PT1841527E

PT1841527E - Suportes cromatográficos

Info

Publication number: PT1841527E
Application number: PT05854430T
Authority: PT
Inventors: Nandu Deorkar; Robert C Buss; Joseph M Mladosich; Paul A Bouis
Original assignee: Mallinckrodt Baker Inc
Priority date: 2005-01-25
Filing date: 2005-12-16
Publication date: 2009-11-20
Also published as: CN101146609B; JP2008528966A; PL1841527T3; EP1841527B1; AU2005325711B2; CN101146609A; JP5094417B2; CA2595735A1; MY144940A; DE602005016972D1; KR20070102685A; IL184761A0; BRPI0519950B1; EP1841527A2; BRPI0519950A2; WO2006081002A3; WO2006081002A2; KR101279305B1; MX2007008832A; DK1841527T3

Description

ΡΕ1841527 1 DESCRIÇÃO "SUPORTES CROMATOGRÁFICOS"

CAMPO DA INVENÇÃO A invenção relaciona-se com a preparação e utilização de novos suportes cromatográficos, de preferência suportes cromatográficos poliméricos de modo misto para separação e purificação de várias biomoléculas tais como péptidos, proteínas e anticorpos. Mais especificamente, a presente invenção descreve novos suportes cromatográficos, de preferência permutadores de aniões mistos, permutadores de aniões-catiões mistos e permutadores hidrófobos. O suporte cromatográfico é preparado por modificação de polímeros com polietilenimina e a sua funcionalização. Inesperadamente constatou-se que estes suportes poliméricos de modo misto proporcionam capacidade de separação e capacidade de ligação a proteínas melhoradas.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO A análise de misturas de proteínas por suportes cromatográficos de permute iónica está bem documentada, como em Pete Gagnon, "Purification Tools for Monoclonal Antibodies", Validated Biosystems, Inc., (1996). Mais recentemente, o desenvolvimento de fármacos e vacinas à 2 ΡΕ1841527 base de proteínas aumentou a necessidade da purificação em maior escala de misturas de proteínas. É altamente desejável que possam ser utilizados nesta área suportes cromatográficos de permuta iónica.

Uma forma de preparar esses materiais de suporte cromatográficos, particularmente permutadores aniónicos contendo funcionalidade amina primária e secundária, é por revestimento da superfície interna de materiais de sílica porosos com polietilenimina (PEI). Por exemplo, o revestimento da superfície interna de partículas de sílica com polietilenimina seguido por imobilização através de reticulação foi descrito em Alpert e Regnier, J. Chromatogr. 185, 375-392 (1979), e a utilização de materiais preparados desta forma para a separação cromatográfica de oligonucleotidos sintéticos foi descrita em Lawson et al., Anal. Biochem. 133, 85-93 (1983).

Analogamente, a preparação de partículas de sílica porosas revestidas com PEI ou partículas de vidro de poros controlados obtidas por ligação covalente de polietileniminopropil-trimetoxi silano foi descrita na US 4540486 da JT Baker Chemical Co. A mesma patente descreve a formação de resinas cromatográficas com funcionalidade mista base fraca/ácido fraco por reacção de sílica revestida com PEI com anidrido carboxílicos cíclicos. Demonstrou-se que estes materiais, quando utilizados numa coluna cromatográfica, podem separar misturas de citocromo C, alfa 1 glicoproteína ácida, ovalbumina e beta- 3 ΡΕ1841527 lactoglobulina (meio de base fraca) ou ovalbumina, citrocromo C, hemoglobina e lisozima (suporte misto de base fraca/ácido fraco). A eficácia da silica porosa derivatizada com PEI, ou da sua versão carboxilada na purificação de imunoglobulina G também foi demonstrada na US 4606825 da JT Baker Chemical Co. A forma acilada da sílica revestida com PEI descrita acima pode ser adicionalmente convertida num suporte de funcionalidade mista ácido fraco/ácido forte pela introdução de grupos sulfónicos, como descrito na US 4721573 da JT Baker Chemical Co. Uma coluna empacotada com este suporte sulfonado permite a separação de uma mistura de citocromo C, hemoglobina, lisozima e ovalbumina, bem como a separação dos componentes proteicos de um suporte de cultura de células de hibridoma.

As partículas de sílica às quais PEI foi ligada covalentemente também podem ser convertidas num suporte cromatográfico hidrófobo por reacção com cloretos de monoacilo ou anidridos carboxílicos lineares em que o grupo acilo pode ser uma cadeia de hidrocarboneto linear, um grupo fenilo ou um grupo fenilo substituído. Um suporte cromatográfico de base fraca/fase inversa à base de sílica preparado dessa maneira utilizando cloreto de butirilo separa citocromo C, mioglobina, lisozima, ovalbumina e alfa-quimiotripsina, como descrito na US 4551245 da JT Baker Chemical Co. 4 ΡΕ1841527

Contas de agarose tendo grupos de permuta iónica na extremidade de um braço de álcool polivinilico (PVA) foram descritas no WO 98/58732 da Amersham. Contudo, ao contrário da presente invenção, os braços espaçadores de PVA não contribuem para qualquer capacidade de permuta iónica do produto, nem ele próprio proporciona uma das funcionalidades de um produto de modo misto.

Uma das principais desvantagens de empacotamentos cromatográficos à base de sílica é a sua falta de estabilidade a pH alto. Isto é especialmente o caso de aplicações que envolvem a purificação de fármacos, uma vez que o tratamento do equipamento com hidróxido de sódio 1 N é uma prática de esterilização comum.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção proporciona um suporte cromatográfico que é capaz de minimizar ou de evitar esta falta de estabilidade a pH alto. 0 suporte cromatográfico da invenção está apresentado na reivindicação 1. A invenção também proporciona suportes cromatográficos de modo misto. Constatou-se que uma forma possível de evitar este problema de instabilidade é a utilização de empacotamentos cromatográficos à base de um suporte polimérico derivatizado na superfície do polímero (i.e., não reticulado) com PEI, suporte com superfície derivatizada esse que de acordo com a invenção pode ser adicionalmente funcionalizado por 5 ΡΕ1841527 reacção de um reagente de funcionalização com grupos amino terminais da polietilenimina na superfície da resina polimérica como descrito na reivindicação 1. De acordo com esta invenção podem de preferência ser proporcionados suportes de modo misto, tais como por exemplo, suportes com sítios de permuta mistos amina primária, secundária e terciária, suportes com sítios de permuta tanto aniónica fraca como catiónica fraca, suportes com sítios de permuta aniónica fraca, catiónica fraca e catiónica forte, suportes com sítios de permuta aniónica fraca e hidrófoba (fase inversa), e suportes com sítios de permuta aniónica fraca e aniónica forte. Além disso, inesperadamente constatou-se que esses suportes cromatográficos poliméricos deriva-tizados com polietilenimina e os seus derivados funciona-lizados proporcionam características de separação diferentes e únicas. Num aspecto da presente invenção são proporcionados suportes cromatográficos poliméricos para biosse-parações. Esta invenção difere dos suportes cromatográficos poliméricos correntes pelo processo de preparação e características dos suportes uma vez que estes suportes cromatográficos correntes são simples permutadores de iões. Além disso, os suportes da presente invenção diferem dos suportes à base de sílica correntes em termos do processo de preparação, composição, utilização e desempenho. Surpreendentemente, os suportes de modo misto poliméricos preparados de acordo com esta invenção têm capacidades de separação e de ligação melhoradas. 6 ΡΕ1841527

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A presente é ilustrada, mas não limitada, pelos desenhos anexos em que: A Figura 1 (ilustrativa) é um gráfico do perfil de eluição, registado por um detector de UV, da separação de proteínas utilizando suportes preparados de acordo com o Exemplo preparativo 1 e suportes de sílica com PEI de acordo com o procedimento do Exemplo 34; A Figura 2 é um gráfico do perfil de eluição, registado por um detector de UV, da separação de proteínas utilizando um suporte preparado de acordo com o Exemplo 9 e um suporte de sílica de modo misto de acordo com o procedimento do Exemplo 35;

As Figuras 3a e 3b são gráficos do perfil de eluição, registado por um detector de UV, da separação de proteínas utilizando o suporte preparado de acordo com o Exemplo 19 e um suporte de sílica de acordo com o procedimento do Exemplo 37; A Figura 4 é um gráfico do perfil de eluição, registado por um detector de UV, da separação de proteínas utilizando o suporte preparado de acordo com o Exemplo 20 de acordo com o procedimento do Exemplo 38; A Figura 5 é um gráfico do perfil de eluição, 7 ΡΕ1841527 registado por um detector de UV, da separação de proteínas utilizando um suporte preparado de acordo com o Exemplo 22 de acordo com o procedimento do Exemplo 39; A Figura 6 é um gráfico do perfil de eluição, registado por um detector de UV, da separação de proteínas utilizando um suporte preparado de acordo com o Exemplo 23 de acordo com o procedimento do Exemplo 40; A Figura 7 é um gráfico da estabilidade a ácidos do suporte preparado de acordo com o Exemplo 7 determinada de acordo com o procedimento do Exemplo 41; e A Figura 8 é um gráfico da estabilidade a bases do suporte preparado de acordo com o Exemplo 7 determinada de acordo com o procedimento do Exemplo 42.

DESCRIÇÃO PORMENORIZADA DA INVENÇÃO

Esta invenção relaciona-se com suportes cromatográficos e com a preparação e utilização de novos suportes cromatográficos poliméricos e de preferência suportes cromatográficos poliméricos de modo misto. De acordo com a presente invenção, o suporte polimérico é preparado utilizando partículas poliméricas derivatizadas com polietilenimina, e funcionalizadas com reagentes apropriados, tal como descrito na reivindicação 1.

Os materiais poliméricos utilizados para a ΡΕ1841527 separação cromatográfica de proteínas vão de preferência ter determinadas propriedades, tais como, 1) o tamanho dos poros é suficientemente grande para permitir a difusão rápida de moléculas tão grandes como proteínas para dentro e para fora das partículas de resina; 2) as interacções entre as proteínas e o polímero não funcionalizado devem ser fracas para evitar "interacções não específicas" e permitir a recuperação da proteína desejada com rendimentos elevados; 3) as partículas da resina devem ser rígidas para evitar compressão e perda de velocidade de fluxo à pressão encontrada em operações cromatográficas; e 4) a resina deve ser quimicamente estável em todas as condições encontradas no processo de separação.

As partículas de resina polimérica a ser derivatizadas à superfície com polietilenimina podem ser quaisquer partículas de resina polimérica capazes de ser derivatizadas com polietilenimina e, quando funcionalizados como descrito na reivindicação 1, úteis como suportes de separação cromatográfica. Exemplos de partículas de resina polimérica adequadas para derivatização com polietilenimina de acordo com esta invenção incluem, mas não estão limitados a celulose, agarose, poliestirenos epoxidados ou 9 ΡΕ1841527 halogenados, poliacrilatos ou polimetacrilatos epoxidados ou halogenados, e polidivinilbenzenos epoxidados ou halogenados. Por exemplo, demonstrou-se que os poli(met)acri-latos porosos, resinas reticuladas à base de monómeros (met)acrílicos com múltiplas ligações duplas polimeri-záveis, tais como dimetacrilato de etileno glicol (US 4118347 de Showa Denko), trimetacrilato de pentaeritritol (US 4256842 de Toyo Soda), trimetacrilato de trimetilol propano (US 4582860 de Rohm and Haas) ou dimetacrilato de glicerol (US 2254634 de Mitsubishi) preparados na presença de um agente porogénio, proporcionam materiais com as propriedades desejadas. Além disso, a adição de monómeros funcionais à mistura de polimerização dá produto final com grupos funcionais aos quais podem ser ligadas outras moléculas através da formação de ligações covalentes. Exemplos desses monómeros são metacrilato de glicerol (grupos -OH) (US 2254634 de Mitsubishi, 1993), metacrilato de dimetilaminoetilo (aminas terciárias) ou metacrilato de glicidilo (US 4118347 de Showa Denko, US 4256842 de Toyo Soda, US 4582860 de Rohm and Haas) . Os reagentes de funcionalização para reacção com as partículas de resina polimérica com superfície derivatizadas com PEI são anidridos de ácidos tais como anidridos carboxílicos cíclicos como os anidridos glutárico e succínico, anidridos carboxílicos insaturados como o anidrido maleico, agentes de sulfonação como bissulfitos como o metabissulfito de sódio, cloretos ou anidridos de alquilo como cloreto de butirilo e anidrido acético ou butírico, e cloretos de alquilo contendo funcionalidade amónio quaternário como 10 ΡΕ1841527 cloreto de (3-cloro-2-hidroxipropil)trimetilamónio, e misturas destes reagentes de funcionalização.

Numa forma de realização desta invenção, um permutador aniónico com sítios mistos de aminas primárias e secundárias e terciárias é preparado por reacção de polietilenimina com um suporte polimérico que tem grupos epoxi ou halogéneo como grupos cloro, bromo, iodo. Esse suporte polimérico pode ser qualquer resina de polímero sintético ou natural adequado tal como poli(met)acrilato, celulose, poliestireno-divinilbenzeno, e agarose. Exemplos dessas resinas disponíveis comercialmente são Toyopearl AF-epoxi 650M de Tosoh Biosciences, Sepharose 6B activada com epoxi. Estes materiais podem reagir com um dos grupos amina terminais da polietilenimina de vários pesos moleculares através da formação de grupos alfa-hidroxi amino quimicamente estáveis. Algumas das propriedades de materiais preparados desse modo, de acordo com os exemplos preparativos 1 a 5 seguintes, estão sumariadas na Tabela 1.

Numa segunda forma de realização, suportes de modo misto com sítios de permuta aniónica fraca e catiónica fraca são preparados por reacção de pérolas poliméricas funcionalizadas com PEI com anidridos de ácidos carbo-xílicos cíclicos, tais como anidrido glutárico ou succínico nos exemplos 6 a 10 seguintes.

Numa Terceira forma de realização, suportes de modo misto com sítio aniónicos fracos, catiónicos fracos e 11 ΡΕ1841527 catiónicos fortes foram preparados por reacção do polímero derivatizado com PEI com um anidrido de ácido carboxílico insaturado seguida por sulfonação, como descrito nos exemplos 11 a 13.

Numa quarta forma de realização, suportes de modo misto com sítios aniónicos fracos e hidrófobos (fase inversa) foram preparados por reacção do polímero derivatizado com PEI com cloreto de alquilo (exemplos 14 a 18) ou anidridos de ácidos monobásicos (exemplos 19 a 24). As reacções com cloreto de butirilo foram realizadas durante 2 h à temperatura ambiente utilizando tolueno ou dioxano como o solvente. Utilizou-se trietilamina para sequestrar o ácido clorídrico produzido como produto secundário da reacção.

Numa quinta forma de realização, suportes de modo misto são obtidos por reacção da resina revestida com PEI com anidrido butírico realizada em l-metoxi-2-propanol durante 3 h a 60°C como indicado nos Exemplos 20-22 seguintes.

As resinas de modo misto base fraca/fase inversa em que a unidade hidrófoba é um grupo metilo ou uma combinação de grupos metilo e butilo podem ser preparadas por utilização de anidrido acético ou adição sequencial de anidrido butírico e acético, como ilustrado no Exemplo 24 (anidrido acético) ou nos Exemplos 20 e 23 (anidridos mistos) respectivamente. Como tal, é possível variar e 12 ΡΕ1841527 seleccionar hidrofobia adequada por utilização de um a uma combinação de reagentes.

Numa sexta forma de realização, suportes de modo misto com sitios aniónicos fracos, e aniónicos fortes (amónio quaternário) foram preparados por reacção do polímero derivatizado com PEI com cloretos de alquilo contendo funcionalidade amónio quaternário terminal. Mais particularmente, faz-se reagir o polímero derivatizado com PEI com cloreto de (3-cloro-2-hidroxipropil)trimetilamónio em hidróxido de sódio aquoso a 70-80°C como ilustrado nos Exemplos 25 a 30 seguintes.

De acordo com a presente invenção, constatou-se inesperadamente que estes suportes cromatográficos poliméricos de modo misto oferecem capacidade de separação aumentada bem como capacidade e estabilidade elevadas. Por exemplo, os suportes de permuta aniónica de modo misto poliméricos podem separar lisozima, imunoglobulina G, albumina de soro bovino, beta-lactoglobulina A e beta-lactoglobulina B enquanto que os suportes à base de sílica com PEI não podem separar todas estas proteínas como ilustrado na Figura 1. Os suportes de permuta catiónica de modo misto podem separar BSA, IgG, citocromo C e lisozima eficientemente, como ilustrado na Figura 2, enquanto que os suportes de sílica de modo misto não podem separar todas estas proteínas. ΡΕ1841527 13

EXEMPLOS

Exemplo 1 (preparativo) 12 g de polímero de metacrilato com epoxi com um tamanho médio das partículas de 35 micrometros de diâmetro e 250 mL de dioxano são colocados num balão de 1 L com fundo redondo equipado com uma ampola, agitador, condensador de refluxo e entrada com pressão de azoto positiva e agitados durante 30 min para permitir que a resina inche. Adiciona-se 20 g de polietilenimina (PEI, peso molecular médio de 600 Daltons) e a ampola é lavada com mais 150 mL de dioxano. A mistura com agitação é aquecida a refluxo de um dia para o outro. Depois de se deixar que a mistura arrefeça, a mistura é transferida para uma ampola de decantação, escorrida, lavada uma vez com dioxano, três vezes com metanol e seca em vácuo a 60°C. Análise elementar: 57,8% de C, 7,4% de H e 5,6% de N.

Exemplo 2 (preparativo)

5 g de polímero de metacrilato com epoxi e 150 mL de dioxano são colocados num balão de 500 mL com fundo redondo equipado com um agitador e condensador de refluxo. Adiciona-se 30 g de PEI (peso molecular médio 1200 Daltons) e a mistura é aquecida a refluxo de um dia para o outro. Depois de se deixar arrefecer, a mistura é transferida para uma ampola de decantação, escorrida, lavada duas vezes com dioxano, três vezes com metanol e seca. Análise elementar: 55,7% de C, 7,8% de H, 5,5% de N ΡΕ1841527 14

Exemplo 3 (preparativo)

5 g de polímero de metacrilato com epoxi e 150 mL de uma mistura 50/50 de dioxano e água são colocados num balão de 500 mL com fundo redondo equipado com um agitador e condensador de refluxo. Adiciona-se 30 g de PEI (peso molecular médio 1200 Daltons) e a mistura é aquecida a refluxo de um dia para o outro (89°C) . Depois de se deixar arrefecer, a mistura é transferida para uma ampola de decantação, escoada, lavada duas vezes com dioxano, três vezes com metanol e seca. A análise elementar indica que o produto final contém: 57,5% de C, 7,4% de H, 2,5% de N

Exemplo 4 (preparativo)

5 g de polímero de metacrilato com epoxi e 100 mL de uma solução a 30% em peso de PEI de peso molecular médio de 10.000 daltons em dioxano são colocados num balão de 250 mL com fundo redondo equipado com um agitador, entrada de azoto e condensador de refluxo e a mistura com agitação é aquecida a refluxo de um dia para o outro. Depois de se deixar arrefecer, a mistura é transferida para uma ampola de decantação, escoada, lavada três vezes com água a 60°C, três vezes com metanol e seca de um dia para o outro numa estufa de vácuo a 60°C. A análise elementar indica que o produto final contém: 56,5% de C, 7,8% de H, 6,4% de N

Exemplo 5 (preparativo) 5 g de resina metacrilica com epoxi e 100 mL de 15 ΡΕ1841527 uma solução a 30% em peso de PEI com peso molecular médio de 10.000 daltons em água são colocados num balão de 250 mL com fundo redondo equipado com um agitador e condensador de refluxo e a mistura com agitação é aquecida a refluxo durante 17 1/2 h. Depois de se deixar arrefecer, a mistura é transferida para uma ampola de decantação, escorrida, lavada três vezes com água, três vezes com metanol e seca de um dia para o outro numa estufa de vácuo a 60°C. A análise elementar indica que o produto final contém: 56,9% de C, 7,5% de H e 3,2% de N.

Tal como indicam os resultados da Tabela 1, a presença de água no sistema tem um efeito negativo na incorporação de azoto, enquanto que se obtém teores de azoto semelhantes quando se faz reagir PEI de vários pesos moleculares com a resina em dioxano seco (apesar de uma proporção de PEI para polímero menor do que no exemplo 1).

Tabela 1. Efeito do solvente e peso molecular da PEI na incorporação de azoto

Solvente PEI de 600 Daltons PEI de 1200 Daltons PEI de 10.000 Daltons Dioxano Exemplo 1 PEl/polímero = 1,66 5,6% de N Exemplo 2 PEI/polímero = 6 5,5% de N Exemplo 4 PEI/polímero = 6 6,4% de N Água/dioxano (1:1) N/A Exemplo 3 PEI/polímero = 6 2,5% de N N/A Água N/A N/A Exemplo 5 PEl/gel = 6 3,2% de N 16 ΡΕ1841527

Como indicam ainda os resultados da Tabela 1, as reacções realizadas em dioxano puro, em oposição a mistura de dioxano/água ou água pura, dão um grau mais elevado de funcionalização, como indicado pelo teor de azoto do produto final. Quando se utiliza dioxano puro como o solvente (primeira linha da Tabela 1), não parece haver um nivel significativamente maior de introdução de azoto à medida que o peso molecular da PEI é aumentado de 600 para 10.000 Daltons.

Exemplo 6 30 g de polímero de PEI preparado como no exemplo 1 é lavado duas vezes com o seu volume de etanol a 100% e duas vezes com o seu volume de l-metoxi-2-propanol para remover qualquer humidade residual. O polímero é então suspenso em 450 mL de l-metoxi-2-propanol, transferido para um balão equipado com um agitador mecânico, condensador de refluxo e entrada com pressão de azoto positiva, e aquecido a 60°C. Após adição de uma solução de 19,43 g de anidrido glutárico a 95% (1 eq, com base no teor de azoto da resina de PEI) a temperatura é mantida a 60 ± 2°C durante 2 1/2 h. A mistura reaccional é depois transferida para uma ampola de decantação, escorrida, e o sólido residual lavado uma vez com 100 mL de l-metoxi-2-propanol, duas vezes com 100 mL de metanol e duas vezes com 100 mL de solução de armazenagem (etanol:água 20:80 v/v, ou acetato de sódio 100 mM pH 4,5 com álcool benzílico a 2%). O produto foi armazenado na respectiva solução de armazenagem para carac- 17 ΡΕ1841527 terização e para separação cromatográfica de proteínas. A análise elementar indica que o produto final contém: % de C = 55,1 , % de N = 4,6.

Exemplo 7 73,7 g de polímero revestido com PEI preparado como no exemplo 1 , 225 mL de l-metoxi-2-propanol e 14,4 g de anidrido succínico são aquecidos a 60 í 2°C e mantidas a essa temperatura durante 2 1/2 h. A mistura reaccional é depois transferida para uma ampola de decantação, escorrida, e o sólido residual lavado uma vez com 100 mL de l-metoxi-2-propanol, duas vezes com 100 mL de metanol e duas vezes com 100 mL de solução tampão de armazenagem como descrito no exemplo 5. A análise elementar indica que o produto final contém: 53,08% de C, 7,13% de H e 4,86% de N.

Exemplo 8

A reacção foi realizada como no em Exemplo 7 excepto que a carga de anidrido succínico é de 17,34 g. A análise elementar indica que o produto final contém: 53,18% de C, 7,97% de H e 5,18% de N

Exemplo 9 11 g de polímero revestido com PEI preparado como no Exemplo 1 é lavado com duas vezes o seu volume de etanol a 100% e duas vezes com o seu volume de dioxano para retirar qualquer humidade residual. A resina é então 18 ΡΕ1841527 suspensa em cerca de 200 mL de dioxano, transferida para um balão com três tubuladuras equipado com um tubo de entrada de azoto e aquecida a 50-60°C. Após uma hora, adiciona-se 7 g de anidrido glutárico e a temperatura é mantida a 60 í 2°C durante 2 1/2 h. A mistura reaccional é então transferida para uma ampola de decantação, escorrida, e o sólido residual é lavado três vezes com dioxano, três vezes com metanol e seco em vácuo. A análise elementar indica que o produto final contém: 56,64% de C, 7,54% de H e 4,36% de N.

Exemplo 10 A reacção foi realizada como no Exemplo 9 excepto que são utilizados 10 g de polímero de PEI preparado de acordo com o Exemplo 1 e 6,6 g de anidrido succínico. A análise elementar indica que o produto final contém: 54,46% de C, 7,96% de H e 4,6% de N.

Tabela 2. Preparação de suportes com sítios de permuta aniónica fraca e catiónica fraca

Exem plo Solvente mL de solvente/ g resina Anidrido Miliequivalentes anidrido/g de resina Temperatura °C Tempo h % de N 6 1-M-2-P 15 glutárico 9,00 60 2,5 4,56- 4,75* 7 1-M-2-P 3,1 succínico 46,45 60 2,5 4,86 8 1-M-2-P 3,1 succínico 54,84 60 2,5 5,18 9 dioxano 15,9 glutárico 3,06 60 2,5 4,36 10 dioxano 17,5 succínico 3,77 60 2,5 4,6 1-M-2-P = l-metoxi-2-propanol ΡΕ1841527 19

Exemplo 11 86,5 g de polímero de PEI de acordo com o Exemplo 1 e 865 mL de metoxi-2-propanol são colocados num balão de 2 litros com fundo redondo equipado com um agitador e condensador de refluxo e agitados durante 30 min. Adiciona-se 23,7 g anidrido maleico e a mistura é agitada durante 2,5 h a 60°C. Depois de se deixar que a mistura arrefeça, a mistura é transferida para uma ampola de decantação, escorrida, lavada uma vez com metoxi-2-propanol, três vezes com água, três vezes com metanol. A análise elementar indica que o produto final contém: % de C, 55,6; % de N, 4,9; % de H, 7,1; % de S, 0.

Exemplo 12 86,5 g de uma resina maleada como no Exemplo 11 é aquecida em 900 mL e hidróxido de sódio 0,01 N na presença de 190 g de metabissulfito de sódio durante 6 h a 80 ± 2°C. Depois de se deixar a mistura reaccional arrefecer, a mistura é transferida para uma ampola de decantação, escorrida, lavada uma vez com metoxi-2-propanol, três vezes com água, três vezes com metanol e armazenada em tampão de armazenagem para utilização posterior. A análise elementar indica que o produto final contém: % de C, 49,8; % de N, 4,6; % de H, 6,8; % de S, 2,1. ΡΕ1841527 20

Exemplo 13 A reacção foi realizada como no Exemplo 12 excepto que a reacção é realizada durante 20 h a 80 í 2°C. A análise elementar indica que o produto final contém:% de C, 50,2; % de N, 4,5; % de H, 6,8; % de S, 2,1. A comparação do teor de enxofre de amostras obtidas após 8 h de reacção (3,8% de S, Exemplo 12) e 20 h de reacção (3,40% de S, exemplo 13) indica que a reacção está completa após 8 h.

Exemplo 14 30 g de PEI funcionalizada preparada de acordo com o Exemplo 1 são lavados duas vezes com 120 mL de etanol a 100% e duas vezes com 120 mL de tolueno para retirar a humidade residual. O material foi então suspenso em 300 mL de tolueno, adicionou-se 9,29 g de cloreto de butirilo (1 eq, com base no teor de azoto da resina) e 9,24 g de trietilamina e deixou-se que a reacção decorresse durante 2 h a 25 ± 2°C. A resina foi então transferida para uma ampola de decantação e lavada com 300 mL de tolueno, 300 mL de metanol, duas vezes com 300 mL de água Dl, três vezes com 300 mL de metanol e duas vezes com 300 mL de tampão de armazenagem pH 5 (acetato de sódio 10 mM, pH 4,5). A análise elementar indica que o produto final contém: 53,7% de C; 7,5% de H; e 5,6% de N. 21 ΡΕ1841527

Exemplo 15 A reacção foi realizada como no Exemplo 14, excepto que o solvente é 450 mL de dioxano. A análise elementar indica que o produto final contém: 54,7% de C, 8,0% de H e 5,5% de N.

Exemplo 16 A reacção foi realizada como no Exemplo 14, excepto que se utilizou 13,3 g de cloreto de butirilo e 13,2 g de trietilamina. A análise elementar indica que o produto final contém: 53,6% de C, 7,9% de H e 4,5% de N.

Exemplo 17 A reacção foi realizada como no Exemplo 14, excepto que se utilizou 19 g de cloreto de butirilo e 18 g de trietilamina. A análise elementar indica que o produto final contém: 55,4% de C, 7,8% de H e 4,2% de N.

Exemplo 18 A reacção foi realizada como no Exemplo 14, excepto que se utilizou 25,3 g de cloreto de butirilo e 24 g de trietilamina. A análise elementar indica que o produto final contém: 55,0% de C, 7,9% de H e 4,5% de N.

Alguns dos resultados obtidos utilizando tolueno como o solvente estão sumariadas na Tabela 3. 22 ΡΕ1841527

Tabela 3. Reacção de resina revestida com PEI com cloreto de butirilo em tolueno (2 h à TA).

Exemplo Eq. reagente de funcionalização/eq. de N C/N % de N 14 1 9,59 5,6 16 1,4 11,86 4,5 17 2 13,12 4,2 18 2,7 12,26 4,5

Como indicam os resultados da Tabela 3, quantidades crescentes de reagente resultam num nível acrescido de funcionalização (como indicado pelo correspondente decréscimo do teor de azoto do produto).

Exemplo 19

Faz-se reagir 60 g de polímero funcionalizado com PEI preparado como no Exemplo 1 e inchados em 200 mL de 1-metoxi-2-propanol, 600 mL de l-metoxi-2-propanol, 56,3 g de anidrido butírico (1,5 de excesso molar) e 36 g de trietilamina durante 3 h a 60 + 2°C. A mistura reaccional é transferida para uma ampola de decantação, escorrida, lavada uma vez com 500 mL de l-metoxi-2-propanopl, uma vez com 500 mL de metanol, duas vezes com 500 mL de água Dl e duas vezes com 500 mL de tampão de armazenagem. A análise elementar indica que o produto final contém: 54,6% de C, 7,9% de H, e 4,8% de N. ΡΕ1841527 23

Exemplo 20

Faz-se reagir 60 g de polímero funcionalizado com PEI preparado como no Exemplo 1 e inchado em 200 mL de 1-metoxi-2-propanol, 600 mL de l-metoxi-2-propanol, 6,2 g anidrido butírico e 4,0 g trietilamina durante 3 h a 60 ± 2°C. Nessa altura, adicionou-se 24,2 g de anidrido acético e a reacção foi deixada decorrer à mesma temperatura durante mais 3 h. A mistura reaccional é transferida para uma ampola de decantação, escorrida, lavada uma vez com 500 mL de l-metoxi-2-propanopl, uma vez com 500 mL de metanol, duas vezes com 500 mL de água Dl e duas vezes com 500 mL de tampão de armazenagem. A análise elementar indica que o produto final contém: 53,7% de C, 7,7% de H, e 4,7% de N.

Exemplo 21 A reacção foi realizada como no Exemplo 19 excepto que se utilizou 6,26 g de anidrido butírico e 4,0 g de trietilamina. A análise elementar indica que o produto final contém: 53,7% de C, 7,9% de H, e 4,8% de N.

Exemplo 22 A reacção foi realizada como no Exemplo 19 excepto que se utilizou 1,52 g de anidrido butírico e 1,0 g de trietilamina. A análise elementar do produto final é 54,6% de C, 8,3% de H, e 5,0% de N. 24 ΡΕ1841527

Alguns dos resultados estão sumariados na Tabela 4.

Tabela 4. Reacção de resina revestida com PEI com anidrido butirico em l-metoxi-2-propanol (3 h a 602C)

Exemplo Eq. reagente de funcionalização/eq. de N C/N % de N 20 1,5 11,4 4,7 21 0,16 11,2 4,8 22 0,04 10,9 5,0 A comparação dos resultados das Tabelas 3 e 4 mostra que níveis de substituições semelhantes aos obtidos com cloreto de butirilo podem ser conseguidos com anidrido butirico utilizando quantidades estequeométricas de reagente consideravelmente inferiores.

Exemplo 23 A reacção foi realizada como no Exemplo 20 excepto que se utiliza 1,52 g de anidrido butirico e 1,0 g de trietilamina e 10,7 g de anidrido acético. A análise elementar indica que o produto final contém: 55,4% de C, 7,9% de H, e 4,9% de N.

Exemplo 24

Faz-se reagir 60 g de polímero funcionalizado com PEI preparado como no Exemplo 1 e inchado em 20 mL de 1- 25 ΡΕ1841527 metoxi-2-propanol, 500 mL de l-metoxi-2-propanol e 14,07 g de anidrido acético durante 6 h a 60 ± 2°C. A mistura reaccional é transferida para uma ampola de decantação, escorrida, lavada uma vez com 500 mL de l-metoxi-2-propanol, duas vezes com 500 mL de NaOH 0,1 N, duas vezes com 500 mL de água Dl e duas vezes com 500 mL de tampão de armazenagem. A análise elementar indica que o produto final contém: 53,8% de C, 7,5% de H, e 5,3% de N.

Exemplo 25

Faz-se reagir 80 g de polimero funcionalizado com PEI preparado como no Exemplo durante 8 h a 80°C com 59 g de uma solução a 60% de cloreto de (3-cloro-2-hidroxi-propil)trimetilamónio em 500 mL de hidróxido de sódio 0,5 N. A mistura reaccional é transferida para uma ampola de decantação e lavada duas vezes com hidróxido de sódio 0,1 N, duas vezes com água Dl e uma vez com tampão de armazenagem. Após lavagem e secagem, a resina tem a seguinte análise elementar: 54,2% de C, 8,4% de H, e 5,9% de N.

Exemplo 26 A reacção foi realizada como no Exemplo 25 excep-to que a solução de hidróxido de sódio é 0,05 N. Após lavagem e secagem, a resina tem a seguinte análise elementar: 51,9% de C, 7,6% de H, e 5,3% de N. 26 ΡΕ1841527

Exemplo 27 A reacção foi realizada como no Exemplo 25 excepto que a reacção é continuada durante 16 h. Após lavagem e secagem, a resina tem a seguinte análise elementar: 53,4% de C, 8,4% de H, e 5,7% de N.

Exemplo 28 A reacção foi realizada como no Exemplo 26 excepto que a reacção é continuada durante 16 h. Após lavagem e secagem, a resina tem a seguinte análise elementar: 52,8% de C, 8,1% de H, e 5,7% de N.

Exemplo 29 A reacção foi realizada como no Exemplo 25 excepto que a proporção de solução de cloreto de (3-cloro-2-hidroxipropil)trimetilamónio a 60% para resina é 0,4 em vez de 0,73. Após lavagem e secagem, a resina tem a seguinte análise elementar: 53,72% de C, 7,32% de H, e 6,04% de N.

Exemplo 30 A reacção foi realizada como no Exemplo 25 excepto que a proporção de solução de cloreto de (3-cloro-2-hidroxipropil) trimetilamónio a 60% para resina é 1,2 em vez de 0,73. Após lavagem e secagem, a resina tem a 27 ΡΕ1841527 seguinte análise elementar: 53,72% de C, 7,32% de H, e 6,04% de N.

Tabela 5. Reacção de resina revestida com PEI com cloreto de (3-cloro-2-hidroxipropil)trimetilamónio

Exemplo g de reagente de funcio-nalização/g de resina NaOH conc. Tempo de reacção % de N 25 0,74 0,5 N 8 h 5,9 26 0,74 0,05 N 8 h 5,3 27 0,74 0,5 N 16 h 5,7 28 0,74 0,05 N 16 h 5,7 29 0,4 0,5 N 8 h 6,04 30 1,2 0,5 N 8 h 6,04

Exemplo 31 (preparativo)

Faz-se reagir 160 g de polímero funcionalizado com PEI preparado de acordo com o Exemplo 1 durante 5 horas a 40°C com 111,8 g de formaldeído, 400 mL de acetonitrilo e 25,9 g de cianoborohidreto de sódio. Após a reacção, o polímero foi lavado com 480 mL de acetonitrilo, 480 mL de água Dl e 3 vezes 480 mL de metanol e armazenado em tampão de armazenagem para utilização posterior. (Análise elementar: % de C = 55,2; % de N = 5,8)

Exemplo 32 25 mg de polímero preparado de acordo com o Exemplo 31 e 200 mL de acetonitrilo foram adicionados a um 28 ΡΕ1841527 autoclave (reactor de pressão de bancada Parr série 4500 com controlador de temperatura Parr 4840). Enquanto se agitava o polimero a 120 RPM, adicionou-se cloreto de metilo gasoso e pressurizou-se para 60 PSI. A reacção foi continuada durante 5 horas a 80°C. Após a reacção, o produto foi lavado com 60 mL de acetonitrilo, 120 mL de hidróxido de sódio 0,1 N, 120 mL de água Dl, 240 mL de tampão de armazenagem e armazenado em tampão de armazenagem.

Exemplo 33 71 g de polimero modificado com PEI preparado de acordo com o Exemplo 1 foi misturado com 500 mL de hidróxido de sódio 0,5 N e reagiu com 49 g de cloreto de 3-(dimetilamino)propilo enquanto se agitava a 50-100 RPM a 80°C durante 8 horas. Após a reacção, o produto foi lavado por duas vezes com 500 mL de hidróxido de sódio, duas vezes com 50 0 mL de água Dl, duas vezes com 500 mL de tampão de armazenagem e armazenado no tampão para utilização posterior. Análise elementar - % de C: 55,4; % de N: 6,2.

Exemplo 34

Separação cromatográfica de proteínas (ilustrativo)

Um suporte cromatográfico preparado como no Exemplo 1 e suporte de sílica PEI de JT Baker (produto 29 ΡΕ1841527 número 7264, lote N16084) foi empacotados numa coluna cromatográfica de 4,6 x 100 mm. 200 microlitros de uma solução de 1 mg/mL de lisozima, 2 mg/mL de imunoglobulina G de coelho, 2 mg/mL de albumina de soro bovino e 2 mg/mL cada de beta-lactolobulina A e B num tampão de acetato de sódio 20 mM a pH 6,2 são injectados na coluna e eluidos utilizando um caudal de 1 mL/min e um gradiente de 30 min desde 100% de tampão de acetato de sódio 20 mM a pH 6,2 até 100% de tampão de acetato de sódio 1,0 M a pH 6,2. A eluição das proteínas é registada por um detector de UV a 280 nm (Figura 1) .

Exemplo 35

Separação cromatográfica de proteínas

Um suporte cromatográfico preparado como no Exemplo 9 é empacotado numa coluna cromatográfica de 4,6 x 100 mm. 200 microlitros de uma solução de 4 mg/mL de BSA, 2 mg/mL de IgG de coelho, 2 mg/mL de citocromo C e 2 mg/mL de solução de lisozima em tampão de acetato de sódio 20 mM a pH 6,2 são injectados na coluna e eluidos utilizando um caudal de 1 mL/min e um gradiente de 40 min desde 100% de tampão de acetato de sódio 20 mM a pH 6,2 até 100% do mesmo eluente mas contendo 1 mole por litro de acetato de sódio, pH 6,2. A eluição das proteínas pelo suporte deste Exemplo e para um suporte de modo misto à base de sílica comparativo (JT Baker Produto N° 7269) é registada por um detector de UV a 280 nm (Figura 2). ΡΕ1841527 30

Exemplo 36

Comparação da capacidade A capacidade do suporte cromatográfico preparado de acordo com o Exemplo 9 e de produtos à base de sílica foram determinadas e comparadas. Uma coluna (4,6 mm x 50 mm) foi empacotada com o suporte. Uma solução de IgG (1 mg/mL) em acetato de sódio 20 mM a pH 5,6, 6,2 e 6,9 foi aplicada na coluna a uma velocidade linear variável (cm/h). A ruptura foi determinada por monitorização por UV a 280 nm. A capacidade de ruptura do suporte na coluna foi determinada a 10% de ruptura (Tabela 7).

Tabela 7: Capacidade de ruptura de suportes de modo misto e suportes de sílica

Amostras Velocidade linear, cm/h pH Capacidade de ruptura, mg/mL Exemplo 9 361 6,2 11,9 Exemplo 9 722 6,2 10,7 Suporte de sílica de modo misto 7269 361 6,2 5,3 Suporte de sílica de modo misto 7269 722 6,2 5,9 Exemplo 9 361 5,6 47 Exemplo 9 722 5,6 32 Suporte de sílica de modo misto 7269 361 5,6 15,5 Suporte de sílica de modo misto 7269 722 5,6 13,1 Exemplo 9 361 6,9 7,1 Suporte de sílica de modo misto 7269 361 6,9 3,5 31 ΡΕ1841527

Exemplo 37 0 suporte cromatográfico preparado de acordo com o Exemplo 19 e suporte de sílica (J T Baker, produto N° 7285) foram empacotados numa coluna de 7,75 mm x 100 mm. Injectou-se 200 pL de solução a 2 mg/mL de citocromo C, ribonuclease, lisozima e ovalbumina em fosfato de sódio 25 mM pH 7,0 + sulfato de amónio 1,7 Μ. A proteína foi eluída da coluna por um gradiente linear de 60 minutos de 100% de fosfato de sódio 25 mM + sulfato de amónio 1,7 M até 100% de fosfato de sódio 25 mM pH 7,0. O perfil de eluição foi monitorizado por UV a 280 nm (Figura 3A e 3B).

Exemplo 38 O suporte cromatográfico preparado de acordo com o Exemplo 20 foi empacotado numa coluna de 7,75 mm x 100 mm. Injectou-se 200 pL de solução a 2 mg/mL de citocromo C, ribonuclease, lisozima e ovalbumina em fosfato de sódio 25 mM pH 7,0 + sulfato de amónio 1,7 Μ. A proteína foi eluída da coluna por um gradiente linear de 60 minutos de 100% de fosfato de sódio 25 mM + sulfato de amónio 1,7 M até 100% de fosfato de sódio 25 mM pH 7,0. O perfil de eluição foi monitorizado por UV a 280 nm (Figura 4).

Exemplo 39 O suporte cromatográfico preparado de acordo com o Exemplo 22 foi empacotado numa coluna de 7,75 mm x 100 mm. Injectou-se 200 pL de solução a 2 mg/mL de citocromo C, 32 ΡΕ1841527 ribonuclease, lisozima e ovalbumina em fosfato de sódio 25 mM pH 7,0 + sulfato de amónio 1,7 Μ. A proteina foi eluida da coluna por um gradiente linear de 60 minutos de 100% de fosfato de sódio 25 mM + sulfato de amónio 1,7 M até 100% de fosfato de sódio 25 mM pH 7,0.0 perfil de eluição foi monitorizado por UV a 280 nm (Figura 5).

Exemplo 40 O suporte cromatográfico preparado de acordo com o Exemplo 23 foi empacotado numa coluna de 7,75 mm x 100 mm. Injectou-se 200 pL de solução a 2 mg/mL de citocromo C, ribonuclease, lisozima e ovalbumina em fosfato de sódio 25 mM pH 7,0 + sulfato de amónio 1,7 Μ. A proteina foi eluida da coluna por um gradiente linear de 60 minutos de 100% de fosfato de sódio 25 mM + sulfato de amónio 1,7 M até 100% de fosfato de sódio 25 mM pH 7,0.0 perfil de eluição foi monitorizado por UV a 280 nm (Figura 6).

Exemplo 41 O suporte polimérico preparado de acordo com o Exemplo 7 foi empacotado numa coluna de 1,0 cm x 10 cm. Primeiro a coluna foi equilibrada por passagem de 10 volumes de coluna de tampão A (MES 0,05 M, pH 5,6). Após a equilibração injectou-se 0,5 mL de solução de proteina contendo globulina de coelho (0,5 mg/mL) e lisozima (0,25 mg/mL). As proteínas foram eluídas da coluna por um gradiente linear de 40 minutos de 100% de tampão a 100% de tampão B (cloreto de sódio 1 M em tampão A) . Depois do 33 ΡΕ1841527 primeiro ensaio de separação de proteínas, a coluna foi lavada por circulação de 500 mL de ácido fosfórico 10 mM a 1 mL/min durante 48 horas. Após lavagem a separação de proteínas foi realizada de novo para determinar a estabilidade a ácidos da coluna (Figura 7) . Estes dados indicam excelente estabilidade do suporte polimérico de modo misto em condições ácidas uma vez que não há alteração do tempo de retenção de IgG e lisozima antes e depois da lavagem da coluna com ácido fosfórico durante até 48 horas.

Exemplo 42 O suporte polimérico preparado de acordo com o Exemplo 7 foi empacotado numa coluna de 1,0 cm x 10 cm. Primeiro a coluna foi equilibrada por passagem de 10 volumes de coluna de tampão A (MES 0,05 M, pH 5,6). Após a equilibração injectou-se 0,5 mL de solução de proteína contendo globulina de coelho (0,5 mg/mL) e lisozima (0,25 mg/mL). As proteínas foram eluídas da coluna por um gradiente linear de 40 minutos de 100% de tampão A até 100% de tampão B (cloreto de sódio 1 M em tampão A) . Depois do primeiro ensaio de separação de proteínas, a coluna foi lavada por circulação de 500 mL de ácido fosfórico 10 mM a 1 mL/min durante 24 e 48 horas. Após lavagem a separação de proteínas foi realizada de novo para determinar a estabilidade a bases da coluna (Figura 8) . Estes dados indicam excelente estabilidade do suporte polimérico de modo misto em condições básicas uma vez que não há alteração do tempo de retenção de IgG e lisozima antes e 34 ΡΕ1841527 depois da lavagem da coluna com hidróxido de sódio durante até 48 horas.

Exemplo 43 A capacidade do suporte cromatográfico preparado de acordo com o Exemplo 1, 25, 26, 27, 28, 29, 30 e 32 foi medida e comparada. Uma coluna (4,6 mm x 50 mm) foi empacotada com os suportes. Aplicou-se solução de BSA (1 mg/mL) em CAPS (ácido 3-[ciclohexilamino]-1-1-propano sulfónico) 20 mM pH 11 na coluna a um caudal de 1 mL/min. A ruptura foi determinada por monitorização por UV a 280 nm. A capacidade de ruptura do suporte da coluna foi determinada a 10% de ruptura. Depois de carregar o BSA nas colunas, as colunas foram lavadas com tampão CAPS e depois o BSA adsorvido foi eluido utilizando cloreto de sódio 1 M para calcular a capacidade de saturação (Tabela 8).

Tabela 8 Comparação da capacidade

Amostras Velocidade linear cm/h pH Capacidade de ruptura mg/mL Capacidade de saturação mg/mL Exemplo 1 361 11 0,8 1 Exemplo 25 361 11 22 34 Exemplo 26 361 11 16 22 Exemplo 27 361 11 21 35 Exemplo 28 361 11 20 28 Exemplo 29 361 11 0,4 0,4 Exemplo 30 361 11 25 33 Exemplo 32 361 11 25 39 35 ΡΕ1841527 A invenção foi aqui descrita com referência às suas formas de realização específicas. Entender-se-á que podem ser feitas alterações, modificações e variações sem afastamento do âmbito das reivindicações. Consequentemente, pretende-se abranger todas essas alterações, modificações e variações que caem no âmbito das reivindicações anexas.

Lisboa, 13 de Novembro de 2009

Claims

ΡΕ1841527 1 REIVINDICAÇÕES 1. Suporte cromatográfico que compreende partículas de resina polimérica derivatizada com polietilenimina na superfície do polímero e funcionalizada por reacção de um reagente de funcionalização com grupos amino terminais da polietilenimina na superfície da resina polimérica, em que o reagente de funcionalização é seleccionado do grupo que consiste em anidridos de ácidos, agentes de sulfonação, cloretos de alquilo, anidridos de alquilo, e cloretos de alquilo contendo funcionalidade amónio quaternário, e as suas misturas.
2. Suporte cromatográfico de acordo com a reivindicação 1, em que o reagente de funcionalização é seleccionado do grupo que consiste em anidridos carboxí-licos cíclicos, anidridos carboxílicos insaturados, bissul-fitos, cloretos de alquilo, anidridos de alquilo, cloretos de alquilo contendo uma funcionalidade amónio quaternário e as suas misturas.
3. Suporte cromatográfico de acordo com a reivindicação 2, em que o reagente de funcionalização é seleccionado do grupo que consiste em: anidrido glutárico, anidridos succínicos, anidrido maleico, metabissulfito de sódio, cloreto de butirilo, anidrido acético, anidrido butírico, cloreto de (3-cloro-2-hidroxipropil)-trimetil-amónio, e as suas misturas. 2 ΡΕ1841527
4. Suporte cromatográfico de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, em que o suporte é um suporte de modo misto.
5. Suporte cromatográfico de acordo com a reivindicação 4, em que o suporte de modo misto é seleccionado do grupo que consiste em suportes com sitios de permuta do tipo amina primária, secundária e terciária mistos, suportes com sitio de permuta aniónica fraca e catiónica fraca, suportes com sitios de permuta aniónica fraca, catiónica fraca e catiónica forte, suportes com sitios de permuta aniónica fraca e hidrófobos (fase inversa), e suportes com sitios de permuta aniónica fraca e aniónica forte.
6. Coluna para cromatografia que está empacotada com um suporte cromatográfico de acordo com qualquer das reivindicações anteriores.
7. Processo para a separação de componentes de uma solução que compreende a passagem da solução através de uma coluna cromatográfica de acordo com a reivindicação 6 e a eluição dos componentes da solução.
8. Processo de acordo com a reivindicação 7, em que a solução é uma solução que contém proteínas. Lisboa, 13 de Novembro de 2009 ΡΕ1841527 1/8

Fig. 1 ΡΕ1841527 2/8 (!) BSA, (2) IgO, (3) CitocTO-mo C e (4) Lisom&a 5 S-.SÍ-Í-M-Í | ¢ -¾ 4 í-Oíp &βφ£3 : 1¾íl -„j - l \ Π ! J c V Ϊ í ΐ ! i Jí 1 } 1 h l \ 2 •Ί 4 Sape^ái&aílks .A. áe moáo misto 'v..--'" x > S S '« i. >'>!<►> i tSMSB íftfK 14.¾¾ -1¾.¾ § í&m mos Mtosm [(1) BSA, (2) IGG, (3) Citocromo C e (4) Lisozima (Coluna de 0,46 x 100, 1 mL/min) A: Acetato de sódio 20 mm pH 6,2, B: Acetato de sódio 1 M, pH 6,2 (gradiente linear de 15 min)] Fig.2 ΡΕ1841527 3/8 02&τ~"ΐ: ι αιοι I V... ÍS! I IAI I / ν \ Λ\>Λ·ι<ιΧ\\·λ\ν^λ>\Νν.\ν.·'Ί1·|Γ ff11 3% - Suporse de aeesds «eis. I | α Exssple lã V. v '•'"Vw.ví, v·^ *'*'*'*y " "i;1'1 .i 1 i. ,1 i i.i ii im,i i i.i^i.oxyaaaa^cw^-^x^aaa^aaaayaaAyax-yÍÁjjjÁaaayaÍ» iim 2t»o mm m.m mm Mtetos &1$j |t § 0-101 N".--Λ 3S ” SsjporSe d* silie» \ <4 30, o@ m Mtrtuio® mm moo moei [(1) Citocromo C, (2) Ribonuclease, (3) Lisozima e (4) Ovalbumina (Coluna de 7,7 5 x 100, 1 mL/min) A: Fosfato de sódio 25 mm pH 7,0 + Sulfato de amónio 1,7 Μ, B: Fosfato de sódio 25 mm pH 7,0 (gradiente linear de 60 min de 100% A até 100% de B)] Figs. 3A e 3B 4/8 ΡΕ1841527 ISO: QM:141 0.20: 0.0fc- Xfl"· F> S& / V 10.00 moo 3100 4100 5100Minutos moo mi [(1) Citocromo C, (2) Ribonuclease, (3) Lisozima (4) Ovalbumina (Coluna de 7,75 x 100, 1 mL/min) A: Fosfato de sódio 25 mm pH 7,0 + Sulfato de amónio 1,7 Μ, B: Fosfato de sódio 25 mm pH 7,0 (gradiente linear de 60 min de 100% A até 100% de B)] Fig.4 ΡΕ1841527 5/8 UO*"'" Μ J 0.50· 0,0«- 10.00 20.00 00.00 χχ^χχγχχ*νχν7?χ^.χχ',χχχγχχχ>χχχ^χχχχγ.χχ\χχχχ',χχχχχχχχι^χν<.'»^,~^ 4OÍ0D 50,00 00.00 70. Minutos [(1) Citocromo C, (2) Ribonuclease, (3) Lisozima e (4) Ovalbumina (Coluna de 7,75 x 100, 1 mL/min) A: Fosfato de sódio 25 mm pH 7,0 + Sulfato de amónio 1,7 Μ, B: Fosfato de sódio 25 mm pH 7,0 (gradiente linear de 60 min de 100% A até 100% de B)] Fig.5 6/8 ΡΕ1841527

[(1) Citocromo C, (2) Ribonuclease, (3) Lisozima e (4) Ovalbumina (Coluna de 7,7 5 x 100, 1 mL/min) A: Fosfato de sódio 25 mm pH 7,0 + Sulfato de amónio 1,7 Μ, B: Fosfato de sódio 25 mm pH 7,0 (gradiente linear de 60 min de 100% A até 100% de B)] Fig. 6 7/8 ΡΕ1841527

Amostra: 0,25 mg de IgG e 0,12 mg de lisozima, coluna inicial; Azul: 48 horas [ (1) BSA, (2) IgG de coelho (Coluna de 1 cm x mL/min) A: MES 0,05 M, pH 5,6, B: A + Cloreto de (gradiente linear de 40 min de 100% A até 100% de Fig.7 Vermelho: 10 cm, 1 sódio 1 M B) ] ΡΕ1841527 8/8

Amostra: 0,25 mg de IgG e 0,12 mg de lisozima, Vermelho: coluna inicial; Azul: 28 horas; Verde: 48 horas [ (1) BSA, (2) IgG de coelho (Coluna de 1 cm x 10 cm, 1 mL/min) A: MES 0,05 M, pH 5,6, B: A + Cloreto de sódio 1 M (gradiente linear de 40 min de 100% A até 100% de B) ] Fig.8 1 ΡΕ1841527 REFERÊNCIAS CITADAS NA DESCRIÇÃO Esta lista de referências citadas pelo requerente é apenas para conveniência do leitor. A mesma não faz parte do documento da patente Europeia. Ainda que tenha sido tomado o devido cuidado ao compilar as referências, podem não estar excluídos erros ou omissões e ο IEP declina quaisquer responsabilidades a esse respeito. Documentos de patentes citadas na Descrição - OS 4548486 A * US *808825A « 05*721573 A * OS*851245A liS 425SS42.4. Tayo Soda IS 4582588 A.. Mm aná Haas 05 2254834 k, mímA * WO 8S58732 A, Atm&m * OS 4118347 4 Sfcsa» D»*» * OS 41'!0347 A, S&owa Qecfc© Literatura que não é de patentes citada na Descrição • PeteG*g»eB„ PiaSscateTeeís Aa- » iam*m«t8L4M:3fce&eR?,. 198¾ vo$. 133,85-93 fiteoáies. VaíkMed BiosysSsms, irse, 1SSS « ASpest; R*gnãsí.. J. Chrsmãtsgf 155, 375-382