JPH04360900A - 蛋白質膜のブロッキング方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、臨床検査などの免疫測
定試薬や、バイオプロダクトの分離精製のためのアフィ
ニティー担体として用いられる、抗体又は抗原を固定化
した蛋白質膜，あるいは、酵素，菌体等を固定化した蛋
白質膜を、蛋白質で共有結合によりブロッキングする方
法に関する。

【０００２】

【従来の技術】抗原抗体反応の高い特異性を利用して、
検体中に含まれる特定の抗原（又は抗体）を、定性的あ
るいは定量的に測定するために、種々の免疫学的測定法
が用いられており、代表的なものとして、酵素免疫測定
法（ＥＩＡ），放射免疫測定法等が知られている。

【０００３】これらの免疫学的測定法には、一般に、測
定対象である抗原（又は抗体）に対応する抗体（又は抗
原）を、化学結合法や吸着法あるいは包括法によって固
定化した不溶性担体（固相）と、酵素又は放射性同位元
素等で標識した標識抗体（又は抗原）が用いられている
。

【０００４】ところが、測定試料中の、免疫反応に関与
しない他の各種夾雑物質や標識抗体（又は抗原）が上述
の膜に非特異的に吸着する為、測定値に誤差が生じたり
、感度が低下するという問題があった。

【０００５】また、抗体（又は抗原）を固定化した膜は
、抗原（又は抗体）の分離・精製用のアフィニティーク
ロマト担体としても有用であるが、この際も、夾雑物質
の非特異的吸着が、分離・精製純度の低下の原因となっ
ている。

【０００６】同様に、固定化酵素や、固定化した菌体を
用いて反応を行う際にも、非特異的吸着は、反応効率の
低下等をひきおこす。

【０００７】そこで、夾雑物質の非特異的吸着の少ない
蛋白質膜（絹フィブロイン膜等）を固相に用いたり、免
疫反応に関与しない蛋白質（牛血清アルブミン（ＢＳＡ
），卵白アルブミン等）を、固相表面の間隙に予め充填
しておく（ブロッキング）等の工夫がなされてきた。

【０００８】しかし、従来のブロッキングは、物理的吸
着に依るものである為、夾雑物質の非特異的吸着を抑制
するには不十分であり又、膜の洗浄時に解離する場合が
ある為、繰り返し使用には適さなかった。

【０００９】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、こうした状
況に鑑みてなされたものであって、その目的とするとこ
ろは、夾雑物質の非特異的吸着を大幅に抑制した蛋白質
膜を提供するにある。

【００１０】

【課題を解決するための手段】上述の目的は、抗原，抗
体，酵素，菌体等を固定化した蛋白質膜をブロッキング
するに際し、蛋白質で共有結合によりブロッキングする
ことを特徴とする、蛋白質膜のブロッキング方法によっ
て達成される。

【００１１】本発明に用いられる蛋白質膜としては、絹
フィブロイン，ゼラチン，コラーゲン等からなる膜が挙
げられるが、中でも、非特異的吸着が少ないという点か
ら、絹フィブロインが特に好ましい。

【００１２】抗体（又は抗原）をこれらの膜に固定化す
る方法としては、前記の如く、化学結合法，吸着法，包
括法等があるが、ブロッキング効果が大きいという点で
包括法が好ましい。

【００１３】本発明に用いられる、上記の抗体（又は抗
原）固定化膜をブロッキングする為の蛋白質としては、
牛血清アルブミン，卵白アルブミン等や、グリシン，ア
ラニン，リジン，アルギニン，セリン，グルタミン酸，
アスパラギン酸等のアミノ酸，及び各種ペプチド類等が
挙げられる。

【００１４】ブロッキングには、抗体（又は抗原）固定
化（蛋白質）膜やブロッキング用の蛋白質，ペプチド，
アミノ酸の持つ、アミノ基，カルボキシル基，チオール
基等が有効に利用され、例えば二官能性以上の結合剤や
縮合剤等の結合試薬を用いることによって、共有結合を
介してブロッキング処理が行われる。また、スペーサー
を介して結合させても良い。

【００１５】結合試薬としては、（ｉ）アミノ基相互間
の結合試薬，（ｉｉ）アミノ基とチオール基間の結合試
薬，（ｉｉｉ）　カルボキシル基とアミノ基間の結合試
薬等が挙げられる。

【００１６】（ｉ）としては、例えば、ジメチルスクシ
ンイミデート等のアルキルジイミデート類，酒石酸ジア
ジド等のアシルアジド類，１，５−ジフルオロ−２，４
−ジニトロベンゼン等のアリールジハライド類，キシレ
ン−ｍ−ジイソシアネート等のイソシアネート類，Ｎ，
Ｎ′−ｏ−フェニレンジマレイミド等のジマレイミド類
，その他、グルタルアルデヒド，グルタルアルデヒド重
合体，ブロムシアン，塩化シアヌル等が挙げられるが、
グルタルアルデヒド重合体が、ブロッキング効果が大き
い為、特に好ましい。

【００１７】グルタルアルデヒド重合体は、グルタルア
ルデヒドから自然発生的に生成するが、６０℃でアルカ
リ存在下、数時間処理するか又は、グルタルアルデヒド
水溶液に、例えばトリエチルアミン等の３級アミンを触
媒量添加することによっても得られる（特開平２−４９
５８７号公報参照）。

【００１８】（ｉｉ）としては、例えば、メチル−４−
メルカプトブチルイミデート等のメルカプトアルキルイ
ミデート類，γ−マレイミド酪酸Ｎ−ヒドロキシスクシ
ンイミドエステル等のマレイミドカルボン酸Ｎ−ヒドロ
キシスクシンイミドエステル類等が挙げられる。

【００１９】（ｉｉｉ）としては、例えば、１−エチル
−３−ジメチルアミノプロピルカルボジイミド等の水溶
性カルボジイミド類等が挙げられる。

【００２０】これらの結合剤の濃度，及びブロッキング
処理時間は、蛋白質膜に固定化されている抗体（抗原，
酵素，菌体）の免疫活性をできるだけそこなわないよう
な範囲で、適宜選択される。

【００２１】ブロッキング処理は、例えば次のようにし
て行うことができる。

【００２２】抗体を包括固定化したフィブロイン膜を、
室温下で１重量％グルタルアルデヒド重合体水溶液に数
秒から数分浸漬した後、０．０１Ｍ生理食塩水で充分洗
浄し、未反応のグルタルアルデヒド重合体を除去する。 次にこの膜を、ブロッキング用の蛋白質を適当量含有す
る０．１Ｍリン酸緩衝溶液に、室温下で２時間浸漬し、
０．０１Ｍ生理食塩水中で充分洗浄する。

【００２３】Ｌ−リジン等のアミノ酸でブロッキングす
る場合、Ｌ−リジンの０．１Ｍリン酸緩衝溶液中の濃度
は０．００５〜１Ｍ（ｐＨ７．０〜１０）とし、４〜４
０℃で数１０分〜数時間反応させれば良い。

【００２４】牛血清アルブミン等の蛋白質でブロッキン
グする場合、０．１Ｍリン酸緩衝液中、牛血清アルブミ
ン濃度は０．０１〜１０重量％であり（ｐＨ５．５〜９
．０）、４〜４０℃で数１０分〜数時間反応させれば良
い。

【００２５】このようにして得られた本発明の蛋白質膜
は、４℃下、０．１重量％ＮａＮ３　を含む０．０１Ｍ
生理食塩水中で保存する。

【００２６】

【発明の効果】本発明の方法によって蛋白質の共有結合
によるブロッキング処理を施した抗体（抗原，酵素，菌
体等）固定化蛋白質膜は、公知の物理的吸着法でブロッ
キング処理を施したものに較べ、非特異的吸着が大きく
抑制される。そのため、これを免疫計測に用いた場合、
後述の試験例に示すように、高感度かつ高精度の測定が
可能になる。また、高純度の物質精製を目的としたアフ
ィニティー担体，効率のよいバイオリアクターとしても
有効に用いられる。また、免疫反応により該蛋白質膜の
固定化抗体（又は抗原）に結合した抗原（又は抗体）を
解離する操作により、該固定化蛋白質膜を再生し、繰り
返し使用しても、そのブロッキング効果は損われないた
め、試験例２に示すように免疫センサー用の固定化膜と
して有効に用いることができる。

【００２７】以下、試験例を挙げて本発明の効果を更に
詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるもので
はない。

【００２８】試験例１ 非特異的吸着比較試験 後述する、比較例１で作成したＡＦＰ測定用免疫センサ
ー（物理的吸着法でリジンブロッキング処理を施した膜
を使用），又は実施例１で作成したＡＦＰ測定用免疫セ
ンサー（共有結合法でリジンブロッキング処理を施した
膜を使用）を用い、図１に示すようなフロー式の測定装
置を組み、ヒトＡＦＰの標準溶液について、それぞれ数
回ずつ、以下のようにして繰り返し測定し、非特異的吸
着の比較を行った。

【００２９】但し、ヒトＡＦＰ　　Ｏ，１００ｎｇ　／
　ｍｌ　を含有する０．５重量％牛血清アルブミン生理
食塩水をヒトＡＦＰの標準溶液とした。

【００３０】まず、カタラーゼにメルカプトイミデート
化合物を反応させたチオール化カタラーゼを製造し、次
に、抗ヒトＡＦＰモノクローナル抗体にスクシニルマレ
イミド化合物を反応させたマレイミド化抗体を製造し、
該チオール化カタラーゼとマレイミド化抗体を反応させ
ることによって、カタラーゼ標識抗ヒトＡＦＰモノクロ
ーナル抗体を製造した（特開昭６３−１０１７５４号公
報参照）。

【００３１】次に、カタラーゼ標識抗ヒトＡＦＰモノク
ローナル抗体２２μｇ／ｍｌを含有するＡＦＰ標準溶液
０．２ｍｌを免疫センサー中の反応セル（容量０．２ｍ
ｌ）に導入し、７分間静置して免疫反応を行った後、２
０ｍｌ／分の流速で１分間洗浄液（蒸留水）を流して反
応セルを洗浄した。次いで、３５．３ｍＭの過酸化水素
を含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）０．２ｍｌ
を反応セルに導入し、酸素電極の酸素濃度に比例した電
流値を求め、更にＡＤ変換機を使用し、電位差に変換し
た。

【００３２】続いて、０．１Ｍグリシン−塩酸緩衝液（
ｐＨ２．５，食塩２重量％含有）からなる解離液を、２
０ｍｌ／分の流速で１分間流した後、２分間静置して、
固定化担体に結合したヒトＡＦＰとカタラーゼ標識抗ヒ
トＡＦＰモノクローナル抗体を解離させ、更に２０ｍｌ
／分の流速で１分間蒸留水を流して反応セルを洗浄した
。

【００３３】また、０．５重量％牛血清アルブミン生理
食塩水についても同様の操作を行い、得られた電位値を
ブランク値とした。

【００３４】操作はすべて３０℃で行い酵素反応時以外
はすべてセル内で攪拌を行った。

【００３５】その結果を図２に示す。図２から明らかな
ように、物理的吸着法によりブロッキング処理を施した
膜に比べ、共有結合法によりブロッキング処理を施した
膜を使用した方が、非特異的吸着（ヒトＡＦＰ　　Ｏｎ
ｇ／ｍｌの時の電位値）が少ない。

【００３６】試験例２ 繰り返し使用に於ける感度の安定性試験後述する、比較
例１で作成したＡＦＰ測定用免疫センサー（物理的吸着
法で２．５重量％牛血清アルブミンブロッキング処理を
施した膜を使用），又は実施例１で作成したＡＦＰ測定
用免疫センサー（共有結合法で０．５重量％牛血清アル
ブミンブロッキング処理を施した膜を使用）を用い、試
験例１と同様にフロー式の測定装置を組みヒトＡＦＰの
繰り返し測定を行った。

【００３７】その結果を図３に示す。図３から明らかな
様に、物理的吸着法でブロッキング処理を施した膜の場
合、ブロッキング効果はほとんどなく、非特異的吸着も
高いことがわかる。一方、共有結合法でブロッキング処
理を施した膜の場合、非特異的吸着がほとんどなく、し
かも繰り返し使用による非特異的吸着の増加もみられな
い。

【００３８】試験例３ 各種ブロッキング処理条件の違いによる抗体固定化絹フ
ィブロイン膜の非特異的吸着比較試験 後述する、比較例１で作成したＡＦＰ測定用免疫センサ
ー（物理的吸着法で牛血清アルブミンブロッキング処理
を施した膜），又は実施例１で作成したＡＦＰ測定用免
疫センサー（共有結合法で蛋白質又はアミノ酸ブロッキ
ング処理を施した膜）を用い、試験例１と同様にフロー
式の測定装置を組み、ヒトＡＦＰの繰り返し測定を行っ
た。ヒトＡＦＰ　　Ｏｎｇ／ｍｌの電位値とブランク値
との差をヒトＡＦＰ１００ｎｇ／ｍｌの電位値で割るこ
とにより、各種ブロッキング処理条件における非特異的
吸着の比較を行った（図４）。ここで値が大きい程、非
特異的吸着が高いことを示している。

【００３９】図４から明らかな様に、共有結合によりブ
ロッキング処理を施した本発明の膜は、物理的吸着法の
場合の膜に比べて、非特異的吸着が著しく少ないことが
わかる。

【００４０】

【実施例】以下、実施例および比較例を挙げて本発明を
更に具体的に説明する。

【００４１】実施例１　　α−フェトプロテイン（ＡＦ
Ｐ）測定用免疫センサーの作成（共有結合法によるブロ
ッキング） （１）フィブロイン水溶液の調製 生糸１００ｇを１．０重量％のマルセル石けん水溶液５
０００ｍｌ中に浸漬し、８０℃で３時間精練した。水洗
後、更に０．５重量％のマルセル石けん水溶液５０００
ｍｌに浸漬して８０℃で３時間精練し、セリシン等を実
質的に除去したフィブロイン原料７２ｇを得た。水１０
０ｇとエチルアルコール８０ｇの入ったニーダー中に塩
化カルシウム１５０ｇを溶解し、７５℃に昇温後上記の
フィブロイン原料７０ｇを投入し、１時間攪拌下に溶解
した。次いで、１８０ｇの温水（７５℃）を加えて希釈
した。これを冷却した後、ホローファイバー型の透析器
を用いて、流水に対して透析脱塩し、５．７重量％のフ
ィブロイン水溶液１２００ｍｌを得た。塩化カルシウム
の残存量は０．０８重量％であった。

【００４２】（２）グルタルアルデヒド重合体の調製市
販グルタルアルデヒド水溶液を０．１Ｍホウ酸緩衝液（
ｐＨ１１．０）にて１．０重量％に希釈し、６０℃中で
１時間熱処理することによりグルタルアルデヒド重合体
（以下１重量％ＧＡ重合体と略す。）水溶液を得た。

【００４３】（３）抗ヒトＡＦＰ−１マウスモノクロー
ナル抗体固定化フィブロイン膜の製造 抗ヒトＡＦＰ−１マウスモノクローナル抗体（ＩｇＧ）
（後述するカタラーゼの標識に用いる抗体とは、ヒトＡ
ＦＰに対しての結合部位が異なるので、ＡＦＰ−１とす
る。）を生理食塩水に溶解し、２５０μｇ／ｍｌの抗体
溶液を調製した。次に、この溶液を四方を区切ったガラ
ス板上に抗体量が２０μｇ／ｃｍ２　となるように流延
し、１５℃で３時間乾燥した。前記（１）のフィブロイ
ン水溶液にグリセリンをフィブロインに対して３０重量
％加え、その溶液を抗体が塗布されたガラス板に流延し
、２０℃で１０時間乾燥することによって皮膜化させ、
剥離した。これを直径０．６ｃｍの円形に裁断し、厚さ
６０μｍの標記抗ヒトＡＦＰ−１マウスモノクローナル
抗体固定化フィブロイン膜を得た。

【００４４】（４）蛋白質又はアミノ酸によるブロッキ
ング処理 （３）で得られた膜を、（２）で製造した１重量％ＧＡ
重合体水溶液中に、室温で表１に示した条件下で浸漬し
、０．０１Ｍ生理食塩水で十分洗浄し、未反応のＧＡ重
合体を除去した。その後、この膜を、表１に示した濃度
の蛋白質又はアミノ酸を含む０．１Ｍリン酸緩衝溶液中
に、室温下，２時間浸漬することによりブロッキング処
理を行い、更にこの膜を、０．０１Ｍ生理食塩水中で十
分洗浄した後、０．１重量％ＮａＮ３　を含む０．０１
Ｍ生理食塩水中で４℃にて保存した。

【００４５】

【表１】

【００４６】（５）ＡＦＰ測定用免疫センサーの作成特
開昭６３−１１７２５３号の記載に準じ反応セル（容量
０．２ｍｌ）に（３）で得られた蛋白質又はアミノ酸ブ
ロッキング処理抗ヒトＡＦＰ−１モノクローナル抗体固
定化フィブロイン膜，酸素透過膜，ｏ−リング及びガル
バニ型酸素電極（ＡＮ型，オリエンタル電気（株）製）
を順次装着してＡＦＰ測定用の酸素検出型免疫センサー
を作成した。

【００４７】比較例１　　ＡＦＰ測定用免疫センサーの
作成（物理的吸着法によるブロッキング）フィブロイン
水溶液の調製，抗体固定化フィブロイン膜の製造，及び
ＡＦＰ測定用免疫センサーの作成は、実施例１の（１）
，（３），（５）と同様の方法で行った。

【００４８】（１）蛋白質又はアミノ酸によるブロッキ
ング処理 実施例１の（３）と同様にして製造した抗ヒトＡＦＰ−
１マウスモノクローナル抗体固定化フィブロイン膜を、
１Ｍリジン又は２．５重量％牛血清アルブミンを含有す
る０．１Ｍリン酸緩衝溶液に、室温下，２時間浸漬する
ことによりブロッキング処理を行った。更に、この膜を
０．０１Ｍ生理食塩水中で十分洗浄した後、０．１重量
％ＮａＮ３　を含む０．０１Ｍ生理食塩水中で４℃にて
保存した。

【図面の簡単な説明】

【図１】試験例１，２，３で用いたフロー式の測定装置
の概略図を表わす。

【図２】試験例１で求めた物理的吸着法（ａ），及び共
有結合法（ｂ）でブロッキング処理を施した抗体固定化
絹フィブロイン膜の非特異的吸着比較結果を示す。

【図３】試験例２で求めた物理的吸着法（ａ），及び共
有結合法（ｂ）でブロッキング処理を施した抗体固定化
絹フィブロイン膜の繰り返し測定結果を示す。

【図４】試験例３で求めた各種蛋白質又はアミノ酸ブロ
ッキング処理条件の違いによる抗体固定化絹フィブロイ
ン膜の非特異的吸着比較結果を示す。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　抗原，抗体，酵素，菌体等を固定化し
   た蛋白質膜をブロッキングするに際し、蛋白質で共有結
   合によりブロッキングすることを特徴とする、蛋白質膜
   のブロッキング方法。
2. 【請求項２】　　蛋白質膜が、抗体又は抗原を包括固定
   化した絹フィブロイン膜である、請求項１記載の蛋白質
   膜のブロッキング方法。