MX2007008832A

MX2007008832A - Medios cromatograficos.

Info

Publication number: MX2007008832A
Application number: MX2007008832A
Authority: MX
Inventors: Nandu Deorkar; Robert C Buss; Joseph M Mladosich; Paul A Bouis
Original assignee: Mallinckrodt Baker Inc
Priority date: 2005-01-25
Filing date: 2005-12-16
Publication date: 2007-09-07
Also published as: KR20070102685A; ES2332008T3; NO20074331L; MY144940A; CN101146609B; CN101146609A; JP5094417B2; US20080203029A1; ATE444119T1; JP2008528966A; KR101279305B1; NZ556639A; US20140194543A1; IL184761A; PL1841527T3; TWI398453B; AU2005325711B2; WO2006081002A3; IL184761A0; TW200637876A

Abstract

Esta invencion se relaciona con la preparacion y uso de medios cromatograficos polimericos novedosos y preferiblemente medios cromatograficos polimericos de modo mezclado. De acuerdo con la presente invencion, los medios polimericos son preparados usando particulas polimericas derivadas con polietilenimina, y preferiblemente como particulas polimericas derivadas de polietilenimina funcionalizadas ademas con reactivos apropiados. Los medios cromatograficos polimericos son especialmente utiles para bioseparaciones.

Description

MEDIOS CROMATOGRAFICOS CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención se relaciona con la preparación y uso de medios cromatográficos novedosos, preferiblemente medios cromatográficos poliméricos de modo mezclado para la separación y purificación de varias biomoléculas como péptidos, proteínas y anticuerpos. De manera más particular, la presente invención describe medios cromatográficos novedosos, preferiblemente intercambiadores de aniones mezclados, intercambiadores de aniones-cationes mezclados e intercambiadores hidrofóbicos. Los medios cromatográficos son preparados mediante la modificación de polímeros con polietilenimina y la funcionalización de los mismos. Se ha descubierto de manera inesperada que esos medios poliméricos de modo mezclado ofrecen mejor capacidad de separación y capacidad de unión de proteína.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El análisis de mezclas de proteínas por medios cromatográficos de intercambio iónico está bien documentado, como por, Pete Gagnon, "Purification Tools for Monoclonal Antibodies", Validated Biosystems, Inc., (1996). Más recientemente, el desarrollo de fármacos y vacunas basadas en proteínas ha incrementado la necesidad de la purificación a Ref .182206 gran escala de mezclas de proteínas. Es altamente deseable que los medios cromatográficos de intercambio iónico puedan ser utilizados en esta área. Una forma de preparar esos materiales de medios cromatográficos, particularmente intercambiadores de aniones que contengan funcionalidad amina primaria y secundaria, recubriendo la superficie interna de materiales de sílice porosos con polietilenimina (PEÍ, por sus siglas en inglés) . Por ejemplo, el recubrimiento de la superficie interna de partículas de sílice con polietilenimina seguido por inmovilización a través de la reticulación ha sido descrito en Alpert y Regnier, J. Chromatogr. 185, 375-392 (1979) , y el uso de materiales preparados de esa forma para la separación cromatográfica de oligonucleótidos sintéticos ha sido descrita en Lawson et al., Anal. Biochem. 133, 85-93 (1983) . De manera similar, la preparación de partículas de sílice porosas recubiertas con PEÍ o partículas de vidrio de poro controlado obtenidas por unión covalente de polietileniminopropil-trimetoxi silano ha sido descrita en la US 4,540,486 de JT Baker Chemical Co . La misma patente describe la formación de resinas cromatográficas que tienen funcionalidad de base débil/ácido débil mezclada por la reacción de la sílice recubierta con PEÍ con anhídridos carboxílicos cíclicos. Se ha mostrado que esos materiales, cuando son usados en una columna cromatográfica, pueden separar mezclas de citocromo C, glicoproteína alfal-ácida, ovoalbúmina y beta-lactoglobulina (medio de base débil) u ovoalbúmina, citocromo C, hemoglobina y lisozima (medios de base débil/ácido débil mezclados) . La eficacia de la sílice porosa derivada de PEÍ, o su versión carboxilada en la purificación de inmunoglobulina G también ha sido demostrada en la US 4,606,825 de JT Baker Chemical Co. La forma acilada de la sílice recubierta con PEÍ descrita anteriormente puede ser convertida además en un medio de funcionalidad de ácido débil/ácido fuerte mezclado por la introducción de grupos sulfónicos, como se describe en la US 4,721,573 de JT Baker Chemical Co . Una columna empaquetada con estos medios sulfonados permite la separación de una mezcla de citocromo C, hemoglobina, lisozima y ovoalbúmina, así como la separación de los componentes de la proteína del medio de cultivo de células de hibridoma. Las partículas de sílice a las cuales la PEÍ ha sido unida covalentemente también pueden ser convertidas a medios cromatográficos hidrofóbicos por la reacción con cloruros de monoacilo o anhídridos carboxílicos lineales donde el grupo acilo puede ser una cadena de hidrocarburo lineal, un grupo fenilo o un grupo fenilo sustituido. Los medios cromatográficos de base débil/fase inversa basados en sílice preparados de esa forma usando cloruro de butirilo separan citocromo C, mioglobina, lisozima, ovoalbúmina y alfa-quimiotripsinógeno, como se describe en la US 4,551,245 de JT Baker Chemical Co . Las perlas de agarosa que contienen un grupo de intercambio iónico al final del brazo de alcohol polivínilico (PVA) han sido descritas en la WO 98/58732 de Amersham. Sin embargo, a diferencia de la presente invención, los brazos separados de PVA no contribuyen de ninguna manera a la capacidad de intercambio iónico al producto, ni proporcionan en sí una de las funcionalidades en un producto en modo mezclado . Una de las desventajas principales de los paquetes cromatográficos basados en sílice es su falta de estabilidad a pH alto. Esto es particularmente el caso para aplicaciones que implican la purificación de fármacos, puesto que el tratamiento del equipo de hidróxido de sodio ÍN es una práctica de esterilización común.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona medios cromatográficos que pueden minimizar o evitar esta falta de estabilidad a pH alto. La invención también proporciona medios cromatográficos de modo mezclado. Se ha descubierto que una posible forma de evitar este problema de inestabilidad es usar paquetes cromatográficos sobre la base de un soporte polimérico derivado sobre la superficie del polímero (es decir, no reticulado) con PEÍ, medios derivados de la superficie los cuales pueden ser funcionalizados además por la reacción de un reactivo de funcionalización con grupos amino terminales de la polietilenimina sobre la superficie de la resina polimérica. De acuerdo con esta invención pueden proporcionarse preferiblemente medios de modo mezclado, por ejemplo, medios con sitios de intercambio de amina primaria, secundaria y terciaria mezclados, medios con sitios de intercambio de anión débil y catión débil, medios con anión débil, y sitios de intercambio de catión débil y catión fuerte, medios con sitios de intercambio de anión débil e hidrofóbico (fase inversa) , y medios con anión débil y anión fuerte. Además, se descubrió, de manera inesperada, que esos medios cromatográficos basados en derivados poliméricos y funcionalizados derivados de polietilenimina de los mismos proporcionan características de separación, diferentes y únicas. En un aspecto de la presente invención, se proporcionan medios cromatográficos poliméricos para las bioseparaciones . Esta invención difiere de los medios cromatográficos poliméricos actuales en el método de preparación y características de los medios y esos medios cromatográficos actuales son intercambiadores de iones simples. También, los medios de la presente invención difieren de los medios basados en sílice actuales en términos de los métodos de preparación, composición, uso y desempeño. De manera sorprendente, los medios de modo mezclado poliméricos preparados de acuerdo a esta invención tienen mejores capacidades de separación y unión.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La presente invención es ilustrada por, pero sin ser limitada por, las figuras acompañantes en las cuales: La Figura 1 es una gráfica del perfil de elución, como el registrado por un detector de UV, de la separación de proteínas usando medios preparados de acuerdo al Ejemplo 1 y medios de sílice con PEÍ de acuerdo al procedimiento del Ejemplo 34; (Referencias numéricas de la figura: 1- Lisozima, 2- IgG, 3- BSA, 4- ß Lactoglobulina B y 5- ß Lactoglobulina A) . La Figura 2 es una gráfica del perfil de elución, de acuerdo a lo registrado por un detector de UV, de la separación de proteínas usando medios preparados de acuerdo al Ejemplo 9 y medios de sílice de modo mezclado de acuerdo al procedimiento del Ejemplo 35; (Referencias numéricas de la figura: (1) BSA, (2) IgG, (3) Citocromo-c y (4) Lisozima (Columna de 0.46x100, lml/min) . A: Acetato de sodio 20mM pH 6.2, B: Acetato de sodio ÍM, pH 6.2 (15 min. Gradiente lineal) ) . Las Figuras 3A y 3B son gráficas del perfil de elución, de acuerdo a lo registrado por un detector de UV, de la separación de proteínas usando medios preparados de acuerdo al Ejemplo 19 (Fig. 3A) y medios de sílice de acuerdo al procedimiento del Ejemplo 37 (Fig. 3B) ; (Referencias numéricas de las figuras: (1) Citocromo-C, (2) Ribonucleasa, (3) Lisozima, (4) Ovoalbúmina (Columna de 7.75x100, lml/min). A: Fosfato de sodio 25mM pH 7.0 + Sulfato de amonio 1.7M, B: Fosfato de sodio 25mM pH 7.0 (60 min. Gradiente lineal de 100% de A a 100% de B) ) . La Figura 4 es una gráfica del perfil de elución, de acuerdo a lo registrado por un detector de UV, de la separación de proteínas usando medios preparados de acuerdo al ejemplo 20 de acuerdo al procedimiento del Ejemplo 38; (Referencias numéricas de la figura: (1) Citocromo-C, (2) Ribonucleasa, (3) Lisozima, (4) Ovoalbúmina (Columna de 7.75x100, lml/min). A: Fosfato de sodio 25mM pH 7.0 + Sulfato de amonio 1.7M, B: Fosfato de sodio 25mM pH 7.0 (60 min. Gradiente lineal de 100% de A a 100% de B) ) . La Figura 5 es una gráfica del perfil de elución, de acuerdo a lo registrado por un detector de UV, de la separación de proteínas usando medios preparados de acuerdo al Ejemplo 22 de acuerdo al procedimiento del Ejemplo 39; (Referencias numéricas de la figura: (1) Citocromo-C, (2) Ribonucleasa, (3) Lisozima, (4) Ovoalbúmina (Columna de 7.75x100, lml/min). A: Fosfato de sodio 25mM pH 7.0 + Sulfato de amonio 1.7M, B: Fosfato de sodio 25mM pH 7.0 (60 min. Gradiente lineal de 100% de A a 100% de B) ) . La Figura 6 es una gráfica del perfil de elución, de acuerdo a lo registrado por un detector de UV, de la separación de proteínas usando medios preparados de acuerdo al Ejemplo 23 de acuerdo al procedimiento en el Ejemplo 40; (Referencias numéricas de la figura: (1) Citocromo-C, (2) Ribonucleasa, (3) Lisozima, (4) Ovoalbúmina (Columna de 7.75x100, lml/min). A: Fosfato de sodio 25mM pH 7.0 + Sulfato de amonio 1.7M, B: Fosfato de sodio 25mM pH 7.0 (60 min. Gradiente lineal de 100% de A a 100% de B) ) . La Figura 7 es una gráfica de la estabilidad del ácido de los medios preparados de acuerdo al Ejemplo 7 como lo determinado en el procedimiento del Ejemplo 41. (Muestra: 0.25 mg de IgG y 0.12 mg de lisozima, Rojo: columna inicial; Azul: 48 horas. Referencias numéricas de la figura: (1) BSA, (2) IgG de conejo (Columna de lcm x lOcm, lml/min) . A: MES 0.05 M, pH 5.6, B: A + Cloruro de sodio a 1 M (40 min.

Gradiente lineal de 100% de A a 100% de B)); y La Figura 8 es una gráfica de la estabilidad de base de los medios preparados de acuerdo al Ejemplo 7 como lo determinado de acuerdo al procedimiento del Ejemplo 42. (Muestra: 0.25 mg de IgG y 0.12 mg de lisozima, Rojo: columna inicial; Azul: 24 horas; Verde; 48 horas. (Referencias numéricas de la figura: (1) BSA, (2) IgG de conejo (Columna de lcm x lOcm, lml/min). A: MES 0.05 M, pH 5.6, B: A + Cloruro de sodio a 1 M (40 min. Gradiente lineal de 100% de A a 100% de B) ) .

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Esta invención se relaciona con la preparación y uso de medios cromatográficos poliméricos novedosos y preferiblemente medios cromatográficos poliméricos de modo mezclado. De acuerdo con la presente invención, los medios poliméricos son preparados usando partículas poliméricas derivadas con polietilenimina, y preferiblemente partículas poliméricas derivadas con polietilenimina funcionalizadas además con reactivos apropiados. Los materiales poliméricos usados para la separación cromatográfica de proteínas preferiblemente tendrán ciertas propiedades, como, 1) los tamaños de poro son suficientemente grandes para permitir una rápida difusión de moléculas tan grandes como proteínas hacia adentro y hacia fuera de las partículas de resina; 2) las interacciones entre las proteínas y el polímero no funcionalizado deben ser débiles para evitar "interacciones no específicas" y permitir la recuperación de la proteína deseada en altos rendimientos; 3) las partículas de resina deben ser rígidas para evitar la compresión y pérdida de velocidad de flujo bajo la presión encontrada en operaciones cromatográficas; y 4) la resina deberá ser estable químicamente bajo todas las condiciones encontradas en el proceso de separación. Las partículas de resina poliméricas a ser derivadas en la superficie con polietilenimina pueden ser cualesquier partículas de resina poliméricas adecuadas capaces de ser derivadas con polietilenimina y, con esos polímeros derivados de polietilenimina o derivados funcionalizados adicionales de los mismos siendo útiles como medios de separación cromatográfica. Los ejemplos de partículas de resina poliméricas adecuadas para la derivación con polietilenimina de acuerdo con esta invención incluyen, pero no se limitan a celulosa, agarosa, poliestirenos epoxidados o halogenados, poliacrilatos o polimetacrilatos epoxidados o halogenados, y polidivinilbencenos epoxidados o halogenados. Por ejemplo, los poli (met) acrilatos porosos), resinas altamente reticuladas basadas en monómeros (met) acrílicos que contienen enlaces dobles polimerizables múltiples, como el dimetacrilato de etilen glicol (US 4,118,347 de Showa Denko) , trimetacrilato de pentaeritritol (US 4,256,842 de Toyo Soda), trimetacrilato de trimetilol propano (US 4,582,860 de Rohm and Haas) o dimetacrilato de glicerol (US 2,254,634 de Mitsubishi) preparadas en presencia de un agente formador de poros, ha mostrado proporcionar materiales con las propiedades deseadas. Además, la adición de monómeros funcionales a la mezcla de polimerización proporciona un producto final con grupos funcionales a los cuales pueden unirse otras moléculas a través de la formación de enlaces covalentes. Los ejemplos de esos monómeros son el metacrilato de glicerol (grupos -OH) (US 2,254,634 de Mitsubishi, 1993), metacrilato de dimetilaminoetilo (aminas terciarias) o metacrilato de glicidilo (US 4,118,347 de Showa Denko, US 4,256,842 de Toyo Soda, US 4,582,860 de Rohm and Hass) , Como ejemplos de reactivos de funcionalización adecuados para la reacción con las partículas de resina poliméricas derivadas en la superficie con PEÍ son, por ejemplo los anhídridos de ácido como los anhídridos carboxílicos cíclicos como los anhídridos glutárico y succínico, anhídridos carboxílicos insaturados como el anhídrido maleico, agentes de sulfonación como los bisulfitos como el metabisulfito de sodio, cloruros o anhídridos de alquilo como el cloruro de butirilo y anhídrido acético o butírico y cloruros de alquilo que contengan funcionalidad de amonio cuaternario como el cloruro de (3-cloro-2-hidroxipropil) rimetilamonio, y mezclas de esos reactivos funcionalizados . En una modalidad de esta invención, un intercambiador aniónico con sitios de amina primaria, secundaria y terciaria mezclados se preparan haciendo reaccionar polietilenimina con un soporte polimérico que contiene grupos epoxi y halo como grupos cloro, bromo, yodo. Ese soporte polimérico puede ser cualquier polímero sintético adecuado o resina polimérica natural como poli (met) acrilato, celulosa, poliestiren-divinilbenceno y agarosa. Los ejemplos de esas resinas comercialmente disponibles son Tosoh Biosciences Toyopearl AF-epoxy 650M, Sepharose 6B activada con epoxi. Esos materiales pueden hacerse reaccionar con uno del grupo amino terminal de la polietilenimina de varios pesos moleculares a través de la formación de grupos alfa-hidroxi amino químicamente adecuados . Algunas de las propiedades de los materiales preparados de esa manera, de acuerdo a los siguientes ejemplos 1 hasta 5, se resumen en la Tabla 1. En una segunda modalidad, los medios de modo mezclado con sitios de intercambio de anión débil y catión débil son preparados haciendo reaccionar las perlas poliméricas funcionalizadas con PEÍ con anhídridos de ácido carboxílico cíclico, como el anhídrido glutárico o succínico en los siguientes ejemplos 6 a 10. En una tercera modalidad, los medios de modo mezclado que tienen sitios de anión débil, catión débil y catión fuerte fueron preparados haciendo reaccionar el polímero derivado con PEÍ con un anhídrido de ácido carboxílico insaturado seguido por sulfonación, como se describe en los ejemplos 11 hasta 13. En una cuarta modalidad, los medios de modo mezclado que tienen sitios de anión débil e hidrofóbicos (fase inversa) fueron preparados haciendo reaccionar el polímero derivado con PEÍ con cloruro de alquilo (Ejemplos 14 hasta 18) o anhídridos ácidos monobásicos (Ejemplos 19 hasta 24) . Las reacciones con cloruro de butirilo fueron efectuadas durante 2 horas a temperatura ambiente usando tolueno o dioxano como solvente. Se usó trietilamina para depurar el ácido clorhídrico producido como subproducto de la reacción. En una quinta modalidad, los medios de modo mezclado se obtuvieron por la reacción de resina recubierta con PEÍ con anhídrido butírico conducida en l-metoxi-2-propanol durante 3 hr a 60 °C como se expone en los siguientes ejemplos 20-22. Las resinas de base débil/fase inversa de modo mezclado donde la porción hidrofóbica es un grupo metilo o una combinación de grupos metilo y butilo puede ser preparada usando anhídrido acético o la adición secuencial de anhídrido butírico y acético, como se muestra en el Ejemplo 24 (anhídrido acético) o en los Ejemplos 20 y 23 (anhídridos mezclados) respectivamente. Por lo tanto, es posible hacer variar y seleccionar la hidrofobicidad apropiada usando uno hasta una combinación de reactivos. En una sexta modalidad, los medios de modo mezclado que tienen sitios de anión débil y anión fuerte (amonio cuaternario) fueron preparados haciendo reaccionar el polímero derivado con PEÍ con cloruros de alquilo que contienen funcionalidad de amonio cuaternario terminal. De manera más particular, el polímero derivado con PEÍ se hace reaccionar con cloruro de (3-cloro-2-hidroxipropil) -trimetilamonio en hidróxido de sodio acuoso a 70-80°C como se muestra en los siguientes Ejemplos 25 a 30. De acuerdo con la presente invención, se ha descubierto, de manera inesperada, que esos medios cromatográficos de modo mezclado poliméricos ofrecen mejor capacidad de separación así como una alta capacidad y estabilidad. Por ejemplo, los medios de intercambio aniónico de modo mezclado poliméricos pueden separar lisozima, inmunoglobulina G, albúmina sérica bovina, beta-lactoglobulina A y beta-lactoglobulina B, mientras que los medios de PEÍ -sílice no pueden separar todas esas proteínas como se muestra en la Figura 1. Los medios de intercambio catiónico de modo mezclado pueden separar BSA, IgG, Citocromo C y Lisozima eficientemente, como se muestra en la Figura 2, mientras que los medios de sílice de modo mezclado no pueden separar todas esas proteínas .

EJEMPLOS Ejemplo 1 Se colocan 12 g de polímero de metacrilato que contiene epoxi con un tamaño de partícula promedio de 35 micrómetros de diámetro y 250 ml de dioxano en un matraz de fondo esférico de ÍL equipado con un embudo, agitador, condensador de reflujo y entrada de presión de nitrógeno positiva y se agita durante 30 minutos para permitir que la resina se hinche. Se agregan 20 g de polietilenimina (PEÍ, peso molecular promedio de 600 Daltons) y el embudo se enjuaga con 150 ml adicionales de dioxano. La mezcla agitada es sometida a reflujo durante la noche. Después de permitir que la mezcla enfríe, la mezcla es transferida a un matraz de filtración, drenada, lavada una vez con dioxano, tres veces con metanol y secada bajo vacío a 60°C. Análisis elemental: 57.8% C, 7.4% H y 5.6% N.

Ejemplo 2 Se colocan 5 g de polímero de metacrilato que contiene epoxi y 150 ml de dioxano en un matraz de fondo esférico de 500 ml equipado con un agitador y condensador de reflujo. Se agregan 30 g de PEÍ (peso molecular promedio de 1200 Daltons) y la mezcla es sometida a reflujo durante la noche. Después de dejar enfriar, la mezcla es transferida a un matraz de filtración, drenada, lavada dos veces con dioxano, tres veces con metanol y secada. Análisis elemental: 55.7% C, 7.8% H, 5.5% N Ejemplo 3 Se colocan 5 g de polímero de metacrilato que contiene epoxi y 150 ml de una mezcla 50/50 de dioxano y agua en un matraz de fondo esférico de 500 ml equipado con un agitador y reflujo. Se agregan 30 g de PEÍ (peso molecular promedio de 1200 Daltons) y la mezcla es sometida a reflujo durante la noche (89°C) . Después de dejar enfriar, la mezcla es transferida a un matraz de filtración, drenada, lavada dos veces con dioxano, tres veces con metanol y secada. El análisis elemental indica que el producto final contiene: 57.5% C, 7.4% H, 2.5% N Ejemplo 4 Se colocan 5 g de polímero de metacrilato que contiene epoxi y 100 ml de una solución al 30% en peso de PEÍ con un peso molecular promedio de 10,000 Daltons en dioxano en un matraz de fondo esférico de 250 ml equipado con un agitador, entrada de nitrógeno y condensador de reflujo y la mezcla agitada es sometida a reflujo durante la noche. Después de dejar enfriar, la mezcla es transferida a un matraz de filtración, drenada, lavada tres veces con agua a 60°C, tres veces con metanol y secada durante la noche en un horno al vacío a 60°C. El análisis elemental indica que el producto final contiene 56.5% C, 7.8% H, 6.4% N Ejemplo 5 Se colocan 5 g de resina metacrílica que contiene epoxi y 100 ml de una solución al 30% en peso de PEÍ con un peso molecular promedio de 10,000 Daltons en agua en un matraz de fondo esférico de 250 ml equipado con un agitador y condensador de reflujo y la mezcla agitada es sometida a reflujo durante 17 ¡ horas. Después de dejar enfriar, la mezcla es transferida a un matraz de filtración, drenada, lavada tres veces con agua, tres veces con metanol y secada durante la noche en un horno al vacío a 60 °C. El análisis elemental indica que el producto final contiene 56.9% C, 7.5% H y 3.2% N. Como los resultados lo indican en la Tabla 1, la presencia de agua en el sistema tiene un efecto dañino sobre la incorporación de nitrógeno, aunque se obtienen contenidos de nitrógeno similares cuando PEÍ de varios pesos moleculares se hacen reaccionar con la resina en dioxano seco (además a una relación de PEÍ a polímero mas baja entonces en el ejemplo 1) .

Tabla 1. Efecto del solvente y el peso molecular de PEÍ sobre la incorporación de nitrógeno Como lo indican mejor los resultados en la Tabla 1, las reacciones efectuadas en dioxano puro, en oposición a la mezcla de dioxano/agua o agua pura, da un mayor grado de funcionalización, de acuerdo a lo indicado por el contenido de nitrógeno del producto final. Cuando es usado dioxano puro como solvente (primera hilera de la Tabla 1) no parece existir un nivel significativamente alto de introducción de nitrógeno a medida que el peso molecular de la PEÍ se incrementa de 600 a 10,000 Daltons.

Ejemplo 6 30 g de polímero de PEÍ preparado como en el ejemplo 1 se lavan con dos veces su volumen de etanol al 100% y dos veces con su volumen de 1-metoxi-2 -propanol para remover cualquier humedad residual. El polímero es entonces suspendido en 450 ml de 1-metoxi-2-propanol, transferido el matraz equipado con un agitador en la parte superior, condesandor de reflujo y entrada de presión de nitrógeno positiva, y calentado a 60°C. Después de agregar una solución de 19.43 g de anhídrido glutárico al 95% (1 eq, sobre la base del contenido de nitrógeno de la resina de PEÍ) la temperatura se mantiene en 60 +/- 2°C durante 2 ^ horas. La mezcla de reacción es entonces transferida a un matraz de filtración, drenada y el sólido residual lavado 1 vez con 100 ml de 1-metoxi-2 -propanol, 2 veces con 100 ml de metanol y 2 veces con 100 ml de solución de almacenamiento (etanol: agua 20:80 v/v, o acetato de sodio 100 mM pH 4.5 con alcohol bencílico al 2%) . El producto fue almacenado en la solución de almacenamiento respectiva para la caracterización y para la separación cromatográfica de las proteínas. El análisis elemental indica que el producto final contiene: %C=55.1, %N=4.6.

Ejemplo 7 73.7 g del polímero recubierto con PEÍ preparado como en el ejemplo 1, 225 ml de 1-metoxi-2 -propanol y 14.4 g de anhídrido succínico son calentados a 60 +/- 2°C y mantenida a esa temperatura durante 2 y¡ horas. La mezcla de reacción es entonces transferida a un matraz de filtración, drenada, y el sólido residual es lavado 1 vez con 100 ml de 1-metoxi-2 -propanol, 2 veces con 100 ml de metanol y 2 veces con 100 ml de solución amortiguadora de almacenamiento como se describe en el Ejemplo 5. El análisis elemental indica que el producto final contiene: 53.08% C, 7.13% H y 4.86% N Ejemplo 8 La reacción fue conducida como en el Ejemplo 7 excepto que la carga de anhídrido succínico es de 17.34 g. El análisis elemental indica que el producto final contiene: 53.18% C, 7.97% H y 5.18% N Ejemplo 9 11 g del polímero recubierto con PEÍ y preparado como en el Ejemplo 1 se lavaron con dos veces su volumen de etanol al 100% y dos veces con su volumen de dioxano para remover cualquier humedad residual. La resina es entonces suspendida en aproximadamente 200 ml de dioxano, transferida a un matraz de tres bocas equipado con un tubo de entrada de nitrógeno y calentada a 50-60°C. Después de una hora, se agregan 7 g de anhídrido glutárico y la temperatura es mantenida a 60 +/- 2°C durante 2 1/2 horas. La mezcla de reacción es entonces transferida a un matraz de filtración, drenada, y el sólido residual lavado tres veces con dioxano, tres veces con metanol y secado bajo vacío. El análisis elemental indica que el producto final contiene: 56.64%C, 7.54% H y 4.36% N.

Ejemplo 10 La reacción se condujo como en el Ejemplo 9 excepto que se usaron 10 g de polímero de PEÍ preparado de acuerdo al Ejemplo 1 y 6.6 g de anhídrido succínico. El análisis elemental indica que el producto final contiene: 54.46% C, 7.96% H y 4.6% N.

Tabla 2. Preparación de medios con sitios de intercambio de anión y catión débil. l-M-2-P= 1-metoxi-2-propanol Ejemplo 11 Se colocan 86.5 g de polímero de PEÍ preparado de acuerdo al Ejemplo 1 y 865 ml de metoxi -2 -propanol en un matraz de fondo esférico de 2 Litros equipado con un agitador y condensador de reflujo y se agita durante 30 min. Se agregan 23.7 g de anhídrido maléico y la mezcla es agitada durante 2.5 hr a 60°C. Después de dejar que la mezcla enfríe, la mezcla es transferida a un matraz de filtración, drenada, lavada una vez con metoxi-2-propanol , tres veces con agua, tres veces con metanol. El análisis elemental indica que el producto final contiene: %C 55.6, %N 4.9% H 7.1, %S 0.

Ejemplo 12 Se colocan 86.5 g de resina preparada como en el Ejemplo 11 se calienta en 900 ml de hidróxido de sodio 0.01 N en presencia de 190 g de meta-bisulfito de sodio durante 6 hr a 80 +/-2°C. Después de dejar que la mezcla de reacción enfríe, la mezcla es transferida a un matraz de filtración, drenada, lavada una vez con metoxi- 2 -propanol, tres veces con agua, tres veces con metanol y almacenada en amortiguador de almacenamiento para su uso adicional. El análisis elemental indica que el producto final contiene: %C 49.8, %N 4.6 %H 6.8, %S 2.1.

Ejemplo 13 La reacción se condujo como en el Ejemplo 12 excepto que la reacción se efectúo durante 20 hr a 80 +/-2°C. El análisis elemental indica que el producto final contiene: %C 50.2, %N 4.5% H 6.8, %S 2.1. La comparación del contenido de azufre de las muestras obtenidas después de 8 horas de reacción (3.8% de S, Ejemplo 12) y 20 hrs. de reacción (3.40% de S, ejemplo 13) indica que la reacción es completa después de 8 horas.

Ejemplo 14 30 g de PEÍ funcionalizada preparada de acuerdo al Ejemplo 1 se lavan dos veces con 120 ml de etanol al 100% y dos veces con 120 ml de tolueno para remover la humedad residual. El material fue entonces suspendido en 300 ml de tolueno, 9.29 g de cloruro de butirilo (1 eq, sobre la base del contenido de nitrógeno de la resina) y se agregaron 9.24 g de trietilamina y la reacción se dejó proceder durante 2 horas a 25 +/-2°C. La resina fue entonces transferida a un matraz de filtración y lavada con 300 ml de tolueno, 300 ml de metanol, dos veces con 300 ml de agua de DI, tres veces con 300 ml de metanol y dos veces con 300 ml de amortiguador de almacenamiento pH 5 (acetato de sodio lOmM, pH 4.5) . El análisis elemental indica que el producto final contiene: 53.7% C, 7.5% H y 5.6% N.

Ejemplo 15 La reacción se condujo como en el Ejemplo 14, excepto que el solvente es 450 ml de dioxano. El análisis elemental indica que el producto final contiene: 54.7% C, 8.0% H y 5.5% N.

Ejemplo 16 La reacción se condujo como en el Ejemplo 14, excepto que se usaron 13.3 g de cloruro de butirilo y 13.2 g de trietilamina. El análisis elemental indica que el producto final contiene: 53.6% C, 7.9% H y 4.5% N.

Ejemplo 17 La reacción se condujo como en el Ejemplo 14, excepto que se usaron 19 g de cloruro de butirilo y 18 g de trietilamina. El análisis elemental indica que el producto final contiene: 55.4% C, 7.8% H y 4.2% N.

Ejemplo 18 La reacción se condujo como en el Ejemplo 14, excepto que se usaron 25.3 g de cloruro de butirilo y 24 g de trietilamina. El análisis elemental indica que el producto final contiene: 55.0% C, 7.9% H y 4.5% N. Algunos de los resultados obtenidos usando tolueno como el solvente se resumen en la Tabla 3.

Tabla 3. Reacción de resina recubierta con PEÍ con cloruro de butirilo en tolueno (2 hr @ RT) .

Como lo indican los resultados en la Tabla 3, el incremento de las cantidades de reactivo da como resultado un incremento en el nivel de funcionalización (como es indicado por la disminución correspondiente en el contenido de nitrógeno del producto) .

Ejemplo 19 60 g de polímero funcionalizado con PEÍ y preparado como en el Ejemplo 1 e hinchado en 200 ml de l-metoxi-2-propanol, 600 ml de 1-metoxi-2 -propanol , 56.3 g de anhídrido butírico (1.5 de exceso molar) y 36 g de trietilamina se hacen reaccionar durante 3 horas a 60 +/-2°C. La mezcla de reacción es transferida a un matraz de filtración, drenada, lavada una vez con 500 ml de 1-metoxi-2-propanol, una vez con 500 ml de metanol, dos veces con 500 ml de agua de DI y dos veces con 500 ml de amortiguador de almacenamiento. El análisis elemental indica que el producto final contiene: 54.6% C, 7.9% H y 4.8% N.

Ejemplo 20 60 g de polímero funcionalizado con PEÍ y preparado como en el Ejemplo 1 e hinchado en 200 ml de l-metoxi-2-propanol, 600 ml de 1 -metoxi -2 -propanol, 6.2 g de anhídrido butírico y 4.0 g de trietilamina se hacen reaccionar durante 3 horas a 60 +/-2°C. En ese punto, se agregaron 24.2 g de anhídrido acético y la reacción se dejó proceder a la misma temperatura durante 3 horas adicionales. La mezcla de reacción es transferida a un matraz de filtración, drenada, lavada una vez con 500 ml de 1 -metoxi -2 -propanol, una vez con 500 ml de metanol, dos veces con 500 ml de agua de DI, y dos veces con 500 ml de amortiguador de almacenamiento. El análisis elemental indica que el producto final contiene: 53.7% C, 7.7% H y 4.7% N.

Ejemplo 21 La reacción se condujo como en el Ejemplo 19, excepto que se usaron 6.26 g de anhídrido butírico y 4.0 g de trietilamina. El análisis elemental indica que el producto final contiene: 53.7% C, 7.9% H y 4.8% N.

Ejemplo 22 La reacción se condujo como en el Ejemplo 19, excepto que se usaron 1.52 g de anhídrido butírico y 1.0 g de trietilamina. El análisis elemental del producto es: 54.6% C, 8.3% H y 5.0% N. Algunos de los resultados se resumen en la Tabla 4.

Tabla 4. Reacción de resina recubierta con PEÍ y con anhídrido butírico en 1-metoxi -2 -propanol (3 hr. @ 60°C).

La comparación de los resultados en las Tablas 3 y 4 muestra que los niveles de sustitución similares a aquéllos obtenidos con cloruro de butirilo pueden ser logrados con anhídrido butírico usando cantidades estequiométricas considerablemente menores de reactivo.

Ejemplo 23 La reacción fue conducida como en el Ejemplo 20 excepto que se usan 1.52 g de anhídrido butírico y 1.0 g de trietilamina y 10.7 g de anhídrido acético. El análisis elemental indica que el producto final contiene: 55.4% C, 7.9% H y 4.9% N.

Ejemplo 24 60 g de polímero funcionalizado con PEÍ preparado como en el Ejemplo 1 se hincharon en 20 ml de l-metoxi-2-propanol, 500 ml de 1-metoxi-2 -propanol y 14.07 g de anhídrido acético se hacen reaccionar durante 6 horas a 60 +/- 2°C. La mezcla de reacción es transferida a un matraz de filtración, drenada, lavada una vez con 500 ml de l-metoxi-2-propanol, 2 veces con 500 ml de NaOH 0.1N, dos veces con 500 ml de agua DI y 2 veces con 500 ml de amortiguador de almacenamiento. El análisis elemental indica que el producto final contiene: 53.8% C, 7.5% H y 5.3% N.

Ejemplo 25 80 g de polímero funcionalizado con PEÍ, como en el Ejemplo 1 se hacen reaccionar durante 8 horas a 80°C con 59 g de una solución al 60% de cloruro de (3-cloro-2-hidroxipropil) trimetil amonio en 500 ml de hidróxido de sodio 0.5 N. La mezcla de reacción es transferida entonces a un matraz de filtración y lavada dos veces con hidróxido de sodio 0.1 N, dos veces con agua DI y una vez con amortiguador de almacenamiento. Después de lavar y secar, la resina tiene el siguiente análisis elemental: 54.2% C, 8.4% H, y 5.9% N.

Ejemplo 26 La reacción se condujo como en el Ejemplo 25 excepto que la solución de hidróxido de sodio es 0.05N. Después de lavar y secar, la resina tiene el siguiente análisis elemental: 51.9% C, 7.6% H, y 5.3% N.

Ejemplo 27 La reacción fue conducida como en el Ejemplo 25 excepto que la reacción continuó durante 16 hr . Después de lavar y secar, la resina tiene el siguiente análisis elemental: 53.4% C, 8.4% H, y 5.7% N.

Ejemplo 28 La reacción se condujo como en el Ejemplo 26 excepto que la reacción continuó durante 16 hr . Después de lavar y secar, la resina tiene el siguiente análisis elemental: 52.8% C, 8.1% H, y 5.7% N.

Ejemplo 29 La reacción se condujo como en el Ejemplo 25 excepto que la relación de solución al 60% de cloruro de (3-cloro-2 -hidroxipropil) trimetil amonio a resina es de 0.4 en lugar de 0.73. Después de lavar y secar, la resina tiene el siguiente análisis elemental: 53.72% C, 7.32% H, y 6.04% N.

Ejemplo 30 La reacción se condujo como en el Ejemplo 25 excepto que la relación de solución al 60% de cloruro de (3-cloro-2-hidroxipropil) trimetil amonio a resina es de 1.2 en lugar de 0.73. Después de lavar y secar, la resina tiene el siguiente análisis elemental: 53.72% C, 7.32% H, y 6.04% N.

Tabla 5. Reacción de resina recubierta con PEÍ con cloruro de (3 -cloro-2 -hidroxipropil) trimetilamonio Ejemplo 31 160 g de polímero funcionalizado con PEÍ preparado de acuerdo al Ejemplo 1 se hacen reaccionar durante 5 horas @ 40°C con 111.8 g de formaldehído, 400 ml de acetonitrilo y 25.9 g de cianoborohidruro de sodio. Después de la reacción, el polímero fue lavado con 480 ml de acetonitrilo, 480 ml de agua DI tres veces con 480 ml de metanol y se almacenó en amortiguador de almacenamiento para su uso adicional (Análisis elemental % C= 55.2, %N = 5.8) Ejemplo 32 25 mg de polímero preparado de acuerdo al Ejemplo 31 y 200 ml de acetonitrilo fueron cargados en un autoclave (reactor a presión montado en el laboratorio Parr serie 4500 con controlador de temperatura Parr 4840) . Mientras se agitaba el polímero a 120 rpm, se cargó el gas de cloruro de metilo y se presurizó a 60 psi. La reacción continuó durante 5 horas a 80°C. Después de la reacción, el producto fue lavado con 60 ml de acetonitrilo, 120 ml de hidróxido de sodio 0.1N, 120 ml de agua DI, 240 ml de amortiguador de almacenamiento y se almacenó en amortiguador de almacenamiento .

Ejemplo 33 71 g de polímero modificado con PEÍ preparado de acuerdo al Ejemplo 1 se mezclaron con 500 ml de hidróxido de sodio 0.5 N y se hicieron reaccionar con 49 g de cloruro de 3- (dimetilamino) propilo mientras se agitaba a 50-100 rpm a 80°C durante 8 horas. Después de la reacción, el producto fue lavado dos veces con 500 ml de hidróxido de sodio, dos veces con 500 ml de agua DI, 2 veces con 500 ml de amortiguador de almacenamiento y se almacenó en amortiguador para su uso adicional. Análisis elemental - % C: 55.4, %N: 6.2.

Ejemplo 34 Separación cromatográfica de proteínas Medios cromatográficos preparados como en el Ejemplo 1 y medios de sílice con PEÍ de JT Baker (Número de producto 7264, lote N16084) empaquetadas en una columna cromatográfica de 4.6x100 mm. 200 microlitros de una solución de 1 mg/ml de lisozima, 2 mg/ml de inmunoglobulina G de conejo, 2 mg/ml de albúmina sérica de bovino y 2 mg/ml de cada una de beta- lactoglobulina A y B en un amortiguador de acetato de sodio 20 mM a pH 6.2 se inyectaron en la columna y se eluyeron usando una velocidad de flujo de 1 ml/min y un gradiente de 30 min del 100% de amortiguador acetato de sodio mM a pH 6.2 hasta 100% de amortiguador de acetato de sodio 1.0 M a pH 6.2. La elución de las proteínas es registrada por un detector de UV a 280 nm (Figura 1) .

Ejemplo 35 Separación cromatográfica de proteínas Medios cromatográficos preparados como en el Ejemplo 9 son empaquetados en una columna cromatográfica de 4.6 x 100 mm. 200 microlitros de una solución de 4 mg/ml de BSA, 2 mg/ml de IgG de conejo, 2 mg/ml de citocromo C y 2 mg/ml de solución de lisozima en amortiguador de acetato de sodio 20 mM a pH 6.2 se inyectaron en la columna y se eluyeron usando una velocidad de flujo de 1 ml/min y un gradiente de 40 minutos del 100% de amortiguador acetato de sodio 20 mM a pH 6.2 a 100% del mismo eluyente pero con un contenido de 1 mol por litro de acetato de sodio, a pH 6.2. La elución de las proteínas por los medios de este ejemplo y para un medio de modo mezclado basado en sílice comparativa (Producto no. 7269 de JT Baker) se registró por un detector de UV a 280 nm (Figura 2) .

Ejemplo 36 Comparación de la Capacidad Se midió y comparó la capacidad de los medios cromatográficos preparados de acuerdo al Ejemplo 9 y los productos basados en sílice. Se empaquetó una columna (4.6 mm x 50 mm) con los medios. Se aplicó solución de IgG (1 mg/ml) en acetato de sodio 20 mM a pH 5.6, 6.2 y 6.9 a la columna a una velocidad lineal variable (cm/hr) . La penetración se determinó verificando la UV a 280 nm. La capacidad de penetración de los medios en la columna se determinó a una penetración del 10% (tabla 7) .

Tabla 7 : Capacidad de Penetración de Medios de Modo Mezclado y Medios de Sílice Ejemplo 37 Los medios cromatográficos preparados de acuerdo al Ejemplo 19 y los medios de sílice (producto no. 7285 de J T Baker) fueron empaquetados en una columna de 7.75 mm x 100 mm. Se inyectaron 200 µl de solución de 2 mg/ml de solución de Citocromo C, ribonucleasa, Lisozima y Ovalbúmina en fosfato de sodio 25 mM pH 7.0 + sulfato de amonio 1.7 M. La proteína fue eluída de la columna por un gradiente lineal de 60 minutos de 100% de fosfato de sodio 25 mM + sulfato de amonio 1.7M hasta 100% de fosfato de sodio 25 mM pH 7.0. El perfil de elución fue verificado por UV @ 280 nm (Figuras 3A y 3B) .

Ejemplo 38 Los medios cromatográficos preparados de acuerdo al Ejemplo 20 fueron empaquetados en una columna de 7.75 mm x 100 mm. Se inyectaron 200 ul de solución de 2 mg/ml de solución de Citocromo C, ribonucleasa, Lisozima y Ovalbúmina en fosfato de sodio 25 mM pH 7.0 + sulfato de amonio 1.7 M. La proteína fue eluida de la columna por un gradiente lineal de 60 minutos de 100% de fosfato de sodio 25 mM + sulfato de amonio 1.7 M hasta 100% de fosfato de sodio 25 mM pH 7.0. El perfil de elución fue verificado por UV @ 280 nm (Figura 4) .

Ejemplo 39 Los medios cromatográficos preparados de acuerdo al ejemplo 22 fueron empaquetados en una columna de 7.75 mm x 100 mm. Se inyectaron 200 ul de solución de 2 mg/ml de solución de Citocromo C, ribonucleasa, Lisozima y Ovalbúmina en fosfato de sodio 25 mM pH 7.0 + sulfato de amonio 1.7 M. La proteína fue eluida de la columna por un gradiente lineal de 60 minutos de 100% de fosfato de sodio 25 mM + sulfato de amonio 1.7 M hasta el 100% de fosfato de sodio 25 mM pH 7.0. El perfil de elución fue verificado por UV @ 280 nm (Figura ) .

Ejemplo 40 Los medios cromatográficos preparados de acuerdo al ejemplo 23 fueron empaquetados en una columna de 7.75 mm x 100 mm. Se inyectaron 200 ul de solución de 2 mg/ml de solución de Citocromo C, ribonucleasa, Lisozima y Ovalbúmina en fosfato de sodio 25 mM pH 7.0 + sulfato de amonio 1.7 M. La proteína fue eluida de la columna por un gradiente lineal de 60 minutos de 100% de fosfato de sodio 25 mM + sulfato de amonio 1.7 M hasta el 100% de fosfato de sodio 25 mM pH 7.0. El perfil de elución fue verificado por UV @ 280 nm (Figura 6) .

Ejemplo 41 Los medios poliméricos preparados de acuerdo al Ejemplo 7 fueron empaquetados en una columna de 1.0 cm x lOcm. Primero la columna fue equilibrada haciendo pasar 10 volúmenes de la columna de amortiguador A (MES 0.05 M, pH 5.6) . Después del equilibrio se inyectan 0.5 ml de la solución de proteína que contiene globulina de conejo (0.5 mg/ml) y lisozima (0.25 mg/ml) . Las proteínas fueron eluidas de la columna corriendo 40 minutos de gradiente lineal de 100% de amortiguador A hasta 100% de amortiguador B (cloruro de sodio ÍM en amortiguador A) . Después del primer ensayo de separación de proteína, la columna fue lavada haciendo circular 500 ml de ácido fosfórico 10 mM a 1 ml/min durante 48 horas. Después de lavar se llevó a cabo la separación de proteína nuevamente para determinar la estabilidad en ácido de la columna (Figura 7) . Estos datos indican una excelente estabilidad de los medios de modo mezclado poliméricos bajo condiciones acidas, puesto que no existe cambio en el tiempo de retención de IgG y lisozima antes y después del lavado de la columna con ácido fosfórico durante hasta 48 horas.

Ejemplo 42 Los medios poliméricos preparados de acuerdo al Ejemplo 7 fueron empaquetados en una columna de 1.0 cm x lOcm. Primero la columna fue equilibrada haciendo pasar 10 volúmenes de la columna de amortiguador A (MES 0.05 M, pH 5.6). Después del equilibrio se inyectan 0.5 ml de la solución de proteína que contiene globulina de conejo (0.5 mg(ml) y lisozima (0.25 mg/ml). Las proteínas fueron eluidas de la columna corriendo 40 minutos de gradiente lineal de 100% de amortiguador A hasta 100% de amortiguador B (cloruro de sodio ÍM en amortiguador A) . Después del primer ensayo de separación de proteína, la columna fue lavada haciendo circular 500 ml de hidróxido de sodio 0.1 M a 1 ml/min durante 24 y 48 horas. Después de lavar se llevó a cabo la separación de proteína nuevamente para determinar la estabilidad en base de la columna (Figura 8) . Estos datos indican una excelente estabilidad de los medios de modo mezclado poliméricos bajo condiciones básicas, puesto que no existe cambio en el tiempo de retención de IgG y lisozima antes y después del lavado de la columna con ácido fosfórico durante hasta 48 horas.

Ejemplo 43 Se midió y comparó la capacidad de los medios cromatográficos preparados de acuerdo a los Ejemplos 1, 25, 26, 27, 28, 29, 30 y 32. Se empaquetó una columna (4.6 mm x 50mm) con los medios. Se aplicó solución de BSA (1 mg/ml) en 20 mM CAPS (ácido 3- [ciclohexilamino] -1-1-propan sulfónico) pH 11 a la columna a una velocidad de flujo de 1 ml/min. La penetración se determinó verificando la UV a 280 nm. La capacidad de penetración de los medios en la columna fue determinada a una penetración del 10%. Después de cargar BSA en las columnas, las columnas fueron lavadas con amortiguador de CAPS y entonces el BSA absorbido fue eluido usando cloruro de sodio 1 M para calcular la capacidad de saturación (Tabla 8) .

Tabla 8: Capacidad de Comparación La invención ha sido descrita aquí con referencia a las modalidades específicas de la misma. Se apreciará que pueden hacerse cambios, modificaciones y variaciones sin apartarse del espíritu y alcance del concepto inventivo descrito aquí. En consecuencia, se pretende abarcar todos aquellos cambios como modificaciones y variaciones que caigan dentro del espíritu y alcance de las reivindicaciones anexas. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES
Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones. 1. Medios cromatográficos, caracterizados porque comprenden partículas de resina poliméricas epoxidadas o halogenadas derivadas por la reacción con polietilenimina sobre la superficie del polímero. 2. Los medios cromatográficos de conformidad con la reivindicación 1, caracterizados porque las partículas poliméricas comprenden polímeros seleccionados del grupo que consiste de celulosa, agarosa, poliestirenos epoxidados o halogenados, poliacrilatos o polimetacrilatos epoxidados o halogenados, y polidivinilbencenos epoxidados o halogenados.
3. Los medios cromatográficos de conformidad con la reivindicación 2, caracterizados porque las partículas poliméricas comprenden polímeros seleccionados del grupo que consiste de poliestirenos epoxidados o halogenados, poliacrilatos o polimetacrilatos epoxidados o halogenados, y polidivinilbencenos epoxidados o halogenados.
4. Los medios cromatográficos de conformidad con la reivindicación 1, caracterizados porque las partículas de resina polimérica derivadas con polietilenimina sobre la superficie del polímero son funcionalizadas por la reacción de un reactivo de funcionalización con grupos amino terminales de la polietilenimina sobre la superficie de la resina polimérica.
5. Los medios cromatográficos de conformidad con la reivindicación 3, caracterizados porque las partículas de resina polimérica derivadas con polietilenimina sobre la superficie del polímero son funcionalizadas por la reacción de un reactivo de funcionalización con grupos amino terminales de la polietilenimina sobre la superficie de la resina polimérica.
6. Los medios cromatográficos de conformidad con la reivindicación 4, caracterizados porque el agente de funcionalización es seleccionado del grupo que consiste de: anhídridos de ácido, agentes de sulfonación, cloruros de alquilo, y cloruros de alquilo que contienen funcionalidad de amonio cuaternario, y mezclas de los mismos.
7. Los medios cromatográficos de conformidad con la reivindicación 6, caracterizados porque el reactivo de funcionalización es seleccionado del grupo que consiste de: anhídridos carboxílicos cíclicos, anhídridos carboxílicos insaturados, bisulfitos, cloruros de alquilo, anhídridos de alquilo, cloruros de alquilo que contienen funcionalidad de amonio cuaternario y mezclas de los mismos.
8. Los medios cromatográficos de conformidad con la reivindicación 7, caracterizados porque el reactivo de funcionalización es seleccionado del grupo que consiste de: anhídrido glutárico, anhídrido succínico, anhídrido maléico, meta-bisulfito de sodio, cloruro de butirilo, anhídrido acético, anhídrido butírico, cloruro de (3-cloro-2-hidroxipropil) trimetilamonio, y mezclas de los mismos.
9. Los medios cromatográficos de conformidad con la reivindicación 1, caracterizados porque los medios son de modo mezclado.
10. Los medios cromatográficos de conformidad con la reivindicación 4, caracterizados porque los medios son de modo mezclado.
11. Los medios cromatográficos de conformidad con la reivindicación 10, caracterizados porque los medios de modo mezclado son seleccionados del grupo que consiste de medios con sitios de intercambio de amina primaria, secundaria y terciaria mezclados, medios con sitios de intercambio de anión débil y catión débil, medios con sitios de intercambio con anión débil y catión débil, medios con sitios de intercambio de anión débil, catión débil y catión fuerte, medios con sitios de intercambio de anión débil e hidrofóbico (fase inversa) y medios con anión débil y anión fuerte .
12. Una columna para cromatografía, caracterizada porque está empaquetada con medios cromatográficos de conformidad con las reivindicaciones 1 a 11.
13. Un proceso para la separación de componentes de una solución, caracterizado porque comprende hacer pasar la solución a través de una columna cromatográfica de conformidad con la reivindicación 12 y los componentes eluyentes de la solución.
14. El proceso de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque la solución es una solución que contiene proteínas.