JP2008505106A - ハイスループットプロテオミクス - Google Patents
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- C12N2800/70—Vectors containing special elements for cloning, e.g. topoisomerase, adaptor sites
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- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Abstract
Description
本出願は、米国特許仮出願第60/585351号(2004年7月1日出願)および第60/638624号(2004年12月23日出願)の利益を主張する。これら出願のそれぞれの内容を参照によりここに取り込む。
(連邦政府の支援によりなされた発明への発明の権利に関する供述)
本研究は国立衛生研究所/国立アレルギー・感染症研究所により一部支援された。米国政府は本発明に対して一定の権利を有する。
ベクターおよびインサートの調製
N末端ヒスチジンタグおよびC末端HAタグをコードする線状T7ベクターを広範な制限分解により、その後のPCRにより作製した。この処理は、相補的インサートを用いずに化学的形質転換受容性E.コリ(E.coli)を形質転換したとき、残留環状ベクターおよびバックグラウンドコロニーをほぼ0にまで減少させた。
インビボの組み換えおよびコロニーの選択
PCRで増幅された実施例1のORFおよび線状T7ベクターの混合物を混合し、化学的形質転換受容性E.コリ内へ導入し、インサートを含むプラスミドを有する形質転換コロニーが生じた。この高効率の形質転換クローニング法はORFのフレーム方向性挿入をもたらした。
インビトロ転写およびタンパク質の翻訳検出
図4に示すプラスミド上にコードされたタンパク質は、T7RNAポリメラーゼが補充されたE.コリベースの無細胞インビトロ転写/翻訳系で発現させた。それぞれのミニプレップのプラスミド鋳型0.5μgをQiagenのミニプレップキットを使用し、RNAse活性を枯渇させるためのタンパク質変性剤を含む「任意の」段階を含ませて、調製した。この段階が含まれなかった場合、インビトロ転写/翻訳反応での発現レベルは低くなり不整合なものになる。25μlの反応量を用いるインビトロ転写/翻訳反応(Roche RTS 100 E.コリ HY キット)を、0.2mlPCR 12−ウェルストリップチューブ中に設定し、製造会社の取り扱い説明書に従って30℃で5時間インキュベートした。マウス抗ヒスチジン抗体およびアルカリフォスファターゼと結合したヤギ抗マウス抗体を使用してウェスタンブロット法を実施した。
マイクロアレイおよび血清学的スクリーニング
Cangene(Winnipeg、Canada)より市販されているワクチニア免疫グロブリン(VIG)を使用した。VIGは多数のドナーよりプールされた過免疫血清の免疫グロブリン分画である。これは全身性ウィルス血症およびワクチニア予防接種に対する他の副作用に陥っている人々のための緊急治療に使用される。
マイクロアレイ
図8は図7に表した免疫ドットブロットのために使用した同じRTS反応物を使用するパイロットマイクロアレイを示す。マイクロアレイのために、まず15μl量を384ウェルプレートに移し、1600xgで遠心分離してすべての沈殿をペレット化し、上清はこれ以上精製は行わずにニトロセルロース被覆FAST(商標)スライドグラス(Schleicher&Schuell Bioscience)上にOmni Grid 100マイクロアレイプリンター(Gene Machines)を使用して転写した。すべての染色のために、スライドはまずタンパク質アレイブロッキングバッファー(Schleicher&Schuell)中で1時間遮断し、ドットブロットのために同一の1次および2次抗体で染色し(JacksonによるCy3結合2次抗体)、共焦点レーザースキャナーでスキャンした。蛍光強度はQuantArrayソフトウェア(GSI Lumonics, Inc)を使用して定量した。ドットブロットおよびアレイで全のRTS反応物を使用するとき、VIGはどのような抗原特異的応答をも隠す抗E.コリ抗体の高い力価を有する。これはE.コリ溶解物の免疫ブロットに対するVIGの吸着により、またはVIGへの大腸菌溶解物の添加により克服された。前者の方法において、大腸菌はSDS PAGEサンプルバッファーに可溶化され、溶解物はOptitranニトロセルロース膜(Schleicher&Schuell)に移す前に調製ゲル上で分離された。ブロットは次に小片(5x5mm)に切り分け、5%脱脂粉乳中で1時間遮断した。この小片は次いで洗浄し、あらかじめブロッキングバッファーで1/1000に希釈したVIG内に置き、一定の撹拌を行いながら1時間インキュベートした。E.コリ溶解物は1リットルのE.コリ(DH5)の静止期培養物から作製し、25mlのTBS‐Tweenに再懸濁し、直径2cmのプローブにより超音波で分解する。1mlのアリコートを−80℃で保存した。
形質転換混合物からのプラスミドの調製
実施例2から5における更なる評価のために単一コロニーを選択するよりも、実施例2に記載したように得られた形質転換混合物を、所望のインサートを含むプラスミドの源として使用した。上記のように、それぞれの形質転換は:10μlの形質転換受容性DH5αおよび10μlのDNA混合物(40ngのPCR作製線状ベクター、10ngのワクチニア由来PCR作製ORFフラグメント;ベクター:1kbORFフラグメントのモル比1:1)で構成した。この混合物を氷上で45分インキュベートし、ヒートショック(42℃、1分)を与え、氷上で1分冷やし、250μlのSOC培地(トリプトン2%、酵母エキス0.55%、NaCl10mM、KCl10mM、MgCl210mM、MgSO410mM、20mMブドウ糖)と混合し、37℃で1時間インキュベートし、LB(Luria Bertani Medium)3mlに、1ml当り50μgのカナマイシン(LB Kan 50)を補って希釈し、振とうしながら一晩インキュベートした。プラスミドをこの培養物からコロニーの選択はせずに単離し、精製した。得られたプラスミド鋳型を上述の実施例で述べたように実質的に翻訳し、以下のように免疫ドットブロットに移した。
同様のプロフィールはマカクおよびマウス由来の血清にも見られる(図14B)。種特有の応答(例えば、A3LまたはA4Lはマウスのみ)がある一方で、ヒトおよび動物モデルのどちらかに共通に認識されるものも多くあり、10のタンパク質が3種すべてに認識された(表1)。これら特定の抗原がヒトにおける使用に関するワクチンの前臨床検査のための優先候補であろう。全般的に、ウィルスの構造タンパク質に対する応答は、エンベロープタンパク質であるこれらの半数以上による応答に優勢である(表1)。血清反応陽性であるこれらタンパク質は、膜貫通ドメインを含有しおよび含有しない、シグナルペプチドを含有しおよび含有しない、およびPI範囲が4〜10のタンパク質を含んでいた。さらに、これらのタンパク質のいくつかは、動物およびヒトにおいて液性応答を生じる一方、他は有さないことがすでに報告されている。
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VACV−Cop=ワクチニアウィルス・コペンハーゲン株
VACV MVA=ワクチニアウィルス・ウィルス改変アンカラ株
VACV−AMVA=ワクチニアウィルス・アカンビス(Acambis)3000MVA株
VACVWR=ワクチニアウィルス・ウェスタンリザーブ(Western Reserve)株
VACV−TAN=ワクチニアウィルス・天壇(Tian Tan)株
CPXV−GRI=牛痘GRI−90株
RPV−UTR=家兎痘ウィルス・ユトレヒト株
VARV−GAR=大痘瘡ウィルス・ガルシア(Garcia)株
VARV−BSH=大痘瘡ウィルス・バングラデシュ株
VARV−IND=大痘瘡ウィルス・インド株
CMLV−CMS=ラクダ痘ウィルス・CMS株
CMLV−M96=ラクダ痘ウィルス・M96株
ECTV−NAV=欠肢症ウィルス・ナバル(Naval)株(未発表)
ECTV−MOS=欠肢症ウィルス・モスクワ株
CPXV−BR=牛痘ウィルス・ブライトンレッド(Brighton Red)株
MPXV−ZRE=サル痘ウィルス・ザイール‐96‐I‐16株
単一コロニー/クローンよりまたは形質転換培養物の混合物より単離したプラスミドを使用するタンパク質発現の比較
上記のように、F.ツラレンシス由来のサイズ300bpから2000bpまでの範囲の28の標的遺伝子を選択し、20bpの遺伝子特異的配列および線状pIX発現ベクター(T7プロモーターおよびN末端ポリヒスチジン融合を与える)の対応する末端に相同な30bpのアダプター配列を含むプライマーを使用してPCRにより増幅した。
ワクチニアエンベロープタンパク質H3Lを、図15に示すように、50個のアミノ酸の、10個の重複セグメントに分割した。各セグメントについて、表3に示すように、長さ53bpのフォワードおよびリバースプライマーを設計した。これらのプライマー配列は、BamH1部位で線状化されたときのpXiベクター(ソース)の末端に相補的なDNAの33bpおよび特異的セグメントの末端に相補的なDNAの20bpを含む。
ビーズに固定したタンパク質を使用したT細胞活性化の検出
上記の方法を使用して、問題としている生物(例えば、ワクチニア)の実質的にすべてのプロテオームをT7ベクター(pTX7)使用してクローン化し、タンパク質をインビトロ無細胞系を使用して発現させた。各タンパク質をベクターに挿入するために使用したアダプターはポリHis‐タグを含むので、発現タンパク質はあらかじめローディングバッファー(300mMNaCl、50mMリン酸ナトリウム、10mMイミダゾール、pH8.0)で平衡化してあるニッケル被覆ビーズ上に捕捉される。ニッケル被覆ビーズはさまざまなサイズでよいが、通常直径約10〜20ミクロンであるAPC細胞より小さいほうが有利である。1〜3ミクロンのニッケル被覆ビーズが入手可能であり、この目的に効果的である。タンパク質被覆ビーズは次いで洗浄バッファー(イミダゾールが20mMである以外は上記の通り)で5回洗浄し、2回の組織培養培地で洗浄し、原体積12.5μlの無血清培地に再懸濁した。96ウェル測定フォーマット中でT細胞と組み合わせる前に、これらのビーズを抗原提示細胞とともにインキュベートした。
APCにおけるタンパク質の発現を使用したT細胞活性化の検出
問題としている生物(例えば、ワクチニア)の実質的にすべてのプロテオームをCMV(gWIZ)ベクターにクローン化する。プラスミドは、脂質送達を使用して(InvitrogenのLipofectin(商標)、Bio−Radのトランスフェクション試薬・Cytofectene(商標)またはRoche Applied Scienceのトランスフェクション試薬・FuGENE6(商標)などの専用の脂質試薬を使用した「リポフェクション(Lipofection)」による。ここにこの全体を参照により組み込むFelgner, et al, Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA.. Nov. 1987 84(21), 7413−7,を参照)、抗原提示細胞(APC)に導入し1日後、タンパク質が96ウェル測定フォーマットにおいてT細胞と組み合わせる前に発現可能にした。病原菌(例えば、腹腔内に投与した2x105pfuワクチニア)によりあるいは腹腔内または尾底部皮下に投与したアジュバントの個々の組み換えタンパク質により免疫されたマウスから、または感染した/免疫されたヒトドナーの末梢血から応答T細胞を得た。マウスの場合、免疫化の7〜10日後、脾臓または脱水リンパ節を取り上げた。次に、形質移入された抗原提示細胞を、抗マウスまたは抗ヒトIFN‐γ(Pharmingenによる)を用いて事前に被覆されおよび10%(FCS)(ハツカネズミ測定用)または5%ヒトAB血清(ヒト測定用)含有組織培養培地で1時間遮断されたマルチスクリーン96ウェルプレート(Millipore MAHAS45)内のハツカネズミ脾細胞またはヒトPBMC(5x105細胞/ウェル)に加えた。
マラリア(P.ファルシパルム)を使用した抗原同定方法の検証
218のP.ファルシパルム(Pf)遺伝子のセットをクローニング、発現およびタンパク質マイクロアレイチップ転写のために選択した。これら遺伝子は細胞内局在性(例えば、分泌タンパク質および細胞培養上清におい見られる他のタンパク質)、P.ファルシパルムのヒトおよび動物モデルにおける周知の免疫原性およびP.ファルシパルムの成長状態に対する遺伝子発現パターンに基づいて選択した。それぞれは9の分類のうちの1つに当てはまる:i)バイオインフォマティクス基準のみにより同定されている(n=25);ii)P.ヨエリ(P.yoelii)肝臓期のレーザーキュプチャー顕微解剖により同定され、MudPIT(n=16)によりスポロゾイトプロテオームにおいて同定されている;iii)Py肝臓期のレーザーキュプチャー顕微解剖により同定されているタンパク質のPfオルソログ、しかしスポロゾイトのプロテオーム(肝臓期特異的;n=52)中には発見されていない;iv)MudPITによるスポロゾイトのプロテオーム中で高度に発現される(n=10);v)MudPITによるスポロゾイトのプロテオーム中で同定され、放射線照射したスポロゾイト(irr−spz)免疫されたボランティア由来のPBMCによる免疫認識について測定された(n=27);vi)臨床開発における知られていてよく特性決定されているPf抗原(n=21);vii)Affymetrix遺伝子チップによるスポロゾイトの遺伝子転写プロファイルにより示されたスポロゾイト期に高度に発現されるもの(n=53);viii)MudPITにより栄養型および繁殖体期プロテオームにおいて同定されているもの(n=11);およびix)インビトロで保護的であると指摘されているP.ヨエリのP.ファルシパルムオルソログ(n=2)。これらの分類のどれにも当てはまらない、対象となる1つの追加の遺伝子、PFB0645cも含まれた。
P.ヨエリ:PY05967(MSP4/5関連)
P.ヨエリ:PY07543(MSP4/5)
PFE1590w:
P.ヨエリ:PY02667(内在性膜タンパク質)
PFB07_0128:
P.ファルシパルム:Chr.13、MAL13P1.60(赤血球結合抗原140)
P.ファルシパルム:Chr.1、PFA0125c(Ebl−1様タンパク質、推定)
P.ファルシパルム:Chr.1,PFA0065w(仮想タンパク質)
P.ファルシパルム:Chr.4,PFD1155w(赤血球結合抗原、推定)
P.ヨエリ:PY04764 ダフィー受容体、ベータ型前駆体)
PF10_0343:
P.ヨエリ:PY04926(仮想タンパク質)
PF13_0197:
P.ファルシパルム:CHR13/MAL13P1.173/MSP7様タンパク質
P.ファルシパルム:CHR13/MAL13P1.174/MSP7様タンパク質
P.ファルシパルム:CHR13/PF13_0193/MSP7様タンパク質
P.ファルシパルム:CHR13/PF13_0196/MSP7様タンパク質
P.ファルシパルム:CHR13/PF13_0197/メロゾイト表面タンパク質7前駆体、MSP7
P.ヨエリ:PY02147/サツマイモネコブセンチュウ(Meloidogyne incognita)COL−l−関連
PF14_0486:
P.ヨエリ PY05356 (伸長因子2)
PF08_0054:
P.ヨエリ PY06158 (ヒートショックタンパク質70)
PF11_0344:
P.ヨエリ PY01581 (頂端膜抗原1)
マラリアワクチンおよび診断テスト
実施例11において得たデータセットを基に、タンパク質のまたはこのタンパク質をコードする核酸のカクテルをワクチン組成物のために選択した。これらの結果に基づいたマラリアワクチンカクテルは、以下の遺伝子または対応するペプチドを少なくとも3種および4種もしくはそれ以上または5種もしくはそれ以上を含み、またはこれらのすべてを含むことができる:PFB0300c、PFE1590w、FB0915w、PFB0310c、PFB0310w、PF11_0509およびPF10_0343。このワクチンは、提供された患者の免疫系が弱められることがなければ、賦形剤、マラリアの危機にあるヒト対象を免疫するここに記載の組成物および方法を使用して投与される。
フランシセラ・ツラレンシスにおいて同定された抗原性タンパク質
F.ツラレンシス由来の実施例1Dのタンパク質を使用した上記の方法に続いて、野兎病菌の非感染性株に曝露されたマウス由来のまたは毒性のSchu S4変異株に曝露されたマウス由来の血清と反応性である多くの抗原性タンパク質が同定された。これらのタンパク質のデータは下記の表5および6である。タンパク質に関する配列はウェブアドレスwww.ncbi.nlm.nih.gov/gquery/gquery.fcgiでオンラインで利用可能なGenBamkのデータベースにおいて利用可能である。表中の遺伝子コードは同定された遺伝子およびタンパク質に関する遺伝子座タグに対応する。
シュードモナス・エルギノーサ(Pseudomonas aeruginosa)PAO1
シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)KT2440
レジオネラ・ニューモフィラ(Legionella pneumophila)
コクシエラ・バーネッティ(Coxiella burnetii)RSA 493株
レジオネラ・ニューモフィラ ランス(Lens)株
レジオネラ・ニューモフィラ パリ(Paris)株
コクシエラ・バーネッティdnaK
レジオネラ・ニューモフィラgrpE、dnaK、dnaJ
サルモネラ・エンテリカ(Salmonella enterica)
サルモネラ・エンテリカ 血液型亜型チフス菌(Salmonella enterica serovar Typhi (Salmonella typhi))CT18株
アシネトバクター種(Acinetobacter sp.)ADP1
キセノラブダス・ネマトフィラ(Xenorhabdus nematophila)GroEL様タンパク質遺伝子
エルトール型O1ビブリオコレラ菌 N16961株 染色体 I
シュードモナス・エルギノサ(Pseudomonas aeroginosa)PAOl
GroESタンパク質相同体、GroELタンパク質相同体のクレブシエラ・ニューモニエ(Klebsiella pneumoniae)遺伝子
GroESタンパク質相同体、GroELタンパク質相同体のエンテロバクター・アグロメランス(Enterobacter agglomerans)遺伝子
GroESタンパク質相同体、GroELタンパク質相同体のエンテロバクター・アズブリエ(Enterobacter asburiae)遺伝子
シュードモナス・エルギノサGroEL(mopA)遺伝子
GroESタンパク質相同体、GroELタンパク質相同体のシュードモナス・エルギノサ遺伝子
GroES、GroELについてのシュードアルテロモナス種(Pseudoalteromonas sp.)PS1M3遺伝子
デルマセンタ・アルビピクス(Dermacentor albipictus)クローンTIGの野兔病菌内共生体17kDaリポタンパク質遺伝子
デルマセンタ・バリアビリス(Dermacentor variabilis)クローン01−109の野兔病菌内共生体17kDaリポタンパク質遺伝子
デルマセンタ・オクシデンタリス(Dermacentor occidentalis)クローン02−241の野兔病菌内共生体17kDaリポタンパク質遺伝子
デルマセンタ・ハンテリ(Dermacentor hunteri)クローン01−113の野兔病菌内共生体17kDaリポタンパク質遺伝子
デルマセンタ・アンデルソニ(Dermacentor andersoni)クローン01−151−1の野兔病菌内共生体17kDaリポタンパク質遺伝子
デルマセンタ・アンデルソニ(Dermacentor andersoni)クローン01−171の野兔病菌内共生体17kDaリポタンパク質遺伝子
デルマセンタ・ニテンス(Dermacentor nitens)クローンDnT2−lの野兔病菌内共生体17kDaリポタンパク質遺伝子
デルマセンタ・ハンテリ(Dermacentor hunteri)クローン02−249の野兔病菌内共生体17kDaリポタンパク質遺伝子
デルマセンタ・ハンテリ(Dermacentor hunteri)クローン01−112の野兔病菌内共生体17kDaリポタンパク質遺伝子
デルマセンタ・アンデルソニ(Dermacentor andersoni)クローン02−31の野兔病菌内共生体17kDaリポタンパク質遺伝子
シュードモナス・プチダ KT2440
シュードモナス・シリンゲ・パソバール・トマト(Pseudomonas syringae pv. tomato)DC3000株
シュードモナス・エルギノサPAO1
キサントモナス・アクソノポディス・パソバール・シトリ(Xanthomonas axonopodis pv. citri)306株
キサントモナス・カンペストリス・パソバール・カンペリトリス(Xanthomonas campestris pv. campestris)ATCC 33913株
フォトバクテリウム・プロフォンダム(Photobacterium profondum) SS9
メチロコックス・カプスラタス(Methylococcus capsulatus)バス(Bath)株
レジオネラ・ニューモフィラ パリ株
レジオネラ・ニューモフィラ ランス株
ブラデリゾビウム・ジャポニカム(Bradyrhizobium japonicum)USDA 110 DNA
シュードモナス・エルギノサPAO1
シュードモナス・エルギノサビオチンカルボキシルキャリアタンパク質およびビオチンカルボキシラーゼ(accBおよびaccC)遺伝子
レジオネラ・ニューモフィラ亜種ニューモフィラ フィラデルフィア1株
レジオネラ・ニューモフィラ パリ株
パスツレラ・ムルトシダ(Pasteurella multocida)亜種ムルトシダ Pm70株
レジオネラ・ニューモフィラ ランス株
メチロコックス・カプスラタス バス(Bath)株
シゲラ・フレックスネリ(Shigella flexneri)2a株
サルモネラ・ティフィムリウム(Salmonella typhimurium) LT2
シゲラ・フレクスネリ(Shigella flexneri)2a 2457T株
マイコバクテリウム・ツベルクロシス由来の抗原性タンパク質
マイコバクテリウム・ツベルクロシスH37Rv由来の実施例1Cのタンパク質を使用した上記の方法にしたがい、以下の抗原性タンパク質が同定された(選択された知られているの変異体およびオルソログもまた限定しない例として記載。)
変異体/オルソログ:Mb2765c(M.ボビス(M.bovis))
ML0981(M.レプラエ(M.leprae)
変異体/オルソログ:Mb0448(M.ボビス)
ML0317(M.レプラエ)
変異体/オルソログ:Mb1891(M.ボビス)
変異体/オルソログ:Mb3789 (M.ボビス)
ML1966(M.レプラエ)
変異体/オルソログ:Mb2765c(M.ボビス)
変異体/オルソログ:Mb3905(M.ボビス)
マイコバクテリウム・ツベルクロシス由来の抗原性タンパク質
マイコバクテリウム・ツベルクロシスH37Rvの312の発現遺伝子由来のタンパク質をウサギ、マウスおよびサルからの血清により、上記の方法および実施例1Cで得た遺伝子によるタンパク質を使用して試験した。以下の表はそれぞれの種からの血清を使用して検出した抗原を記載する。各タンパク質は公的に利用可能なGenBankデータベースで使用されている遺伝子に対応する遺伝子座タグにより同定した。非感染動物からの血清は記載の抗原すべてに反応し、TB‐感染動物からの血清のみにより検出された抗原は太字で強調表示して記載されている。
結核ワクチンおよび診断テスト
実施例15にて得たデータのセットよりタンパク質またはタンパク質をコードする核酸のカクテルをワクチン組成物のために選択した。これらの結果に基づく結核診断テストまたはワクチンカクテルは以下の遺伝子または対応するペプチドを少なくとも3種含み、または4種もしくはそれ以上または5種もしくはそれ以上またはこれらのすべてを含むことができる。Rv0440、Rv0467、Rv0475、RV0538、Rv0674、Rv0685、Rv0798c、Rv0916c、Rv0934、Rvl801、Rvl860、Rvl926c、Rvl980c、Rvl984c、Rv2007c、Rv2031c、Rv2190c、Rv2220、Rv2376c、Rv2389c、Rv2446c、Rv2744c、Rv2873、Rv2875、Rv2875、Rv3270、Rv3330、Rv3333c、Rv3418c、Rv3763、Rv3803c、Rv3828c、Rv3846、Rv3874、Rv3875、Rv3881cおよびRv3914。特に適切な抗原は多種の感染動物からの血清に特異的に反応するものを含み、これら抗原はRv0440、Rvl801、Rv2031c、Rv2376c、Rv2875、およびRv3875を含む。さらに特に重要なものは感染したサル由来の血清により特異的に認識される抗原であり、これらはRv0440、Rv0475、Rvl801、Rvl980c、Rv2220、Rv2873、Rv2875、Rv3270、Rv3763およびRv3875を含む。ワクチンまたは診断テストはしたがって、これらの抗原のいずれかから選択された2種もしくはそれ以上または3種もしくはそれ以上または4種より多くのタンパク質または核酸を含む。
Claims (67)
- 所望のヌクレオチド配列のための発現系を得る方法であって、
形質転換された細胞の混合物より前記発現系を抽出することを含み、
前記混合物は、個別のクローンを単離することなく培養物より前記細胞を収集することにより得られたものであり、前記培養物は、前記ヌクレオチド配列のための発現系を用いてまたは前記発現系の成分を用いて、宿主細胞を形質転換することにより得られたものである
前記方法。 - 前記発現系がプラスミド上に含まれている、請求項1に記載の方法。
- 前記プラスミドが、前記ヌクレオチド配列および線状プラスミドを含む核酸の前記細胞中の相同的組み換えにより得られる、請求項2に記載の方法。
- 少なくとも1つのアダプターを含み、前記アダプターは、前記線状プラスミドの少なくとも1つの末端に相補的でありおよび前記ヌクレオチド配列の少なくとも1つの末端に相補的であるポリヌクレオチドであり、それによって前記ヌクレオチド配列の前記線状プラスミドへの連結の方向性を制御する、請求項3に記載の方法。
- 2つのアダプターが使用され、前記アダプターは、前記線状プラスミドの第1末端におよび前記ヌクレオチド配列の第1末端に相補的な第1アダプターでありならびに前記線状プラスミドの第2末端におよび前記ヌクレオチド配列の第2末端に相補的な第2アダプターである、請求項4に記載の方法。
- 前記ヌクレオチド配列が、プロモーター、終止配列または融合タグもしくはシグナルペプチドをコードする配列に機能可能に連結されている、請求項1に記載の方法。
- 前記融合タクがポリヒスチジンタグ、血球凝集素タグ、ビオチン−リガーゼ認識部位、GSTタグ、蛍光タンパク質タグ、FLAGタグまたはリンカー配列である、請求項6に記載の方法。
- 所望のヌクレオチド配列のための発現系を含むプラスミドを調製する方法であって、
前記ヌクレオチド配列および線状プラスミドを含む核酸により宿主細胞を形質転換することを含み、前記核酸および線状プラスミドの量は100万細胞当り核酸1ngから10ngであり、
前記核酸および線状プラスミドはPCRにより増幅されて、前記線状プラスミドと前記核酸の組み換えを達成する形質転換細胞が得られ、前記発現系を含む前記プラスミドがもたらされる、前記方法。 - 前記細胞の少なくとも1千万が使用される、請求項8の方法。
- 前記細胞が、化学的に形質転換受容性でありおよび/またはE.コリ(E.coli)もしくは酵母を含む、請求項8の方法。
- 前記E.コリがJC8679、TB1、DH5アルファ、DH5、HB101、JM101、JM109およびLE392からなる群より選択される、請求項10に記載の方法。
- 前記形質転換細胞由来の前記発現系を含む前記プラスミドを抽出することをさらに含む、請求項8に記載の方法。
- 前記ヌクレオチド配列を発現させて、細胞由来系においてコードされたタンパク質またはペプチドを得ることをさらに含む、請求項1または8に記載の方法。
- 前記細胞由来系が無細胞系である、請求項13に記載の方法。
- 前記無細胞系が微生物、真核細胞または小麦胚芽由来の転写/翻訳系である、請求項14に記載の方法。
- 前記細胞由来系が細胞に内在的である、請求項13に記載の方法。
- 前記細胞が抗原提示細胞(APC)である、請求項16に記載の方法。
- 前記APCがマクロファージ、樹状細胞およびB細胞からなる群より選択される、請求項17に記載の方法。
- 前記発現が多様なヌクレオチド配列の発現であり、多様なタンパク質またはペプチドが得られる請求項13に記載の方法。
- 前記多様なタンパク質またはペプチドが感染病原体のゲノムによりコードされている、請求項19に記載の方法。
- 前記多様なタンパク質またはペプチドが、タンパク質/ペプチドのアレイになるように、検査表面上にて用いられる、請求項20に記載の方法。
- 前記多様性が、前記感染病原体の全ゲノムの少なくとも50%を表すタンパク質/ペプチドのアレイをもたらす、請求項21に記載の方法。
- 前記多様性が、前記病原体の全ゲノムの少なくとも98%を表すペプチドおよび/またはタンパク質のアレイをもたらす、請求項21に記載の方法。
- 前記感染病原体がワクチニア、フランシセラ・ツラレンシス(Francisella tularensis)、ヒトパピローマウィルス、西ナイルウィルス、バークホリデリア・シュードマレイ(Burkholderia pseudomallei)、マイコバクテリウム・ツベルクロシス(Mycobacterium tuberculosis)またはプラスモジウム・ファシパルム(Plasmodium faciparum)である、請求項21に記載の方法。
- 請求項21の方法により調製されたペプチド/タンパク質のアレイ。
- タンパク質/ペプチドアレイであって、前記アレイは感染病原体ゲノムの少なくとも50%を表すタンパク質およびペプチドを含み、前記アレイは少なくとも100の異なるタンパク質またはペプチドを含む、前記アレイ。
- 前記感染病原体の全ゲノムの少なくとも98%を表す、請求項25に記載のタンパク質/ペプチドアレイ。
- 前記感染病原体がワクチニア、フランシセラ・ツラレンシス(Francisella tularensis)、ヒトパピローマウィルス、西ナイルウィルス、バークホリデリア・シュードマレイ(Burkholderia pseudomallei)、プラスモジウム・ファシパルム(Plasmodium faciparum)またはマイコバクテリウム・ツベルクロシス(Mycobacterium tuberculosis)である、請求項26に記載のタンパク質/ペプチドのアレイ。
- 免疫活性を有するタンパク質またはペプチドを同定する方法であって、
請求項26のアレイまたは請求項13の方法により得られたタンパク質もしくはペプチドまたは請求項20の多様なタンパク質もしくはペプチドを、対象の免疫成分の少なくとも1つを含む試料と接触させることを含み、
前記対象は前記感染病原体に暴露されたことがあり、
前記アレイのタンパク質またはペプチドと免疫成分との相互作用により、前記タンパク質またはペプチドが免疫活性を有すると同定される、前記方法。 - 前記感染病原体が弱毒化型である、請求項29に記載の方法。
- 前記免疫活性が液性活性であり、前記試料が前記対象の血清または血漿を含み、前記相互作用が抗体との相互作用である、請求項29に記載の方法。
- 前記血清または血漿が、抗体とは免疫反応性であるが感染病原体とは反応性でない組成物により前処理される、請求項31に記載の方法。
- かくして同定されたペプチドまたはタンパク質を、前記対象由来のT細胞の少なくとも1つの型を含む試料と接触させることをさらに含む、請求項29に記載の方法。
- 前記免疫活性が細胞性活性であり、前記試料が前記対象由来のT細胞の少なくとも1つの型を含む請求項29の方法。
- 前記免疫活性が少なくとも1種のサイトカインの形成により検出されるおよび/または前記タンパク質がAPC内で発現される、請求項34に記載の方法。
- (a)形質転換された細胞の混合物由来の発現系を抽出することにより得られた発現系由来のヌクレオチド配列を発現させることを含む方法により調製された(前記混合物は、個別のクローンの単離を行わずに培養物より前記細胞を収穫することにより得られたものであり、前記培養物は、前記ヌクレオチド配列のための発現系を用いてまたは前記発現系の成分を用いて、宿主細胞を形質転換することにより得られたものである。)、または
(b)前記ヌクレオチド配列および線状プラスミドを含む核酸を用いて宿主細胞を形質転換することを含む方法により得られた発現系由来のヌクレオチド配列を発現させることを含む方法により調製された(前記核酸および線状プラスミドの量はそれぞれ百万細胞当り核酸1ngから10ngである。)、
請求項26に記載のアレイ。 - ワクチニアタンパク質ATI遺伝子座タンパク質、A10L、A11R、A13L、A33R、A56R、B5R、D8L、D13L、F13L、H3L、H5R、A26L、A27L、E3L、L4R、H7R、A17L、A3L、A4L、D11L、H6R、K2L、N1L、A41L、A47L、B2R、D10R、E1L、F2L、F9L、G5R、G7L、H7R、I1L、L5RおよびO2Lならびにこれらに実質的に相同なタンパク質およびこれらの免疫学的に活性な断片からなる群より選択される3種またはそれ以上の免疫反応性タンパク質またはペプチドを含んでいる免疫学的組成物。
- 前記免疫反応性タンパク質またはペプチドが、ATI遺伝子座タンパク質、A10L、A11R、A13L、A33R、A56R、B5R、D8L、D13L、F13L、H3L、H5R、A26L、A27L、E3L、L4R、H7R、A17L、A3L、A4L、D11L、H6R、K2L、N1L、A41L、A47L、B2R、D10R、E1L、F2L、F9L、G5R、G7L、H7R、I1L、L5RおよびO2Lならびにこれらに実質的に相同なタンパク質およびこれらの免疫学的に活性な断片からなる群より選択される、請求項37に記載の免疫学的組成物。
- 前記免疫反応性タンパク質またはペプチドが、ATI遺伝子座タンパク質、A10L、A11R、A13L、A33R、A56R、B5R、D8L、D13L、F13L、H3L、H5R、A26L、A27L、E3L、L4R、H7R、A17L、A3L、A4L、D11L、H6R、K2LおよびN1Lならびにこれらにほぼ相同なタンパク質およびこれらの免疫学的に活性な断片からなる群より選択される、請求項38に記載の免疫学的組成物。
- 前記免疫反応性タンパク質またはペプチドが、ATI遺伝子座タンパク質、A10L、A11R、A13L、A33R、A56R、B5R、D8L、D13L、F13L、H3L、H5R、A26L、A27L、E3LおよびL4Rならびにこれらに実質的に相同なタンパク質およびこれらの免疫学的に活性な断片からなる群より選択される、請求項39に記載の免疫学的組成物。
- 前記免疫反応性タンパク質またはペプチドが、A10L、A11R、A13L、A33R、A56R、B5R、D8L、D13L、F13L、H3LおよびH5Rならびにこれらに実質的に相同なタンパク質およびこれらの免疫学的に活性な断片からなる群より選択される、請求項39に記載の免疫学的組成物。
- ATI遺伝子座タンパク質、A10L、A13L、H3L、D13L、A11RおよびA17Rならびにこれらに実質的に相同なタンパク質および免疫学的に活性な断片からなる群より選択される少なくとも1種の免疫反応性ワクチニアタンパク質を含み、前記ワクチニアタンパク質は1種またはそれ以上の追加の免疫反応性ワクチニアタンパク質との混合物中に場合によりあってよい、免疫学的組成物。
- ATI遺伝子座タンパク質、A10L、A13L、A26L、A56R、D8L、D13L、F13L、H5RおよびH3Lならびにこれらに実質的に相同なタンパク質およびこれらの免疫学的に活性な断片からなる群より選択され、前記ワクチニアタンパク質は1種またはそれ以上の追加の免疫反応性ワクチニアタンパク質との混合物中に場合によりあってよい、少なくとも1種の免疫反応性ワクチニアタンパク質を含んでいる免疫学的組成物。
- ワクチニアタンパク質がATI遺伝子座タンパク質、A10L、D13LおよびH3Lならびにこれらに実質的に相同なタンパク質およびこれらの免疫学的に活性な断片からなる群より選択される、請求項43に記載の免疫学的組成物。
- ワクチニアタンパク質H3L、ならびに
ワクチニアタンパク質A10L、D13L、A11R、A13R、A33R、A56R、D13L、H5R、D8R、F13L、H5R、A17R、ATI遺伝子座タンパク質およびA26Lならびにこれらに実質的に相同なタンパク質およびこれらの免疫学的に活性な断片からなる群より選択される2種またはそれ以上の免疫反応性タンパク質またはペプチド
を含んでいる免疫学的組成物。 - ワクチニアタンパク質ATI遺伝子座タンパク質またはこれらに実質的に相同なタンパク質およびこれらの免疫学的に活性な断片を含んでいる免疫学的組成物。
- ワクチニアタンパク質A10L、D13LおよびH3Lまたはこれらに実質的に相同なタンパク質およびこれらの免疫学的に活性な断片を含んでいる免疫学的組成物。
- ワクチニアタンパク質A10L、D13L、H3L、A11R、A13L、H5R、A17Rならびにこれらに実質的に相同なタンパク質およびこれらの免疫学的に活性な断片からなる群より選択される2種またはそれ以上の免疫反応性タンパク質またはペプチドを含んでいる免疫学的組成物。
- 遺伝子座PFB0300c、PFE1590w、PFB0915w、PFB0310c、PFD0310w、PF7_0128、PF11_0509、PF10_0356およびPF10_0343に伴われているマラリアタンパク質ならびにこれらに実質的に相同なタンパク質およびこれらの免疫学的に活性な断片からなる群より選択される1種またはそれ以上の免疫反応性たんぱく質またはペプチドを含んでいる免疫学的組成物。
- FTT1269、FTT1747、FTT1696、FTT0975、FTT0901、FTT1477、FTT0472およびFTT0264によりコードされたフランシセラ・ツラレンシス(Flancisella tularensia)タンパク質およびフランシセラタンパク質DnaK、TMタンパク質、HSP60および17kdタンパク質ならびにこれらに実質的に相同なタンパク質およびこれらの免疫学的に活性な断片からなる群より選択される1種またはそれ以上の免疫反応性タンパク質またはペプチドを含んでいる免疫学的組成物。
- ワクチニアタンパク質A10L、D13L、H3L、A11R、A13R、A33R、A56R、D13L、H5R、D8R、F13L、H5R、A17R、ATI遺伝子座タンパク質、A26Lならびにこれらに実質的に相同なタンパク質およびこれらの免疫学的に活性な断片からなる群より選択される1種またはそれ以上の免疫反応性タンパク質またはペプチドを含んでいる組成物。
- 結核菌遺伝子Rv0440、Rv0467、Rv0475、Rv0538、Rv0674、Rv0685、Rv0798c、Rv0916c、Rv0934、Rvl801、Rvl860、Rvl926c、Rvl980c、Rvl984c、Rv2007c、Rv2031c、Rv2190c、Rv2220、Rv2376c、Rv2389c、Rv2446c、Rv2744c、Rv2873、Rv2875、Rv2875、Rv3270、Rv3330、Rv3333c、Rv3418c、Rv3763、Rv3803c、Rv3828c、Rv3846、Rv3874、Rv3875およびRv3881cによりコードされたタンパク質またはペプチドからなる群より選択される3種またはそれ以上の免疫反応性のタンパク質またはペプチドを含んでいる免疫学的組成物。
- 前記ペプチドまたはタンパク質が、マイコバクテリウム・ツベルクロシス(Mycobacterium tuberculosis)遺伝子Rv0440、Rvl801、Rv2031c、Rv2376c、Rv2875およびRv3875によりコードされたペプチドからなる群より選択される、請求項52に記載の組成物。
- 前記ペプチドまたはタンパク質が、マイコバクテリウム・ツベルクロシス(Mycobacterium tuberculosis)遺伝子Rv0440、Rv0475、Rvl801、Rvl980c、Rv2220、Rv2873、Rv2875、Rv3270、Rv3763およびRv3875によりコードされたペプチドからなる群より選択される、請求項52に記載の組成物。
- P.ファルシパルム(P.falciparum)遺伝子PFB0915w、PFB0310c、PFB0300c、PFB0305c、PFL2410w、PFC0210c、PFD0310w、PFD0310w、PF13_0197、PF10_0138、PFI1520w、PFI1520w、PF11_0344、PF13_0012、PFD0310w、PF11_0358、PF07_0029、PFL1605w、PFE1590w、MAL6P1.201、PFD0235c、PF13_0201、PF13_0267、PF07_0128、PF10_0343、PF10_0343、PFI1520w、PFI0580c、PF07_0020、PFE0520c、MAL7P1.29およびPF10_0260によりコードされたタンパク質またはペプチドからなる群より選択される3種またはそれ以上の免疫反応性タンパク質またはペプチドを含んでいる免疫学的組成物。
- P.ファルシパルム(P.falciparum)遺伝子PFB0915w、PFB0310c、PFB0300c、PFB0305c、PFL2410w、PFC0210c、PFD0310w、PFD0310w、PF13_0197、PF10_0138、PFI1520w、PFI1520w、PF11_0344、PF13_0012、PFD0310w、PFll_0358、PF07_0029、PFL1605w、PFE1590wおよびMAL6P1.201によりコードされるタンパク質またはペプチドからなる群より選択される3種またはそれ以上のペプチドまたはタンパク質を含んでいる、請求項55に記載の免疫学的組成物。
- 請求項37から56のいずれか1項のタンパク質またはペプチドの1種またはそれ以上をコードするヌクレオチド配列を含む1種またはそれ以上の単離された核酸分子を含んでいる免疫学的組成物。
- 請求項37から56のいずれか1項の組成物の有効量を対象に投与することを含んでいる、前記患者を感染から保護する方法。
- 請求項57の組成物の有効量を対象に投与することを含んでいる、前記対象を感染から保護する方法。
- 請求項37から56のいずれか1項のタンパク質またはペプチドの少なくとも1つに特異的に結合するモノクロナール抗体。
- 請求項60のモノクロナール抗体を含んでいる免疫学的組成物。
- 請求項61の免疫学的組成物の有効量を対象に投与することを含んでいる、対象を受動的に免疫する方法。
- 患者の免疫成分と検査材料との相互作用を検出する方法であって、
前記免疫材料は免疫成分を含む患者に関する追加材料を含む第1の試料中に含まれていて、
前記患者より得られる第2の試料を前記追加材料により処理し、それにより、前記第2の試料を第1の試料により処理する前に、前記追加材料に対する相互作用を遮断することを含んでいる、前記検出方法。 - 前記追加材料が細胞の成分を含み、前記検査材料が前記細胞の細胞由来系を使用して生産されたものである、請求項63に記載の方法。
- 前記検査材料が感染病原体由来のタンパク質またはペプチドであり、前記対象が前記感染病原体に暴露されたことがある、請求項63に記載の方法。
- 対象における感染病原体または病状の同定方法であって、前記対象が特徴的なタンパク質またはペプチドに対する抗体を有するかどうかを決定するために、感染病原体または病状に特徴的な免疫活性を有する少なくとも2種のタンパク質またはペプチドを使用することを含んでいる、前記同定方法。
- 前記免疫活性を有する特徴的なタンパク質またはペプチドが請求項29の方法により同定されたものである、請求項66に記載の方法。
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