 여과 플라스크로 옮기고, 배수시키고, 500 ml 1-메톡시-2-프로판올로 한 번, 500 ml 메탄올로 한 번, 500 ml Dl 물로 두 번 및 500 ml 저장 완충액으로 두 번 세척하였다. 원소 분석은 최종 생성물이 다음을 함유함을 나타낸다: 54.6 %C, 7.9 %H 및 4.8 %N.
실시예 20
4.0 g의 트리에틸아민, 6.2 g의 부티르산 무수물, 600 ml의 1-메톡시-2-프로판올, 200 ml의 1-메톡시-2-프로판올에서 팽창된 실시예 1에서 제조한 60 g PEI 관능화된 중합체를 3 시간 동안 60±2℃에서 반응시켰다. 이 때, 24.2 g의 아세트산 무수물을 첨가하고 동일한 온도에서 추가적으로 3 시간 동안 반응이 진행되도록 하였다. 반응 혼합물을 여과 플라스크로 옮기고, 배수시키고, 500 ml 1-메톡시-2-프로판올로 한 번, 500 ml 메탄올로 한 번, 500 ml Dl 물로 두 번 및 500 ml 저장 완충액으로 두 번 세척하였다. 원소 분석은 최종 생성물이 다음을 함유함을 나타낸다: 53.7 %C, 7.7 %H 및 4.7 %N.
실시예 21
반응은 6.26 g의 부티르산 무수물 및 4.0 g의 트리에틸아민을 사용한 것을 제외하고는 실시예 19와 동일하게 수행하였다. 원소 분석은 최종 생성물이 다음을 함유함을 나타낸다: 53.7 %C, 7.9 %H 및 4.8 %N.
실시예 22
반응은 1.52 g의 부티르산 무수물 및 1.0 g의 트리에틸아민을 사용한 것을 제외하고는 실시예 19와 동일하게 수행하였다. 최종 생성물의 원소 분석은 다음과 같다: 54.6 %C, 8.3 %H 및 5.0 %N.
결과의 일부를 표 4에 요약하였다.
1-메톡시-2-프로판올에서 PEI 코팅된 수지와 부티르산 무수물의 반응 (60℃에서 3 시간)
실시예 관능화제 당량/
N 당량		 C/N %N
20 1.5 11.4 4.7
21 0.16 11.2 4.8
22 0.04 10.9 5.0
표 3 및 4의 결과를 비교하면, 부티릴 클로라이드로 수득한 것과 비슷한 정도의 치환을, 현저하게 적은 화학양론적 양의 시약을 사용하여 부티르산 무수물로 얻을 수 있다는 것을 알 수 있다.
실시예 23
반응은 1.52 g의 부티르산 무수물 및 1.0 g의 트리에틸아민 및 10.7 g의 아세트산 무수물을 사용한 것을 제외하고는 실시예 20에서와 동일하게 수행하였다. 원소 분석은 최종 생성물이 다음을 함유함을 나타낸다: 55.4 %C, 7.9 %H 및 4.9 %N.
실시예 24
14.07 g 아세트산 무수물, 500 ml 1-메톡시-2-프로판올, 20 ml의 1-메톡시-2-프로판올에서 팽창된 실시예 1에서 제조한 60 g의 PEI 관능화된 중합체를 6 시간 동안 60±2℃에서 반응시켰다. 반응 혼합물을 여과 플라스크로 옮기고, 배수시키고, 500 ml 1-메톡시-2-프로판올로 한 번, 500 ml 0.1 N NaOH로 두 번, 500 ml Dl 물로 두 번 및 500 ml 저장 완충액으로 두 번 세척하였다. 원소 분석은 최종 생성물이 다음을 함유함을 나타낸다: 53.8 %C, 7.5 %H 및 5.3 %N.
실시예 25
실시예 1에서 제조한 80 g의 PEI 관능화된 중합체를 500 ml 0.5 N 수산화나트륨에서 8 시간 동안 80℃에서 59 g의 (3-클로로-2-히드록시프로필) 트리메틸 암모늄 클로라이드의 60% 용액과 반응시켰다. 반응 혼합물 여과 플라스크로 옮기고, 0.1 N 수산화나트륨으로 두 번, Dl 물로 두 번 및 저장 완충액으로 한 번 세척하였다. 세척 및 건조 후, 수지를 원소 분석하였다: 54.2 %C, 8.4 %H, 및 5.9%N.
실시예 26
반응은 수산화나트륨 용액이 0.05 N이라는 것을 제외하고는 실시예 25와 동일하게 수행하였다. 세척 및 건조 후, 수지를 원소 분석하였다: 51.9 %C, 7.6 %H, 및 5.3 %N.
실시예 27
반응은, 반응이 16 시간 동안 계속된 것을 제외하고는 실시예 25에서와 동일하게 수행하였다. 세척 및 건조 후, 수지를 원소 분석하였다: 53.4 %C, 8.4 %H, 및 5.7 %N.
실시예 28
반응은, 반응이 16 시간 동안 계속된 것을 제외하고는 실시예 26과 동일하게 수행하였다. 세척 및 건조 후, 수지를 원소 분석하였다: 52.8 %C, 8.1 %H, 및 5.7 %N.
실시예 29
반응은 수지에 대한 (3-클로로-2-히드록시프로필) 트리메틸 암모늄 클로라이드 60% 용액의 비율이 0.73이 아니라 0.4라는 것을 제외하고는 실시예 25와 동일하게 수행하였다. 세척 및 건조 후, 수지를 원소 분석하였다: 53.72 %C, 7.32 %H, 및 6.04 %N.
실시예 30
반응은 수지에 대한 (3-클로로-2-히드록시프로필) 트리메틸 암모늄 클로라이드 60% 용액의 비율이 0.73이 아니라 1.2라는 것을 제외하고는 실시예 25와 동일하게 수행하였다. 세척 및 건조 후, 수지를 원소 분석하였다: 53.72 %C, 7.32 %H, 및 6.04 %N.
PEI 코팅된 수지와 (3-클로로-2-히드록시프로필) 트리메틸암모늄 클로라이드의 반응
실시예 관능화제 g/
수지 g		 NaOH 농도 반응 시간 %N
25 0.74 0.5 N 8 시간 5.9
26 0.74 0.05 N 8 시간 5.3
27 0.74 0.5 N 16 시간 5.7
28 0.74 0.05 N 16 시간 5.7
29 0.4 0.5 N 8 시간 6.04
30 1.2 0.5 N 8 시간 6.04
실시예 31
실시예 1에서 제조한 160 g의 PEI 관능화된 중합체를 5 시간 동안 40℃에서 111.8 g의 포름알데히드, 400 ml의 아세토니트릴 및 25.9 g의 소듐 시아노보로히드리드와 반응시켰다. 반응 후, 중합체를 480 ml의 아세토니트릴, 480 ml의 Dl 물 및 480 ml의 메탄올로 3 회 세척하고, 추가적인 사용을 위하여 저장 완충액에 저장하였다 (원소 분석 %C = 55.2, %N = 5.8).
실시예 32
실시예 31에서 제조한 25 mg의 중합체 및 200 ml의 아세토니트릴을 오토클레이브 (파르(Parr) 4840 온도 조절기를 갖춘 파르 시리즈 4500 벤치 탑재 압력 반응기)에 충전하였다. 중합체를 120 RPM으로 교반하면서, 메틸 클로라이드를 충전하고 60 PSI로 가압하였다. 반응을 5 시간 동안 80℃에서 계속하였다. 반응 후, 생성물을 60 ml 아세토니트릴, 120 ml 0.1 N 수산화나트륨, 120 ml Dl 물, 240 ml의 저장 완충액으로 세척하고, 저장 완충액에 저장하였다.
실시예 33
실시예 1에서 제조한 71 g의 PEI 개질된 중합체를 500 ml의 0.5N 수산화나트륨과 혼합하고 80℃에서 8 시간 동안 50 내지 100 RPM으로 교반하면서 49 g의 3-(디메틸아미노) 프로필 클로라이드와 반응시켰다. 반응 후, 생성물을 500 ml 수산화나트륨으로 두 번, 500 ml Dl 물로 두 번, 500 ml의 저장 완충액으로 두 번 세척하고, 추가적인 사용을 위하여 완충액에 저장하였다. 원소 분석 - %C: 55.4, %N: 6.2.
실시예 34
단백질의 크로마토그래피 분리
실시예 1에서 제조한 크로마토그래피 매질 및 PEI 제이티 베이커의 실리카 매질 (물품 번호 7264, 제품 번호 16084)을 4.6 x 100 mm 크로마토그래피 칼럼에 충전하였다. 20 mM 소듐 아세테이트 완충액 중 2 mg/ml 토끼 이뮤노글로불린 G, 2 mg/ml 소혈청 알부민 및 베타-락토글로불린 A 및 B 각 2 mg/ml, 1 mg/ml 리소자임의 200 마이크로 리터 용액을 pH 6.2에서 칼럼에 주입하고, 1 ml/분의 유속 및 pH 6.2의 100 % 20 mM 소듐 아세테이트 완충액에서 pH 6.2의 100 % 1.0M 소듐 아세테이트 완충액으로의 30 분 동안의 구배를 이용하여 용출시켰다. 단백질의 용출을 UV 탐지기로 280 nm에서 기록하였다 (도 1).
실시예 35
단백질의 크로마토그래피 분리
실시예 9에서 제조한 크로마토그래피 매질을 4.6 x 100 mm 크로마토그래피 칼럼에 충전하였다. pH 6.2에서 20 mM 소듐 아세테이트 완충액 중 리소자임의 2mg/ml 용액, 2mg/ml의 시토크롬-c, 2 mg/ml 토끼 IgG, 4 mg/ml BSA의 200 마이크로 리터 용액을 칼럼에 주입하고, 1 ml/분의 유속 및 pH 6.2의 100 % 20 mM 소듐 아세테이트 완충액에서 pH 6.2의 1 몰/L의 소듐 아세테이트를 함유하는 100 %의 동일한 용출액으로의 40 분 동안의 구배를 이용하여 용출시켰다. 비교를 위한 실리카 기재 혼합식 매질 (제이티 베이커 물품 번호 7269) 및 본 실시예의 매질에 의한 단백질의 용출을 UV 탐지기를 사용하여 280 nm에서 기록하였다 (도 2).
실시예 36
용량의 비교
실리카 기재 제품 및 실시예 9에서 제조한 크로마토그래피 매질의 용량을 측정하고 비교하였다. 칼럼 (4.6 mm x 50 mm)을 매질로 충전하였다. pH 5.6, 6.2 및 6.9에서 2O mM 소듐 아세테이트 중 IgG 용액 (1 mg/ml)을 선속도(cm/hr)를 변화시키며 칼럼에 가하였다. 돌파(breakthrough)는 UV를 280 nm에서 관찰하여 측정하였다. 칼럼 내의 매질의 돌파 용량은 10% 돌파에서 측정하였다 (표 7).
혼합식 매질 및 실리카 매질의 돌파 용량
시료 선속도, cm/시간 pH mg/ml
실시예 9 361 6.2 11.9
실시예 9 722 6.2 10.7
혼합식 실리카 매질-
7269		 361 6.2 5.3
혼합식 실리카 매질-
7269		 722 6.2 5.9
실시예 9 361 5.6 47
실시예 9 722 5.6 32
혼합식 실리카 매질-
7269		 361 5.6 15.5
혼합식 실리카 매질-
7269		 722 5.6 13.1
실시예 9 361 6.9 7.1
혼합식 실리카 매질-
7269		 361 6.9 3.5
실시예 37
실시예 19에서 제조한 크로마토그래피 매질 및 실리카 매질 (제이티 베이커 물품 번호 7285)을 7.75 mm x 100 mm 칼럼에 충전하였다. 1.7M 암모늄 술페이트 + 25 mM 소듐 포스페이트 pH 7.0 중 난알부민, 리소자임, 리보뉴클레아제, 시토크롬 C 2 mg/ml 용액의 20Oul 용액을 주입하였다. 100 % 25 mm 소듐 포스페이트 + 1.7M 암모늄 술페이트에서 100 % 25 mM 소듐 포스페이트 pH 7.0로의 60 분 동안의 선형 구배에 의하여 단백질을 칼럼으로부터 용출시켰다. 용출 프로파일은 UV로 280 nm에서 관찰하였다 (도 3A 및 3B).
실시예 38
실시예 20에서 제조한 크로마토그래피 매질을 7.75 mm x 100 mm 칼럼에 충전하였다. 25mM 소듐 포스페이트 pH 7.0 + 1.7M 암모늄 술페이트 중 난알부민, 리소자임, 리보뉴클레아제, 시토크롬 C 2mg/ml 용액의 20OuI 용액을 주입하였다. 100 % 25 mm 소듐 포스페이트 + 1.7M 암모늄 술페이트에서 100 % 25 mM 소듐 포스페이트 pH 7.0으로의 60 분 동안의 선형 구배에 의하여 단백질을 칼럼으로부터 용출시켰다. 용출 프로파일은 UV로 280 nm에서 관찰하였다 (도 4).
실시예 39
실시예 22에서 제조한 크로마토그래피 매질을 7.75 mm x 100 mm 칼럼에 충전하였다. 25mM 소듐 포스페이트 pH 7.0 + 1.7M 암모늄 술페이트 중 난알부민, 리소자임, 리보뉴클레아제, 시토크롬 C 2mg/ml 용액의 20OuI 용액을 주입하였다. 100 % 25mm 소듐 포스페이트 + 1.7M 암모늄 술페이트에서 100 % 25 mM 소듐 포스페이트 pH 7.0으로의 60 분 동안의 선형 구배에 의하여 단백질을 칼럼으로부터 용출시켰다. 용출 프로파일은 UV로 280 nm에서 관찰하였다 (도 5).
실시예 40
실시예 23에서 제조한 크로마토그래피 매질을 7.75 mm x 100 mm 칼럼에 충전하였다. 25mM 소듐 포스페이트 pH 7.0 + 1.7M 암모늄 술페이트 중 난알부민, 리소자임 리보뉴클레아제, 시토크롬 C 2mg/ml 용액의 20OuI 용액을 주입하였다. 100 % 25mm 소듐 포스페이트 + 1.7M 암모늄 술페이트에서 100 % 25 mM 소듐 포스페이트 pH 7.0으로의 60 분 동안의 선형 구배에 의하여 단백질을 칼럼으로부터 용출시켰다. 용출 프로파일은 UV로 280 nm에서 관찰하였다 (도 6).
실시예 41
실시예 7에서 제조한 중합체 매질을 1.0 cm x 10 cm 칼럼에 충전하였다. 우선, 10 칼럼 부피의 완충액 A (0.05M MES, pH 5.6)에 통과시켜 칼럼을 평형화시켰다. 평형화 후, 토끼 글로불린 (0.5 mg/ml) 및 리소자임 (0.25 mg/ml)을 함유하는 0.5 ml의 단백질 용액을 주입하였다. 100 % 완충액 A에서 100 % 완충액 B (완충액 A 중의 1M 염화나트륨)로의 40 분 동안의 선형 구배를 수행하여 단백질을 칼럼으로부터 용출시켰다. 첫 번재 단백질 분리를 수행한 후, 1 ml/분에서 48 시간 동안 500 ml의 1O mM 인산을 순환시켜 칼럼을 세척하였다. 세척 후 다시 단백질 분리를 수행하여 칼럼의 산 안정성을 측정하였다 (도 7). 48 시간까지 인산에 의한 칼럼의 세척 전 및 후에 IgG 및 리소자임의 보유 시간에 변화가 없으므로, 이 데이타는 산성 조건 하에서 중합체성 혼합식 매질의 우수한 안정성을 나타낸다.
실시예 42
실시예 7에서 제조한 중합체 매질을 1.0 cm x 10 cm 칼럼에 충전하였다. 우선, 10 칼럼 부피의 완충액 A (0.05M MES, pH 5.6)에 통과시켜 칼럼을 평형화시켰다. 평형화 후, 토끼 글로불린 (0.5 mg/ml) 및 리소자임 (0.25 mg/ml)을 함유하는 0.5 ml의 단백질 용액을 주입하였다. 100 % 완충액 A에서 100 % 완충액 B (완충액 A 중의 1 M 염화나트륨)로의 40 분 동안의 선형 구배를 수행하여 단백질을 칼럼으로부터 용출시켰다. 첫 번재 단백질 분리를 수행한 후, 1 ml/분에서 24 및 48 시간 동안 500 ml의 0.1 M 수산화나트륨을 순환시켜 칼럼을 세척하였다. 세척 후 다시 단백질 분리를 수행하여 칼럼의 염기 안정성을 측정하였다 (도 8). 48 시간까지 수산화나트륨으로의 칼럼의 세척 전 및 후에 IgG 및 리소자임의 보유 시간에 변화가 없으므로, 이 데이타는 염기성 조건 하에서 중합체성 혼합식 매질의 우수한 안정성을 나타낸다.
실시예 43
실시예 1, 25, 26, 27, 28, 29, 30 및 32에서 제조한 크로마토그래피 매질의 용량을 측정하고 비교하였다. 칼럼 (4.6 mm x 50 mm)을 매질로 충전하였다. 2O mM CAPS (3-[시클로헥실아미노]-1-1 프로판 술폰산) pH 11 중의 BSA 용액 (1 mg/ml)을 칼럼에 1 ml/분의 유속으로 가하였다. 돌파는 UV를 280 nm에서 관찰하여 측정하였다. 칼럼 내의 매질의 돌파 용량은 10% 돌파에서 측정하였다. 칼럼 상에 BSA를 적재한 후, 칼럼을 CAPS 완충액으로 세척하고, 1M 염화나트륨을 사용하여 흡착된 BSA를 용출시켜 포화 용량을 계산하였다 (표 8).
Figure 112007053640830-pct00001
본원에서는 특정 실시양태에 대한 언급과 함께 발명을 설명하였다. 본원에 개시된 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않고 변화, 변형 및 변동이 가능하다는 것이 이해될 것이다. 따라서, 이러한 모든 변화, 변형 및 변동은 첨부된 청구항의 사상 및 범위에 포함되도록 의도되는 것이다.

Claims (20)

  1. 중합체 표면 상의 폴리에틸렌이민으로 유도체화되고, 중합체 수지의 표면 상의 폴리에틸렌이민의 말단 아미노기와 관능화제의 반응에 의하여 관능화된 중합체성 수지 입자를 포함하며, 상기 관능화제는 산 무수물, 알킬 클로라이드, 알킬 무수물 및 4차 암모늄 관능기를 함유하는 알킬 클로라이드 및 그의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 크로마토그래피 매질.
  2. 제1항에 있어서, 상기 중합체성 입자가 셀룰로스, 아가로스, 에폭시화 또는 할로겐화된 폴리스티렌, 에폭시화 또는 할로겐화된 폴리아크릴레이트 또는 폴리메타크릴레이트, 및 에폭시화 또는 할로겐화된 폴리디비닐벤젠으로 구성된 군으로부터 선택되는 중합체를 포함하는 크로마토그래피 매질.
  3. 제2항에 있어서, 상기 중합체성 입자가 에폭시화 또는 할로겐화된 폴리스티렌, 에폭시화 또는 할로겐화된 폴리아크릴레이트 또는 폴리메타크릴레이트, 및 에폭시화 또는 할로겐화된 폴리디비닐벤젠으로 구성된 군으로부터 선택되는 중합체를 포함하는 크로마토그래피 매질.
  4. 제1항에 있어서, 상기 관능화제가 시클릭 카르복실산 무수물, 불포화 카르복실산 무수물, 알킬 클로라이드, 알킬 무수물 및 4차 암모늄 관능기를 함유하는 알킬 클로라이드 및 그의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 크로마토그래피 매질.
  5. 제1항에 있어서, 상기 관능화제가 글루타르산 무수물, 숙신산 무수물, 말레산 무수물, 부티릴 클로라이드, 아세트산 무수물, 부티르산 무수물, (3-클로로-2-히드록시프로필)트리메틸암모늄 클로라이드 및 그의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 크로마토그래피 매질.
  6. 제1항에 있어서, 상기 관능화제가 불포화 카르복실산 무수물, 알킬 클로라이드 및 4차 암모늄 관능기를 함유하는 알킬 클로라이드 및 그의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 크로마토그래피 매질.
  7. 제1항에 있어서, 상기 매질이 혼합식인 크로마토그래피 매질.
  8. 제7항에 있어서, 상기 혼합식 매질이 혼합 1차, 2차 및 3차 아민 교환 부위를 갖는 매질, 약 음이온 및 약 양이온 교환 부위를 갖는 매질, 약 음이온, 약 양이온 및 강 양이온 교환 부위를 갖는 매질, 약 음이온 및 소수성 (역상) 교환 부위를 갖는 매질 및 약 음이온 및 강 음이온 교환 부위를 갖는 매질로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 크로마토그래피 매질.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 크로마토그래피 매질로 충전되는 크로마토그래피용 칼럼.
  10. 제9항의 크로마토그래피용 칼럼에 용액을 통과시키고 용액 성분을 용출시키는 것을 포함하는, 용액 성분의 분리 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 용액이 단백질을 함유하는 용액인 방법.
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  13. 삭제
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