JP2004189627A

JP2004189627A - リガンドの脱離可能なリガンド−カチオン性ポリマー複合体および、該ポリマー複合体を固定化させた材料およびそれを用いたカラム

Info

Publication number: JP2004189627A
Application number: JP2002356553A
Authority: JP
Inventors: Tetsuji Kondo; 哲司近藤; Atsuko Mizoguchi; 敦子溝口; Yoshihiro Aga; 善広英加
Original assignee: Toray Industries Inc
Current assignee: Toray Industries Inc
Priority date: 2002-12-09
Filing date: 2002-12-09
Publication date: 2004-07-08

Abstract

【課題】特定の細胞を簡単、大量に回収するためのリガンド−カチオン性ポリマー複合体およびそれを用いた材料を提供する。
【解決手段】カチオン性ポリマーとリガンドを含むリガンド−カチオン性ポリマー複合体であって、複合化したリガンドを外部刺激によって脱離できるリガンド−カチオン性ポリマー複合体。
【選択図】なし

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、血液中の病因物質や有用物質を除去回収したり、あるいは幹細胞やリンパ球系の細胞などの特定の細胞を分離回収する材料のために利用でき、さらに該材料を再利用するため、外部刺激により材料に固定化されたリガンドが脱離することを特徴とするリガンド−カチオン性ポリマー複合体に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
近年、リガンド、特に抗体を用いて抗体と相互作用する細胞を選択的に分離する試みがなされている。かかる試みは抗体を担体に固定化した材料を用い、ここに血液細胞などの細胞群を流すことにより、抗体と相互作用するある特定の細胞だけを除去する技術が検討されている。例えば、ヒト表面抗原を認識する抗体を不織布に固定化し、特定の血球成分を除去することを試みている。しかし、このような技術では、抗体と相互作用する細胞が除去されるだけであり、それらの細胞を担体表面から回収し、さらに利用することは困難である（例えば、特許文献１参照）。
【０００３】
特定の細胞を回収する技術としては、フローサイトメトリーによる方法や最近では磁気ビーズ法（例えば、非特許文献１参照））などがあげられるが、いずれも少量の細胞を対象としており、細胞と標識抗体とを反応させた後、分離作業をするという非常に煩雑な操作が必要であり、特定の細胞を大量に回収する際は、時間、コストがかかることが問題であった。
【０００４】
また、これら担体になんらかの物質を固定化する際は、臭化シアンで活性基を表面に導入したり、スクシンイミド基、α−クロロアセトアミドメチル基などの活性基を表面に導入したり、担体官能基と物質の官能基を結合させてやるためにカルボジイミドなどを利用したりして、物質を共有結合などにより固定化してやる必要があった（例えば、非特許文献１参照）。これらの手法は研究用途などでは頻繁に用いられているが、医療用途などに用いる場合は、製造コストがかかってしまう問題があった。さらに医療用途の場合は製品を滅菌しなければならないが、抗体などのリガンドは、放射線や熱による滅菌により失活してしまうため、抗体などのリガンドを固定化したような医療用具を製造する場合が、製造プロセスをすべて無菌状態にして製造するなどされており、莫大な製造コストを必要としている。
【０００５】
【非特許文献１】
ポール・Ｔ・シャープ（Ｐ．Ｔ．Ｓｈａｒｐｅ），「生化学実験法１３−細胞分離法−」，第１版，１９９１年，東京化学同人，ｐ．１５１〜１９０
【０００６】
【特許文献１】
国際公開第９７／０２７８７８号パンフレット
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明では、上記従来技術の問題に対し、特定の細胞を簡単、大量に回収するためのリガンド−カチオン性ポリマー複合体およびそれを用いた材料を提供することを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成するために、本発明は主として下記構成を有する。
「外部刺激によりリガンドが脱離できるリガンド−カチオン性ポリマー複合体または該ポリマー複合体を固定化させた材料およびそれを用いたカラム」
【０００９】
【発明の実施の形態】
本発明は、カチオン性ポリマーとリガンドを含むリガンド−カチオン性ポリマー複合体であって、複合化したリガンドを外部刺激によって脱離できるリガンド−カチオン性ポリマー複合体を固定化した材料である。
【００１０】
本発明において使用するカチオン性ポリマーとしては、カチオン性を有するポリマーであればいずれのポリマーも利用できるが、特に、アミノ基を含有するポリマーがリガンドへの反応性や取り扱い易さの点から好適である。アミノ基含有ポリマーの例としては、ポリアルキレンイミン、ポリアリルアミン、ポリビニルアミン、ジアルキルアミノアルキルデキストラン、ポリリシン、ポリオルニチン、ポリヒスチジン、ポリアルギニン、アジリジン（エチレンイミン）化合物を有するポリマー、ポリアルキレンイミン誘導体、キチン、キトサン、およびそれらに置換基の導入されたもの、およびこれらを構成するモノマー単位からなる共重合体などがあげられる。アミノ基含有ポリマーのなかでもポリアルキレンイミンおよびその誘導体が好ましい。
【００１１】
ポリアルキレンイミンには、分子量６００以上の直鎖状、分岐状のものが好ましく用いられる。
【００１２】
また、ポリアルキレンイミン誘導体としては、ポリアルキレンイミンをアルキル化、カルボキシル化、フェニル化、リン酸化、スルホン化など、所望の割合で誘導体化したものがあげられる。
【００１３】
カチオン性ポリマーの中でも毒性の低さ、入手のしやすさ、取り扱いのしやすさなどから、分岐状のポリエチレンイミンやジエチルアミノエチルデキストランが特に好適に用いられる。
【００１４】
本発明に使用するリガンドは、細胞や病因物質などのターゲット物質と相互作用をもつものであれば、合成品でも天然物でもよいが、特異性の点から抗体あるいはレセプターであることが望ましい。用いる抗体は、例えば、抗ＣＤ１ａ抗体、抗ＣＤ１ｂ抗体、抗ＣＤ１ｃ抗体、抗ＣＤ２抗体、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ４抗体、抗ＣＤ８抗体、抗ＣＤ１０抗体、抗ＣＤ１１ａ抗体、抗ＣＤ１１ｂ抗体、抗ＣＤ１１ｃ抗体、抗ＣＤｗ１２抗体、抗ＣＤ１３抗体、抗ＣＤ１４抗体、抗ＣＤ１５抗体、抗ＣＤ１６ａ抗体、抗ＣＤ１６ｂ抗体、抗ＣＤ１８抗体、抗ＣＤ１９抗体、抗ＣＤ２０抗体、抗ＣＤ２２抗体、抗ＣＤ２３抗体、抗ＣＤ２４抗体、抗ＣＤ２５抗体、抗ＣＤ２６抗体、抗ＣＤ２７抗体、抗ＣＤ２８抗体、抗ＣＤ３０抗体、抗ＣＤ３１抗体、抗ＣＤ３２抗体、抗ＣＤ３３抗体、抗ＣＤ３４抗体、抗ＣＤ３８抗体、抗ＣＤ４０抗体、抗ＣＤ４２ａ抗体、抗ＣＤ４４抗体、抗ＣＤ４５抗体、抗ＣＤ４５ＲＡ抗体、抗ＣＤ４５ＲＯ抗体、抗ＣＤ４９ｄ抗体、抗ＣＤ５０抗体、抗ＣＤ５４抗体、抗ＣＤ５６抗体、抗ＣＤ５７抗体、抗ＣＤ５８抗体、抗ＣＤ６１抗体、抗ＣＤ６２Ｌ抗体、抗ＣＤ６２Ｐ抗体、抗ＣＤ６６抗体、抗ＣＤ６９抗体、抗ＣＤ７０抗体、抗ＣＤ７１抗体、抗ＣＤ８０抗体、抗ＣＤ８１抗体、抗ＣＤ８６抗体、抗ＣＤ９５抗体、抗ＣＤ１０２抗体、抗ＣＤ１０５抗体、抗ＣＤ１０６抗体、抗ＣＤ１０９抗体、抗ＣＤｗ１１９抗体、抗ＣＤ１２０ａ抗体、抗ＣＤ１２０ｂ抗体、抗ＣＤ１２１ａ抗体、抗ＣＤｗ１２１ｂ抗体、抗ＣＤ１２２抗体、抗ＣＤ１２３抗体、抗ＣＤ１２６抗体、抗ＣＤｗ１２８ａ抗体、抗ＣＤ１３０抗体、抗ＣＤｗ１３１抗体、抗ＣＤ１３２抗体、抗ＣＤ１３３抗体、抗ＣＤ１３４抗体、抗ＣＤ１０５抗体、抗ＣＤ１３８抗体、ＣＤ１５２抗体、抗ＣＤ１５４抗体、抗ＣＤ１９９抗体、抗低比重リポ蛋白質（ＬＤＬ）抗体、抗酸化ＬＤＬ抗体、抗β２ミクログロブリン抗体、抗ＣＣＲ１抗体、抗ＣＣＲ２抗体、抗ＣＣＲ３抗体、抗ＣＣＲ４抗体、抗ＣＣＲ５抗体、抗ＣＣＲ７抗体、抗ＣＸＣＲ３抗体、抗ＣＸ３ＣＲ１抗体、抗ＣＸＣＲ５抗体、抗ＣＸＣＲ１抗体などが挙げられるが、これらに限定されない。また、レセプターとしては例えば、ＣＣＲ１、ＣＣＲ２、ＣＣＲ３、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＣＲ７、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ３、ＣＸ３ＣＲ１、ＣＸＣＲ５等のサイトカインレセプターやＦｃγ，Ｆｃε等のイムノグロブリンレセプター、ＲＡＧＥ，ＬＤＬレセプター等のスカベンジャ−レセプター等，Ｔ細胞レセプターや主要組織適合性抗原等の細胞認識レセプター等が挙げられるが、これらに限定されない。これらの抗体やレセプターは単独で固定化しても良いし、複数の抗体やレセプターを組み合わせても良い。抗体は、アフィニティーの高さからモノクローナル抗体が好ましい。
【００１５】
これら抗体やレセプターは目的によって種々選定することができ、血液中の有用物質や病因物質を特異的に除去、回収する場合は細胞、無機物、タンパク質、ＤＮＡ、脂質、糖、ウィルスなどがターゲットとして挙げられる。例えば、抗ＣＤ２抗体を用いればＴ細胞およびＮＫ細胞を分離でき、抗ＣＤ３抗体を用いればＴ細胞をを分離でき、抗ＣＤ４抗体を用いればヘルパーＴ細胞を分離でき、抗ＣＤ８抗体を用いればサイトトキシックＴ細胞を分離でき、抗ＣＤ１１ａを用いれば白血球を分離でき、抗ＣＤ１１ｂを用いれば単球を分離でき、抗ＣＤ１４抗体を用いれば単球やマクロファージを分離でき、抗ＣＤ１５抗体を用いれば顆粒球やミエロイド細胞を分離でき、抗ＣＤ１６細胞を用いれば好中球あるいは休止期ＮＫ細胞を分離でき、抗ＣＤ１９抗体を用いればＢ細胞を分離でき、抗ＣＤ２２抗体を用いればＢ細胞を分離でき、抗ＣＤ２７抗体を用いればナイーブＢ細胞やメモリーＢ細胞を分離でき、抗ＣＤ３０抗体を用いれば活性化Ｂ細胞および活性化Ｔ細胞を分離でき、抗ＣＤ３３細胞を用いれば単球、顆粒球およびミエロイド細胞を分離でき、抗ＣＤ３４抗体を用いれば造血幹細胞を分離でき、抗ＣＤ４５抗体を用いれば白血球を分離でき、抗ＣＤ５６抗体を用いればＮＫ細胞を分離でき、抗ＣＤ６１抗体を用いれば巨核球及びその前駆細胞を分離でき、抗ＣＤ６６抗体を用いれば顆粒球を分離でき、抗ＣＤ６９抗体を用いれば活性化Ｔ細胞や活性化Ｂ細胞やＮＫ細胞を分離でき、抗ＣＤ７１抗体を用いれば赤芽球や活性化されたリンパ芽球を分離でき、抗ＣＤ１０５抗体を用いれば内皮細胞、抗ＣＤ１３３抗体を用いれば神経幹細胞を分離できる。
【００１６】
カチオン性ポリマーに複合化したリガンドを脱離させる外部刺激としては光、熱、ｐＨ、塩濃度、化学反応などがあるが、リガンドの安定性などから化学反応により化学結合を切断してリガンドが脱離される方法が好ましく、化学的な結合が切断される反応として、加水分解反応、酸化反応、還元反応、酵素反応などがあげられる。このなかでも、水中での反応の安定性の点から、還元反応が好ましく、特に、ジスルフィド結合を還元剤による還元反応により切断させる反応は、タンパク質のリフォールディングなど生体内で良く行われる反応であり、リガンドを脱離する反応として好適である。また、この還元反応で使用する還元剤としてはジチオスレイトール、メルカプトエタノール、システイン、還元型グルタチオンなどがあげられる。
【００１７】
次にリガンドをカチオン性ポリマーに結合し、複合体とする方法について説明する。
【００１８】
リガンドがタンパク質である場合は、タンパク質自身もジスルフィド結合を有することもあるので、リガンドを直接カチオン性ポリマーに複合化しても良いが、架橋剤を利用してカチオン性ポリマーにジスルフィド結合を介してリガンドを固定化してもよい。固定化の反応としては、メルカプト基同士の酸化反応やあるいはジスルフィド交換反応を利用してジスルフィド結合を形成させる反応が利用できる。
【００１９】
また、架橋剤を利用する場合には、ポリマー同士あるいはリガンド同士の結合を防ぐため二種類の違った官能基と反応する活性化基をもつ架橋剤を使用することが好ましく、活性化基としてアミノ基と反応するＮ−ヒドロキシスクシンイミド基、イミドエステル基、ニトロアリールハライド基、イミダゾリルカルバミン酸基、メルカプト基と反応するマレイミド基、ピリジルジスルフィド基、チオフタルイミド基、活性化ハロゲン基、光化学反応により架橋をするフェニルアジド基、ジアゾカルベン基などを持つような架橋剤を利用することができる。
【００２０】
なかでもアミノ基とｐＨ７〜９で反応性があるＮ−ヒドロキシスクシンイミド基をもつ架橋剤はカチオン性ポリマーとリガンドとの結合に好適であり、また、ピリジンジスルフィド基をもつ架橋剤はジスルフィド交換反応による架橋によりジスルフィド結合を形成することから本発明に好適に用いることができる。このような二つの活性化基をもつ架橋剤として、Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）−プロピオネート、スルフォスクシンイミジル６−［３’（２−ピリジルジチオ）−プロピオンアミド］ヘキサノエート、スクシンイミジル６−［３’（２−ピリジルジチオ）−プロピオンアミド］ヘキサノエート、Ｎ−（（２−ピリジルジチオ）エチル）−４−アジドサリシルアミドなどがあげられる。
【００２１】
また、ピリジンジスルフィド基をもつようなカチオン性ポリマーとリガンドのメルカプト基を反応させる場合には、リガンドにピリジンジスルフィド基を導入して、還元し、メルカプト基を導入することができる。この際、リガンドが抗体である場合は、抗体自体の還元を防ぐために酢酸緩衝液中などで還元することにより抗体自身の還元を抑えることができ、この際、限外ろ過膜やゲルろ過カラムにより使用した還元剤を除くことが可能である。また、リガンドが抗体である場合は、抗体をペプシンなどの分解酵素で消化し、抗体の可変部位のみに精製した後、生成するメルカプト基を用いることができる。
【００２２】
逆に、メルカプト基をもつカチオン性ポリマーを用いる場合には、リガンドにピリジンジスルフィド基を導入したものと反応させればよい。
【００２３】
メルカプト基を導入する場合は、イミノチオランを利用すれば、一段階でメルカプト基を導入できる。
【００２４】
カチオン性ポリマーに結合させるリガンド密度は高い方が望ましいが、反応に用いる架橋剤の濃度や反応時間により制御することができるので、適宜選ぶことができる。例えば、上記方法でのリガンドへのピリジルジスルフィド基の導入率は１以上であることが必要であるが、導入率を上げるためにピリジルジスルフィド化剤の仕込量を上げるとリガンドがタンパク質の場合は失活したり、凝集したりするおそれがある。この場合、仕込量はリガンド１モルあたり１０モル以下が望ましい。
【００２５】
また、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド基を有する架橋剤を用いる場合は、アミノ基を持つカチオン性ポリマーを使用する必要があり、カチオン性ポリマーにアミノ基がない場合は、ポリマー内にアミノ基を導入する必要があり、官能基をアミノ基に変換する反応、アミノ基をもつ低分子物質を結合させる反応、あるいは、アミノ基を持つモノマーを共重合させることにより達成できる。
【００２６】
また、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド基とピリジルジスルフィド基を持つような架橋剤は、ポリスルホン系のポリマーを使用する際に吸着しやすいため、メタノール、エチレングリコール、グリセリンなどで架橋剤を溶解し、反応後ポリスルホン系材料を溶解しない有機溶媒でポリマーを洗浄することが望ましい。
【００２７】
以上のような反応を例として、ジスルフィド結合を介してカチオン性ポリマーにリガンドを結合できるが、この反応に限定されない。
【００２８】
【化１】

【００２９】
本発明のリガンド−カチオン性ポリマー複合体は、この物質そのものを細胞分離剤として用いることができる。赤血球表面は陰性荷電の状態で血液中に浮遊しており、陽性荷電であるカチオン性ポリマーを添加すると赤血球同士が架橋し、沈降する。本発明のリガンド−カチオン性ポリマー複合体を添加すると、リガンドと相互作用をもつ細胞や病因物質（ターゲット物質）といっしょに赤血球が沈降する。この沈降物を分離した後、外部刺激を用いて沈降物中の複合体を脱離させるとターゲット物質と赤血球は分離され、赤血球を比重遠心法や溶血により除去してやれば、ターゲット物質を回収できる。
【００３０】
本発明のリガンド−カチオン性ポリマー複合体は、透析膜や繊維をはじめとして種々の分離膜やフィルムなどの材料に固定化させて利用することが出来る。この際用いる材料の素材は、特に限定しないが、医療用に用いられている素材が好ましく、例えば、ポリ塩化ビニル、セルロース系ポリマー、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート、ポリカーボネート、ポリスルホン、ポリウレタンおよびそれらの誘導体やブレンド体などが挙げられるが、カチオン性ポリマー複合体を固定化させるには、素材がアニオン性を帯びている方がカチオン性ポリマーとの静電相互作用により固定化し易い。このため、アニオン性物質自体を素材として使用したり、あるいはアニオン物質をブレンドした素材、アニオン物質を浸漬または付着させ、放射線照射などにより固定化した素材、素材に活性基を導入しておき、アニオン物質を固定化した素材などが用いられる。アニオン性物質は低分子であっても、高分子であってもよい。これらの用途で使用されるアニオン性材料の官能基としては、側鎖あるいは主鎖にカルボキシ基、硫酸基、硫酸水素基、リン酸基、ニトロ基などであり、例えば、ポリマーとしては、ポリアクリル酸、ポリスチレンスルホン酸、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリアスパラギン酸、ポリグルタミン酸、デキストラン硫酸、アルギン酸、コロミン酸、ペクチン酸、グリコサミノグリカンを有するポリマーなどがあげられる。
【００３１】
本発明のリガンド−カチオン性ポリマー複合体を固定化させることができる材料の形状としては、フィルム状、粒子状、中空糸状、繊維状、平膜状、スポンジ状、カットファイバーなど何でもよいが、閉鎖系で圧力損失を伴わず、細胞を傷つけず体外循環できる利点から、中空糸あるいは平膜が望ましい。また、表面積を確保する点からこれらは多孔質であることがのぞましく、多孔質材料を用いる場合は、透析やろ過機能を付与することができ、血液浄化、細胞分離用途のみならず、バイオリアクターなどの細胞培養用材料としても用いることができる。また、多孔質材料の場合は、製造条件を制御することにより孔の制御も可能である。
【００３２】
本発明のカラム内には上記材料が充填されており、血液や細胞などが通過、循環が可能である。
【００３３】
材料をカラムとして利用する場合、特に中空糸を用いる場合は公知の方法にて製造され、特に限定されるものではないが、一例を示すと次の通りである。まず、中空糸膜を必要な長さに切断し、必要本数を束ねた後、筒状ケースに入れる。その後両端に仮のキャップをし、中空糸膜両端部にポッティング剤を入れる。このとき遠心機でモジュールを回転させながらポッティング剤を入れる方法は、ポッティング剤が均一に充填されるために好ましい方法である。ポッティング剤が固化した後、中空糸膜の両端が開口するように両端部を切断し、中空糸膜モジュールを得る。
【００３４】
リガンドが蛋白質のような失活しやすいものであれば、リガンド−カチオン性ポリマー複合体を材料に固定化する際に、リガンド−カチオン性ポリマー複合体の溶液を溶液状態で無菌ろ過滅菌した後、無菌状態の材料に固定化させれば、簡単に無菌状態の材料が作製できる。
【００３５】
また、リガンド−カチオン性ポリマー複合体を材料に固定化したあとに放射線や熱処理することにより、リガンド−カチオン性ポリマー固定化材料を作製しても良い。放射線処理としては、γ線・電子線などを照射すればよい。
【００３６】
本発明のリガンド−カチオン性ポリマー複合体を材料に固定化した材料は、体外循環用カラムとして利用することにより、血液中の有用物質や病因物質を特異的に除去、回収する目的で使用することができ、無機物、タンパク質、ＤＮＡ、脂質、糖、細胞、ウィルスなどがターゲットとして挙げられ、細胞分離カラムや体液浄化カラムに利用することができる。
【００３７】
また、本発明の材料を利用して目的とする物質を除去、回収する際は、カラムなどとして目的物質をリガンドで捕捉した後、還元反応などの外部刺激により、リガンドを脱離させることにより、目的とする有用物質や病因物質を回収し、分析することが可能である。
【００３８】
また、回収目的とするものが細胞の場合は、分析だけでなく、回収した細胞を培養して増やしたり、活性化させたりすることができるため、細胞が血液幹細胞、神経幹細胞、Ｔ細胞であれば、癌あるいは自己免疫疾患などの治療などに利用できる。この際、細胞を回収するために本発明の材料を全血と作用させてやってもよいし、血漿分画や単核球分画などにした後、作用させてやってもよい。
【００３９】
また、抗体脱離後の材料は再利用することも可能である。
【００４０】
本発明のリガンド−カチオン性ポリマー複合体を利用すれば、上記で示したようなターゲットとなる有用物質や病因物質をリガンドにより捕捉でき、さらに、外部刺激によりリガンドを材料から脱離させることにより、捕捉した有用物質や病因物質を回収することが可能であるが、ターゲット物質を捕捉あるいは回収する際に使用する溶媒として、様々なｐＨ値のリン酸、酢酸、クエン酸などの緩衝液を用いることができ、さらに緩衝液の中にウシ血清アルブミンや抗体などのタンパク質あるいはカチオン性、アニオン性などのポリマーなどを含有していても良い。
【００４１】
細胞を回収する際は全血と作用させてもよいし、血漿分画や単核球分画などにした後、作用させてもよい。
【００４２】
以上のような方法で、回収した有用物質、病因物質を分析に用いることが可能である。また、細胞の場合はそれを培養し、分析や治療などに利用できる。例えば、リガンドとして抗ＣＤ４抗体を使用し、このリガンドを固定化した本発明の材料に血液を通してＣＤ４陽性のＴ細胞を捕捉し、ジチオスレイトールなどの還元剤でリガンドを脱離することにより、捕捉した細胞を大量に回収し、この細胞に様々な刺激を加えて活性化させ体内に戻すことにより、癌、アレルギー、感染症、臓器移植、神経疾患、血管再生、糖尿病、肝再生、皮膚再生あるいは自己免疫疾患の治療やワクチンとしてもちいることができる。
【００４３】
また、例えば、リガンドとして抗ＣＤ３４抗体を使用し、このリガンドを固定化した本発明の材料に臍帯血を通して、造血幹細胞を捕捉し、ジチオスレイトールなどの還元剤でリガンドを脱離することにより、造血幹細胞を大量に回収し、回収した造血幹細胞を培養して輸血医療に用いたり、様々な組織幹細胞に分化させることにより、肝疾患や神経疾患、血管傷害などの細胞療法に用いることができる。
【００４４】
また、例えば、リガンドとして抗ＣＤ１３３抗体を使用し、このリガンドを固定化した本発明の材料に臍帯血を通して、神経幹細胞を捕捉し、ジチオスレイトールなどの還元剤でリガンドを脱離することにより、神経幹細胞を大量に回収し、回収した神経幹細胞を培養して神経幹細胞移植に用いたり、様々な神経細胞に分化させることにより、パーキンソン病やアルツハイマー病など神経疾患、脳梗塞により壊死した神経細胞の修復などの細胞療法に用いることができる。
【００４５】
【実施例】
以下に実施例を用いて詳細に説明を加えるが、発明の内容は実施例に限定されるものではない。
【００４６】
＜実施例１＞
１．メルカプト基を持つポリエチレンイミン誘導体の作製
１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのエチレンジアミン三酢酸（ＥＤＴＡ）を含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）にポリエチレンイミン（和光純薬製、数平均分子量１００００）を５ｍｇ／ｍｌとなるように溶解した。この溶液３ｍｌに、Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）−プロピオネート（ピアース社製、以下ＳＰＤＰ）を２０ｍＭになるように溶解したジメチルスルホキシド溶液を０．５ｍｌ添加し、室温で３０時間撹拌した。反応させた溶液をＰＤ−１０カラム（ファルマシア社製）で高分子量分画に精製した。
【００４７】
合成したＳＰＤＰ化ポリエチレンイミンを２５ｍＭのジチオスレイトール（以下ＤＴＴ）を含むリン酸緩衝液中で還元反応を行い、メルカプト基を有するポリエチレンイミン誘導体（以下、ＨＳ−ＰＥＩ）を合成した。還元反応について、反応により生成するピリジン−２−チオンの吸収（３４３ｎｍ）を測定することにより、メルカプト基の導入量を測定したところ、ポリエチレンイミン１分子当たり５モルのメルカプト基が導入されていることが分かった。
【００４８】
２．ヒト免疫グロブリンＧのＳＰＤＰ化
ＮａＣｌを０．１５ｍＭ含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に５ｍｇ／ｍｌに溶解した精製ヒト免疫グロブリンＧ（シグマ社製）にＳＰＤＰを２０ｍＭに溶解したジメチルスルホキシド溶液をヒト免疫グロブリンＧ１モルに対して１０モル添加し、室温で３０分反応させた後、ＰＤ−１０カラム（ファルマシア社製）で高分子量分画に精製した。ヒト免疫グロブリンＧ１モルあたりのＳＰＤＰ導入量は４．２モルであった。
３．ジスルフィド基を介してヒト免疫グロブリンＧを複合化したポリエチレンイミンの合成
１．で得られたＨＳ−ＰＥＩを２．１ｍｇ／ｍｌ含むリン酸緩衝液と２．で得られたＳＰＤＰ化ヒト免疫グロブリンＧを１ｍｇ／ｍｌ含むリン酸緩衝液をモル比で１：１となるように混合し、室温で１４時間反応させ、ヒト免疫グロブリンＧをポリエチレンイミンにジスルフィド結合を介して複合化した。複合化は反応液を高速液体クロマトグラフィー（以下ＨＰＬＣ、測定条件は、カラム：東ソーＴＳＫｇｅｌＧ３０００ＳＷＸＬ、溶出液：０．５Ｍ酢酸バッファー、流速：０．５ｍｌ／ｍｉｎ）を用いて分析し、高分子量側にシフトすることにより確認した。さらに、ヒト免疫グロブリンＧ−ポリエチレンイミン複合体の溶液にＤＴＴを２５ｍＭとなるように添加し、複合体を還元すると、複合体は分離し、もとのヒト免疫グロブリンＧとポリエチレンイミンのピークになることをＨＰＬＣにより確認した。
【００４９】
＜比較例１＞
１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡを含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）にポリエチレンイミン（和光純薬製、数平均分子量１００００）を５ｍｇ／ｍｌとなるように溶解した。この溶液３ｍｌに、スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸（ピアース社製）を２０ｍＭになりるように溶解したジメチルスルホキシド溶液を０．５ｍｌ添加し、室温で３０時間撹拌した。反応させた溶液をＰＤ−１０カラム（ファルマシア社製）で高分子量分画に精製した。
【００５０】
上記で得られたマレイミド化ポリエチレンイミンを２．１ｍｇ／ｍｌ含むリン酸緩衝液とヒト免疫グロブリンＧを１ｍｇ／ｍｌ含むリン酸緩衝液をモル比で１：１となるように混合し、室温で１４時間反応させ混合し、ヒト免疫グロブリンＧをポリエチレンイミンと複合化した。複合化は反応液をＨＰＬＣを用いて分析し、高分子量側にシフトすることにより確認した。得られた複合体を２５ｍＭのＤＴＴを含むリン酸緩衝液中で還元反応を行い、複合体を還元しても、複合体は分離されなかった。
【００５１】
＜実施例２＞
１．ポリスルホン（テイジンアモコ社製”ユーデル”（登録商標）Ｐ−３５００）１８重量部、ポリビニルピロリドン（ＢＡＳＦ社製”Ｋ３０”（登録商標））９重量部をＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミド７２重量部、水１重量部に加え、９０℃、１４時間加熱溶解した。この溶液を０．１ｍｍスペーサー付きのガラス板に塗布し、ドクターブレードにて溶液を引き延ばしたものを水中にいれて、凝固させ、ポリスルホン／ポリビニルピロリドンブレンドからなる平膜状の材料を作製した。
【００５２】
２．上記、ポリスルホン／ポリビニルピロリドンブレンド材料を十分水洗した後、１ｗｔ％のデキストラン硫酸（分子量５０万、和光純薬製）水溶液に浸漬して、２５ｋＧｙにてγ線照射して、表面に硫酸基をもつ平膜を作製した。放射線処理した平膜は、十分水洗した。
３．平膜へのリガンド−カチオン性ポリマー複合体の固定化
２．で作製したアニオン性平膜１ｃｍ^２を、実施例１で合成したジスルフィド基を介してヒト免疫グロブリンＧを複合化したポリエチレンイミンを０．２ｍｇ／ｍｌ含むリン酸緩衝液に、室温で２時間浸漬させた。２時間後のリン酸緩衝液に含まれるヒト免疫グロブリンＧの吸光度（２８０ｎｍ）を測定したところ、吸光度が減少し、ヒト免疫グロブリンＧ−ポリエチレンイミン複合体がアニオン性平膜に固定化されていることが確認された。また、この膜を２５ｍＭのジチオスレイトールを含むリン酸緩衝液で還元反応し、脱離されたヒト免疫グロブリン量をＨＰＬＣおよび吸光度で測定したところ、還元処理により７．７μｇ／ｃｍ^２ヒト免疫グロブリンＧがアニオン性平膜から脱離されたことが確認できた。
【００５３】
＜比較例２＞
実施例２の１．で得られた表面にポリビニルピロリドン層を有するポリスルホン製平膜に、実施例１で合成したジスルフィド基を介してヒト免疫グロブリンＧを複合化したポリエチレンイミンを０．２ｍｇ／ｍｌ含むリン酸緩衝液に室温で２時間浸漬させたが、ヒト免疫グロブリンＧは平膜に固定化されなかった。
【００５４】
＜比較例３＞
実施例２の２．で作製したアニオン性平膜に、ヒト免疫グロブリンＧを０．２ｍｇ／ｍｌ含むリン酸緩衝液に室温で２時間浸漬させたが、ヒト免疫グロブリンＧは平膜に固定化されなかった。
【００５５】
＜実施例３＞
表面に硫酸基をもつ東レ製繊維状イオン交換体“アイオネックス”０．１ｇを実施例１で合成したジスルフィド基を介してヒト免疫グロブリンＧを複合化したポリエチレンイミンを０．２ｍｇ／ｍｌ含むリン酸緩衝液に室温で２時間浸漬させた。２時間後のリン酸緩衝液に含まれるヒト免疫グロブリンＧの吸光度（２８０ｎｍ）を測定したところ、吸光度が減少し、ヒト免疫グロブリンＧ−ポリエチレンイミン複合体が繊維に固定化されていることが確認された。また、この繊維を２５ｍＭのジチオスレイトールを含むリン酸緩衝液で還元反応し、脱離されたヒト免疫グロブリン量をＨＰＬＣおよび吸光度で測定したところ、還元処理により１０μｇ／０．１ｇ繊維のヒト免疫グロブリンＧが繊維から脱離された。
【００５６】
＜実施例４＞
２５ｋＧｙでγ線滅菌された表面に硫酸基を有するポリメチルメタクリレート中空糸膜からなる東レ製“フィルトライザー”人工腎臓（ＢＧ）を解体して中空糸膜を取り出し、中空糸膜を３６本束ね、中空糸膜中空部を閉塞しないようにエポキシ系ポッティング剤で両末端をモジュールケースに固定し、ミニモジュールを作製した。該ミニモジュールの直径は約７ｍｍ、長さは約１０ｃｍである。作製したミニモジュールの中空糸内部に実施例１で合成したジスルフィド基を介してヒト免疫グロブリンＧを複合化したポリエチレンイミンを０．２ｍｇ／ｍｌ含むリン酸緩衝液１．５ｍｌを室温で２時間灌流した。２時間後のリン酸緩衝液に含まれるヒト免疫グロブリンＧの吸光度（２８０ｎｍ）を測定したところ、吸光度が減少し、ヒト免疫グロブリンＧ−ポリエチレンイミン複合体が中空糸内部に固定化されていることが確認された。また、この中空糸内部を２５ｍＭのジチオスレイトールを含むリン酸緩衝液で灌流して中空糸内表面を還元し、脱離されたヒト免疫グロブリン量をＨＰＬＣおよび吸光度で測定したところ、還元処理により１０μｇヒト免疫グロブリンＧがミニモジュールから脱離された。
【００５７】
＜実施例５＞
ヘパリン固定化ビーズ（アマシャム製）０．１ｇを実施例１で合成したジスルフィド基を介してヒト免疫グロブリンＧを複合化したポリエチレンイミンを０．２ｍｇ／ｍｌ含むリン酸緩衝液に室温で２時間浸漬させた。、２時間後のリン酸緩衝液に含まれるヒト免疫グロブリンＧの吸光度（２８０ｎｍ）を測定したところ、吸光度が減少し、ヒト免疫グロブリンＧ−ポリエチレンイミン複合体がヘパリンビーズに固定化されていることが確認された。また、このビーズを２５ｍＭのジチオスレイトールを含むリン酸緩衝液で還元反応し、脱離されたヒト免疫グロブリン量をＨＰＬＣおよび吸光度で測定したところ、還元処理により１０μｇ／０．１ｇビーズのヒト免疫グロブリンＧがビーズから脱離された。
【００５８】
＜実施例６＞
１．ＮａＣｌを０．１５ｍＭ含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に５ｍｇ／ｍｌに溶解したＯＫＴ３（抗ＣＤ３抗体、ヤンセンファーマ社製）にＮ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）−プロピオネート（ピアス社製、ＳＰＤＰ）を２０ｍＭに溶解したジメチルスルホキシド溶液を抗体１モルに対して１０倍モル量添加し、室温で３０分反応させた後、ＰＤ−１０カラム（ファルマシア社製）で高分子量分画に精製した。ＯＫＴ３が１モルに対してＳＰＤＰ導入量は３．８モルであった。
【００５９】
実施例１の１．で得られたＨＳ−ＰＥＩを２．１ｍｇ／ｍｌ含むリン酸緩衝液と得られたＳＰＤＰ化ＯＫＴ３を１ｍｇ／ｍｌ含むリン酸緩衝液をモル比で１：１となるように混合し、室温で１４時間反応させ混合し、ＯＫＴ３をポリエチレンイミンにジスルフィド結合を介して複合化した。複合化は反応液をＨＰＬＣを用いて分析し、高分子量側にシフトすることにより確認した。
２．実施例２で作製したアニオン性平膜１ｃｍ^２を合成したジスルフィド基を介してＯＫＴ３を複合化したポリエチレンイミン体を０．２ｍｇ／ｍｌ含むリン酸緩衝液に室温で２時間浸漬させた。、２時間後のリン酸緩衝液に含まれるＯＫＴ３の吸光度（２８０ｎｍ）を測定したところ、吸光度が減少し、ＯＫＴ３−ポリエチレンイミン複合体がアニオン性平膜に固定化されていることが確認された。
【００６０】
こうして得られたＯＫＴ３−ポリエチレンイミン複合体固定化平膜１ｃｍ＾２に健常者血液から得た単核球からなる細胞懸濁液を５×１０^５個添加して２０分後、洗浄した材料に５ｍＭのジチオスレイトールを含むリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）を添加して、ジスルフィド結合を還元することによりＯＫＴ３に結合したＣＤ３陽性細胞を脱離させた。フローサイトメトリーにより求められる細胞懸濁液中のＣＤ３陽性細胞の比率は６０％から８０％になり、ＣＤ３陽性細胞を分離することができた。
【００６１】
＜実施例７＞
実施例６の１．で得られたＯＫＴ３− ポリエチレンイミン複合体を健常者血液に添加し、沈降した赤血球をリン酸緩衝液で洗浄した後、５ｍＭのＤＴＴを含むリン酸緩衝液で還元した細胞懸濁液を比重遠心法にて、単核球分画を取り出したところ、ＣＤ３陽性細胞の比率は１０％から８０％となり、ＣＤ３陽性細胞を分離することができた。
【００６２】
【発明の効果】
本発明により、特定の細胞を簡単、大量に回収するための材料に使用できるリガンド−カチオン性ポリマー複合体および該ポリマー複合体を固定化させた材料およびそれを用いたカラムを提供することができる。

Claims

カチオン性ポリマーとリガンドを含むリガンド−カチオン性ポリマー複合体であって、複合化したリガンドを外部刺激によって脱離できるリガンド−カチオン性ポリマー複合体。
カチオン性ポリマーがアミノ基を有することを特徴とする請求項１に記載のリガンド−カチオン性ポリマー複合体。
カチオン性ポリマーがポリエチレンイミンまたはジエチルアミノエチルデキストランを含むことを特徴とする請求項２に記載のリガンド−カチオン性ポリマー複合体。
外部刺激により化学結合が切断されることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載のリガンド−カチオン性ポリマー複合体。
外部刺激が還元剤による還元反応であることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載のリガンド−カチオン性ポリマー複合体。
リガンドとカチオン性ポリマーがジスルフィド結合を介して結合されていることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載リガンド−カチオン性ポリマー複合体。
カチオン性ポリマーがアミノ基を有し、かつリガンドがメルカプト基を有するものであり、前記カチオン性ポリマーのアミノ基と前記リガンドのメルカプト基を外部刺激により切断可能な架橋剤を利用してリガンドをカチオン性ポリマーに複合化したことを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載のリガンド−カチオン性ポリマー複合体。
カチオン性ポリマーがメルカプト基を有し、かつリガンドがアミノ基を有するものであり、前記カチオン性ポリマーのメルカプト基と前記リガンドのアミノ基を外部刺激により切断可能な架橋剤を利用してリガンドをカチオン性ポリマーに複合化したことを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載のリガンド−カチオン性ポリマー複合体。
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド基とピリジルジスルフィド基および／またはＮ−ヒドロキシスクシンイミド基とマレイミド基を有する架橋剤を利用してリガンドがカチオン性ポリマーに複合化したことを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載のリガンド−カチオン性ポリマー複合体。
架橋剤がＮ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）−プロピオネートである請求項９記載のリガンド−カチオン性ポリマー複合体。
リガンドが抗体あるいはレセプターであることを特徴とする請求項１〜１０のいずれかに記載のリガンド−カチオン性ポリマー複合体。
細胞分離剤に用いる請求項１〜１１のいずれかに記載のリガンド−カチオン性ポリマー複合体。
請求項１〜１１のいずれかに記載のリガンド−カチオン性ポリマー複合体を固定化させた材料。
請求項１３の材料を用いた体外循環に使用可能な細胞分離カラム。
請求項１３の材料を用いた体外循環に使用可能な血液浄化カラム。
請求項１〜１１のいずれかに記載のリガンド−カチオン性ポリマー複合体を含む疾患治療用カラムであって、該疾患治療用カラムで得られた細胞が癌または自己免疫疾患または脳梗塞またはパーキンソン病またはアルツハイマー病または糖尿病または心筋梗塞または血管再生の治療に用いられる疾患治療用カラム。
細胞が造血幹細胞であることを特徴とする請求項１６に記載の疾患治療用カラム。
細胞が神経幹細胞であることを特徴とする請求項１６に記載の疾患治療用カラム。
細胞がＴ細胞であることを特徴とする請求項１６に記載の疾患治療用カラム。