JPS6161068B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、免疫吸着体の製造法に関する。

人間および動物の病気の診断方法において、免
疫学的原理に基づいて微量の生体物質を測定する
ことが益々増加している。生体にとつて全く異質
の物質（抗原）が生体に与えられたとき、抗原と
反応する物質（抗体）が生体内で作られる。抗原
とそれに対応する抗体との反応を抗原抗体反応と
いい、この反応は非常に特異的である。生体物質
の免疫学的測定方法はこの抗原抗体反応に基づい
ており、たとえば生体の体液中に存在する抗体
（あるいは抗原）は、その抗体（あるいは抗原）
に対応する抗原（あるいは抗体）と接触させるこ
とにより検出あるいは測定される。このような方
法においては、抗原が結合されるかあるいは抗体
が結合された吸着体を用いるのが抗原抗体結合物
を遊離の抗原あるいは抗体より容易に分離できる
ので有利である。

抗原、抗体のような免疫反応性物質が結合され
た吸着体の製造法に関しては種々の方法が提案さ
れている。Edelmanらはポリアミド・モノフイラ
メントを塩酸処理したのち、水溶性カーボジイミ
ドを用いてコンカナバリンＡを結合した〔G.M.
Edelman.U.Rutishauser、C.F.Millette、
Proceedings of the National Academy of
Sciences of USA、第68巻、2153頁（1971）〕。ま
た、特開昭50−82229号においては、ポリアミド
粒子を塩酸により加水分解したのち遊離アミノ基
をアシル化し、次いでこれをベンチジンと反応せ
しめ、さらにこれをジアゾ化したものに免疫グロ
ブリンを結合することが提案されている。

しかしながら、これらの免疫吸着体の製造法に
おいてはポリアミドの末端カルボキシル基あるい
は（および）アミノ基が用いられているが、これ
らの末端基の数が少ないために多量の免疫反応性
物質が結合できず、その結果、得られた免疫吸着
を用いて免疫学的測定を行うに際して十分な感度
あるいは測定範囲が得られないという欠点があつ
た。

本発明者らはこの点にかんがみ、多量の免疫反
応性物質が結合された吸着体を製造する方法につ
いて鋭意研究した結果、本発明に到達したもので
ある。

すなわち、本発明は、カルボキシル基を有する
高分子物質からなる固体表面とポリアミンとを反
応させて固体表面にアミノ基を導入し、しかるの
ち該固体表面のアミノ基とポリカルボン酸無水物
とを反応させて固体表面に酸無水物基を導入した
のち、該固体表面の酸無水物基と免疫反応性物質
とを反応させて固体表面に免疫反応性物質を結合
することを特徴とする免疫吸着体の製造法を要旨
とするものである。

本発明に用いられるカルボキシル基を有する高
分子物質としては、たとえばポリアミド、ポリエ
ステル、ポリ（メタ）アクリル酸、ポリ（メタ）
アクリル酸エステル、ポリマレイン酸、ポリ無水
マレイン酸などがあげられるが、カルボキシル基
を有しない高分子物質に、あとからカルボキシル
基を導入したものであつてもよい。そのような高
分子物質としては、たとえばポリビニルアルコー
ル、でんぷん、セルロースなどの水酸基を有する
高分子物質にモノクロル酢酸を反応させることに
よりカルボキシル基を導入したものがあげられ
る。カルボキシル基は高分子物質の末端基として
存在していてもよいし、あるいは側鎖あるいは主
鎖に存在していてもよい。また、ポリアミノスチ
レンのような芳香族アミノ基を有する高分子物質
に亜硝酸あるいはホスゲンなどを反応させること
によりそれぞれジアゾニウム塩の基、クロロホル
ミル基などを導入したものがあげられる。

カルボキシル基を有する高分子物質は、たとえ
ばモノフイラメント、ステーブル、紡績糸、不織
布、織物、編物、フイルム、中空糸、チユーブ、
皮膜、多孔性膜、スポンジ、粉末、ビーズなどの
形状に加工される。また、高分子物質にカルボキ
シル基を導入する前に上記のような形状への加工
を行い、しかるのち加工された固体表面に前記の
ような方法でカルボキシル基を導入することもで
きる。

本発明におけるポリアミンとは少なくとも２個
のアミノ基を有する化合物であり、たとえばエチ
レンジアミン、ヘキサメチレンジアミン、ジエチ
レントリアミン、トリエチレンテトラミン、ポリ
エチレンイミン、ジ（２−アミノエチル）メチル
アミン、ジ（２−アミノエチル）エチルアミン、
Ｎ・Ｎ−ジメチル−１・３−プロパンジアミン、
アミノアセタール化ポリビニルアルコール、ポリ
ビニルアミン、ポリリジン、ポリアミノスチレ
ン、ポリ（ｐ−アミノフエニルアラニン）などが
あげられる。

本発明においては、まずカルボキシル基を有す
る高分子物質からなる固体表面とポリアミンとを
反応させて固体表面にアミノ基を導入する。その
ためにはポリアミンが液体である場合はポリアミ
ンそのものを固体表面に接触させればよいが、ポ
リアミンをたとえばメタノール、エタノール、プ
ロパノール、ジオキサン、テトラヒドロフラン、
水あるいはこれらの混合溶媒に0.1重量％、好ま
しくは１重量％以上の濃度になるように溶解し、
得られた溶液を固体表面に接触させることもでき
る。ポリアミンが固体である場合は上記のように
して得られた溶液を固体表面に接触させればよ
い。処理温度の範囲は−20〜100℃、とくに０〜
80℃が好ましく、処理時間の範囲は10分〜24時
間、とくに30分〜５時間が好ましい。ポリアミン
との反応の際、必要に応じて脱水縮合剤を使用す
ることができる。脱水縮合剤としては、たとえば
Ｎ・N′−ジシクロヘキシルカーボジイミド、１
−シクロヘキシル−３−〔２−モルホリノ−(4)−
エチル〕カーボジイミド−メト−パラ−トルエン
スルホネート、ジフエニルホスホリルアジド、Ｎ
−エチル−５−フエニルイソオキサゾリウム−
3′−スルホネート、ジフエニルケテン−ｐ−トリ
ルイミン、Ｎ・N′−カルボニルジイミダゾール
などがあげられる。ポリアミンを固体表面と反応
させる場合は必要に応じて撹拌、振盪、循環など
の方法により表面を更新することが好ましい。

本発明においては、次に前記のようにして導入
された固体表面のアミノ基とポリカルボン酸無水
物とを反応させて固体表面に酸無水物基を導入す
る。そのためにはポリカルボン酸無水物を、たと
えばジオキサン、ヒドロフラン、アセトンなどの
有機溶媒に溶解した溶液を固体表面に接触させれ
ばよい。ポリカルボン酸無水物の濃度の範囲は
0.001〜30重量％が好ましく、処理温度の範囲は
０〜80℃が好ましく、処理時間の範囲は５分〜24
時間が好ましい。反応の際、必要に応じてポリカ
ルボン酸無水物を溶解した溶液を撹拌するか、あ
るいは固体表面を振とうさせることが好ましい。

本発明に用いられるポリカルボン酸無水物とし
ては、たとえば無水マレイン酸−メチルビニルエ
ーテル共重合体、無水マレイン酸−エチレン共重
合体、無水マレイン酸−スチレン共重合体などが
あげられる。

本発明に用いる免疫反応性物質とは、たとえば
抗原、抗体のような免疫学的な結合を生成しうる
物質のことをいう。抗原とは、抗原抗体反応を誘
起しうる物質のことであり、一般にはペプチド、
蛋白、多糖類、グルコプロテイン、ステロイドな
どである。抗体とは、抗原の刺激により生体内に
作られ抗原と特異的に結合する蛋白質のことであ
り、その化学的な実体は免疫グロブリンである。
本発明に特に適した免疫反応性物質としては、た
とえば細菌、糸状菌、酵母、原生動物、ビールス
のような微生物、それらの免疫学的活性成分、人
および動物から分離された抗体、血清成分、毒
素、ホルモン、酵素、アルカロイド、細胞、組織
の抽出物、血液細胞、レクチンなどがあげられ
る。

本発明においては、次にこのような免疫反応性
物質と固体表面に導入された酸無水物基とを反応
させて固体表面に免疫反応性物質を結合する。そ
のためには、酸無水物基が導入された固体表面
と、免疫反応性物質を含む液とを接触させればよ
い。これらの処理における温度範囲は−20〜80
℃、とくに０〜60℃が好ましく、処理時間の範囲
は１分〜72時間、とくに５分〜24時間が好まし
い。

このようにして製造された免疫吸着体に細胞を
含む液、血液、血漿、血清、尿などの試料を接触
させることにより抗原や抗体を検出するかあるい
は測定することができる。試料中に適当な抗原あ
るいは抗体が存在する場合には抗原抗体結合物が
生成する。抗原抗体結合物は検鏡、色の変化、沈
澱、凝集反応などにより確認することができる
か、あるいは放射能、螢光、酵素活性などにより
測定することができる。

本発明により製造された免疫吸着体には多量の
免疫活性物質が結合しているのでこの吸着体を用
いて免疫学的測定を行う場合に高い測定感度ある
いは広い測定範囲が得られるという特長がある。

本発明により得られた免疫吸着体は生体物質の
分離、精製にも使用することができる。たとえば
特定の抗体が結合された吸着体を用いてアフイニ
テイークロマトグラフイーを行えばその抗体の抗
原である酵素を精製することができる。また、ホ
ルモン、ハプテン、蛋白などもそれらの抗体が結
合された吸着体を用いて精製することができる。
そのほかコンカナバリンＡなどのレクチン、抗グ
ロブリンなどが結合された吸着体を用いて細胞の
分離、精製を行うことができる。

以下、実施例を挙げて本発明をさらに具体的に
説明する。

実施例 １ 厚さ150μのナイロン６フイルムを直径15mmの
円形に切断しデイスクを作成した。得られたナイ
ロン・デイスク10枚をメタノール、引き続き蒸留
水により洗浄した後下記のように処理した。

(1) 3N−HCl水溶液中に30℃で振盪しながら30分
間浸漬した後、蒸留水で洗浄した。

(2) ついで10重量％ポリエチレンイミン水溶液40
mlとメタノール50mlとからなる混合液中に室温
で振盪しながら30分間浸漬した後、ジシクロヘ
キシルカーボジイミド１ｇをメタノール20mlに
溶解した溶液を添加し、引き続き室温で振盪し
ながら２時間浸漬した。得られたデイスクをメ
タノールで洗浄後、乾燥した。

(3) ついで無水マレイン酸−メチルビニルエーテ
ル共重合体２ｇをドライアライトにて脱水した
アセトン50mlに溶解して得られる溶液中に室温
で振盪しながら１時間浸漬し、脱水アセトンに
洗浄後、乾燥した。

(4) ついでヒト免疫グロブリンＧ（ヒトIgG）に
対するウサギの抗血清より調製された（抗ヒト
IgG）IgG画分を含むリン酸緩衝液（0.5mg／
ml、PH7.0）10ml中に浸漬して４℃で一夜放置
した後、上記緩衝液にて洗浄した。

上記のようにして得られた（抗ヒトIgG）IgG
が結合されたナイロン・デイスクを3N−塩酸水
溶液を用いて40℃で１時間加水分解し、可溶化さ
れた（抗ヒトIgG）IgGをLowry法で比色したと
ころ、フイルム面積１cm²あたり10μｇの（抗ヒト
IgG）IgGが結合していることがわかつた。

比較のためEdelmanの方法により（抗ヒト
IgG）IgGを結合した場合は、フイルム面積１cm²
あたり２μｇの（抗ヒトIgG）IgGしか結合して
いないことがわかつた。

比較のため、実施１における(3)の操作を行なわ
ず、かつ(4)の操作を下記(4)′のように変更したほ
かは実施１と同様にして（抗ヒトIgG）IgGを結
合した。

(4)′ ついで１−シクロヘキシル−３−〔２−モル
ホリニノ−(4)−エチル〕−カーボジイミド−メ
ト−パラ−トルエンスルホネート200mgとヒト
免疫グロブリンＧ（ヒトIgG）に対するウサギ
の抗血清より調製された（抗ヒトIgG）IgG画
分とを含むリン酸緩衝液（0.5mg／ml、PH7.0）
10ml中に浸漬して４℃で一夜放置した後、上記
緩衝液にて洗浄した。

このようにして得られた（抗ヒトIgG）IgGが
結合されたナイロン・デイスクを実施例１と同様
にして分析したところ、フイルム面積１cm²あたり
７μｇの（抗ヒトIgG）IgGしか結合していない
ことがわかつた。

なお、（抗ヒトIgG）IgGが結合されているナイ
ロン・デイスクはヒトIgGの測定に用いられる。

実施例 ２ （抗ヒトIgG）IgGのかわりに（抗α−フエト
プロテイン）IgGを用いたほかは実施例１と同様
な方法で（抗α−フエトプロテイン）IgGをナイ
ロン・デイスクに結合した。得られた免疫吸着体
はα−フエトプロテインの測定に用いられる。

実施例 ３ 厚さ125μのポリエチレンテレフタレート・フ
イルムを直径15mmの円形に切断し、ポリエステル
デイスクを作成し、実施例１における(1)の操作を
下記(1)′のように変更したほかは実施例１と同様
にして（抗ヒトIgG）IgGを結合した。

(1)′ 1N−NaOH水溶液、引き続き0.1N−HCl水
溶液にて１時間ずつ煮沸処理した後、蒸留水に
て洗浄した。

得られたポリエステル・デイスクにはフイルム
面積１cm²あたり８μｇの（抗ヒトIgG）IgGが結
合していることがわかつた。

実施例 ４ （抗ヒトIgG）IgGのかわりにコンカナバリン
Ａを用いたほかは実施例３と同様な方法でコンカ
ナバリンＡをポリエステル・デイスクに結合し
た。

得られた免疫吸着体は腫瘍細胞、赤血球、胸腺
細胞、リンパ球などの細胞の分離に用いられる。

実施例 ５ ナイロン６・フイルムのかわりにナイロン６の
モノフイラメント、ステープル、タフタ、チユー
ブ、粉末、ビーズあるいは不織布を用いたほかは
実施例１と同様な方法で（抗ヒトIgG）IgGを結
合した。実施例１の場合と同様にそれぞれの固体
表面に（抗ヒトIgG）IgGが結合していることを
確認した。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ カルボキシル基を有する高分子物質からなる
   固体表面とポリアミンとを反応させて固体表面に
   アミノ基を導入し、しかるのち該固体表面のアミ
   ノ基とポリカルボン酸無水物とを反応させて固体
   表面に酸無水物基を導入したのち、該固体表面の
   酸無水物基と免疫反応性物質とを反応させて固体
   表面に免疫反応性物質を結合することを特徴とす
   る免疫吸着体の製造法。 ２ 高分子物質がポリアミドである特許請求の範
   囲第１項記載の製造法。 ３ 高分子物質がポリエステルである特許請求の
   範囲第１項記載の製造法。 ４ ポリカルボン酸無水物が無水マレイン酸共重
   合体である特許請求の第１項記載の製造法。 ５ 免疫反応性物質が抗原である特許請求の範囲
   第１ないし４項のいずれか記載の製造法。 ６ 免疫反応性物質が抗体である特許請求の範囲
   第１ないし４項のいずれか記載の製造法。