JP2021523712A - 安定性が改善された遺伝子組み換え組換えワクシニアアンカラ（ｒｍｖａ）ワクチン及びその調製方法 - Google Patents

安定性が改善された遺伝子組み換え組換えワクシニアアンカラ（ｒｍｖａ）ワクチン及びその調製方法 Download PDF

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Abstract

ＩＥＩ、ＩＥ２及びｐｐ６５又はそれらの抗原性フラグメントを含み、少なくとも１０継代後は遺伝的に安定している、免疫学的に有効な量の組換え改変ワクシニアアンカラ（ｒＭＶＡ）ウイルスを含むワクチン組成物。継代時のそのようなｒＭＶＡの安定性を改善する方法であって、以下の改変：（１）ＣＭＶ抗原又はその抗原性フラグメントをコードする１つ又は複数の核酸配列を、０４４Ｌ／０４５Ｌ、ＩＧＲ３、ＧＩＬ／Ｉ８Ｒ、及びＤｅｌ３を包含するがこれらに限定されないがＤｅｌ２を包含しない１つ又は複数の挿入部位に挿入すること；（２）連続するシトシン又はグアニンを除去することにより、前記ＣＭＶ抗原をコードする前記核酸配列をコドン最適化すること；及び（３）前記ＣＭＶ抗原の前記アミノ酸配列に１つ又は複数の変異を導入すること；のうち１つ以上を包含することによる方法。

Description

優先権主張
この出願は、図面を含むその全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０１８年５月１１日に出願された米国仮出願第６２／６７０，６５６号の優先権を主張する。
政府の利益に関する声明
本発明は、国立衛生研究所（ＮＩＨ）の国立癌研究所によって授与された助成金番号ＣＡ０７５４４４の下で政府の支援を受けてなされた。政府は本発明において一定の権利を有する。
背景
改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）は、ほとんどの哺乳動物細胞において増殖しない、遺伝子操作された、高度に弱毒化されたワクシニアウイルス株である。哺乳類細胞で増殖するＭＶＡの能力は後期のウイルス集合でブロックされるため、この特性はウイルス又は外来遺伝子の発現に最小限の影響を与える。ただし、ＤＮＡは複製を続け、したがってＲＮＡ生合成の効率的なテンプレートとして機能し、高レベルのタンパク質合成をもたらす。ＭＶＡはまた、大きな外来遺伝子容量と複数の統合サイト
ワクチン抗原を発現するための望ましいベクターにする2つの特徴を持つ。ＭＶＡは、異種タンパク質の生産に関して確立された安全記録と多様性を持つ。実際、感染症と癌の治療のためのＭＶＡベースのワクチンが開発され、フェーズＩ／ＩＩの臨床試験に到達した。
ＭＶＡは、げっ歯類、アカゲザル、及び他の非ヒト霊長類への、そしてより最近では癌患者における臨床ワクチンとしての成功した送達の広範な歴史を有する。オリジナルのＭＶＡウイルスは、１９７０年代にヨーロッパの１２万人の若者と高齢者に投与された。ＭＶＡは、ニワトリ細胞での繰り返しの連続継代中に発生した２５の突然変異と欠失の中で２つの重要な宿主範囲遺伝子が失われているため、無毒性である。
ＭＶＡは、重度の免疫抑制され、悪性腫瘍又は臓器不全などの追加の合併症を経験し、それにより移植を必要とする個体におけるＣＭＶ抗原のワクチンベクターとして魅力的である。ＣＭＶ感染は移植手順の重要な合併症であり、新生児や進行性疾患のＨＩＶ患者を包含する多種多様な個人に影響を及ぼす。ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）は、固形臓器及び造血幹細胞移植のレシピエントにとって主要な危険因子である。以前にＣＭＶに感染しているか、ＣＭＶに感染した固形臓器又は幹細胞同種移植を受けている個人は、ウイルスの細胞リザーバーを標的とするワクチン戦略の候補者である。
ｒＭＶＡワクチンによる外来抗原のin vitro発現レベルは、ｒＭＶＡワクチンの免疫原性と相関していることが報告されている。ただし、連続継代後、外来抗原の発現が低下する可能性があり、免疫原性が低下する可能性がある。したがって、ＭＶＡは組換えワクチン開発にとって魅力的なウイルスベクターであるが、ゲノム不安定性と免疫原性の低下は、連続継代後の重大な懸念事項である。高い抗原発現レベルと改善された免疫原性の有益な効果は、ｒＭＶＡがそのライフサイクルに不要な遺伝子を削除する傾向によって制限される可能性がある。
進行中のＣＭＶウイルス血症及びその増殖を弱めるか又は抑制するために、第１世代の「トリプレックス(Triplex)」ワクチンが構築された。第一世代のトリプレックスには、３つの免疫優勢タンパク質： ｐｐ６５（主要な外皮タンパク質）及び前初期タンパク質ＩＥ１とＩＥ２との融合（ＩＥｆｕｓｉｏｎ）、が含まれている。これらの抗原は以前に組み合わされ、単一のＭＶＡベクターで発現されていた。ただし、ＭＶＡ内でのこれらの抗原の現在のアセンブリは、ワクチンの大量生産には最適ではない。ウイルス継代を延長すると、ＩＥｆｕｓｉｏｎの発現の減少が観察された。このワクチンは、２４人の健康なボランティアを対象とした第Ｉ相安全性及び用量漸増試験で成功裏に評価された［３１］。
外来タンパク質抗原の改善された安定な発現及び延長された連続継代後の強力な免疫原性を有するｒＭＶＡワクチンを開発することは有利であろう。これにより、特定のＨＣＭＶ抗原を発現するＭＶＡを、感染性病原体及び癌抗原の幅広いポートフォリオの臨床ベクターとして大規模に製造できるようになる。
要約
一態様では、本開示は、２つ以上のサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）抗原、例えば、ヒトＣＭＶ抗原、を共発現するための発現系に関する。発現系は、２つ以上のＣＭＶ抗原又はその抗原性部分をコードする２つ以上の核酸配列が挿入された遺伝子組換え改変ワクシニアアンカラ（ｒＭＶＡ）ベクターを包含する。いくつかの実施形態において、ＣＭＶ抗原又はその抗原性フラグメントは、ＩＥ１エクソン４（ＩＥ１／ｅ４）、ＩＥ２エクソン５（ＩＥ２／ｅ５）、ＩＥｆｕｓｉｏｎ（例えば、ＩＥ１／ｅ４及びＩＥ２／ｅ５の融合）、及びｐｐ６５を包含する。様々な実施形態において、ｐｐ６５は、ＩＥ１／ｅ４、ＩＥ２／ｅ５、又はＩＥfusionと共発現され得る。発現系は、単一のベクターから同時にＣＭＶ抗原を共発現させることができる。いくつかの実施形態において、２つ以上のＣＭＶ抗原をコードする核酸配列は、０４４Ｌ／０４５Ｌ、ＩＧＲ３、Ｇ１Ｌ／Ｉ８Ｒ、及びＤｅｌ３を包含する１つ以上の挿入部位に挿入される。追加の挿入部位には、表１にリストされている部位が含まれる。
いくつかの実施形態において、２つ以上の核酸配列は、ｍＨ５プロモーターなどの単一のプロモーターに作動可能に連結され、その制御下にある。他の実施形態では、各核酸配列は、別個のｍＨ５プロモーターに作動可能に連結され、その制御下にある。さらに、他のポックスウイルスプロモーターを使用することができ、ｍＨ５プロモーターの使用は必要ない。いくつかの実施形態において、１つ以上の核酸配列は、同じアミノ酸を改変することなく発現しながら、連続するシトシン又はグアニンを除去するようにコドン最適化される。いくつかの実施形態において、ＣＭＶ抗原のアミノ酸配列は、ウイルス継代時のｒＭＶＡの遺伝的安定性を改善するための１つ以上の突然変異を含む。いくつかの実施形態では、ＩＥ１及びＩＥ２又はその抗原フラグメントは、ＩＥ１／エクソン４及びＩＥ２／エクソン５の融合などのＩＥ融合タンパク質として発現される。いくつかの実施形態では、ＣＭＶ抗原を発現するｒＭＶＡは、少なくとも１０継代の間遺伝的に安定である。
本開示の別の態様は、少なくとも１０継代後に遺伝的に安定である、本明細書に開示される免疫学的に有効な量の組換え改変ワクシニアアンカラ（ｒＭＶＡ）を含むワクチンに関する。
本開示の別の態様は、対象に上記のワクチン組成物を投与することにより、対象におけるＣＭＶの制御されない増殖によって引き起こされるウイルス血症及び疾患に対する免疫応答及び臨床的保護を誘発又は改変する方法に関する。いくつかの実施形態では、対象は、ヒトなどの哺乳動物である。
本開示のさらに別の態様は、以下の改変：
（１）ＣＭＶ抗原又はその抗原性断片をコードする１つ又は複数の核酸配列を、０４４Ｌ／０４５Ｌ、ＩＧＲ３、Ｇ１Ｌ／Ｉ８Ｒ、及びＤｅｌ３を包含する１つ又は複数の挿入部位に、並びにＤｅｌ２を包含しない、表１にリストされている追加の挿入部位に挿入すること；
（２）連続するシトシン又はグアニンを除去することにより、ＣＭＶ抗原をコードする核酸配列を最適化するコドン；及び
（３）ＣＭＶ抗原のアミノ酸配列に１つ又は複数の変異を導入すること；
のうちの１つ以上を組み込むことによって、２つ以上のＣＭＶ抗原又はその抗原性フラグメントを発現するｒＭＶＡの継代(passage)時の安定性を改善する方法に関する。いくつかの実施形態では、ＣＭＶ抗原又はその抗原性フラグメントには、ＩＥ１エクソン４（ＩＥ１／ｅ４）、ＩＥ２エクソン５（ＩＥ２／ｅ５）、ＩＥfusion（例えば、ＩＥ１とＩＥ２又はＩＥ１／ｅ４とＩＥ２／ｅ５の融合）、及びｐｐ６５が含まれる。
図面の簡単な説明
図１は、再導出されたトリプレックスの発達を描写する概略図を示す。ｐｐ６５を発現するＭＶＡ ＢＡＣは、Ｔｒｉｐｌｅｘについての他のＨＣＭＶ抗原の添加の基礎として使用される。ＢＡＣテクノロジーとアンパッサン(en passant)変異誘発を利用して、目的のＴｒｉｐｌｅｘ抗原を発現する遺伝子をＭＶＡに順次組み込む。すべての目的の抗原が存在し、最終コンストラクトの安定性を分析した後、ＢＡＣをＭＶＡから削除する。黒い実線の矢印は最終的な再誘導Ｔｒｉｐｌｅｘコンストラクトを示す。；灰色の矢印は中間ステップを示す。最終的な潜在的トリプレックス候補の３つの例がある。： Ｉ） ＭＶＡのさまざまなサイトにあるＩＥ２、ＩＥ１、及びｐｐ６５； ＩＩ） ０４４Ｌ／０４５ＬにおけるＩＥｆｕｓｉｏｎ；及び Ｉｌｌ） ＩＧＲ３におけるＩＥｆｕｓｉｏｎ。３つのコンストラクトの例はすべて、Ｄｅｌ３にｐｐ６５がある。； （＊）は、サイトに挿入された遺伝子のバリアントを示す。 図２Ａ−２Ｃは、改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）ウイルスのトリプレックス遺伝子構成とニワトリ胚性線維芽細胞（ＣＥＦ）の継代後の安定性を示す。図２Ａは、ＴｒｉｐｌｅｘでのＩＥｆｕｓｉｏｎの元の構造の簡略図を示す。ＩＥ１とＩＥ２についてのＨＣＭＶＡＤ１６９エクソン４と５は、それぞれ、シームレスな接合のためにＡｐａｌサイトで設計されており、ＩＥｆｕｓｉｏｎをもたらした。ＩＥｆｕｓｉｏｎは、ｍＨ５プロモーターによって制御されるＭＶＡのＤｅｌ２サイトに挿入された。ＭＶＡ Ｄｅｌ３サイトにはｐｐ６５があり、これもｍＨ５プロモーターによって制御される。図２Ｂは、ＣＥＦでさらに７回（Ｐ６−Ｐ１２）継代された臨床トリプレックスのウエスタンブロット分析を示している。「ＣＥＦ」とラベル付けされたレーンは感染しておらず、ネガティブコントロールである。；「ＭＶＡ」とラベル付けされたレーンは、ＣＭＶ抗原を発現しない野生型ＭＶＡである。；「Ｔｒｉｐｌｅｘ」とラベル付けされたレーンは、Ｐ５でＴｒｉｐｌｅｘの臨床ロットを生成するために使用されるウイルスである。ＩＥｆｕｓｉｏｎは、精製された抗ＩＥ１マウスモノクローナル抗体（ｍＡＢ）ｐ６３−２７を使用してプローブされた［１１］。；ｐｐ６５は、精製されたマウスｍＡＢ２８−１０３を使用してプローブされた［４］。感染／ローディングコントロールとして、ＢＲ５抗体を使用してエンベロープＭＶＡ糖タンパク質をプローブした。図２Ｃは、Ｐ６−Ｐ１２からのＤｅｌ２におけるＩＥｆｕｓｉｏｎのＰＣＲ増幅を視覚化した１％アガロースゲルを示す。ここで、プライマーはＤｅｌ２サイト内の遺伝子に隣接している。 図３Ａ〜３Ｄは、連続するシトシン及びグアニンへの変異を伴うＩＥｆｕｓｉｏｎコンストラクトの核酸配列アラインメントを示しており、それによってタンパク質発現の不安定性及び／又はワクシニアコドンの最適化を低減している。配列番号１〜３及び２５。 図４Ａ〜４Ｃは、ＭＶＡ−ＢＡＣ上のＩＧＲ３挿入部位におけるＩＥｆｕｓｉｏｎ ４ｎｔの安定性分析を示す。図４Ａは、ＩＥｆｕｓｉｏｎ（４ｎｔ）のＩＧＲ３サイトへの挿入を表す概略図を示す（矢印で示されている）。評価されたすべてのＭＶＡＢＡＣ挿入部位、Ｇ１Ｌ／Ｉ８Ｒ、０４４Ｌ／０４５Ｌ、及びＩＧＲ３、は矢印で示されている。図４Ｂは、ＩＧＲ３でＩＥｆｕｓｉｏｎ（４ｎｔ）の安定性を分析し、ニワトリ胚性線維芽細胞（ＣＥＦ）で最大１０回（Ｐ１−Ｐ１０）継代したＰＣＲ産物の１％アガロースゲルを示している。図４Ｃは、ＣＥＦ細胞でＰ１０まで継代されたＩＥｆｕｓｉｏｎ（４ｎｔ）のウエスタンブロット分析を示している。ＩＥｆｕｓｉｏｎは、精製された抗ＩＥ１マウスモノクローナル抗体（ｍＡＢ）ｐ６３−２７を使用してプローブされた［１１］。；ｐｐ６５は、精製されたマウスｍＡＢ２８−１０３を使用してプローブされた［４］。感染／ローディングコントロールとして、ＢＲ５抗体を使用してエンベロープＭＶＡ糖タンパク質をプローブした。図４Ｂ及び４Ｃの場合、「ＣＥＦ」とラベル付けされたレーンは感染しておらず、ネガティブコントロールである。；「ＭＶＡ」とラベル付けされたレーンは、いずれの抗原を発現しない野生型ＭＶＡである。；「Ｔｒｉｐｌｅｘ」というラベルの付いたレーンは、臨床ロットのＴｒｉｐｌｅｘを生成するために使用されるウイルス（Ｐ６で）である。 図５は、ＭＶＡ−ＢＡＣ上の潜在的なサイトと、ＩＥ１及びＩＥ２へのＩＥｆｕｓｉｏｎの分解の概略図である。ＩＥ１又はＩＥ２遺伝子の挿入に利用できるＭＶＡ ＢＡＣの潜在的な部位は、０４４Ｌ／０４５Ｌ、ＩＧＲ３、及びＧ１Ｌ／Ｉ８Ｒである。ＩＥ１とＩＥ２が分離されると、各遺伝子はｍＨ５プロモーターによって制御される。 図６Ａ〜６Ｅは、ＩＥ２タンパク質変異体（６Ａ〜６Ｃ）を発現する構築物の核酸配列アラインメント（配列番号７〜９及び２６）及びＩＥ１タンパク質変異体（６Ｄ−６Ｅ）を発現するコンストラクトの核酸配列アラインメントを示す。配列番号２７−３０。 図７Ａ〜７Ｃは、ＭＶＡの０４４Ｌ／０４５Ｌ挿入部位におけるＩＥ２の安定性分析を示す。図７Ａは、０４４Ｌ／０４５Ｌ部位へのＩＥ２の挿入を表す概略図を示す（矢印で示される）。図７Ｂは、ニワトリ胚性線維芽細胞（ＣＥＦ）で最大１０回継代（Ｐ１−Ｐ１０）された０４４Ｌ／０４５ＬでのＩＥ２の安定性を分析するＰＣＲ産物の１％アガロースゲルを示す。図７Ｃは、ＣＥＦ細胞でＰ１０まで継代されたＩＥ２のウエスタンブロット分析を示す。ＩＥ２は、抗ｌＥ２マウスモノクローナル抗体（ｍＡＢ）２．９．５を使用してプローブされた［１１］。；ｐｐ６５は、精製されたマウスｍＡＢ２８−１０３を使用してプローブされた［４］。感染／ローディングコントロールとして、ＢＲ５抗体を使用してエンベロープＭＶＡ糖タンパク質をプローブした。図７Ｂ及び７Ｃの場合、「ＣＥＦ」とラベル付けされたレーンは感染しておらず、ネガティブコントロールである。；「ＭＶＡ」とラベル付けされたレーンは、いずれの抗原を発現しない野生型ＭＶＡである。；「Ｔｒｉｐｌｅｘ」とラベル付けされたレーンは、Ｐ６でＴｒｉｐｌｅｘの臨床ロットを生成するために使用されるウイルスである。 図８Ａ−８Ｃは、ＭＶＡ上の０４４Ｌ／０４５Ｌ挿入部位におけるＩＥ２ Ｈ３６３Ａ変異体の安定性分析を示す。図８Ａは、ＩＥ２の概略図を示しており、特定の必須モジュレーター（ＳＥＭ、対応する矢印で濃い灰色）及びコア（対応する矢印で薄い陰影）内の位置３６３及び３６９（Ｈ３６３及びＨ３６９）にある２つのヒスチジン残基の位置を示している。ＩＥ２アミノ酸配列内で、推定約４０ｋＤａの産物を転写するための内部ＴＡＴＡボックスがラベル付けされる［１８］。このアミノ酸注釈は、核局在化シグナル又はシグナルペプチドを欠くＩＥ２に対応するアミノ酸番号と一致している。図８Ｂは、ニワトリ胚性線維芽細胞（ＣＥＦ）で最大１０回継代（Ｐ１−Ｐ１０）された０４４Ｌ／０４５ＬでのＩＥ２ Ｈ３６３Ａの安定性を分析するＰＣＲ産物の１％アガロースゲルを示す。図８Ｃは、ＣＥＦ細胞でＰ１０まで継代されたＩＥ２ Ｈ３６３Ａのウエスタンブロット分析を示す。ＩＥ２ Ｈ３６３Ａは、抗ｌＥ２マウスモノクローナル抗体（ｍＡＢ）２．９．５を使用してプローブされた［１１］。感染／ローディングコントロールとして、ＢＲ５抗体を使用してエンベロープＭＶＡ糖タンパク質をプローブした。図８Ｂ及び８Ｃの場合、「ＣＥＦ」とラベル付けされたレーンは感染しておらず、ネガティブコントロールである。「ＭＶＡ」とラベル付けされたレーンは、いずれの抗原を発現しない野生型ＭＶＡである。；「ＩＥ２（０４４Ｌ／０４５Ｌ）」とラベル付けされたレーンは、非コドン最適化ＩＥ２を発現することが以前に示されたウイルスである（図７Ｃ）。 図９Ａ〜９Ｃは、ＭＶＡ−ＢＡＣのＧ１Ｌ／Ｉ８Ｒ挿入部位におけるＩＥ１ ＮＣＯ、４ｎｔ、及びＶａｃＯの安定性分析を示す。ＩＥ１ ＮＣＯ（９Ａ）、４ｎｔ（９Ｂ）、及びＶａｃＯ（９Ｃ）のＰＣＲ（左）及びウエスタンブロット分析（右）。左： ＣＥＦでＰ１０まで継代されたＧ１Ｌ ／ Ｉ８ＲでのＩＥ１の安定性を分析するＰＣＲ産物の１．０％アガロースゲル。右： ＣＥＦ細胞でＰ１０まで継代されたＩＥ１のウエスタンブロット分析。ＩＥ１及びＩＥｆｕｓｉｏｎは、精製された抗ｌＥ１マウスモノクローナル抗体（ｍＡＢ）ｐ６３−２７を使用してプローブされた。感染／ローディングコントロール（下部）として、ＢＲ５抗体を使用してエンベロープＭＶＡ糖タンパク質をプローブした。「ＣＥＦ」は感染していない、ネガティブコントロールである。；「ＭＶＡ」とラベル付けされたレーンは、いずれの抗原を発現しない野生型ＭＶＡである。；（＋）とラベル付けされたレーンは、トリプレックスの臨床ロットを生成するために使用されるウイルスである。 図１０Ａ−１０Ｂは、ＭＶＡ−ＢＡＣのＩＧＲ３挿入部位におけるＩＥ１４ｎｔとＶａｃＯの安定性分析を示す。ＩＥ１ ４ｎｔ（１０Ａ）及びＶａｃＯ（１０Ｂ）のＰＣＲ（左）及びウエスタンブロット分析（右）。左： ＣＥＦでＰ１０まで継代された、ＩＥ１ ＩＧＲ３の安定性を分析するＰＣＲ産物の１．０％アガロースゲル。右： ＣＥＦ細胞でＰ１０まで継代されたＩＥ１のウエスタンブロット分析。ＩＥ１及びＩＥｆｕｓｉｏｎは、精製された抗ｌＥ１マウスモノクローナル抗体（ｍＡＢ）ｐ６３−２７を使用してプローブされた。感染／ローディングコントロール（下部）として、ＢＲ５抗体を使用してエンベロープＭＶＡ糖タンパク質をプローブした。「ＣＥＦ」は感染していない、ネガティブコントロールである。；「ＭＶＡ」とラベル付けされたレーンは、いずれの抗原を発現しない野生型ＭＶＡである。；（＋）とラベル付けされたレーンは、トリプレックスの臨床ロットを生成するために使用されるウイルスである。 図１１Ａ−１１Ｂは、ＭＶＡ−ＢＡＣのＧ１Ｌ／Ｉ８Ｒ挿入部位におけるＩＥ２ ＮＣＯ及び４ｎｔの安定性分析を示す。ＩＥ２ ＮＣＯ（１１Ａ）及び４ｎｔ（１１Ｂ）のＰＣＲ（左）及びウエスタンブロット分析（右）。左： ＣＥＦでＰ１０まで継代された、ＩＥ２ Ｇ１Ｌ／Ｉ８Ｒの安定性を分析するＰＣＲ産物の１．０％アガロースゲル。右： ＣＥＦ細胞で１０回継代されたＩＥ２（Ｐ１−Ｐ１０）のウエスタンブロット分析。ＩＥ２は、ａｎｔｉ−ｌＥ２ ｍＡＢ２．９．５を使用してプローブされた。感染／ローディングコントロール（下）として、ＢＲ５抗体を使用してエンベロープＭＶＡ糖タンパク質をプローブした。「ＣＥＦ」は感染していない、ネガティブコントロールである。；「ＭＶＡ」とラベル付けされたレーンは、いずれの抗原を発現しない野生型ＭＶＡである。；（＋）とラベル付けされたレーンは、トリプレックスの臨床ロットを生成するために使用されるウイルスである。 図１２は、ＭＶＡ−ＢＡＣのＩＧＲ３挿入部位におけるＩＥ２ ＶａｃＯの安定性分析を示す。ＩＥ２ ＶａｃＯのＰＣＲ（左）及びウエスタンブロット分析（右）。左： ＣＥＦでＰ１０まで継代された、ＩＥ２ ＩＧＲ３の安定性を分析するＰＣＲ産物の１．０％アガロースゲル。右： ＣＥＦ細胞でＰ１０まで継代されたＩＥ２のウエスタンブロット分析。ＩＥ２は、ａｎｔｉ−ｌＥ２ ｍＡＢ２．９．５を使用してプローブされた。感染／ローディングコントロール（下部）として、ＢＲ５抗体を使用してエンベロープＭＶＡ糖タンパク質をプローブした。「ＣＥＦ」は感染していない、ネガティブコントロールである。；「ＭＶＡ」とラベル付けされたレーンは、いずれの抗原を発現しない野生型ＭＶＡである。；（＋）とラベル付けされたレーンは、トリプレックスの臨床ロットを生成するために使用されるウイルスである。 図１３Ａ〜１３Ｂは、ＭＶＡ−ＢＡＣ上の０４４／０４５Ｌ挿入部位におけるＩＥ２Ｈ３６３Ａ ＮＣＯ及び４ｎｔの安定性分析を示す。ＩＥ２ ＮＣＯ（１３Ａ）及び４ｎｔ（１３Ｂ）のＰＣＲ（左）及びウエスタンブロット分析（右）。左： ＣＥＦでＰ１０まで継代された、０４４／０４５ＬでＩＥ２変異体の安定性を分析するＰＣＲ産物の１．０％アガロースゲル。右： ＣＥＦ細胞でＰ１０まで継代されたＩＥ２変異体のウエスタンブロット分析。ＩＥ２は、ａｎｔｉ−ｌＥ２ ｍＡＢ２．９．５を使用してプローブされた。感染／ローディングコントロール（下部）として、ＢＲ５抗体を使用してエンベロープＭＶＡ糖タンパク質をプローブした。「ＣＥＦ」は感染していない、ネガティブコントロールである。；「ＭＶＡ」とラベル付けされたレーンは、いずれの抗原を発現しない野生型ＭＶＡである。；（＋）とラベル付けされたレーンは、トリプレックスの臨床ロットを生成するために使用されるウイルスである。 図１４Ａ〜１４Ｃは、ＭＶＡ−ＢＡＣ上の０４４／０４５Ｌ挿入部位におけるＩＥ２Ｈ３６９Ａ ＮＣＯ、４ｎｔ、及びＶａｃＯの安定性分析を示す。ＩＥ２ ＮＣＯ（１４Ａ）、４ｎｔ（１４Ｂ）、及びＶａｃＯ（１４Ｃ）のＰＣＲ（左）及びウエスタンブロット分析（右）。左： ＣＥＦでＰ１０まで継代された、０４４／０４５ＬでＩＥ２変異体の安定性を分析するＰＣＲ産物の１．０％アガロースゲル。右： ＣＥＦ細胞でＰ１０まで継代されたＩＥ２変異体のウエスタンブロット分析。ＩＥ２は、ａｎｔｉ−ｌＥ２ ｍＡＢ２．９．５を使用してプローブされた。感染／ローディングコントロール（下部）として、ＢＲ５抗体を使用してエンベロープＭＶＡ糖タンパク質をプローブした。「ＣＥＦ」は感染していない、ネガティブコントロールである。；「ＭＶＡ」とラベル付けされたレーンは、いずれの抗原を発現しない野生型ＭＶＡである。；（＋）とラベル付けされたレーンは、トリプレックスの臨床ロットを生成するために使用されるウイルスである。 図１５Ａ−１５Ｃは、ＭＶＡ−ＢＡＣの０４４／０４５Ｌ挿入部位におけるＩＥ２Ｈ３６３／３６９Ａ ＮＣＯ、４ｎｔ、及びＶａｃＯの安定性分析を示す。ＩＥ２ ＮＣＯ（１５Ａ）、４ｎｔ（１５Ｂ）、及びＶａｃＯ（１５Ｃ）のＰＣＲ（左）及びウエスタンブロット分析（右）。左： ＣＥＦでＰ１０まで継代された、０４４／０４５ＬでＩＥ２変異体の安定性を分析するＰＣＲ産物の１．０％アガロースゲル。右： ＣＥＦ細胞でＰ１０まで継代されたＩＥ２変異体のウエスタンブロット分析。ＩＥ２は、ａｎｔｉ−ｌＥ２ ｍＡＢ２．９．５を使用してプローブされた。感染／ローディングコントロール（下部）として、ＢＲ５抗体を使用してエンベロープＭＶＡ糖タンパク質をプローブした。「ＣＥＦ」は感染していない、ネガティブコントロールである。；「ＭＶＡ」とラベル付けされたレーンは、いずれの抗原を発現しない野生型ＭＶＡである。；（＋）とラベル付けされたレーンは、トリプレックスの臨床ロットを生成するために使用されるウイルスである。 図１６Ａ−１６Ｃは、ＭＶＡ−ＢＡＣのＩＧＲ３挿入部位におけるＩＥｆｕｓｉｏｎ ４ｎｔ変異体の安定性分析を示す。ＩＥｆｕｓｉｏｎ ４ｎｔ Ｈ３６３Ａ（１６Ａ）、Ｈ３６９Ａ（１６Ｂ）、及びＨ３６３Ａ／Ｈ３６９Ａ（１６Ｃ）のＰＣＲ（左）及びウエスタンブロット分析（右）。左： ＣＥＦでＰ１０まで継代された、ＩＧＲ３のＩＥｆｕｓｉｏｎ変異体の安定性を分析するＰＣＲ製品の１．０％アガロースゲル。右： ＣＥＦ細胞でＰ１０まで継代されたＩＥｆｕｓｉｏｎ変異体のウエスタンブロット分析。ＩＥｆｕｓｉｏｎは、精製された抗ｌＥ１マウスモノクローナル抗体（ｍＡＢ）ｐ６３−２７を使用してプローブされた。感染／ローディングコントロール（下部）として、ＢＲ５抗体を使用してエンベロープＭＶＡ糖タンパク質をプローブした。「ＣＥＦ」は感染していない、ネガティブコントロールである。；「ＭＶＡ」とラベル付けされたレーンは、いずれの抗原を発現しない野生型ＭＶＡである。；（＋）とラベル付けされたレーンは、トリプレックスの臨床ロットを生成するために使用されるウイルスである。 図１７は、コンストラクトＡ（ｉ）の安定性分析を示す。ＩＥ１、ＩＥ２、及びｐｐ６５のＰＣＲ（左）及びウエスタンブロット分析（右）。左： ＣＥＦでＰ１０まで継代された、ＩＧＲ３のＩＥ１、０４４／０４５ＬのＩＥ２、及びＤｅｌ３のｐｐ６５の安定性を分析するＰＣＲ産物の１．０％アガロースゲル。右： ＣＥＦ細胞でＰ１０まで継代されたＩＥｆｕｓｉｏｎ及びｐｐ６５のウエスタンブロット分析。ＩＥ１は、精製された抗ｌＥ１マウスモノクローナル抗体（ｍＡＢ）ｐ６３−２７を使用してプローブされた。；ＩＥ２は、抗ｌＥ２ ｍＡＢ２．９．５を使用してプローブされた。；ｐｐ６５は、精製されたマウスｍＡＢ２８−１０３を使用してプローブされた。感染／ローディングコントロール（下部）として、ＢＲ５抗体を使用してエンベロープＭＶＡ糖タンパク質をプローブした。「ＣＥＦ」は感染していない、ネガティブコントロールである。；「ＭＶＡ」とラベル付けされたレーンは、いずれの抗原を発現しない野生型ＭＶＡである。；（＋）とラベル付けされたレーンは、トリプレックスの臨床ロットを生成するために使用されるウイルスである。 図１８は、コンストラクトＡ（ｖ）の安定性分析を示す。ＩＥ１、ＩＥ２、及びｐｐ６５のＰＣＲ（左）及びウエスタンブロット分析（右）。左： ＣＥＦでＰ１０まで継代された、ＩＧＲ３のＩＥ１、０４４／０４５ＬのＩＥ２、及びＤｅｌ３のｐｐ６５の安定性を分析するＰＣＲ産物の１．０％アガロースゲル。右： ＣＥＦ細胞でＰ１０まで継代されたＩＥｆｕｓｉｏｎ及びｐｐ６５のウエスタンブロット分析。ＩＥ１は、精製された抗ｌＥ１マウスモノクローナル抗体（ｍＡＢ）ｐ６３−２を使用してプローブされた。；ＩＥ２は、抗ｌＥ２ ｍＡＢ２．９．５を使用してプローブされた。；ｐｐ６５は、精製されたマウスｍＡＢ２８−１０３を使用してプローブされた。感染／ローディングコントロール（下部）として、ＢＲ５抗体を使用してエンベロープＭＶＡ糖タンパク質をプローブした。「ＣＥＦ」は感染していない、ネガティブコントロールである。；「ＭＶＡ」とラベル付けされたレーンは、いずれの抗原を発現しない野生型ＭＶＡである。；（＋）とラベル付けされたレーンは、トリプレックスの臨床ロットを生成するために使用されるウイルスである。 図１９は、コンストラクトＡ（ｖｉ）の安定性分析を示す。ＩＥ１、ＩＥ２、及びｐｐ６５のＰＣＲ（左）及びウエスタンブロット分析（右）。左： ＣＥＦでＰ１０まで継代された、ＩＧＲ３のＩＥ１、０４４／０４５ＬのＩＥ２、及びＤｅｌ３のｐｐ６５の安定性を分析するＰＣＲ産物の１．０％アガロースゲル。右： ＣＥＦ細胞でＰ１０まで継代されたＩＥｆｕｓｉｏｎ及びｐｐ６５のウエスタンブロット分析。ＩＥ１は、精製された抗ｌＥ１マウスモノクローナル抗体（ｍＡＢ）ｐ６３−２７を使用してプローブされた。；ＩＥ２は、抗ｌＥ２ ｍＡＢ２．９．５を使用してプローブされた。ｐｐ６５は、精製されたマウスｍＡＢ２８−１０３を使用してプローブされた。感染／ローディングコントロール（下部）として、ＢＲ５抗体を使用してエンベロープＭＶＡ糖タンパク質をプローブした。「ＣＥＦ」は感染していない、ネガティブコントロールである。；「ＭＶＡ」とラベル付けされたレーンは、いずれ抗原を発現しない野生型ＭＶＡである。；（＋）とラベル付けされたレーンは、トリプレックスの臨床ロットを生成するために使用されるウイルスである。 図２０は、コンストラクトＢ（ｉ）の安定性分析を示す。ＩＥ１、ＩＥ２、及びｐｐ６５のＰＣＲ（左）及びウエスタンブロット分析（右）。左： ＣＥＦでＰ１０まで継代された、ＩＧＲ３のＩＥ１、０４４／０４５ＬのＩＥ２、及びＤｅｌ３のｐｐ６５の安定性を分析するＰＣＲ産物の１．０％アガロースゲル。右： ＣＥＦ細胞でＰ１０まで継代されたＩＥｆｕｓｉｏｎ及びｐｐ６５のウエスタンブロット分析。ＩＥ１は、精製された抗ｌＥ１マウスモノクローナル抗体（ｍＡＢ）ｐ６３−２７を使用してプローブされた。；ＩＥ２は、抗ｌＥ２ ｍＡＢ２．９．５を使用してプローブされた。；ｐｐ６５は、精製されたマウスｍＡＢ２８−１０３を使用してプローブされた。この図では（＋）は機能しなかったため、α−ｐｐ６５又はα−ｌＥ１ウエスタンブロットではバンドは観察されなかった。感染／ローディングコントロール（下部）として、ＢＲ５抗体を使用してエンベロープＭＶＡ糖タンパク質をプローブした。「ＣＥＦ」は感染していない、ネガティブコントロールである。；「ＭＶＡ」とラベル付けされたレーンは、いずれの抗原を発現しない野生型ＭＶＡである。；（＋）とラベル付けされたレーンは、トリプレックスの臨床ロットを生成するために使用されるウイルスである。 図２１は、コンストラクトＢ（ｉｉ）の安定性分析を示す。ＩＥ１、ＩＥ２、及びｐｐ６５のＰＣＲ（左）及びウエスタンブロット分析（右）。左： ＣＥＦでＰ１０まで継代された、ＩＧＲ３のＩＥ１、０４４／０４５ＬのＩＥ２、及びＤｅｌ３のｐｐ６５の安定性を分析するＰＣＲ産物の１．０％アガロースゲル。右： ＣＥＦ細胞でＰ１０まで継代されたＩＥｆｕｓｉｏｎ及びｐｐ６５のウエスタンブロット分析。ＩＥ１は、精製された抗ｌＥ１マウスモノクローナル抗体（ｍＡＢ）ｐ６３−２７を使用してプローブされた。；ＩＥ２は、抗ｌＥ２ ｍＡＢ２．９．５を使用してプローブされた。；ｐｐ６５は、精製されたマウスｍＡＢ２８−１０３を使用してプローブされた。感染／ローディングコントロール（下）として、ＢＲ５抗体を使用してエンベロープＭＶＡ糖タンパク質をプローブした。「ＣＥＦ」は感染していない、ネガティブコントロールである。；「ＭＶＡ」とラベル付けされたレーンは、いずれの抗原を発現しない野生型ＭＶＡである。；（＋）とラベル付けされたレーンは、トリプレックスの臨床ロットを生成するために使用されるウイルスである。（＊）Ｐ１ ＰＣＲの場合、レーンが欠落していることを示す。 図２２は、コンストラクトＢ（ｉｉｉ）の安定性分析を示す。ＩＥ１、ＩＥ２、及びｐｐ６５のＰＣＲ（左）及びウエスタンブロット分析（右）。左： ＣＥＦでＰ１０まで継代された、ＩＧＲ３のＩＥ１、０４４／０４５ＬのＩＥ２、及びＤｅｌ３のｐｐ６５の安定性を分析するＰＣＲ産物の１．０％アガロースゲル。右： ＣＥＦ細胞でＰ１０まで継代されたＩＥｆｕｓｉｏｎ及びｐｐ６５のウエスタンブロット分析。ＩＥ１は、精製された抗ｌＥ１マウスモノクローナル抗体（ｍＡＢ）ｐ６３−２７を使用してプローブされた。；ＩＥ２は、抗ｌＥ２ ｍＡＢ２．９．５を使用してプローブされた。；ｐｐ６５は、精製されたマウスｍＡＢ２８−１０３を使用してプローブされた。感染／ローディングコントロール（下部）として、ＢＲ５抗体を使用してエンベロープＭＶＡ糖タンパク質をプローブした。「ＣＥＦ」は感染していない、ネガティブコントロールである。；「ＭＶＡ」とラベル付けされたレーンは、いずれの抗原を発現しない野生型ＭＶＡである。；（＋）とラベル付けされたレーンは、トリプレックスの臨床ロットを生成するために使用されるウイルスである。分子量に基づくタンパク質同定を明確にするために、ＩＥｆｕｓｉｏｎとＩＥ１は矢印で示されている。 図２３は、コンストラクトＢ（ｖ）の安定性分析を示す。ＩＥ１、ＩＥ２、及びｐｐ６５のＰＣＲ（左）及びウエスタンブロット分析（右）。左： ＣＥＦでＰ１０まで継代された、ＩＧＲ３のＩＥ１、０４４／０４５ＬのＩＥ２、及びＤｅｌ３のｐｐ６５の安定性を分析するＰＣＲ産物の１．０％アガロースゲル。右： ＣＥＦ細胞でＰ１０まで継代されたＩＥｆｕｓｉｏｎ及びｐｐ６５のウエスタンブロット分析。ＩＥ１は、精製された抗ｌＥ１マウスモノクローナル抗体（ｍＡＢ）ｐ６３−２７を使用してプローブされた。；ＩＥ２は、抗ｌＥ２ ｍＡＢ２．９．５を使用してプローブされた。；ｐｐ６５は、精製されたマウスｍＡＢ２８−１０３を使用してプローブされた。感染／ローディングコントロール（下部）として、ＢＲ５抗体を使用してエンベロープＭＶＡ糖タンパク質をプローブした。「ＣＥＦ」は感染していない、ネガティブコントロールである；「ＭＶＡ」とラベル付けされたレーンは、いずれの抗原を発現しない野生型ＭＶＡである；（＋）とラベル付けされたレーンは、トリプレックスの臨床ロットを生成するために使用されるウイルスである。 図２４は、コンストラクトＢ（ｖｉｉ）の安定性分析を示す。ＩＥ１、ＩＥ２、及びｐｐ６５のＰＣＲ（左）及びウエスタンブロット分析（右）。左： ＣＥＦでＰ１０まで継代された、ＩＧＲ３のＩＥ１、０４４／０４５ＬのＩＥ２、及びＤｅｌ３のｐｐ６５の安定性を分析するＰＣＲ産物の１．０％アガロースゲル。右： ＣＥＦ細胞でＰ１０まで継代されたＩＥｆｕｓｉｏｎ及びｐｐ６５のウエスタンブロット分析。ＩＥ１は、精製された抗ｌＥ１マウスモノクローナル抗体（ｍＡＢ）ｐ６３−２７を使用してプローブされた。；ＩＥ２は、抗ｌＥ２ ｍＡＢ２．９．５を使用してプローブされた。；ｐｐ６５は、精製されたマウスｍＡＢ２８−１０３を使用してプローブされた。感染／ローディングコントロール（下部）として、ＢＲ５抗体を使用してエンベロープＭＶＡ糖タンパク質をプローブした。「ＣＥＦ」は感染していない、ネガティブコントロールである；「ＭＶＡ」とラベル付けされたレーンは、いずれの抗原を発現しない野生型ＭＶＡである；（＋）とラベル付けされたレーンは、トリプレックスの臨床ロットを生成するために使用されるウイルスである。 図２５は、ＩＥｆｕｓｉｏｎ ４ｎｔ Ｈ３６３Ａ（ＩＧＲ３）：ｐｐ６５（Ｄｅｌ３）の安定性分析を示す。ＩＥｆｕｓｉｏｎ ４ｎｔ Ｈ３６３Ａ及びｐｐ６５のＰＣＲ（左）及びウエスタンブロット分析（右）。左： ＣＥＦでＰ１０まで継代された、ＩＧＲ３でのＩＥｆｕｓｉｏｎ及びＤｅｌ３でのｐｐ６５の安定性を分析するＰＣＲ産物の１．０％アガロースゲル。右： ＣＥＦ細胞でＰ１０まで継代されたＩＥｆｕｓｉｏｎ及びｐｐ６５のウエスタンブロット分析。ＩＥｆｕｓｉｏｎは、精製された抗ｌＥ１マウスモノクローナル抗体（ｍＡＢ）ｐ６３−２７を使用してプローブされた。；ｐｐ６５は、精製されたマウスｍＡＢ２８−１０３を使用してプローブされた。感染／ローディングコントロール（下部）として、ＢＲ５抗体を使用してエンベロープＭＶＡ糖タンパク質をプローブした。「ＣＥＦ」は感染していない、ネガティブコントロールである；「ＭＶＡ」とラベル付けされたレーンは、抗原を発現しない野生型ＭＶＡである；（＋）とラベル付けされたレーンは、トリプレックスの臨床ロットを生成するために使用されるウイルスである。 図２６は、ＩＥｆｕｓｉｏｎ ４ｎｔ Ｈ３６９Ａ（ＩＧＲ３）：ｐｐ６５（Ｄｅｌ３）の安定性分析を示す。ＩＥｆｕｓｉｏｎ ４ｎｔ Ｈ３６９Ａ及びｐｐ６５のＰＣＲ（左）及びウエスタンブロット分析（右）。左： ＣＥＦでＰ１０まで継代された、ＩＧＲ３でのＩＥｆｕｓｉｏｎ及びＤｅｌ３でのｐｐ６５の安定性を分析するＰＣＲ産物の１．０％アガロースゲル。右： ＣＥＦ細胞でＰ１０まで継代されたＩＥｆｕｓｉｏｎ及びｐｐ６５のウエスタンブロット分析。ＩＥｆｕｓｉｏｎは、精製された抗ｌＥ１マウスモノクローナル抗体（ｍＡＢ）ｐ６３−２７を使用してプローブされた。；ｐｐ６５は、精製されたマウスｍＡＢ２８−１０３を使用してプローブされた。感染／ローディングコントロール（下部）として、ＢＲ５抗体を使用してエンベロープＭＶＡ糖タンパク質をプローブした。「ＣＥＦ」は感染していない、ネガティブコントロールである；「ＭＶＡ」とラベル付けされたレーンは、いずれの抗原を発現していない野生型ＭＶＡである；（＋）とラベル付けされたレーンは、トリプレックスの臨床ロットを生成するために使用されるウイルスである。 図２７Ａ〜２７Ｂは、第２世代のトリプレックス免疫化後のＴ細胞応答及び刺激を示す。図２７Ａ： 第２世代トリプレックスによって誘発されたヒトＭＨＣ制限Ｔ細胞応答。表６のデータのグラフ表示。図２７Ｂ： 第２世代トリプレックスによるＨＬＡ−B＊０７０２−又はＨＬＡ−Ａ＊０２０１制限ＣＤ８＋ Ｔ細胞刺激。表７のデータのグラフ表示。エラーバーはＳＥＭで計算され、表６及び７に報告されている。 図２８Ａ−２８Ｂは、重複するＩＥ２遺伝子を発現するコンストラクトの安定性分析を示す。ＩＥ２及びＩＥ２変異体のＰＣＲ（上部）及びウエスタンブロット分析（下部）。図２８Ａ： ＣＥＦでＰ５まで継代された、Ｇ１ＬでのＩＥ２及び０４４／０４５ＬでのＩＥ２変異体の３つのバージョンの安定性を分析するＰＣＲ産物の１．０％アガロースゲル。図２８Ｂ： ＩＥ２及び３つの変異体のウエスタンブロット分析は、ＣＥＦ細胞でＰ５まで継代された。ＩＥ２は、ａｎｔｉ−ｌＥ２ ｍＡＢ２．９．５を使用してプローブされた。感染／ローディングコントロール（下部）として、ＢＲ５抗体を使用してエンベロープＭＶＡ糖タンパク質をプローブした。「ＣＥＦ」は感染していない、ネガティブコントロールである；「ＭＶＡ」とラベル付けされたレーンは、いずれの抗原を発現しない野生型ＭＶＡである；（＋）とラベル付けされたレーンは、トリプレックスの臨床ロットを生成するために使用されるウイルスである。
発明の詳細な説明
現在のトリプレックスワクチン製剤は、３つの免疫優勢タンパク質： ｐｐ６５及び前初期タンパク質ＩＥ１及びＩＥ２の融合、を包含するが、限定的な製造特性を有する。：
１）ＩＥｆｕｓｉｏｎ挿入の安定性を維持するために限定された継代を受けなければならない;
２）ＩＥｆｕｓｉｏｎの不安定性なしにウイルス増殖を可能にするための制限された増殖条件；
３）大規模な臨床ロットの大量生産の場合、現在のＴｒｉｐｌｅｘ製剤(formulation)は、最も効率的で長期的な生産戦略ではない。
改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）ワクチンプラットフォームを細菌人工染色体（ＢＡＣ）技術と組み合わせて利用することにより、１０継代にわたって別々の挿入部位でＩＥ１及びＩＥ２タンパク質の両方を安定して発現する新しい形態のトリプレックスが生成される。ＭＶＡは、感染症や癌を治療又は予防するための治療ワクチン戦略の開発に広く使用されている、十分に特徴付けられ、臨床的に忍容性の高いワクチンベクターである。ＨＣＭＶ抗原ＩＥ１、ＩＥ２、及びｐｐ６５による細胞性免疫応答の誘導は、造血幹細胞又は固形臓器移植を受けた、又は受ける予定の個人の感染又は再感染を防ぐためのワクチン候補の構築に不可欠であると考えられている。本明細書に開示されるのは、ＭＶＡ内に挿入部位を有する複数のＨＣＭＶ抗原を同時に発現するＭＶＡベクターの構築、ＩＥｆｕｓｉｏｎのＩＥ１及びＩＥ２構成要素への改変、ならびにＩＥｆｕｓｉｏｎをＩＥ１（エクソン４）及びＩＥ２（エクソン５）の個々の構成要素に分割することである。挿入されたＨＣＭＶ抗原配列は、それらの天然のＨＣＭＶ ＤＮＡ配列に基づいているか、効率的なワクシニアウイルス発現のためにコドン最適化されている。個々のＨＣＭＶ抗原は、３つのユニークなＭＶＡ挿入部位に別々に挿入される。ＭＶＡ欠失部位ＩＩＩ（Ｄｅｌ３）、ＭＶＡ必須遺伝子Ｉ８ＲとＧ１Ｌとの間の部位、遺伝子間領域ＩＧＲ３、及びＭＶＡ０４４／０４５Ｌ部位を包含する、４つの候補挿入部位がある。異所的に挿入された改変プロモーターＨ５は、ＭＶＡベクターからのＨＣＭＶ抗原の発現を誘導する。さらに、ＩＥ２のＣ末端ＤＮＡ結合ドメインでのＨｉｓからＡｌａへのアミノ酸置換は、最低１０継代にわたってＩＥ２の安定した発現を助けた。したがって、ＩＥ２をさらに安定させるために、ＨｉｓからＡｌａへの置換が部位特異的突然変異誘発を介して挿入さた。これらの変異は、１０回の継代を通じてＩＥ２の発現を安定させるのに役立った。
一態様では、本開示は、トリプレックスの延長継代時の安定性の改善すること、及び効果的なワクチン製剤に必要な３つすべての抗原を維持しながら免疫原性を保持することに関する。例えば、効率的なウイルスワクチン産生のためにＩＥ１、ＩＥ２、及びｐｐ６５を安定して発現するＭＶＡを生成するために、以下を包含するがこれらに限定されない１つ以上の変更を行うことができる。：
１）遺伝子の安定性にとって好ましい環境となる可能性のあるＭＶＡでの複数のユニークな遺伝子挿入部位の使用；
２）コドン「ゆらぎ」位置での突然変異を含むことが以前に同定された遺伝子配列内のＤＮＡ突然変異「ホットスポット」の除去、それにより連続するＣ又はＧヌクレオチドを破壊する；及び
３）タンパク質発現の増加のためのポックスウイルスコドン最適化。
いくつかの実施形態では、ＩＥfusionは、ＭＶＡ内の他の部位に挿入される。候補サイトには、Ｄｅｌ３［５、６］、Ｇ１Ｌ／Ｉ８Ｒ［７、８］、ＩＧＲ３［９］、及び０４４Ｌ／０４５Ｌ［１０］が含まれる。追加の挿入部位を表１に列挙する。いくつかの実施形態では、挿入部位はＤｅｌ２を包含しない。いくつかの実施形態において、遺伝子配列中の３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上の連続したＣ又はＧヌクレオチドは、同一のアミノ酸同一性を維持するゆらぎ塩基置換によって破壊される。
本明細書に開示されるのは、ワクチンの大規模増殖のために最低１０継代で３つすべてのＣＭＶ抗原を安定して発現するＭＶＡを生成するための挿入部位及び遺伝子改変の最も安定した組み合わせである。ＩＥ１、ＩＥ２、及びｐｐ６５の安定した発現を可能にする挿入部位の最も安定した組み合わせを見つけるために、さまざまな組み合わせが考えらる。：
１）ＩＥｆｕｓｉｏｎをＩＥ１及びＩＥ２遺伝子コンポーネントに分割すること；
２）３つの遺伝子すべてをＭＶＡの別々の挿入部位に挿入すること、及びインサートの変異遺伝子配列を使用すること；
３）ＭＶＡの新しい挿入サイトを探索する。
挿入部位のいくつかの例を表１に示す。
Figure 2021523712
図１に図示するように、ＩＥ１、ＩＥ２、及びｐｐ６５を単一のＭＶＡベクターで同時に発現するＴｒｉｐｌｅｘの安定性を高める目的で、さまざまな変更及び／又は挿入部位の選択が行われる。一部のＭＶＡ挿入部位は、より高い安定性を生み出す環境を提供する。ＩＥ１又はＩＥ２のいずれかについて、おそらくそれらのヌクレオチド配列に基づいています。例えば、１つ以上のＩＥ１、ＩＥ２及びｐｐ６５遺伝子は、０４４Ｌ／０４５Ｌ、ＩＧＲ３、Ｇ１Ｌ／Ｉ８Ｒ、及びＤｅｌ３を包含する１つ又は複数の挿入部位に挿入される。いくつかの実施形態では、挿入部位はＤｅｌ２を包含しない。加えて、又は代替として、ＩＥ１遺伝子及び／又はＩＥ２遺伝子のＤＮＡ配列、及び／又はＩＥ１タンパク質及び／又はＩＥ２タンパク質のアミノ酸配列は、ＭＶＡのライフサイクル又は細胞毒性の不在とより適合性があるように改変される。いくつかの実施形態において、ＩＥ１遺伝子及び／又はＩＥ２遺伝子のＤＮＡ配列は、コドン最適化されている。例えば、シトシン又はグアニンの連続したＤＮＡ配列はコドン最適化され、連続したシトシン又はグアニンのない同じアミノ酸残基をコードするＤＮＡ配列に置き換えられる。いくつかの実施形態において、ＩＥ１タンパク質又はＩＥ２タンパク質のアミノ酸配列は、突然変異体ＩＥ１タンパク質又は突然変異体ＩＥ２タンパク質の安定性が野生型ＩＥ１タンパク質又は野生型ＩＥ２タンパク質の安定性と比較して改善されるように、１つ以上の突然変異を含有する。いくつかの実施形態では、１つ又は複数のアミノ酸変異は、ＩＥ２タンパク質のＺｎフィンガードメインを破壊する。例えば、ＩＥ２タンパク質のアミノ酸配列には、Ｃ末端に１つ以上のＨｉｓ→Ａｌａ変異が含まれる。いくつかの実施形態では、ＩＥ２タンパク質のアミノ酸配列は、Ｈ３６３Ａ突然変異、Ｈ３６９Ａ突然変異、又はその両方を含有する。
本明細書で使用される「免疫学的に有効な量」は、免疫される対象（動物又はヒト）にとって安全であり、且つ対象の免疫を改善するのに十分である量を意味する。免疫学的に有効な量は変動する可能性があり、日常的な試験を通じて既知の技術によって決定することができる。
別の実施形態において、連続継代後に遺伝的に安定である免疫学的に有効な量のｒＭＶＡウイルスを含有するＣＭＶワクチンは、上記の１つ以上の改変を組み込んだ本明細書に開示される方法によって産生され得る。
ＣＭＶ抗原は、ＣＭＶタンパク質抗原、ＣＭＶタンパク質抗原のフラグメント、改変されたＣＭＶタンパク質抗原、改変されたＣＭＶタンパク質抗原のフラグメント、変異されたＣＭＶタンパク質抗原、又は融合ＣＭＶタンパク質抗原であり得る。ＣＭＶタンパク質抗原及びＣＭＶフラグメントの例には、ｐｐ６５、ＩＥ１エクソン４（ＩＥ１／ｅ４）、ＩＥ２エクソン５（ＩＥ２／ｅ５）、及びそれらの抗原性フラグメントが含まれ得る。改変されたＣＭＶタンパク質抗原及びそのフラグメントの例は、Ｄｉａｍｏｎｄ ｅｔ ａｌ．に対する米国特許第７，１６３，６８５号に見出すことができる。そして、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。変異したＣＭＶタンパク質抗原の例は、Ｚａｉａ ｅｔ ａｌ．に対する米国特許第６，８３５，３８３号に見出すことができる。そして、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。さらに、健康な成人の免疫応答を評価することによって確立されたすべてのランク付けされた抗原は、遺伝子挿入のためのＭＶＡベクターの最大容量に達するまで合計することができる（図１Ｃ及び４Ｄを参照）［３２］。
融合ＣＭＶタンパク質抗原は、２つ以上のＣＭＶタンパク質、改変されたＣＭＶタンパク質、変異したＣＭＶタンパク質、又はそれらのいずれの抗原性フラグメントを含み得る。一態様では、例示的な融合タンパク質は、ＩＥ１エクソン４（ＩＥ１／ｅ４）及びＩＥ２エクソン５（ＩＥ２／ｅ５）、ＩＥ１／ｅ４−ＩＥ２／ｅ５の融合である（「ＩＥｆｕｓｉｏｎ」）。一実施形態では、融合タンパク質の使用は、ＩＥ１からのエクソン４及びＩＥ２遺伝子からのエクソン５を、追加の遺伝物質なしで単一の遺伝子に含むＩＥ融合タンパク質を作成することを含む。ＩＥｆｕｓｉｏｎタンパク質は、いずれかのタンパク質単独よりも前初期抗原のユニークな表現を含む。別の実施形態では、ＩＥｆｕｓｉｏｎをコードする核酸配列は、コドン最適化されている。さらに別の実施形態では、ＩＥfusionタンパク質のアミノ酸配列は、ＩＥ２のＣ末端に１つ又は複数のＨｉｓからＡｌａへの突然変異を含む。
本明細書で使用される「遺伝的安定性」という用語は、ウイルスの連続継代に伴う、遺伝子のＤＮＡ配列、遺伝子の発現レベル、又はその両方の変化に対する耐性の尺度を指す。ｒＭＶＡベクターにおける標的遺伝子の遺伝的安定性は、ワクチンの開発における懸念事項である。標的遺伝子の遺伝的安定性の低下は、遺伝子配列又は発現レベルの変化により、ｒＭＶＡベクターの免疫原性を低下させる効果がある可能性がある。挿入遺伝子配列の遺伝的不安定性は、遺伝子挿入に隣接する配列の変化につながる可能性がある。挿入遺伝子の不安定性を抑制することは、隣接するウイルスＤＮＡ配列の不安定性を抑制するように思われる。
組換えウイルスの遺伝的安定性は、当技術分野で知られている多くの方法、例えば、ウエスタンブロット（ＷＢ）又は免疫染色ウイルスプラークによる各継代での外来タンパク質発現レベルの試験、及び連続継代前後の外来タンパク質産生病巣の割合を計算すること、によって測定又は評価することができる。遺伝的安定性を評価する別の手段は、リアルタイム定量ＰＣＲ（ＲＴ−ｑＰＣＲ）法によるものである。これは、単離されたＭＶＡゲノムＤＮＡを増幅し、各継代後に挿入された目的の遺伝子とＭＶＡベクターのコピー数を計算する。目的の遺伝子のコピー数とＭＶＡバックボーンベクターのコピー数の比率を使用して、遺伝子又は遺伝子を保有するＭＶＡワクチンの遺伝的安定性を決定する。ＭＶＡバックボーンベクターのコピー数に対する目的の遺伝子のコピー数の比率が高いほど、遺伝的安定性が高いことを反映しており、比率が最も高い＝１は、連続継代後も約１００％の遺伝子発現が残っていることを意味する。ＲＴ−ｑＰＣＲは、ウエスタンブロットや免疫染色などの他の方法と比較して、より感度が高く、スループットが高く、再現性の高い結果を提供する。ＲＴ−ｑＰＣＲの方法は、当技術分野で周知の手順又は市販のＲＴ−ｑＰＣＲキットのマニュアルに従って実施することができる。ただし、この方法では、配列情報を伴わずに単一ヌクレオチドの変化を検出できない場合がある。ＩＥ１又はＩＥ２インサートのコード配列の破壊は、無傷の形態を認識するモノクローナル抗体による認識を妨げる可能性がある。
興味対象の遺伝子を保有するｒＭＶＡワクチンは、ワクチンの連続継代中、特に１０回以上継代後、遺伝子のＤＮＡ配列及び遺伝子の発現が実質的に変化しない場合、遺伝的に安定している。
別の態様は、本明細書に開示される遺伝的に安定なｒＭＶＡワクチンを対象に投与することによる、哺乳動物対象における感染症又は癌の予防又は治療のための方法であり、ｒＭＶＡワクチンは、ｍＨ５又はＩＥ１、ＩＥ２、及びｐｐ６５又はそれらの抗原性フラグメントを包含する他のポックスウイルスプロモーターを含有する。いくつかの実施形態では、哺乳動物対象はヒト対象である。
特定のＩＥfusions、ＩＥタンパク質、及びそれらの変異体の核酸配列及びアミノ酸配列を以下に開示する。
ＩＥｆｕｓｉｏｎ−ＶａｃＯ ＤＮＡ配列（配列番号１）：
Figure 2021523712
ＩＥｆｕｓｉｏｎ ＤＮＡ配列（配列番号２）：
Figure 2021523712
ＩＥｆｕｓｉｏｎ−４ｎｔ ＤＮＡ配列（配列番号３）：
Figure 2021523712
Figure 2021523712


ＩＥｆｕｓｉｏｎ−ＶａｃＯアミノ酸配列（配列番号４）：
Figure 2021523712
ＩＥｆｕｓｉｏｎアミノ酸配列（配列番号５）：
Figure 2021523712
ＩＥｆｕｓｉｏｎ−４ＮＴアミノ酸配列（配列番号６）：
Figure 2021523712

ＩＥ２−ＶａｃO ＤＮＡ配列（配列番号７）：
Figure 2021523712
ＩＥ２ ＤＮＡ配列（配列番号８）：
Figure 2021523712
ＩＥ２−４ｎｔ ＤＮＡ配列（配列番号９）：
Figure 2021523712
ＩＥ２ ４ｎｔ Ｈ３６３Ａ ＤＮＡ配列（変異は太字で下線付きで示されている）（配列番号１０）：
Figure 2021523712
ＩＥ２ ４ｎｔ Ｈ３６９Ａ ＤＮＡ配列（変異は太字で下線が引かれている）（配列番号１１）：
Figure 2021523712
ＩＥ２ ４ｎｔ Ｈ３６３Ａ／Ｈ３６９Ａ ＤＮＡ配列（変異は太字及び下線付きで示されている）（配列番号１２）：
Figure 2021523712
ＩＥ２ Ｈ３６３Ａ ＤＮＡ配列（変異は太字で下線付きで示されている）（配列番号１３）：
Figure 2021523712
ＩＥ２ Ｈ３６９Ａ ＤＮＡ配列（変異は太字で下線付きで示されている）（配列番号１４）：
Figure 2021523712
ＩＥ２ Ｈ３６３Ａ／Ｈ３６９Ａ ＤＮＡ配列（変異は太字で下線付きで示されている）（配列番号１５）：
Figure 2021523712
ＩＥ２ ＶａｃＯ Ｈ３６３Ａ ＤＮＡ配列（突然変異は太字及び下線で示されている）（配列番号１６）：
Figure 2021523712
ＩＥ２ ＶａｃＯ Ｈ３６９Ａ ＤＮＡ配列（突然変異は太字及び下線で示されている）（配列番号１７）：
Figure 2021523712
ＩＥ２ ＶａｃＯ Ｈ３６３Ａ／Ｈ３６９Ａ ＤＮＡ配列（突然変異は太字及び下線で示されている）（配列番号１８）：
Figure 2021523712
ＩＥ２−ＶａｃOアミノ酸配列（配列番号１９）：
Figure 2021523712
ＩＥ２アミノ酸配列（配列番号２０）：
Figure 2021523712
ＩＥ２−４ｎｔアミノ酸配列（配列番号２１）：
Figure 2021523712
ＩＥ２ Ｈ３６３Ａアミノ酸配列（突然変異（複数可）は太字及び下線で示されている）（配列番号２２）：
Figure 2021523712
ＩＥ２ Ｈ３６９Ａアミノ酸配列（突然変異（複数可）は太字及び下線で示されている）（配列番号２３）：
Figure 2021523712
ＩＥ２ Ｈ３６３Ａ／Ｈ３６９Ａアミノ酸配列（突然変異（複数可）は太字及び下線で示されている）（配列番号２４）：
Figure 2021523712
実施形態及び例示的な例を参照して本発明を説明してきたが、当技術分野の人々は、本明細書に開示された本発明の精神及び範囲から逸脱しない、説明及び図示された本発明への修正を認めることができる。これらの例は、本発明の理解を助けるために記載されているが、その範囲を制限することを意図しておらず、またそのように解釈されるべきではない。例には、従来の方法の詳細な説明は含まれていない。そのような方法は当業者によく知られており、多くの刊行物に記載されている。本明細書に記載されているすべての参考文献は、その全体が組み込まれている。
材料及び方法
データベース検索： タンデム質量スペクトル（ＭＳ／ＭＳ）は、ゲル内トリプシン消化及びその後のペプチド抽出を介して、勾配４〜２０％ＳＯＳ−ＰＡＧＥゲル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、ＵＳＡ）から抽出された。電荷状態のデコンボリューションとデアイソトーピングは実行されなかった。すべてのＭＳ／ＭＳサンプルは、Ｓｅｑｕｅｓｔ（ＸＣｏｒｒのみ）を使用して分析した（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国カリフォルニア州サンノゼ、Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｒ ２．１．０．８１のバージョンｌｓｅＮｏｄｅ）。Ｓｅｑｕｅｓｔ（ＸＣｏｒｒのみ）は、ｃｒａｐ＿ｎｃｂｉ．ｆａｓｔａ； Ｈｅｉｄｉ＿２０１７０８２８．ｆａｓｔａ； ｈｕｍａｎ＿ｒｅｆｓｅｑ．ｆａｓｔａを検索するように設定された（不明なバージョン、７３２０４エントリ）。消化酵素が非特異的であると仮定する。

（不明なバージョン、７３２０４エントリ）は、消化酵素が非特異的であると想定しています。 Ｓｅｑｕｅｓｔ（ＸＣｏｒｒのみ）は、０．６０Ｄａのフラグメントイオン質量許容値と０．６０Ｄａの親イオン許容値で検索されました。Ｓｅｑｕｅｓｔ（ＸＣｏｒｒのみ）は、０．６０Ｄａのフラグメントイオン質量許容値と０．６０Ｄａの１０．０ＰＰＭの親イオン許容値で検索された。システインのカルバミドメチルは、固定修飾としてＳｅｑｕｅｓｔ（ＸＣｏｒｒのみ）で指定された。アスパラギンの脱アミド化、メチオニンの酸化、及びＮ末端のアセチルは、Ｓｅｑｕｅｓｔ（ＸＣｏｒｒのみ）で可変修飾として指定されている。
タンパク質同定の基準： 足場（バージョンＳｃａｆｆｏｌｄ＿４．８．４、Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ．、オレゴン州ポートランド）を使用して、ＭＳ／ＭＳベースのペプチド及びタンパク質の同定を検証した。ペプチドの同定は、Ｓｃａｆｆｏｌｄ Ｌｏｃａｌ ＦDＲアルゴリズムによって３６．０％を超える確率で確立できた場合に受け入れられた。タンパク質の同定は、１．０％未満のＦＤＲを達成するために９８．０％を超える確率で確立でき、少なくとも５つの同定されたペプチドを含む場合に受け入れられた。タンパク質の確率は、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｏｐｈｅｔアルゴリズムによって割り当てられた［３３］。類似のペプチドを含有した、ＭＳ／ＭＳ分析だけでは区別できなかったタンパク質は、節約の原則(principles of parismony)を満たすためにグループ化された。
実施例１： 第１世代トリプレックスの評価
この研究において、「安定性」は、完全長の遺伝子が存在し、完全長のタンパク質が存在することを確認するために、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ＤＮＡシーケンス、及びウエスタンブロットを介して監視されているＭＶＡ内の目的の遺伝子の完全性によって評価された。Ｔｒｉｐｌｅｘの元の設計には、連続継代時に不安定性を引き起こし、タンパク質発現を大幅に低下させるｐＳｙｎプロモーターが含まれていた。ｐＳｙｎプロモーターは以前に改変ワクシニアウイルスＨ５（ｍＨ５）プロモーターに置き換えられており（図２Ａ）、免疫原性を維持しながらＩＥｆｕｓｉｏｎタンパク質の安定性の増加が観察された［１、２］。発現の安定性をさらに改善するために、発がんに関連する可能性のある遺伝子活性化イベントを防ぎ、可能な転写ユニットの数を減らすために、エクソン２／エクソン３内にコードされた核局在化配列と転写活性化ドメイン、及びＨＣＭＶＡＤ１６９からのＩＥ１とＩＥ２の重複するリーディングフレームは省略された。（図２Ａ）［３］。したがって、ヌクレオチドやアミノ酸を追加せずに、間にシームレスな接合部を持つＩＥ１／ＩＥ２融合体を、修飾ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）のＤｅｌ２部位に挿入し、非修飾リンタンパク質ｐｐ６５［４］をＭＶＡのＤｅｌ３部位に挿入した［１］。これらの変更後、ＩＥｆｕｓｉｏｎの安定性は、タンパク質（図２Ｂ）又はＤＮＡレベル（図２Ｃ）のいずれでもないものの、ＣＥＦの１０ウイルス継代にわたってＲＮＡレベルで観察された［１］。増殖のために、ＩＥｆｕｓｉｏｎサンプルは評価の前に約５継代を受けた。したがって、図２Ｂでは、Ｐ１とマークされたサンプルは、ＣＥＦで分析する前に５回継代された可能性がある。一方、図２Ｂで使用されている臨床Ｔｒｉｐｌｅｘは、それほど多くの継代を受けていない；したがって、ＩＥｆｕｓｉｏｎのＰ１では安定性の低下がすでに観察されている（図２Ｂ及び２Ｃ）。
したがって、第１世代のトリプレックスは、厳密な検証なしに、第３相製造ソリューションとして食品医薬品局（ＦＤＡ）に受け入れられない可能性がある。
実施例２： ＩＥｆｕｓｉｏｎバリアントの生成
本明細書に開示される第１世代トリプレックス及び新しいトリプレックスコンストラクトのゲノム構造は類似しているが、ＭＶＡの他の部位に挿入されたＩＥｆｕｓｉｏｎ（図１に示すスキームＩ）は、自然突然変異のホットスポットを減らしたり、ポックスウイルスのコドン最適化を介して発現を増やしたりするためのＩＥｆｕｓｉｏｎへの遺伝子改変の調査に加えて評価された（すなわち、ゆらぎ位置（４ ｎｔ）及びワクシニアウイルス発現（ＶａｃＯ）の最適化）。第１世代のＴｒｉｐｌｅｘには、野生型ＭＶＡへのＩＥｆｕｓｉｏｎの相同組換えを促進するトランスファープラスミドを介して生成されたＨＣＭＶ ＡＤ１６９ＤＮＡ配列を使用したＭＶＡのＤｅｌ２のＩＥｆｕｓｉｏｎとＤｅｌ３のｐｐ６５が含まれている［３］。図２を参照。このプロセスには時間がかかる可能性があるため、バクテリア人工染色体（ＢＡＣ）技術が利用された。ＢＡＣテクノロジー［１１、１２］及びアンパッサン突然変異誘発［１３、１４］を適用して、ｐｐ６５及びＩＥｆｕｓｉｏｎのさまざまな反復を発現する新しいＭＶＡコンストラクトを生成することにより、提案されたウイルスコンストラクトの各々（表２）が迅速に生成され、テストされた。
表２． ＢＡＣテクノロジーを介して生成されたＩＥｆｕｓｉｏｎを発現するＭＶＡコンストラクト
Figure 2021523712
「Ｘ」は不安定であることを示す。「√」は安定したサイトを示す。「ＮＤ」は未定を示す。
表２に示すように、ＩＥｆｕｓｉｏｎ（ＩＥｆｕｓ）の一部のバージョンは、ＭＶＡの次のサイトに挿入された： Ｄｅｌ２、Ｇ１Ｌ、ＩＧＲ３、又は０４４Ｌ／０４５Ｌ。ＩＥｆｕｓｉｏｎをＤｅｌ３、Ｇ１Ｌ／１８Ｒ、ＩＧＲ３、及び０４４Ｌ／０４５Ｌに挿入した後、一部のサイトは遺伝子発現の安定化にある程度役立ったが（データは示していない）、後期臨床評価のＦＤＡ基準を満たすには不十分である可能性がある。図３は、ＩＥｆｕｓｉｏｎコンストラクトの核酸配列アラインメントを示す。図４は、ＩＥｆｕｓｉｏｎ ４ｎｔがＭＶＡのＩＧＲ３サイト内に構築された場合、５つのウイルス継代（Ｐ５）を超えてＩＥｆｕｓｉｏｎの発現を安定化させたことを示す。
実施例３： ＩＥｆｕｓｉｏｎバリアントの評価
突然変異のホットスポットは、連続するＣ又はＧヌクレオチド塩基の、続いて、ＩＥfusionのＤＮＡ配列を最適化するワクシニアウイルスコドン（ＶａｃＯとして指定される）の実行を破壊することによって除去された［１５］。「Ｘ」でマークされた表２に示されるコンストラクトは、ＰＣＲ及びウエスタンブロットによって安定性について分析され、その挿入部位内の遺伝子の完全性及び継代後の発現をモニターした。このタイプの分析は、ＤＮＡ又はタンパク質レベルでの不安定性に関する洞察を提供する。
自発的突然変異のホットスポットの除去が不安定性を最小化するという知識に基づいて、表２に示されるすべてのＩＥｆｕｓｉｏｎコンストラクトが評価された。
ＩＧＲ３に挿入されたＩＥｆｕｓｉｏｎ ４ｎｔ（図４）は、改変されてた且つＤｅｌ２、Ｇ１Ｌ、及び０４４Ｌ／０４５Ｌ挿入部位に挿入された様々なＩＥfusionコンストラクト（表２及び図４Ａ）にわたって増加した安定性を示す。興味対象の遺伝子は、ＭＶＡの隣接領域を包含する遺伝子安定性分析のためにＰＣＲを介して増幅された（予想されるＩＥｆｕｓｉｏｎサイズは表３に示される）。
表３ 特定のサイト内で操作された遺伝子のＰＣＲ産物のサイズ
Figure 2021523712
継代中に完全長遺伝子の完全性が損なわれると、非特異的ＰＣＲ産物が出現し、継代３（Ｐ３）又はネガティブコントロールのサイズと同様の産物の周りに異常なＤＮＡ配列決定結果が観察された（図４Ｂ）；しかし、タンパク質レベルでの不安定性により、完全長産物の発現の減少がＰ７で観察された（図４Ｃ）。ＣＥＦでの連続ウイルス継代で安定性のいくらかの改善が観察されたように見えたが（データは示していない）、完全長ＩＥｆｕｓｉｏｎのタンパク質発現は長時間の継代で維持されなかった。この情報に基づいて、ＩＥ１及びＩＥ２は、ＤＮＡ又はアミノ酸レベルのいずれかで変更を加えない限り、約１３０ｋＤａのタンパク質融合体として安定して発現されないと結論付けられた。その結果、融合配列としてさらに変更を加えないＩＥｆｕｓｉｏｎは、１０回以上の継代に耐えるＭＶＡでＩＥｆｕｓｉｏｎの安定した発現を維持するのに最適ではない可能性がある。
実施例４： ＭＶＡにおけるＩＥ１、ＩＥ２、及びｐｐ６５の安定した発現のための革新的な戦略の開発
目標は、ワクチンウイルスの大規模増殖のために、最低１０継代で３つすべての抗原を安定して発現するＭＶＡを生成するため、挿入部位と遺伝子修飾の最も安定した組み合わせを見つけることであった。ＩＥ１、ＩＥ２、及びｐｐ６５の安定した発現を可能にする挿入部位の最も安定した組み合わせを見つけるために、３つの主要なポイントを考慮して新しいワクチン構築戦略が開始された：
１）ＩＥｆｕｓｉｏｎをそのＩＥ１／ＩＥ２コンポーネントに分割すること；
２）３つすべての遺伝子の変異遺伝子配列をＭＶＡの別々の挿入部位に挿入すること；及び
３）ＭＶＡの新しい挿入サイトを探索する。
ヌクレオチド修飾後の融合タンパク質としてのＩＥ１及びＩＥ２の安定性を高めることに限られた成功しかなかったので、ＩＥ１とＩＥ２を分離し、且つ各遺伝子を別々の挿入部位に挿入した後、新しいサイトのそれぞれにおける各遺伝子の安定性を分析した。元のＩＥｆｕｓｉｏｎコンストラクトはＩＥ１とＩＥ２を分割するためのテンプレートとして使用され、各コンポーネントは別々のｍＨ５プロモーターの制御下にあった［１］。表２は、１０継代以上(≧１０)にわたってＩＥ１及びＩＥ２を安定して発現するＭＶＡを生じさせるために生成されたすべてのコンストラクトを示す。さらに、連続するＣ及びＧヌクレオチドの除去などの他の変更、並びにＩＥｆｕｓｉｏｎで行われたような遺伝子のコドン最適化が組み込まれた。ＩＥ１及びＩＥ２遺伝子の異なる配列修飾を、ＣＥＦの安定性について分析し、また、ＢＡＣテクノロジーを使用してさまざまなＭＶＡコンストラクトを生成した。Ｄｅｌ２の不安定性が観察されたため［１５］、Ｄｅｌ２サイトは候補サイトとしてさらに追求されなかった。
ＣＥＦの遺伝子の安定性を評価するための実験設定に基づいて、Ｇ１Ｌ又はＩＧＲ３のいずれかで発現されるＩＥ１遺伝子の５つの潜在的な候補が得られた（表２）。ＩＥ１のみ（非コドン最適化（ＮＣＯ）、４ヌクレオチド最適化（４ｎｔ）、及びワクシニア最適化（ＶａｃＯ））がＧ１Ｌで安定性を示し（図９）、ＩＥ１（４ｎｔ）とＩＥ１（ＶａｃＯ）のみがＩＧＲ３で安定性を示した（図１０）。ＩＥ２コンストラクトは、鶏痘ヘルパーウイルスを使用したＢＨＫ細胞でのウイルス再構成時に生成するのがより困難であった［１１、１６］。ＩＥ２含有ＭＶＡを再構成する試みは、ＩＥ１で経験したことよりも困難であった。多くのトランスフェクションの試みとそれに続く安定性分析の後、ＣＥＦのいくつかのウイルス継代にわたって完全長ＩＥ２タンパク質を産生する安定したＩＥ２発現ＭＶＡコンストラクトは得られなかった（図１１及び１２）。図６は、ＩＥ２コンストラクトの核酸配列アラインメントを示す。
実施例５： ＩＥ２ ＤＮＡ及びアミノ酸配列の探索
ＩＥ２を発現するＭＶＡコンストラクトはいずれも完全長のＩＥ２タンパク質を産生しなかったが、１つのコンストラクトであるＭＶＡ：：ＩＥ２（０４４Ｌ／０４５Ｌ）（表２）は、１０回のウイルス継代すべてでＩＥ２関連産物を発現した（図７）。〜２０ｋＤａ及び〜４０ｋＤａのフラグメントをもたらすＩＥ２の代替タンパク質産物は、ＩＥ２について以前に記載されている［１７−１９］。これらの代替タンパク質産物の同一性を決定するために、ゲル内トリプシン消化、続いてＬＣ−ＭＳ／ＭＳを実施した。質量分析データ分析により、約２０ｋＤａの生成物は主にＩＥ２のＣ末端部分（４８％の被覆率）であるのに対し、約４０ｋＤａの生成物は主にＮ末端（３４％の被覆率）であることが明らかになった（表４）。全長ＩＥ２は、コントロールとして分析に含まれた（材料と方法で説明されているように実行されたタンパク質確率計算）。
表４ ＨＣＭＶ ＡＤ１６９からのＩＥ２に対応するペプチドの質量分析による同定
Figure 2021523712
図７Ｂで観察されたように、約２０ｋＤａと全長約６０ｋＤａの両方の産物が同時に消失したが、約４０ｋＤａの産物は１０回の継代にわたって「安定」したままであった。これらの結果は、おそらくＣＥＦセル又はＭＶＡのいずれかによっても許容されない可能性のある約２０ｋＤａの産物内の要素があることを示唆している。ＤＮＡ配列の領域内の変異を特定しようとしてＰＣＲ産物のＤＮＡ配列を決定すると、ＩＥ２遺伝子配列は、継代中に確率的に変異し、それによってＩＥ２内の終止コドンが早まることが観察された。ＩＥ２特異的抗体によって認識される切り捨てられたが安定したＩＥ２産物を生成する［１７］。
実施例６： Ｃ末端ヒスチジンのＩＥ２変異の生成
ＩＥ１にはヌクレオチドレベルの特性があり、一部の場所で不安定になる；ＩＥ１をＭＶＡの別のサイトに挿入すると、不安定さが軽減された。ＩＥ２の不安定性は、この方法だけでは解決できまなかった。推定上のＩＥ２機能ドメインが報告されている［２０］。ＩＥ２のＣ末端は、ＤＮＡ結合、トランス活性化、及び自己抑制に重要な「コア」ドメインの一部として説明されている（図８Ａ）。コアドメインに隣接する領域には、ＩＥ２タンパク質とＤＮＡの相互作用に影響を与えることなく変異させることができるＺｎフィンガー結合ドメインが含まれている。コアドメインに隣接する領域は、「特異的かつ必須のモジュレーター」ドメイン（ＳＥＭ）と名付けられた（図８Ａ）。ＳＥＭ領域内の変異は、以前ＩＥ２に関連付けられていたすべての機能を損なわなかったが、この領域内の異なるシーケンス要件が異なるＩＥ２機能に影響を与えることが観察されている。ＩＥ２のＣ末端内の２つのＨｉｓ残基は、推定されるＺｎフィンガー結合ドメイン（図８Ａ）、Ｈｉｓ４４６及びＨｉｓ４５２内で同定された［２１、２２］。これらのＩＥ２残基を変異させても、ＤＮＡ結合能力が失われることはなく、ＨＣＭＶ内又はアデノウイルスなどの異種システムでのＩＥ２発現が妨げられることもない［２３］。最後の３７アミノ酸残基を変異させた結果、ＩＥ２の自己抑制及びトランス活性化機能に必要であると判断された［２４−２７］。２つのヒスチジン（Ｈ）残基は、部位特異的変異誘発を使用してアラニン（Ａ）に変異したが、ＳＥＭドメイン又はコアドメインのいずれからも他のＣ末端残基は変化しなかった。この決定は、Ｃ末端の最後の約３７アミノ酸残基がＩＥ２活性にとって重要である場合、これらの残基が免疫原性エピトープをコードしている可能性があるという考えによるものであった。ＳＥＭ内の変異残基は、ＩＥ２活性に影響を与えることなく、十分に許容される［２０］；したがって、この領域内の変更が、ＣＥＦでのウイルス継代時にＩＥ２遺伝子及びＭＶＡでのそのタンパク質産物の遺伝的及びタンパク質安定性に役立つかどうかをさらに調査した。
場所を見つけて、ＭＶＡでの発現に対して「安定」させるＩＥ２のシーケンスを特定するという課題があった。ＩＥｆｕｓｉｏｎを含有するＴｒｉｐｌｅｘの元の構築と同様に、ＩＥ２を発現するＭＶＡを生成する際、Ｎ末端シグナルペプチド、核局在化配列、及び活性化ドメイン（エクソン１、２、及び３；アミノ酸１〜８５）は省略された［１８、２６］；したがって、これらの欠失により、アミノ酸残基番号がそれぞれＨｉｓ４４６及びＨｉｓ４５２からＨｉｓ３６３及びＨｉｓ３６９に変更された。以下のＩＥ２の単一及び二重変異体は、ＭＶＡの０４４／０４５Ｌ部位に挿入するために生成された： Ｈ３６３Ａ、Ｈ３６９Ａ、及びＨ３６３Ａ／Ｈ３６９Ａ（表５）。以下の表５では、Ｘ□＝不安定；√□＝安定。ローマ数字は、ＩＥ２の反復と突然変異を識別する。
表５ ＭＶＡ内のＩＥ２変異体の要約
Figure 2021523712
トランスフェクションとウイルスの再構成後、すべてのコンストラクトをＣＥＦで継代した。連続継代時に、ＩＥ２発現はウエスタンブロット分析に基づいて安定していることが観察された（図８Ｃ）。さらに、ＰＣＲ分析により、予想される遺伝子産物の増幅が明らかになり、１０継代で「安定した」コンストラクトが得られた（図８Ｂ、１３〜１５）。Ｈ３６３Ａ変異体（図１３）ではＩＥ２ ＮＣＯ及びＩＥ２ ４ｎｔの反復しか生成できなかったが、ＩＥ２ ＮＣＯ、４ｎｔ、及びＶａｃＯバージョンのＨ３６９Ａ（図１４）及びＨ３６３Ａ／Ｈ３６９Ａ（図１５）が構築された。ＩＥ２変異体の８つのバージョンが継代され、ＰＣＲ及びウエスタンブロット分析によって分析された。これらの結果は、推定上のＺｎ結合ドメインを含むＣ末端内のＨｉｓ残基を変異させると、ウイルス継代時にＩＥ２の発現と遺伝子配列を安定化させるのに役立つことを示唆している。
Ｅ２が不安定性の主な原因であると特定し、ＩＥｆｕｓｉｏｎを再評価した。対応するＨｉｓはＩＥｆｕｓｉｏｎのＣ末端のＡｌａ残基に変異した。以前のデータ（図４）に基づいて、ＩＧＲ３サイトへの挿入用に設計されたＩＥｆｕｓｉｏｎの４ｎｔバージョンの残基が変異した、ＩＥｆｕｓｉｏｎ ４ｎｔのＨ３６３Ａ及び／又はＨ３６９Ａ変異体のいずれか。Ｔｒｉｐｌｅｘとは対照的に、タンパク質レベルでＩＥｆｕｓｉｏｎ ４ｎｔの３つの変異バージョンすべてでＰ１０への長期安定性が観察された；しかし、二重変異体ではマイナーな非特異的ＰＣＲ産物が観察された（図１６Ｃ、左）。これらのコンストラクトは、ｐｐ６５と組み合わせてさらに分析するための候補になった。
実施例７： ３つすべてのＨＣＭＶ抗原を１つのＭＶＡに組み合わせる
ＩＥ１とｐｐ６５の両方を安定して発現する２つのコンストラクトが同定された： （Ａ）ＭＶＡ ＢＡＣ：：ＩＥ１ ４ｎｔ（ＩＧＲ３）：：ｐｐ６５（Ｄｅｌ３）及び（Ｂ）ＭＶＡ ＢＡＣ：：ＩＥ１ ＶａｃＯ（ＩＧＲ３）：：ｐｐ６５（Ｄｅｌ３）。ＩＥ２の安定性に対するＨ３６３Ａ及び／又はＨ３６９Ａの変異の影響を評価したら、前述のいずれかのコンストラクトのＭＶＡサイト０４４Ｌ／０４５Ｌにさまざまな変異ＩＥ２バージョンを挿入した。ＩＥ２の安定性を評価した以前の研究に基づいて、ＩＥ１はヌクレオチドレベルでいくつかの場所で不安定になる特性を持っているが、ＭＶＡの別のサイトにＩＥ１を挿入することで不安定性が軽減されることが明らかになった。対照的に、ＩＥ２は、ＭＶＡでの発現を「安定」させる場所と配列を見つけるのが困難であった。Ｃ末端Ｈｉｓの変異により、０４４Ｌ／０４５Ｌ部位内の遺伝子とタンパク質の安定性が改善された。ＩＥ２が不安定性の主な原因であると特定し、ＩＥｆｕｓｉｏｎを再評価した。ＩＥ２部分のＣ末端にあるＨｉｓ残基の変異誘発を包含する、ＩＥｆｕｓｉｏｎの変異体が生成された。しかし、Ｄｅｌ２に挿入された遺伝子は不安定であるため、その部位に遺伝子を挿入することはできなかった。ＩＥｆｕｓｉｏｎ、ＩＥｆｕｓｉｏｎ ４ｎｔ、及びＩＥｆｕｓｉｏｎ ＶａｃＯのＨ３６３Ａ及び／又はＨ３６９Ａ変異体のいずれかが生成された。ＩＥｆｕｓｉｏｎのこれらのバリアントは、ＩＧＲ３又は０４４Ｌ／０４５Ｌのいずれかに挿入され、Ｄｅｌ３にはｐｐ６５も含まれている。Ｔｒｉｐｌｅｘバリアントが完成したら、トランスジェニックＨＬＡ発現マウスのワクチン接種は、ＩＥｆｕｓｉｏｎ変異体によって生成された免疫原性と、分離されたＩＥ１及びＩＥ２遺伝子を持つ再誘導トリプレックスを比較するために使用できる。これらはすべて、図８に示すようにＨｉｓ変異を伴う。
さらに、Ｃ末端のＨｉｓの突然変異はＩＥ２の０４４Ｌ／０４５Ｌサイト及びＩＥｆｕｓｉｏｎのＩＧＲ３サイト内の遺伝子及びタンパク質の安定性を延長した。３つのコンストラクト（Ａ）のコンテキストでの３つのコンストラクト（ＩＥ２ ＮＣＯ Ｈ３６３Ａ（ｉ）；ＩＥ２ ４ｎｔ Ｈ３６９Ａ（ｖ）；ＩＥ２ ４ｎｔ Ｈ３６３Ａ／Ｈ３６９Ａ（ｖｉ））は、Ｐ１０まで安定しているように見えた。ここで、３つの抗原すべて（ＩＥ１、ＩＥ２、ｐｐ６５）が単一のＭＶＡから発現されている（図１７−１９）。（Ｂ）のコンテキストでの５つのコンストラクトは、単一のＭＶＡから３つの抗原すべてを安定して発現するように見えた（図２０−２４）。しかし、コンストラクトＢ（ｉｉ）（図２１）は、Ｐ１０によるｐｐ６５発現の減少を示しているように見えた。コンストラクトＢ（ｖ）でのＩＥ１発現の減少は、Ｐ１０でも観察された（図２３）。全体として、６つのコンストラクト（Ａ（ｉ）、Ａ（ｖ）、Ａ（ｖｉ）、Ｂ（ｉ）、Ｂ（ｉｉｉ）、及びＢ（ｖｉｉ））は、ＰＣＲ及びウエスタンブロット分析によって評価されるように、６つの構築物は１０回のウイルス連続継代にわたって３つすべての抗原の安定した発現を示したように見えた。これらの結果は、ＩＥ２の推定Ｚｎフィンガー結合ドメイン内の単一及び二重変異が３つすべての抗原の発現を安定させるのに役立ったことを示している。
ＩＥｆｕｓｉｏｎの変異体は、１０回の連続ウイルス継代にわたって安定した発現が特徴であった（図２５及び２６）。ＩＥｆｕｓｉｏｎ ４ｎｔ Ｈ３６３Ａ（ＩＧＲ３）：：ｐｐ６５（Ｄｅｌ３）は、ＩＥｆｕｓｉｏｎ ＩＧＲ３（図９）と比較してＰ７を超えて安定性の向上（図２５）を示した。ＩＥｆｕｓｉｏｎ ＰＣＲ産物のわずかな減少がＰ１０で観察され（図２５、左）、ｐｐ６５タンパク質のわずかな減少がＰ１０によるウエスタンブロット（図２５、右）で観察された。対照的に、ＩＥｆｕｓｉｏｎ ４ｎｔ Ｈ３６９Ａ（ＩＧＲ３）：：ｐｐ６５（Ｄｅｌ３）は、Ｐ７＜ｎ＞Ｐ１０によるＩＥｆｕｓｉｏｎ及びｐｐ６５タンパク質（図２６、右）の減少を示した。ＩＥｆｕｓｉｏｎ ＰＣＲ産物では有意な減少は観察されなかった；しかし、Ｐ１０までにｐｐ６５ＰＣＲ産物の著しい減少が見られた。これらの結果は、ＩＥｆｕｓｉｏｎ ４ｎｔ Ｈ３６３Ａ（ＩＧＲ３）：：ｐｐ６５（Ｄｅｌ３）がこれらのＣＭＶ抗原を安定して発現し、Ｈ３６３Ａ変異が無傷のタンパク質発現とＰＣＲ産物の完全性の維持に役立つことを示している。
実施例８： 第２世代トリプレックスの免疫原性
新しいトリプレックスバリアントが完全に構築されると、免疫原性研究は、ＩＥｆｕｓｉｏｎバリアント変異体及び再誘導された第２世代トリプレックスによって生成された免疫原性を、第１世代トリプレックスと比較して分離されたＩＥ１及びＩＥ２バリアントと比較するために行われた。ＨＬＡ−Ｂ ＨＬＡ−B＊０７０２（Ｂ７）又はＨＬＡ−Ａ＊０２０１（ＨＨＤ−ＩＩ）クラスＩ分子を発現するトランスジェニックＣ５６ＢＬ／６マウスを、トリプレックスに加えて６つの第２世代トリプレックスコンストラクト（Ａ（ｉ）、Ａ（ｖ）、Ｂ（ｉ）、Ｂ（ｉｉｉ）、Ｂ（ｖｉｉ）、ＩＥｆｕｓｉｏｎ ４ｎｔ Ｈ３６３Ａ（ＩＧＲ３）：：ｐｐ６５（Ｄｅｌ３））で免疫した。マウスに、２．５×１０７ＰＦＵ（Ｂ７マウスの場合）又は５×１０７ＰＦＵ（ＨＨＤ−ＩＩの場合）のいずれかを用いた腹腔内（ｉ．ｐ．）経路により、さまざまなコンストラクトを３週間間隔で２回ワクチン接種した後、脾細胞を単離した。第２世代トリプレックスによって誘発されたヒトＭＨＣ制限Ｔ細胞応答を、ＥＬＩＳｐｏｔによって評価された元のトリプレックス及びワクチン未接種のナイーブグループと比較した（表６）。表６では、ＨＬＡ−Ｂ＊０７０２（Ｂ７、上部）又はＨＬＡ−Ａ＊０２０１（ＨＨＤ−ＩＩ、下部）クラスＩ分子を発現するトランスジェニックＣ５７ＢＬ／６マウスを、ＩＥｆｕｓｉｏｎ／ｐｐ６５（ＩＥＦｕｓ）又はＩＥ１／ＩＥ２／ｐｐ６５のいずれかを発現するさまざまなコンストラクトで免疫した。抗原特異的Ｔ細胞応答は、ｐｐ６５、ＩＥ１、及びＩＥ２特異的ライブラリー、ｐｐ６５及びＩＥ１のＨＬＡ−Ｂ＊０７０２又はＨＬＡＡ＊０２０１制限免疫優勢エピトープを使用したＩＦＮ−γ酵素結合免疫吸収スポット（ＥＬＩＳｐｏｔ）アッセイによって決定された。ＤＭＳＯをネガティブコントロールとして使用した。平均値と平均値の標準誤差（ＳＥＭ）値は、ＨＬＡ−Ｂ７（上部）又はＨＨＤ−ＩＩ（下部）マウスの（Ｎ）数から計算された。ＳＦＣ： サイトカイン特異的スポット形成細胞。
表６ 第２世代トリプレックスによって誘発されたヒトＭＨＣ制限Ｔ細胞応答
Figure 2021523712
図２７Ａは、第２世代のトリプレックスコンストラクトが、トリプレックスに匹敵するＴ細胞応答を誘発したことを示している。ただし、コンストラクトＢ（ｉ）は、Ｂ７マウスの他の第２世代トリプレックスコンストラクトと比較してパフォーマンスが低いように見えた（図２７Ａ、左）。コンストラクトＡ（ｉ）は、誘発されたＴ細胞応答に関してＢ７マウスとＨＨＤ−ＩＩマウスの両方でＴｒｉｐｌｅｘに最も類似していた（図２７Ａ）。
免疫化されたマウスから単離された脾細胞からのＴ細胞刺激もまた、ＦＡＣＳ分析によって分析されるように、抗原特異的Ｔ細胞応答を評価するために実施された（表７）。表７では、ＨＬＡ−Ｂ＊０７０２（Ｂ７、上部）又はＨＬＡ−Ａ＊０２０１（ＨＨＤ−ＩＩ、下部）クラスＩ分子を発現するトランスジェニックＣ５７ＢＬ／６マウスを、ＩＥｆｕｓｉｏｎ／ｐｐ６５（ＩＥＦｕｓ）又はＩＥ１／ＩＥ２／ｐｐ６５のいずれかで免疫した。抗原特異的Ｔ細胞応答は、ｐｐ６５、ＩＥ１、及びＩＥ２特異的ライブラリー、又はｐｐ６５及びＩＥ１のＨＬＡ−B＊０７０２−又はＨＬＡ−Ａ＊０２０１制限免疫優勢エピトープによる刺激後の細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）によって評価された。ＤＭＳＯをネガティブコントロールとして使用した。異なる刺激によるＢ７又はＨＨＤ−ＩＩ免疫マウスからの脾細胞の刺激後のＩＦＮ−γ分泌ＣＤ８＋−Ｔ細胞のパーセンテージが示されている。平均及び平均の標準誤差（ＳＥＭ）値は、ＨＬＡ−Ｂ７（上部）又はＨＨＤ−ＩＩ（下部）マウスの（Ｎ）数から計算された。
表７ 第２世代ＴｒｉｐｌｅｘによるＨＬＡ−B＊０７０２−又はＨＬＡ−Ａ＊０２０１制限ＣＤ８＋ Ｔ細胞刺激
Figure 2021523712
図２７Ｂは、ＥＬＩＳｐｏｔ分析による観察を繰り返している（図２７Ａ）。ただし、Ｂ７マウスでは、Ｂ（ｖｉｉ）はＴｒｉｐｌｅｘを包含する他のコンストラクトよりもＴ細胞刺激が高いように見えた（図２７Ｂ、左）。全体として、Ｂ７（図２７Ｂ、左）とＨＨＤ−ＩＩ（図２７Ｂ、右）のすべてのコンストラクトは、元のＴｒｉｐｌｅｘと同様に機能した。
実施例９： ＺｎフィンガーＨｉｓ変異を介したＩＥ２安定性のメカニズム
ＭＶＡで発現されるＩＥ２の安定性の増加は、ＩＥ２タンパク質のＣ末端内に存在する１つ又は２つのＨｉｓ残基の突然変異の際に観察された。ＩＥ２変異体がＩＥ２全体の安定性に及ぼす影響を調べるために、ＭＶＡは、ＩＥ２の２つのコピーを収容するように構築された： Ｇ１ＬのＩＥ２ ＮＣＯ（野生型）と、ＩＥ２変異体を収容する０４４／０４５Ｌサイトのもう一方。ＩＥ２の２つのコピーを含むＭＶＡコンストラクトは、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞のＰ５に継代された（図２８）。ＩＥ２の両方のコピーのＰＣＲ分析は、非特異的なＰＣＲ産物を示さず、正しいサイズの産物のみを示している（図２８Ａ）。一方、ウエスタンブロット分析では、２つのＩＥ２コピーを含むコンストラクトでＩＥ２の一貫した発現が示されるが、ＭＶＡ：ＩＥ２ ＮＣＯ（Ｇ１Ｌ）では、完全長のＩＥ２発現が減少し、約４０ｋＤａのバンドが出現し（図２８Ｂ）、以前に観察された切り捨てられた(truncated)産物を示している（図７）。２つのＩＥ２コピーを持つＭＶＡからのＩＥ２の発現を示すウエスタンブロットにはいくつかの分解産物があったが、ＭＶＡ：ＩＥ２ ＮＣＯ（Ｇ１Ｌ）で観察されたＩＥ２の継代及び分解から蓄積すると予想される分解産物の同時増加はなかった。これらの結果は、変異型ＩＥ２遺伝子インサートの存在の結果として以前に観察されたＩＥ２不安定性の「救済」を示唆している可能性がある。
参考文献
以下に列挙された参考文献、及び本明細書で引用されたすべての参考文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
Figure 2021523712
Figure 2021523712
Figure 2021523712
Figure 2021523712

SEQUENCE LISTING

<110>
CITY OF HOPE

<120>
GENETICALLY MODIFIED RECOMBINANT VACCINIA ANKARA (RMVA) VACCINES

OF IMPROVED STABILITY AND METHODS OF PREPARATION THEREOF

<130>
054435-8183.WO00

<140>
PCT/US2019/031866
<141>
2019-05-10

<150>
62/670,656
<151>
2018-05-11

<160>
29

<170>
PatentIn version 3.5

<210>
1
<211>
2709
<212>
DNA
<213>
Artificial Sequence

<220>
<223>
Description of Artificial Sequence: Synthetic

polynucleotide IEfusion-VacO DNA sequence

<400>
1
atggtgaagc
aaatcaaggt cagagtggac atggtaagac acagaattaa
ggaacacatg 60

ttgaagaagt
atactcaaac agaggagaag ttcaccggtg ccttcaatat
gatgggtgga 120

tgtctacaga
acgctttgga tatcttagat aaggtacatg aaccattcga
agaaatgaag 180

tgcattggat
tgacaatgca atcaatgtat gagaactaca tagtgccaga
ggataagcgt 240

gaaatgtgga
tggcatgcat caaggagtta catgatgtat ccaaaggagc
agccaacaag 300

ctaggtggtg
ctttgcaagc gaaggcaaga gcgaagaagg atgaattgag
acgaaagatg 360

atgtacatgt
gctatcgaaa catcgaattc ttcactaaga actcagcgtt
tcctaagact 420

accaatggat
gcagtcaagc tatggctgcg cttcagaact tgcctcaatg tagtcctgat
480

gaaatcatgg
catatgcaca gaagatcttc aagatcttag atgaggaaag
agacaaggta 540

ttgactcata
tcgatcacat attcatggat atactaacaa catgtgtaga
aacgatgtgt 600

aacgagtaca
aggtaacttc ggacgcttgt atgatgacta tgtacggagg
aatatctcta 660

cttagtgagt
tctgtcgagt tctatgctgt tacgtattag aagaaactag
tgtaatgtta 720

gcgaagagac
cattgatcac taagcctgaa gtgatctcgg ttatgaagag
acgaatagag 780

gagatctgta
tgaaggtgtt cgcacaatac atcttaggag ctgatcctct
aagagtgtgt 840

agtccatcgg
tagacgattt gagagctata gcggaggaat ctgacgagga
agaggcaata 900

gttgcataca
cacttgctac agctggagta tccagttctg attctcttgt
aagtcctccg 960

gagtcacctg
tgccagcaac cataccgttg agtagtgtga ttgtggctga gaactcggat
1020

caggaagagt
ctgagcaatc cgatgaagaa gaggaggaag gagcacaaga ggagagagaa 1080

gatactgtct
ctgtgaagag tgaacctgta tctgaaatcg aggaagtagc acctgaggaa
1140

gaggaggatg
gagccgaaga accaacagct tcgggtggta agtcaactca tccgatggta
1200

accagatcta
aggcagacca gggagacatc ctagcacaag cagtgaacca tgctggaatt
1260

gactcatctt
cgaccggacc aactctaacg actcattcat gttcggttag ttctgctcct
1320

cttaacaagc
ctacacctac ctcggtagct gttaccaaca cacctttacc aggagcatca
1380

gcaacacctg
agttgtctcc aagaaagaag cctcgtaaga ccacgagacc gttcaaggtg
1440

atcatcaagc
caccagtacc acctgctccg atcatgttgc cattgatcaa gcaggaggac
1500

attaagccag
aacctgactt cacgatacag taccgtaaca agatcataga tacagcagga
1560

tgcatagtga
tctcagatag tgaagaggag caaggtgagg aagtggagac tagaggagcc
1620

acagccagtt
cgccttccac aggatccgga actcctagag taactagtcc gacacatcca
1680

ctttcccaga
tgaatcatcc acctctaccg gatcctctag gacgaccaga tgaagattct
1740

tcttcatcta
gttcaagttc ttgctcatcc gcgagtgata gtgagtcaga aagtgaagag
1800

atgaagtgct
cttctggtgg tggagctagt gtcacttcat ctcatcatgg acgaggagga
1860

tttggaggtg
ctgcgagtag ttccttacta agttgtggac atcagtcatc tggtggtgca
1920

tctactggac
ctagaaagaa gaagtcaaag agaatctccg aattggataa tgagaaagtg
1980

agaaacatca
tgaaggacaa gaacacgccg ttctgcactc cgaatgttca gacgagaaga
2040

ggacgagtga
agatagatga agtatcacga atgttcagaa acacaaatcg ttctctagag
2100

tacaagaatc
ttccgttcac cataccttcg atgcaccaag tattagatga ggctatcaag
2160

gcatgtaaga
ccatgcaagt taacaacaaa ggaatacaga tcatctacac tagaaaccat
2220

gaggttaaga
gtgaggtgga tgccgtacgt tgtagattgg gaacgatgtg taaccttgcg
2280

ctatctactc
ctttcctaat ggagcatact atgcctgtga ctcatcctcc tgaagtggct
2340

caaagaacag
ctgatgcttg taacgaaggt gtgaaagctg cttggtccct aaaggagtta
2400

catacacacc
aactttgtcc acgatccagt gactacagaa acatgatcat tcatgcagct
2460

acgcctgtag
atctacttgg agctcttaac ctatgtcttc ctttgatgca gaagttccct
2520

aagcaagtga
tggtgagaat cttctcgacg aatcaaggag gattcatgtt accgatatac
2580

gagacagctg
caaaggctta cgctgtcggt cagttcgagc aaccgactga aacgcctcct
2640

gaggacttag
atacattgtc tttggcgata gaagcagcga ttcaggatct tagaaacaag
2700

agtcagtaa
2709


<210>
2
<211>
2709
<212>
DNA
<213>
Artificial Sequence

<220>
<223>
Description of Artificial Sequence: Synthetic

polynucleotide IEfusion DNA sequence

<400>
2
atggtcaaac
agattaaggt tcgagtggac atggtgcggc atagaatcaa
ggagcacatg 60

ctgaaaaaat
atacccagac ggaagagaaa ttcactggcg cctttaatat
gatgggagga 120

tgtttgcaga
atgccttaga tatcttagat aaggttcatg agcctttcga
ggagatgaag 180

tgtattgggc
taactatgca gagcatgtat gagaactaca ttgtacctga
ggataagcgg 240

gagatgtgga
tggcttgtat taaggagctg catgatgtga gcaagggcgc
cgctaacaag 300

ttggggggtg
cactgcaggc taaggcccgt gctaaaaagg atgaacttag
gagaaagatg 360

atgtatatgt
gctacaggaa tatagagttc tttaccaaga actcagcctt ccctaagacc
420

accaatggct
gcagtcaggc catggcggca ctgcagaact tgcctcagtg
ctcccctgat 480

gagattatgg
cttatgccca gaaaatattt aagattttgg atgaggagag
agacaaggtg 540

ctcacgcaca
ttgatcacat atttatggat atcctcacta catgtgtgga
aacaatgtgt 600

aatgagtaca
aggtcactag tgacgcttgt atgatgacca tgtacggggg
catctctctc 660

ttaagtgagt
tctgtcgggt gctgtgctgc tatgtcttag aggagactag
tgtgatgctg 720

gccaagcggc
ctctgataac caagcctgag gttatcagtg taatgaagcg
ccgcattgag 780

gagatctgca
tgaaggtctt tgcccagtac attctggggg ccgatcctct
gagagtctgc 840

tctcctagtg
tggatgacct acgggccatc gccgaggagt cagatgagga
agaggctatt 900

gtagcctaca
ctttggccac cgctggtgtc agctcctctg attctctggt
gtcaccccca 960

gagtcccctg
tacccgcgac tatccctctg tcctcagtaa ttgtggctga gaacagtgat 1020

caggaagaaa
gtgagcagag tgatgaggaa gaggaggagg gtgctcagga ggagcgggag
1080

gacactgtgt
ctgtcaagtc tgagccagtg tctgagatag aggaagttgc cccagaggaa
1140

gaggaggatg
gtgctgagga acccaccgcc tctggaggca agagcaccca ccctatggtg
1200

actagaagca
aggctgacca gggtgacatc ctcgcccagg ctgtcaatca tgccggtatc
1260

gattccagta
gcaccggccc cacgctgaca acccactctt gcagcgttag cagcgcccct
1320

cttaacaagc
cgacccccac cagcgtcgcg gttactaaca ctcctctccc cggggcatcc
1380

gctactcccg
agctcagccc gcgtaagaaa ccgcgcaaaa ccacgcgtcc tttcaaggtg
1440

attattaaac
cgcccgtgcc tcccgcgcct atcatgctgc ccctcatcaa acaggaagac
1500

atcaagcccg
agcccgactt taccatccag taccgcaaca agattatcga taccgccggc
1560

tgtatcgtga
tctctgatag cgaggaagaa cagggtgaag aagtcgaaac ccgcggtgct
1620

accgcgtctt
ccccttccac cggcagcggc acgccgcgag tgacctctcc cacgcacccg
1680

ctctcccaga
tgaaccaccc tcctcttccc gatcccttgg gccggcccga tgaagatagt
1740

tcctcttcgt
cttcctcctc ctgcagttcg gcttcggact cggagagtga gtccgaggag
1800

atgaaatgca
gcagtggcgg aggagcatcc gtgacctcga gccaccatgg gcgcggcggt
1860

tttggtggcg
cggcctcctc ctctctgctg agctgcggcc atcagagcag cggcggggcg
1920

agcaccggac
cccgcaagaa gaagagcaaa cgcatctccg agttggacaa cgagaaggtg
1980

cgcaatatca
tgaaagataa gaacaccccc ttctgcacac ccaacgtgca gactcggcgg
2040

ggtcgcgtca
agattgacga ggtgagccgc atgttccgca acaccaatcg ctctcttgag
2100

tacaagaacc
tgcccttcac gattcccagt atgcaccagg tgttagatga ggccatcaaa
2160

gcctgcaaaa
ccatgcaggt gaacaacaag ggcatccaga ttatctacac ccgcaatcat
2220

gaggtgaaga
gtgaggtgga tgcggtgcgg tgtcgcctgg gcaccatgtg caacctggcc
2280

ctctccactc
ccttcctcat ggagcacacc atgcccgtga cacatccacc cgaagtggcg
2340

cagcgcacag
ccgatgcttg taacgaaggc gtcaaggccg cgtggagcct caaagaattg
2400

cacacccacc
aattatgccc ccgttcctcc gattaccgca acatgatcat ccacgctgcc
2460

acccccgtgg
acctgttggg cgctctcaac ctgtgcctgc ccctgatgca aaagtttccc
2520

aaacaggtca
tggtgcgcat cttctccacc aaccagggtg ggttcatgct gcctatctac
2580

gagacggccg
cgaaggccta cgccgtgggg cagtttgagc agcccaccga gacccctccc
2640

gaagacctgg
acaccctgag cctggccatc gaggcagcca tccaggacct gaggaacaag
2700

tctcagtaa
2709


<210>
3
<211>
2709
<212>
DNA
<213>
Artificial Sequence

<220>
<223>
Description of Artificial Sequence: Synthetic

polynucleotide IEfusion-4nt DNA sequence

<400>
3
atggtcaaac
agattaaggt tcgagtggac atggtgcggc atagaatcaa
ggagcacatg 60

ctgaagaagt
atacccagac ggaagagaaa ttcactggcg cctttaatat
gatgggagga 120

tgtttgcaga
atgccttaga tatcttagat aaggttcatg agcctttcga
ggagatgaag 180

tgtattgggc
taactatgca gagcatgtat gagaactaca ttgtacctga
ggataagcgg 240

gagatgtgga
tggcttgtat taaggagctg catgatgtga gcaagggcgc
cgctaacaag 300

ttaggaggtg
cactgcaggc taaggcccgt gctaagaagg atgaacttag
gagaaagatg 360

atgtatatgt
gctacaggaa tatagagttc tttaccaaga actcagcctt
ccctaagacc 420

accaatggct
gcagtcaggc catggcggca ctgcagaact tgcctcagtg
ctctcctgat 480

gagattatgg
cttatgccca gaagatattt aagatcttgg atgaggagag
agacaaggtg 540

ctcacgcaca
ttgatcacat atttatggat atcctcacta catgtgtgga
aacaatgtgt 600

aatgagtaca
aggtcactag tgacgcttgt atgatgacca tgtacggagg
catctctctc 660

ttaagtgagt
tctgtcgggt gctgtgctgc tatgtcttag aggagactag
tgtgatgctg 720

gccaagcggc
ctctgataac caagcctgag gttatcagtg taatgaagcg
ccgcattgag 780

gagatctgca
tgaaggtctt tgcccagtac attctaggtg ccgatcctct
gagagtctgc 840

tctcctagtg
tggatgacct acgggccatc gccgaggagt cagatgagga
agaggctatt 900

gtagcctaca
ctttggccac cgctggtgtc agctcctctg attctctggt gtcacctcca
960

gagtcacctg
tacccgcgac tatccctctg tcctcagtaa ttgtggctga gaacagtgat
1020

caggaagaaa
gtgagcagag tgatgaggaa gaggaggagg gtgctcagga ggagcgggag
1080

gacactgtgt
ctgtcaagtc tgagccagtg tctgagatag aggaagttgc tccagaggaa
1140

gaggaggatg
gtgctgagga acccaccgcc tctggaggca agagcaccca ccctatggtg
1200

actagaagca
aggctgacca gggtgacatc ctcgcccagg ctgtcaatca tgccggtatc
1260

gattccagta
gcaccggacc tacgctgaca acccactctt gcagcgttag cagcgctcct
1320

cttaacaagc
cgactccaac cagcgtcgcg gttactaaca ctcctctacc aggagcatcc
1380

gctactcccg
agctcagccc gcgtaagaaa ccgcgcaaga ccacgcgtcc tttcaaggtg
1440

attattaaac
cgcccgtgcc tcccgcgcct atcatgctgc cactcatcaa acaggaagac
1500

atcaagcccg
agcccgactt taccatccag taccgcaaca agattatcga taccgccggc 1560

tgtatcgtga
tctctgatag cgaggaagaa cagggtgaag aagtcgaaac ccgcggtgct
1620

accgcgtctt
caccttccac cggcagcggc acgccgcgag tgacctctcc cacgcacccg
1680

ctctcccaga
tgaaccaccc tcctcttccc gatcccttgg gccggcccga tgaagatagt
1740

tcctcttcgt
cttcctcctc ctgcagttcg gcttcggact cggagagtga gtccgaggag
1800

atgaaatgca
gcagtggcgg aggagcatcc gtgacctcga gccaccatgg gcgcggcgga
1860

tttggtggcg
cggcctcctc ctctctgctg agctgcggcc atcagagcag cggcggtgcg
1920

agcaccggac
ctcgcaagaa gaagagcaaa cgcatctccg agttggacaa cgagaaggtg
1980

cgcaatatca
tgaaagataa gaacactccc ttctgcacac ccaacgtgca gactcggcgt
2040

ggtcgcgtca
agattgacga ggtgagccgc atgttccgca acaccaatcg ctctcttgag
2100

tacaagaacc
tgcccttcac gattcccagt atgcaccagg tgttagatga ggccatcaaa
2160

gcctgcaaga
ccatgcaggt gaacaacaag ggcatccaga ttatctacac ccgcaatcat
2220

gaggtgaaga
gtgaggtgga tgcggtgcgg tgtcgcctgg gcaccatgtg caacctggcc
2280

ctctccactc
ccttcctcat ggagcacacc atgcccgtga cacatccacc cgaagtggcg
2340

cagcgcacag
ccgatgcttg taacgaaggc gtcaaggccg cgtggagcct caaagaattg
2400

cacacccacc
aattatgtcc tcgttcctcc gattaccgca acatgatcat ccacgctgcc
2460

acaccagtgg
acctgttggg cgctctcaac ctgtgcctgc cactgatgca gaagtttccc
2520

aaacaggtca
tggtgcgcat cttctccacc aaccagggtg ggttcatgct gcctatctac
2580

gagacggccg
cgaaggccta cgccgttggt cagtttgagc agcccaccga gacacctccc
2640

gaagacctgg
acaccctgag cctggccatc gaggcagcca tccaggacct gaggaacaag
2700

tctcagtaa
2709


<210>
4
<211>
902
<212>
PRT
<213>
Artificial Sequence

<220>
<223>
Description of Artificial Sequence: Synthetic

polypeptide IEfusion-VacO amino acid sequence

<400>
4
Met Val
Lys Gln Ile Lys Val Arg Val Asp Met Val Arg His Arg Ile
1
5 10
15


Lys Glu
His Met Leu Lys Lys Tyr Thr Gln Thr Glu Glu Lys Phe Thr

20
25
30


Gly Ala
Phe Asn Met Met Gly Gly Cys Leu Gln Asn Ala Leu Asp Ile

35 40
45



Leu Asp
Lys Val His Glu Pro Phe Glu Glu Met Lys Cys Ile Gly Leu

50
55
60



Thr Met
Gln Ser Met Tyr Glu Asn Tyr Ile Val Pro Glu Asp Lys Arg
65
70
75
80


Glu Met
Trp Met Ala Cys Ile Lys Glu Leu His Asp Val Ser Lys Gly

85
90
95


Ala Ala Asn
Lys Leu Gly Gly Ala Leu Gln Ala Lys Ala Arg Ala Lys

100
105
110


Lys Asp
Glu Leu Arg Arg Lys Met Met Tyr Met Cys Tyr Arg Asn Ile

115
120
125


Glu Phe
Phe Thr Lys Asn Ser Ala Phe Pro Lys Thr Thr Asn Gly Cys

130
135
140



Ser Gln Ala
Met Ala Ala Leu Gln Asn Leu Pro Gln Cys Ser Pro Asp
145
150
155
160


Glu Ile Met
Ala Tyr Ala Gln Lys Ile Phe Lys Ile Leu Asp Glu Glu

165
170
175


Arg Asp Lys
Val Leu Thr His Ile Asp His Ile Phe Met Asp Ile Leu

180
185
190


Thr Thr
Cys Val Glu Thr Met Cys Asn Glu Tyr Lys Val Thr Ser Asp

195
200
205


Ala Cys
Met Met Thr Met Tyr Gly Gly Ile Ser Leu Leu Ser Glu Phe

210
215
220



Cys Arg
Val Leu Cys Cys Tyr Val Leu Glu Glu Thr Ser Val Met Leu
225
230
235
240


Ala Lys
Arg Pro Leu Ile Thr Lys Pro Glu Val Ile Ser Val Met Lys

245
250
255


Arg Arg
Ile Glu Glu Ile Cys Met Lys Val Phe Ala Gln Tyr Ile Leu

260
265
270


Gly Ala Asp
Pro Leu Arg Val Cys Ser Pro Ser Val Asp Asp Leu Arg

275
280
285


Ala Ile Ala
Glu Glu Ser Asp Glu Glu Glu Ala Ile Val Ala Tyr Thr

290
295
300



Leu Ala Thr
Ala Gly Val Ser Ser Ser Asp Ser Leu Val Ser Pro Pro
305
310
315
320


Glu Ser Pro
Val Pro Ala Thr Ile Pro Leu Ser Ser Val Ile Val Ala

325
330
335


Glu Asn Ser
Asp Gln Glu Glu Ser Glu Gln Ser Asp Glu Glu Glu Glu

340
345
350


Glu Gly Ala
Gln Glu Glu Arg Glu Asp Thr Val Ser Val Lys Ser Glu

355
360
365


Pro Val Ser
Glu Ile Glu Glu Val Ala Pro Glu Glu Glu Glu Asp Gly

370
375
380


Ala Glu
Glu Pro Thr Ala Ser Gly Gly Lys Ser Thr His Pro Met Val
385
390
395
400


Thr Arg Ser
Lys Ala Asp Gln Gly Asp Ile Leu Ala Gln Ala Val Asn

405
410 415



His Ala
Gly Ile Asp Ser Ser Ser Thr Gly Pro Thr Leu Thr Thr His

420
425
430


Ser Cys Ser
Val Ser Ser Ala Pro Leu Asn Lys Pro Thr Pro Thr Ser

435
440 445



Val Ala Val
Thr Asn Thr Pro Leu Pro Gly Ala Ser Ala Thr Pro Glu

450
455
460



Leu Ser Pro
Arg Lys Lys Pro Arg Lys Thr Thr Arg Pro Phe Lys Val
465
470 475
480


Ile Ile Lys
Pro Pro Val Pro Pro Ala Pro Ile Met Leu Pro Leu Ile

485
490
495


Lys Gln Glu
Asp Ile Lys Pro Glu Pro Asp Phe Thr Ile Gln Tyr Arg

500 505
510


Asn Lys Ile
Ile Asp Thr Ala Gly Cys Ile Val Ile Ser Asp Ser Glu

515
520
525


Glu Glu Gln
Gly Glu Glu Val Glu Thr Arg Gly Ala Thr Ala Ser Ser

530
535
540



Pro Ser
Thr Gly Ser Gly Thr Pro Arg Val Thr Ser Pro Thr His Pro
545
550
555
560


Leu Ser Gln
Met Asn His Pro Pro Leu Pro Asp Pro Leu Gly Arg Pro

565
570
575


Asp Glu Asp
Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Cys Ser Ser Ala Ser

580
585
590


Asp Ser Glu
Ser Glu Ser Glu Glu Met Lys Cys Ser Ser Gly Gly Gly
595
600
605


Ala Ser
Val Thr Ser Ser His His Gly Arg Gly Gly Phe Gly Gly Ala

610
615
620



Ala Ser Ser
Ser Leu Leu Ser Cys Gly His Gln Ser Ser Gly Gly Ala
625
630
635
640


Ser Thr Gly
Pro Arg Lys Lys Lys Ser Lys Arg Ile Ser Glu Leu Asp

645
650
655


Asn Glu Lys
Val Arg Asn Ile Met Lys Asp Lys Asn Thr Pro Phe Cys

660
665
670


Thr Pro
Asn Val Gln Thr Arg Arg Gly Arg Val Lys Ile Asp Glu Val

675
680
685


Ser Arg
Met Phe Arg Asn Thr Asn Arg Ser Leu Glu Tyr Lys Asn Leu

690
695
700



Pro Phe
Thr Ile Pro Ser Met His Gln Val Leu Asp Glu Ala Ile Lys
705
710
715
720


Ala Cys
Lys Thr Met Gln Val Asn Asn Lys Gly Ile Gln Ile Ile Tyr

725
730
735


Thr Arg
Asn His Glu Val Lys Ser Glu Val Asp Ala Val Arg Cys Arg

740
745
750


Leu Gly
Thr Met Cys Asn Leu Ala Leu Ser Thr Pro Phe Leu Met Glu

755
760
765


His Thr
Met Pro Val Thr His Pro Pro Glu Val Ala Gln Arg Thr Ala

770
775
780



Asp Ala Cys
Asn Glu Gly Val Lys Ala Ala Trp Ser Leu Lys Glu Leu
785
790
795
800


His Thr
His Gln Leu Cys Pro Arg Ser Ser Asp Tyr Arg Asn Met Ile

805
810
815


Ile His Ala Ala
Thr Pro Val Asp Leu Leu Gly Ala Leu Asn Leu Cys

820
825
830


Leu Pro Leu
Met Gln Lys Phe Pro Lys Gln Val Met Val Arg Ile Phe

835
840
845


Ser Thr Asn
Gln Gly Gly Phe Met Leu Pro Ile Tyr Glu Thr Ala Ala

850
855
860



Lys Ala
Tyr Ala Val Gly Gln Phe Glu Gln Pro Thr Glu Thr Pro Pro
865
870
875
880


Glu Asp Leu
Asp Thr Leu Ser Leu Ala Ile Glu Ala Ala Ile Gln Asp

885
890
895


Leu Arg Asn
Lys Ser Gln

900


<210> 5
<211>
902
<212>
PRT
<213>
Artificial Sequence

<220>
<223>
Description of Artificial Sequence: Synthetic

polypeptide IEfusion amino acid sequence

<400>
5
Met Val
Lys Gln Ile Lys Val Arg Val Asp Met Val Arg His Arg Ile
1
5
10
15


Lys Glu
His Met Leu Lys Lys Tyr Thr Gln Thr Glu Glu Lys Phe Thr

20
25
30


Gly Ala
Phe Asn Met Met Gly Gly Cys Leu Gln Asn Ala Leu Asp Ile

35
40
45



Leu Asp
Lys Val His Glu Pro Phe Glu Glu Met Lys Cys Ile Gly Leu

50
55
60



Thr Met
Gln Ser Met Tyr Glu Asn Tyr Ile Val Pro Glu Asp Lys Arg
65
70
75
80


Glu Met
Trp Met Ala Cys Ile Lys Glu Leu His Asp Val Ser Lys Gly

85
90
95


Ala Ala Asn
Lys Leu Gly Gly Ala Leu Gln Ala Lys Ala Arg Ala Lys

100
105
110


Lys Asp
Glu Leu Arg Arg Lys Met Met Tyr Met Cys Tyr Arg Asn Ile

115
120
125


Glu Phe
Phe Thr Lys Asn Ser Ala Phe Pro Lys Thr Thr Asn Gly Cys

130
135
140


Ser Gln Ala
Met Ala Ala Leu Gln Asn Leu Pro Gln Cys Ser Pro Asp
145
150
155
160


Glu Ile Met
Ala Tyr Ala Gln Lys Ile Phe Lys Ile Leu Asp Glu Glu

165
170 175



Arg Asp Lys
Val Leu Thr His Ile Asp His Ile Phe Met Asp Ile Leu

180
185
190


Thr Thr
Cys Val Glu Thr Met Cys Asn Glu Tyr Lys Val Thr Ser Asp

195
200 205



Ala Cys
Met Met Thr Met Tyr Gly Gly Ile Ser Leu Leu Ser Glu Phe

210
215
220



Cys Arg
Val Leu Cys Cys Tyr Val Leu Glu Glu Thr Ser Val Met Leu
225
230 235
240


Ala Lys
Arg Pro Leu Ile Thr Lys Pro Glu Val Ile Ser Val Met Lys

245
250
255


Arg Arg
Ile Glu Glu Ile Cys Met Lys Val Phe Ala Gln Tyr Ile Leu

260
265
270


Gly Ala Asp
Pro Leu Arg Val Cys Ser Pro Ser Val Asp Asp Leu Arg

275
280
285


Ala Ile Ala
Glu Glu Ser Asp Glu Glu Glu Ala Ile Val Ala Tyr Thr

290 295
300



Leu Ala Thr
Ala Gly Val Ser Ser Ser Asp Ser Leu Val Ser Pro Pro
305
310
315
320


Glu Ser Pro
Val Pro Ala Thr Ile Pro Leu Ser Ser Val Ile Val Ala

325
330
335


Glu Asn Ser
Asp Gln Glu Glu Ser Glu Gln Ser Asp Glu Glu Glu Glu

340
345
350


Glu Gly Ala
Gln Glu Glu Arg Glu Asp Thr Val Ser Val Lys Ser Glu
355
360
365


Pro Val Ser
Glu Ile Glu Glu Val Ala Pro Glu Glu Glu Glu Asp Gly

370
375
380



Ala Glu
Glu Pro Thr Ala Ser Gly Gly Lys Ser Thr His Pro Met Val
385
390
395
400


Thr Arg Ser
Lys Ala Asp Gln Gly Asp Ile Leu Ala Gln Ala Val Asn

405
410
415


His Ala
Gly Ile Asp Ser Ser Ser Thr Gly Pro Thr Leu Thr Thr His

420
425
430


Ser Cys Ser
Val Ser Ser Ala Pro Leu Asn Lys Pro Thr Pro Thr Ser

435
440
445


Val Ala Val
Thr Asn Thr Pro Leu Pro Gly Ala Ser Ala Thr Pro Glu

450
455
460



Leu Ser Pro
Arg Lys Lys Pro Arg Lys Thr Thr Arg Pro Phe Lys Val
465
470
475
480


Ile Ile Lys
Pro Pro Val Pro Pro Ala Pro Ile Met Leu Pro Leu Ile

485
490
495


Lys Gln Glu
Asp Ile Lys Pro Glu Pro Asp Phe Thr Ile Gln Tyr Arg

500
505
510


Asn Lys Ile
Ile Asp Thr Ala Gly Cys Ile Val Ile Ser Asp Ser Glu

515
520
525


Glu Glu Gln
Gly Glu Glu Val Glu Thr Arg Gly Ala Thr Ala Ser Ser

530
535
540



Pro Ser
Thr Gly Ser Gly Thr Pro Arg Val Thr Ser Pro Thr His Pro
545
550
555
560


Leu Ser Gln
Met Asn His Pro Pro Leu Pro Asp Pro Leu Gly Arg Pro

565
570
575


Asp Glu Asp
Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Cys Ser Ser Ala Ser

580
585
590


Asp Ser Glu
Ser Glu Ser Glu Glu Met Lys Cys Ser Ser Gly Gly Gly

595
600
605


Ala Ser
Val Thr Ser Ser His His Gly Arg Gly Gly Phe Gly Gly Ala

610
615
620



Ala Ser Ser
Ser Leu Leu Ser Cys Gly His Gln Ser Ser Gly Gly Ala
625
630
635
640


Ser Thr Gly
Pro Arg Lys Lys Lys Ser Lys Arg Ile Ser Glu Leu Asp

645
650
655


Asn Glu Lys
Val Arg Asn Ile Met Lys Asp Lys Asn Thr Pro Phe Cys

660
665
670


Thr Pro
Asn Val Gln Thr Arg Arg Gly Arg Val Lys Ile Asp Glu Val

675
680
685


Ser Arg
Met Phe Arg Asn Thr Asn Arg Ser Leu Glu Tyr Lys Asn Leu

690
695
700



Pro Phe
Thr Ile Pro Ser Met His Gln Val Leu Asp Glu Ala Ile Lys
705
710
715
720


Ala Cys
Lys Thr Met Gln Val Asn Asn Lys Gly Ile Gln Ile Ile Tyr

725
730
735


Thr Arg
Asn His Glu Val Lys Ser Glu Val Asp Ala Val Arg Cys Arg

740
745
750


Leu Gly
Thr Met Cys Asn Leu Ala Leu Ser Thr Pro Phe Leu Met Glu

755
760
765


His Thr
Met Pro Val Thr His Pro Pro Glu Val Ala Gln Arg Thr Ala

770
775
780



Asp Ala Cys
Asn Glu Gly Val Lys Ala Ala Trp Ser Leu Lys Glu Leu
785
790
795
800


His Thr
His Gln Leu Cys Pro Arg Ser Ser Asp Tyr Arg Asn Met Ile

805
810
815


Ile His Ala
Ala Thr Pro Val Asp Leu Leu Gly Ala Leu Asn Leu Cys

820
825
830


Leu Pro Leu
Met Gln Lys Phe Pro Lys Gln Val Met Val Arg Ile Phe

835
840
845


Ser Thr Asn
Gln Gly Gly Phe Met Leu Pro Ile Tyr Glu Thr Ala Ala

850
855
860



Lys Ala
Tyr Ala Val Gly Gln Phe Glu Gln Pro Thr Glu Thr Pro Pro
865
870
875
880


Glu Asp Leu
Asp Thr Leu Ser Leu Ala Ile Glu Ala Ala Ile Gln Asp

885
890
895


Leu Arg Asn
Lys Ser Gln

900


<210> 6
<211>
902
<212>
PRT
<213>
Artificial Sequence

<220>
<223>
Description of Artificial Sequence: Synthetic

polypeptide IEfusion-4NT amino acid sequence

<400>
6
Met Val
Lys Gln Ile Lys Val Arg Val Asp Met Val Arg His Arg Ile
1
5
10
15


Lys Glu
His Met Leu Lys Lys Tyr Thr Gln Thr Glu Glu Lys Phe Thr

20 25
30


Gly Ala
Phe Asn Met Met Gly Gly Cys Leu Gln Asn Ala Leu Asp Ile

35
40
45



Leu Asp
Lys Val His Glu Pro Phe Glu Glu Met Lys Cys Ile Gly Leu

50 55
60



Thr Met
Gln Ser Met Tyr Glu Asn Tyr Ile Val Pro Glu Asp Lys Arg
65
70
75
80


Glu Met
Trp Met Ala Cys Ile Lys Glu Leu His Asp Val Ser Lys Gly

85
90
95


Ala Ala Asn
Lys Leu Gly Gly Ala Leu Gln Ala Lys Ala Arg Ala Lys

100
105
110


Lys Asp
Glu Leu Arg Arg Lys Met Met Tyr Met Cys Tyr Arg Asn Ile

115
120
125


Glu Phe
Phe Thr Lys Asn Ser Ala Phe Pro Lys Thr Thr Asn Gly Cys

130
135
140



Ser Gln Ala
Met Ala Ala Leu Gln Asn Leu Pro Gln Cys Ser Pro Asp
145
150
155
160


Glu Ile Met
Ala Tyr Ala Gln Lys Ile Phe Lys Ile Leu Asp Glu Glu

165
170
175


Arg Asp Lys
Val Leu Thr His Ile Asp His Ile Phe Met Asp Ile Leu

180
185
190


Thr Thr
Cys Val Glu Thr Met Cys Asn Glu Tyr Lys Val Thr Ser Asp

195
200
205


Ala Cys
Met Met Thr Met Tyr Gly Gly Ile Ser Leu Leu Ser Glu Phe

210
215
220



Cys Arg
Val Leu Cys Cys Tyr Val Leu Glu Glu Thr Ser Val Met Leu
225
230
235
240


Ala Lys
Arg Pro Leu Ile Thr Lys Pro Glu Val Ile Ser Val Met Lys

245
250
255


Arg Arg
Ile Glu Glu Ile Cys Met Lys Val Phe Ala Gln Tyr Ile Leu

260
265
270


Gly Ala Asp
Pro Leu Arg Val Cys Ser Pro Ser Val Asp Asp Leu Arg

275
280
285


Ala Ile Ala
Glu Glu Ser Asp Glu Glu Glu Ala Ile Val Ala Tyr Thr

290
295
300



Leu Ala Thr
Ala Gly Val Ser Ser Ser Asp Ser Leu Val Ser Pro Pro
305
310
315
320


Glu Ser Pro
Val Pro Ala Thr Ile Pro Leu Ser Ser Val Ile Val Ala

325
330
335


Glu Asn Ser
Asp Gln Glu Glu Ser Glu Gln Ser Asp Glu Glu Glu Glu

340
345
350


Glu Gly Ala
Gln Glu Glu Arg Glu Asp Thr Val Ser Val Lys Ser Glu

355
360
365


Pro Val Ser
Glu Ile Glu Glu Val Ala Pro Glu Glu Glu Glu Asp Gly

370
375
380



Ala Glu
Glu Pro Thr Ala Ser Gly Gly Lys Ser Thr His Pro Met Val
385
390
395
400


Thr Arg Ser
Lys Ala Asp Gln Gly Asp Ile Leu Ala Gln Ala Val Asn

405
410
415


His Ala
Gly Ile Asp Ser Ser Ser Thr Gly Pro Thr Leu Thr Thr His

420
425
430


Ser Cys Ser
Val Ser Ser Ala Pro Leu Asn Lys Pro Thr Pro Thr Ser

435
440
445


Val Ala Val
Thr Asn Thr Pro Leu Pro Gly Ala Ser Ala Thr Pro Glu

450
455
460



Leu Ser Pro
Arg Lys Lys Pro Arg Lys Thr Thr Arg Pro Phe Lys Val
465
470
475
480


Ile Ile Lys
Pro Pro Val Pro Pro Ala Pro Ile Met Leu Pro Leu Ile

485
490
495


Lys Gln Glu
Asp Ile Lys Pro Glu Pro Asp Phe Thr Ile Gln Tyr Arg

500
505
510


Asn Lys Ile
Ile Asp Thr Ala Gly Cys Ile Val Ile Ser Asp Ser Glu

515
520
525


Glu Glu Gln
Gly Glu Glu Val Glu Thr Arg Gly Ala Thr Ala Ser Ser

530
535
540



Pro Ser
Thr Gly Ser Gly Thr Pro Arg Val Thr Ser Pro Thr His Pro
545
550
555
560


Leu Ser Gln
Met Asn His Pro Pro Leu Pro Asp Pro Leu Gly Arg Pro

565
570
575


Asp Glu Asp
Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Cys Ser Ser Ala Ser

580
585
590


Asp Ser Glu
Ser Glu Ser Glu Glu Met Lys Cys Ser Ser Gly Gly Gly

595
600
605


Ala Ser
Val Thr Ser Ser His His Gly Arg Gly Gly Phe Gly Gly Ala

610
615
620



Ala Ser Ser
Ser Leu Leu Ser Cys Gly His Gln Ser Ser Gly Gly Ala
625
630
635
640


Ser Thr Gly
Pro Arg Lys Lys Lys Ser Lys Arg Ile Ser Glu Leu Asp

645
650
655


Asn Glu Lys
Val Arg Asn Ile Met Lys Asp Lys Asn Thr Pro Phe Cys

660
665
670


Thr Pro
Asn Val Gln Thr Arg Arg Gly Arg Val Lys Ile Asp Glu Val

675
680
685


Ser Arg
Met Phe Arg Asn Thr Asn Arg Ser Leu Glu Tyr Lys Asn Leu

690
695
700



Pro Phe
Thr Ile Pro Ser Met His Gln Val Leu Asp Glu Ala Ile Lys
705
710
715
720


Ala Cys
Lys Thr Met Gln Val Asn Asn Lys Gly Ile Gln Ile Ile Tyr

725
730
735


Thr Arg
Asn His Glu Val Lys Ser Glu Val Asp Ala Val Arg Cys Arg

740
745
750


Leu Gly
Thr Met Cys Asn Leu Ala Leu Ser Thr Pro Phe Leu Met Glu

755
760
765


His Thr
Met Pro Val Thr His Pro Pro Glu Val Ala Gln Arg Thr Ala

770
775
780



Asp Ala Cys
Asn Glu Gly Val Lys Ala Ala Trp Ser Leu Lys Glu Leu
785
790
795
800


His Thr
His Gln Leu Cys Pro Arg Ser Ser Asp Tyr Arg Asn Met Ile

805
810
815


Ile His Ala
Ala Thr Pro Val Asp Leu Leu Gly Ala Leu Asn Leu Cys

820
825
830


Leu Pro Leu
Met Gln Lys Phe Pro Lys Gln Val Met Val Arg Ile Phe

835
840
845


Ser Thr Asn
Gln Gly Gly Phe Met Leu Pro Ile Tyr Glu Thr Ala Ala

850
855
860



Lys Ala
Tyr Ala Val Gly Gln Phe Glu Gln Pro Thr Glu Thr Pro Pro
865
870
875
880


Glu Asp Leu
Asp Thr Leu Ser Leu Ala Ile Glu Ala Ala Ile Gln Asp

885
890
895


Leu Arg Asn
Lys Ser Gln

900


<210> 7
<211>
1491
<212>
DNA
<213>
Artificial Sequence

<220>
<223>
Description of Artificial Sequence: Synthetic

polynucleotide IE2-VacO DNA sequence

<400>
7
atgggagaca
tcctagcaca agcagtgaac catgctggaa ttgactcatc
ttcgaccgga 60

ccaactctaa
cgactcattc atgttcggtt agttctgctc ctcttaacaa
gcctacacct 120

acctcggtag
ctgttaccaa cacaccttta ccaggagcat cagcaacacc
tgagttgtct 180

ccaagaaaga
agcctcgtaa gaccacgaga ccgttcaagg tgatcatcaa gccaccagta
240

ccacctgctc
cgatcatgtt gccattgatc aagcaggagg acattaagcc
agaacctgac 300

ttcacgatac
agtaccgtaa caagatcata gatacagcag gatgcatagt
gatctcagat 360

agtgaagagg
agcaaggtga ggaagtggag actagaggag ccacagccag
ttcgccttcc 420

acaggatccg
gaactcctag agtaactagt ccgacacatc cactttccca
gatgaatcat 480

ccacctctac
cggatcctct aggacgacca gatgaagatt cttcttcatc
tagttcaagt 540

tcttgctcat
ccgcgagtga tagtgagtca gaaagtgaag agatgaagtg
ctcttctggt 600

ggtggagcta
gtgtcacttc atctcatcat ggacgaggag gatttggagg
tgctgcgagt 660

agttccttac
taagttgtgg acatcagtca tctggtggtg catctactgg
acctagaaag 720

aagaagtcaa
agagaatctc cgaattggat aatgagaaag tgagaaacat
catgaaggac 780

aagaacacgc
cgttctgcac tccgaatgtt cagacgagaa gaggacgagt gaagatagat 840

gaagtatcac
gaatgttcag aaacacaaat cgttctctag agtacaagaa
tcttccgttc 900

accatacctt
cgatgcacca agtattagat gaggctatca aggcatgtaa
gaccatgcaa 960

gttaacaaca
aaggaataca gatcatctac actagaaacc atgaggttaa gagtgaggtg
1020

gatgccgtac
gttgtagatt gggaacgatg tgtaaccttg cgctatctac tcctttccta
1080

atggagcata
ctatgcctgt gactcatcct cctgaagtgg ctcaaagaac agctgatgct
1140

tgtaacgaag
gtgtgaaagc tgcttggtcc ctaaaggagt tacatacaca ccaactttgt
1200

ccacgatcca
gtgactacag aaacatgatc attcatgcag ctacgcctgt agatctactt
1260

ggagctctta
acctatgtct tcctttgatg cagaagttcc ctaagcaagt gatggtgaga
1320

atcttctcga
cgaatcaagg aggattcatg ttaccgatat acgagacagc tgcaaaggct
1380

tacgctgtcg
gtcagttcga gcaaccgact gaaacgcctc ctgaggactt agatacattg
1440

tctttggcga
tagaagcagc gattcaggat cttagaaaca agagtcagta
a
1491


<210>
8
<211>
1491
<212>
DNA
<213>
Artificial Sequence

<220>
<223>
Description of Artificial Sequence: Synthetic

polynucleotide IE2 DNA sequence

<400>
8
atgggtgaca
tcctcgccca ggctgtcaat catgccggta tcgattccag
tagcaccggc 60

cccacgctga
caacccactc ttgcagcgtt agcagcgccc ctcttaacaa
gccgaccccc 120

accagcgtcg
cggttactaa cactcctctc cccggggcat ccgctactcc
cgagctcagc 180

ccgcgtaaga
aaccgcgcaa aaccacgcgt cctttcaagg tgattattaa
accgcccgtg 240

cctcccgcgc
ctatcatgct gcccctcatc aaacaggaag acatcaagcc
cgagcccgac 300

tttaccatcc
agtaccgcaa caagattatc gataccgccg gctgtatcgt
gatctctgat 360

agcgaggaag
aacagggtga agaagtcgaa acccgcggtg ctaccgcgtc
ttccccttcc 420

accggcagcg
gcacgccgcg agtgacctct cccacgcacc cgctctccca
gatgaaccac 480

cctcctcttc
ccgatccctt gggccggccc gatgaagata gttcctcttc
gtcttcctcc 540

tcctgcagtt
cggcttcgga ctcggagagt gagtccgagg agatgaaatg
cagcagtggc 600

ggaggagcat
ccgtgacctc gagccaccat gggcgcggcg gttttggtgg
cgcggcctcc 660

tcctctctgc
tgagctgcgg ccatcagagc agcggcgggg cgagcaccgg
accccgcaag 720

aagaagagca
aacgcatctc cgagttggac aacgagaagg tgcgcaatat
catgaaagat 780

aagaacaccc
ccttctgcac acccaacgtg cagactcggc ggggtcgcgt
caagattgac 840

gaggtgagcc
gcatgttccg caacaccaat cgctctcttg agtacaagaa
cctgcccttc 900

acgattccca
gtatgcacca ggtgttagat gaggccatca aagcctgcaa
aaccatgcag 960

gtgaacaaca
agggcatcca gattatctac acccgcaatc atgaggtgaa gagtgaggtg
1020

gatgcggtgc
ggtgtcgcct gggcaccatg tgcaacctgg ccctctccac tcccttcctc
1080

atggagcaca
ccatgcccgt gacacatcca cccgaagtgg cgcagcgcac agccgatgct
1140

tgtaacgaag
gcgtcaaggc cgcgtggagc ctcaaagaat tgcacaccca ccaattatgc
1200

ccccgttcct
ccgattaccg caacatgatc atccacgctg ccacccccgt ggacctgttg
1260

ggcgctctca
acctgtgcct gcccctgatg caaaagtttc ccaaacaggt catggtgcgc
1320

atcttctcca
ccaaccaggg tgggttcatg ctgcctatct acgagacggc cgcgaaggcc
1380

tacgccgtgg
ggcagtttga gcagcccacc gagacccctc ccgaagacct ggacaccctg
1440

agcctggcca
tcgaggcagc catccaggac ctgaggaaca agtctcagta
a
1491


<210>
9
<211>
1491
<212>
DNA
<213>
Artificial Sequence

<220>
<223>
Description of Artificial Sequence: Synthetic

polynucleotide IE2-4nt DNA sequence

<400>
9
atgggtgaca
tcctcgccca ggctgtcaat catgccggta tcgattccag
tagcaccgga 60

cctacgctga
caacccactc ttgcagcgtt agcagcgctc ctcttaacaa
gccgactcca 120

accagcgtcg
cggttactaa cactcctcta ccaggagcat ccgctactcc
cgagctcagc 180

ccgcgtaaga
aaccgcgcaa gaccacgcgt cctttcaagg tgattattaa
accgcccgtg 240

cctcccgcgc
ctatcatgct gccactcatc aaacaggaag acatcaagcc
cgagcccgac 300

tttaccatcc
agtaccgcaa caagattatc gataccgccg gctgtatcgt
gatctctgat 360

agcgaggaag
aacagggtga agaagtcgaa acccgcggtg ctaccgcgtc ttcaccttcc
420

accggcagcg
gcacgccgcg agtgacctct cccacgcacc cgctctccca
gatgaaccac 480

cctcctcttc
ccgatccctt gggccggccc gatgaagata gttcctcttc
gtcttcctcc 540

tcctgcagtt
cggcttcgga ctcggagagt gagtccgagg agatgaaatg
cagcagtggc 600

ggaggagcat
ccgtgacctc gagccaccat gggcgcggcg gatttggtgg
cgcggcctcc 660

tcctctctgc
tgagctgcgg ccatcagagc agcggcggtg cgagcaccgg
acctcgcaag 720

aagaagagca
aacgcatctc cgagttggac aacgagaagg tgcgcaatat
catgaaagat 780

aagaacactc
ccttctgcac acccaacgtg cagactcggc gtggtcgcgt
caagattgac 840

gaggtgagcc
gcatgttccg caacaccaat cgctctcttg agtacaagaa
cctgcccttc 900

acgattccca
gtatgcacca ggtgttagat gaggccatca aagcctgcaa
gaccatgcag 960

gtgaacaaca
agggcatcca gattatctac acccgcaatc atgaggtgaa gagtgaggtg
1020

gatgcggtgc
ggtgtcgcct gggcaccatg tgcaacctgg ccctctccac tcccttcctc
1080

atggagcaca
ccatgcccgt gacacatcca cccgaagtgg cgcagcgcac agccgatgct
1140

tgtaacgaag
gcgtcaaggc cgcgtggagc ctcaaagaat tgcacaccca ccaattatgt
1200

cctcgttcct
ccgattaccg caacatgatc atccacgctg ccacaccagt ggacctgttg
1260

ggcgctctca
acctgtgcct gccactgatg cagaagtttc ccaaacaggt catggtgcgc
1320

atcttctcca
ccaaccaggg tgggttcatg ctgcctatct acgagacggc cgcgaaggcc
1380

tacgccgttg
gtcagtttga gcagcccacc gagacacctc ccgaagacct ggacaccctg
1440

agcctggcca
tcgaggcagc catccaggac ctgaggaaca agtctcagta
a
1491


<210>
10
<211>
1491
<212>
DNA
<213>
Artificial Sequence

<220>
<223>
Description of Artificial Sequence: Synthetic

polynucleotide IE2 4nt H363A
DNA sequence

<400>
10
atgggtgaca
tcctcgccca ggctgtcaat catgccggta tcgattccag
tagcaccgga 60

cctacgctga
caacccactc ttgcagcgtt agcagcgctc ctcttaacaa
gccgactcca 120

accagcgtcg
cggttactaa cactcctcta ccaggagcat ccgctactcc
cgagctcagc 180

ccgcgtaaga
aaccgcgcaa gaccacgcgt cctttcaagg tgattattaa
accgcccgtg 240

cctcccgcgc
ctatcatgct gccactcatc aaacaggaag acatcaagcc
cgagcccgac 300

tttaccatcc
agtaccgcaa caagattatc gataccgccg gctgtatcgt
gatctctgat 360

agcgaggaag
aacagggtga agaagtcgaa acccgcggtg ctaccgcgtc
ttcaccttcc 420

accggcagcg
gcacgccgcg agtgacctct cccacgcacc cgctctccca
gatgaaccac 480

cctcctcttc
ccgatccctt gggccggccc gatgaagata gttcctcttc
gtcttcctcc 540

tcctgcagtt
cggcttcgga ctcggagagt gagtccgagg agatgaaatg cagcagtggc
600

ggaggagcat
ccgtgacctc gagccaccat gggcgcggcg gatttggtgg
cgcggcctcc 660

tcctctctgc
tgagctgcgg ccatcagagc agcggcggtg cgagcaccgg
acctcgcaag 720

aagaagagca
aacgcatctc cgagttggac aacgagaagg tgcgcaatat
catgaaagat 780

aagaacactc
ccttctgcac acccaacgtg cagactcggc gtggtcgcgt
caagattgac 840

gaggtgagcc
gcatgttccg caacaccaat cgctctcttg agtacaagaa
cctgcccttc 900

acgattccca
gtatgcacca ggtgttagat gaggccatca aagcctgcaa
gaccatgcag 960

gtgaacaaca
agggcatcca gattatctac acccgcaatc atgaggtgaa gagtgaggtg
1020

gatgcggtgc
ggtgtcgcct gggcaccatg tgcaacctgg ccctctccac tcccttcctc
1080

atggaggcaa
ccatgcccgt gacacatcca cccgaagtgg cgcagcgcac agccgatgct
1140

tgtaacgaag
gcgtcaaggc cgcgtggagc ctcaaagaat tgcacaccca ccaattatgt 1200

cctcgttcct
ccgattaccg caacatgatc atccacgctg ccacaccagt ggacctgttg
1260

ggcgctctca
acctgtgcct gccactgatg cagaagtttc ccaaacaggt catggtgcgc
1320

atcttctcca
ccaaccaggg tgggttcatg ctgcctatct acgagacggc cgcgaaggcc
1380

tacgccgttg
gtcagtttga gcagcccacc gagacacctc ccgaagacct ggacaccctg
1440

agcctggcca
tcgaggcagc catccaggac ctgaggaaca agtctcagta
a
1491


<210>
11
<211>
1491
<212>
DNA
<213>
Artificial Sequence

<220>
<223>
Description of Artificial Sequence: Synthetic

polynucleotide IE2 4nt H369A
DNA sequence

<400>
11
atgggtgaca
tcctcgccca ggctgtcaat catgccggta tcgattccag
tagcaccgga 60

cctacgctga
caacccactc ttgcagcgtt agcagcgctc ctcttaacaa
gccgactcca 120

accagcgtcg
cggttactaa cactcctcta ccaggagcat ccgctactcc
cgagctcagc 180

ccgcgtaaga
aaccgcgcaa gaccacgcgt cctttcaagg tgattattaa
accgcccgtg 240

cctcccgcgc
ctatcatgct gccactcatc aaacaggaag acatcaagcc
cgagcccgac 300

tttaccatcc
agtaccgcaa caagattatc gataccgccg gctgtatcgt
gatctctgat 360

agcgaggaag
aacagggtga agaagtcgaa acccgcggtg ctaccgcgtc
ttcaccttcc 420

accggcagcg
gcacgccgcg agtgacctct cccacgcacc cgctctccca
gatgaaccac 480

cctcctcttc
ccgatccctt gggccggccc gatgaagata gttcctcttc
gtcttcctcc 540

tcctgcagtt
cggcttcgga ctcggagagt gagtccgagg agatgaaatg
cagcagtggc 600

ggaggagcat
ccgtgacctc gagccaccat gggcgcggcg gatttggtgg
cgcggcctcc 660

tcctctctgc
tgagctgcgg ccatcagagc agcggcggtg cgagcaccgg
acctcgcaag 720

aagaagagca
aacgcatctc cgagttggac aacgagaagg tgcgcaatat catgaaagat
780

aagaacactc
ccttctgcac acccaacgtg cagactcggc gtggtcgcgt
caagattgac 840

gaggtgagcc
gcatgttccg caacaccaat cgctctcttg agtacaagaa
cctgcccttc 900

acgattccca
gtatgcacca ggtgttagat gaggccatca aagcctgcaa
gaccatgcag 960

gtgaacaaca agggcatcca
gattatctac acccgcaatc atgaggtgaa gagtgaggtg 1020

gatgcggtgc
ggtgtcgcct gggcaccatg tgcaacctgg ccctctccac tcccttcctc
1080

atggagcaca
ccatgcccgt gacagcacca cccgaagtgg cgcagcgcac agccgatgct
1140

tgtaacgaag
gcgtcaaggc cgcgtggagc ctcaaagaat tgcacaccca ccaattatgt
1200

cctcgttcct
ccgattaccg caacatgatc atccacgctg ccacaccagt ggacctgttg
1260

ggcgctctca
acctgtgcct gccactgatg cagaagtttc ccaaacaggt catggtgcgc
1320

atcttctcca
ccaaccaggg tgggttcatg ctgcctatct acgagacggc cgcgaaggcc 1380

tacgccgttg
gtcagtttga gcagcccacc gagacacctc ccgaagacct ggacaccctg
1440

agcctggcca
tcgaggcagc catccaggac ctgaggaaca agtctcagta
a
1491


<210>
12
<211>
1491
<212>
DNA
<213>
Artificial Sequence

<220>
<223>
Description of Artificial Sequence: Synthetic

polynucleotide IE2 4nt
H363A/H369A DNA sequence

<400>
12
atgggtgaca
tcctcgccca ggctgtcaat catgccggta tcgattccag
tagcaccgga 60

cctacgctga
caacccactc ttgcagcgtt agcagcgctc ctcttaacaa
gccgactcca 120

accagcgtcg
cggttactaa cactcctcta ccaggagcat ccgctactcc
cgagctcagc 180

ccgcgtaaga
aaccgcgcaa gaccacgcgt cctttcaagg tgattattaa
accgcccgtg 240

cctcccgcgc
ctatcatgct gccactcatc aaacaggaag acatcaagcc
cgagcccgac 300

tttaccatcc
agtaccgcaa caagattatc gataccgccg gctgtatcgt
gatctctgat 360

agcgaggaag
aacagggtga agaagtcgaa acccgcggtg ctaccgcgtc
ttcaccttcc 420

accggcagcg
gcacgccgcg agtgacctct cccacgcacc cgctctccca
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cctcctcttc
ccgatccctt gggccggccc gatgaagata gttcctcttc
gtcttcctcc 540

tcctgcagtt
cggcttcgga ctcggagagt gagtccgagg agatgaaatg
cagcagtggc 600

ggaggagcat
ccgtgacctc gagccaccat gggcgcggcg gatttggtgg
cgcggcctcc 660

tcctctctgc
tgagctgcgg ccatcagagc agcggcggtg cgagcaccgg
acctcgcaag 720

aagaagagca
aacgcatctc cgagttggac aacgagaagg tgcgcaatat
catgaaagat 780

aagaacactc
ccttctgcac acccaacgtg cagactcggc gtggtcgcgt
caagattgac 840

gaggtgagcc
gcatgttccg caacaccaat cgctctcttg agtacaagaa
cctgcccttc 900

acgattccca
gtatgcacca ggtgttagat gaggccatca aagcctgcaa gaccatgcag
960

gtgaacaaca
agggcatcca gattatctac acccgcaatc atgaggtgaa gagtgaggtg
1020

gatgcggtgc
ggtgtcgcct gggcaccatg tgcaacctgg ccctctccac tcccttcctc
1080

atggaggcaa
ccatgcccgt gacagcacca cccgaagtgg cgcagcgcac agccgatgct
1140

tgtaacgaag
gcgtcaaggc cgcgtggagc ctcaaagaat tgcacaccca ccaattatgt
1200

cctcgttcct
ccgattaccg caacatgatc atccacgctg ccacaccagt ggacctgttg
1260

ggcgctctca
acctgtgcct gccactgatg cagaagtttc ccaaacaggt catggtgcgc
1320

atcttctcca
ccaaccaggg tgggttcatg ctgcctatct acgagacggc cgcgaaggcc
1380

tacgccgttg
gtcagtttga gcagcccacc gagacacctc ccgaagacct ggacaccctg
1440

agcctggcca
tcgaggcagc catccaggac ctgaggaaca agtctcagta
a
1491


<210>
13
<211>
1488
<212>
DNA
<213>
Artificial Sequence

<220>
<223>
Description of Artificial Sequence: Synthetic

polynucleotide IE2 H363A DNA
sequence

<400>
13
atgggtgaca
tcctcgccca ggctgtcaat catgccggta tcgattccag
tagcaccggc 60

cccacgctga
caacccactc ttgcagcgtt agcagcgccc ctcttaacaa
gccgaccccc 120

accagcgtcg
cggttactaa cactcctctc cccggggcat ccgctactcc
cgagctcagc 180

ccgcgtaaga
aaccgcgcaa aaccacgcgt cctttcaagg tgattattaa
accgcccgtg 240

cctcccgcgc
ctatcatgct gcccctcatc aaacaggaag acatcaagcc
cgagcccgac 300

tttaccatcc
agtaccgcaa caagattatc gataccgccg gctgtatcgt
gatctctgat 360

agcgaggaag
aacagggtga agaagtcgaa acccgcggtg ctaccgcgtc
ttccccttcc 420

accggcagcg
gcacgccgcg agtgacctct cccacgcacc cgctctccca
gatgaaccac 480

cctcctcttc
ccgatccctt gggccggccc gatgaagata gttcctcttc
gtcttcctcc 540

tcctgcagtt
cggcttcgga ctcggagagt gagtccgagg agatgaaatg
cagcagtggc 600

ggaggagcat
ccgtgacctc gagccaccat gggcgcggcg gttttggtgg
cgcggcctcc 660

tcctctctgc
tgagctgcgg ccatcagagc agcggcgggg cgagcaccgg
accccgcaag 720

aagaagagca
aacgcatctc cgagttggac aacgagaagg tgcgcaatat
catgaaagat 780

aagaacaccc
ccttctgcac acccaacgtg cagactcggc ggggtcgcgt
caagattgac 840

gaggtgagcc
gcatgttccg caacaccaat cgctctcttg agtacaagaa
cctgcccttc 900

acgattccca
gtatgcacca ggtgttagat gaggccatca aagcctgcaa
aaccatgcag 960

gtgaacaaca
agggcatcca gattatctac acccgcaatc atgaggtgaa gagtgaggtg
1020

gatgcggtgc
ggtgtcgcct gggcaccatg tgcaacctgg ccctctccac tcccttcctc
1080

atggaggcaa
ccatgcccgt gacacatcca cccgaagtgg cgcagcgcac agccgatgct
1140

tgtaacgaag
gcgtcaaggc cgcgtggagc ctcaaagaat tgcacaccca ccaattatgc
1200

ccccgttcct
ccgattaccg caacatgatc atccacgctg ccacccccgt ggacctgttg
1260

ggcgctctca
acctgtgcct gcccctgatg caaaagtttc ccaaacaggt catggtgcgc
1320

atcttctcca
ccaaccaggg tgggttcatg ctgcctatct acgagacggc cgcgaaggcc
1380

tacgccgtgg
ggcagtttga gcagcccacc gagacccctc ccgaagacct ggacaccctg
1440

agcctggcca
tcgaggcagc catccaggac ctgaggaaca
agtctcag
1488


<210>
14
<211>
1488
<212>
DNA
<213>
Artificial Sequence

<220>
<223>
Description of Artificial Sequence: Synthetic

polynucleotide IE2 H369A DNA
sequence

<400>
14
atgggtgaca
tcctcgccca ggctgtcaat catgccggta tcgattccag
tagcaccggc 60

cccacgctga
caacccactc ttgcagcgtt agcagcgccc ctcttaacaa
gccgaccccc 120

accagcgtcg
cggttactaa cactcctctc cccggggcat ccgctactcc
cgagctcagc 180

ccgcgtaaga
aaccgcgcaa aaccacgcgt cctttcaagg tgattattaa
accgcccgtg 240

cctcccgcgc
ctatcatgct gcccctcatc aaacaggaag acatcaagcc
cgagcccgac 300

tttaccatcc
agtaccgcaa caagattatc gataccgccg gctgtatcgt
gatctctgat 360

agcgaggaag
aacagggtga agaagtcgaa acccgcggtg ctaccgcgtc
ttccccttcc 420

accggcagcg
gcacgccgcg agtgacctct cccacgcacc cgctctccca
gatgaaccac 480

cctcctcttc
ccgatccctt gggccggccc gatgaagata gttcctcttc
gtcttcctcc 540

tcctgcagtt
cggcttcgga ctcggagagt gagtccgagg agatgaaatg
cagcagtggc 600

ggaggagcat
ccgtgacctc gagccaccat gggcgcggcg gttttggtgg
cgcggcctcc 660

tcctctctgc
tgagctgcgg ccatcagagc agcggcgggg cgagcaccgg accccgcaag
720

aagaagagca
aacgcatctc cgagttggac aacgagaagg tgcgcaatat
catgaaagat 780

aagaacaccc
ccttctgcac acccaacgtg cagactcggc ggggtcgcgt
caagattgac 840

gaggtgagcc
gcatgttccg caacaccaat cgctctcttg agtacaagaa
cctgcccttc 900

acgattccca gtatgcacca
ggtgttagat gaggccatca aagcctgcaa aaccatgcag 960

gtgaacaaca
agggcatcca gattatctac acccgcaatc atgaggtgaa gagtgaggtg
1020

gatgcggtgc
ggtgtcgcct gggcaccatg tgcaacctgg ccctctccac tcccttcctc
1080

atggagcaca
ccatgcccgt gacagcacca cccgaagtgg cgcagcgcac agccgatgct
1140

tgtaacgaag
gcgtcaaggc cgcgtggagc ctcaaagaat tgcacaccca ccaattatgc
1200

ccccgttcct
ccgattaccg caacatgatc atccacgctg ccacccccgt ggacctgttg
1260

ggcgctctca
acctgtgcct gcccctgatg caaaagtttc ccaaacaggt catggtgcgc 1320

atcttctcca
ccaaccaggg tgggttcatg ctgcctatct acgagacggc cgcgaaggcc
1380

tacgccgtgg
ggcagtttga gcagcccacc gagacccctc ccgaagacct ggacaccctg
1440

agcctggcca
tcgaggcagc catccaggac ctgaggaaca
agtctcag
1488


<210>
15
<211>
1488
<212>
DNA
<213>
Artificial Sequence

<220>
<223>
Description of Artificial Sequence: Synthetic

polynucleotide IE2
H363A/H369A DNA sequence

<400>
15
atgggtgaca
tcctcgccca ggctgtcaat catgccggta tcgattccag
tagcaccggc 60

cccacgctga
caacccactc ttgcagcgtt agcagcgccc ctcttaacaa
gccgaccccc 120

accagcgtcg
cggttactaa cactcctctc cccggggcat ccgctactcc
cgagctcagc 180

ccgcgtaaga
aaccgcgcaa aaccacgcgt cctttcaagg tgattattaa
accgcccgtg 240

cctcccgcgc
ctatcatgct gcccctcatc aaacaggaag acatcaagcc
cgagcccgac 300

tttaccatcc
agtaccgcaa caagattatc gataccgccg gctgtatcgt
gatctctgat 360

agcgaggaag
aacagggtga agaagtcgaa acccgcggtg ctaccgcgtc
ttccccttcc 420

accggcagcg
gcacgccgcg agtgacctct cccacgcacc cgctctccca
gatgaaccac 480

cctcctcttc
ccgatccctt gggccggccc gatgaagata gttcctcttc
gtcttcctcc 540

tcctgcagtt
cggcttcgga ctcggagagt gagtccgagg agatgaaatg
cagcagtggc 600

ggaggagcat
ccgtgacctc gagccaccat gggcgcggcg gttttggtgg
cgcggcctcc 660

tcctctctgc
tgagctgcgg ccatcagagc agcggcgggg cgagcaccgg
accccgcaag 720

aagaagagca
aacgcatctc cgagttggac aacgagaagg tgcgcaatat
catgaaagat 780

aagaacaccc
ccttctgcac acccaacgtg cagactcggc ggggtcgcgt
caagattgac 840

gaggtgagcc
gcatgttccg caacaccaat cgctctcttg agtacaagaa cctgcccttc
900

acgattccca
gtatgcacca ggtgttagat gaggccatca aagcctgcaa
aaccatgcag 960

gtgaacaaca
agggcatcca gattatctac acccgcaatc atgaggtgaa gagtgaggtg
1020

gatgcggtgc
ggtgtcgcct gggcaccatg tgcaacctgg ccctctccac tcccttcctc
1080

atggaggcaa ccatgcccgt
gacagcacca cccgaagtgg cgcagcgcac agccgatgct 1140

tgtaacgaag
gcgtcaaggc cgcgtggagc ctcaaagaat tgcacaccca ccaattatgc
1200

ccccgttcct
ccgattaccg caacatgatc atccacgctg ccacccccgt ggacctgttg
1260

ggcgctctca
acctgtgcct gcccctgatg caaaagtttc ccaaacaggt catggtgcgc
1320

atcttctcca
ccaaccaggg tgggttcatg ctgcctatct acgagacggc cgcgaaggcc
1380

tacgccgtgg
ggcagtttga gcagcccacc gagacccctc ccgaagacct ggacaccctg
1440

agcctggcca
tcgaggcagc catccaggac ctgaggaaca
agtctcag
1488


<210>
16
<211>
1488
<212>
DNA
<213>
Artificial Sequence

<220>
<223>
Description of Artificial Sequence: Synthetic

polynucleotide IE2 VacO
H363A DNA sequence

<400>
16
atgggagaca
tcctagcaca agcagtgaac catgctggaa ttgactcatc
ttcgaccgga 60

ccaactctaa
cgactcattc atgttcggtt agttctgctc ctcttaacaa
gcctacacct 120

acctcggtag
ctgttaccaa cacaccttta ccaggagcat cagcaacacc
tgagttgtct 180

ccaagaaaga
agcctcgtaa gaccacgaga ccgttcaagg tgatcatcaa
gccaccagta 240

ccacctgctc
cgatcatgtt gccattgatc aagcaggagg acattaagcc
agaacctgac 300

ttcacgatac
agtaccgtaa caagatcata gatacagcag gatgcatagt
gatctcagat 360

agtgaagagg
agcaaggtga ggaagtggag actagaggag ccacagccag
ttcgccttcc 420

acaggatccg
gaactcctag agtaactagt ccgacacatc cactttccca
gatgaatcat 480

ccacctctac
cggatcctct aggacgacca gatgaagatt cttcttcatc
tagttcaagt 540

tcttgctcat
ccgcgagtga tagtgagtca gaaagtgaag agatgaagtg
ctcttctggt 600

ggtggagcta
gtgtcacttc atctcatcat ggacgaggag gatttggagg
tgctgcgagt 660

agttccttac
taagttgtgg acatcagtca tctggtggtg catctactgg
acctagaaag 720

aagaagtcaa
agagaatctc cgaattggat aatgagaaag tgagaaacat
catgaaggac 780

aagaacacgc
cgttctgcac tccgaatgtt cagacgagaa gaggacgagt
gaagatagat 840

gaagtatcac
gaatgttcag aaacacaaat cgttctctag agtacaagaa
tcttccgttc 900

accatacctt
cgatgcacca agtattagat gaggctatca aggcatgtaa
gaccatgcaa 960

gttaacaaca
aaggaataca gatcatctac actagaaacc atgaggttaa gagtgaggtg
1020

gatgccgtac
gttgtagatt gggaacgatg tgtaaccttg cgctatctac tcctttccta
1080

atggaggcta
ctatgcctgt gactcatcct cctgaagtgg ctcaaagaac agctgatgct
1140

tgtaacgaag
gtgtgaaagc tgcttggtcc ctaaaggagt tacatacaca ccaactttgt
1200

ccacgatcca
gtgactacag aaacatgatc attcatgcag ctacgcctgt agatctactt
1260

ggagctctta
acctatgtct tcctttgatg cagaagttcc ctaagcaagt gatggtgaga
1320

atcttctcga
cgaatcaagg aggattcatg ttaccgatat acgagacagc tgcaaaggct
1380

tacgctgtcg
gtcagttcga gcaaccgact gaaacgcctc ctgaggactt agatacattg
1440

tctttggcga
tagaagcagc gattcaggat cttagaaaca
agagtcag
1488


<210>
17
<211>
1488
<212>
DNA
<213>
Artificial Sequence

<220>
<223>
Description of Artificial Sequence: Synthetic

polynucleotide IE2 VacO
H369A DNA sequence

<400>
17
atgggagaca
tcctagcaca agcagtgaac catgctggaa ttgactcatc
ttcgaccgga 60

ccaactctaa
cgactcattc atgttcggtt agttctgctc ctcttaacaa
gcctacacct 120

acctcggtag
ctgttaccaa cacaccttta ccaggagcat cagcaacacc
tgagttgtct 180

ccaagaaaga agcctcgtaa
gaccacgaga ccgttcaagg tgatcatcaa gccaccagta 240

ccacctgctc
cgatcatgtt gccattgatc aagcaggagg acattaagcc
agaacctgac 300

ttcacgatac
agtaccgtaa caagatcata gatacagcag gatgcatagt
gatctcagat 360

agtgaagagg
agcaaggtga ggaagtggag actagaggag ccacagccag
ttcgccttcc 420

acaggatccg
gaactcctag agtaactagt ccgacacatc cactttccca
gatgaatcat 480

ccacctctac
cggatcctct aggacgacca gatgaagatt cttcttcatc
tagttcaagt 540

tcttgctcat
ccgcgagtga tagtgagtca gaaagtgaag agatgaagtg ctcttctggt 600

ggtggagcta
gtgtcacttc atctcatcat ggacgaggag gatttggagg
tgctgcgagt 660

agttccttac
taagttgtgg acatcagtca tctggtggtg catctactgg
acctagaaag 720

aagaagtcaa
agagaatctc cgaattggat aatgagaaag tgagaaacat
catgaaggac 780

aagaacacgc
cgttctgcac tccgaatgtt cagacgagaa gaggacgagt
gaagatagat 840

gaagtatcac
gaatgttcag aaacacaaat cgttctctag agtacaagaa
tcttccgttc 900

accatacctt
cgatgcacca agtattagat gaggctatca aggcatgtaa
gaccatgcaa 960

gttaacaaca
aaggaataca gatcatctac actagaaacc atgaggttaa gagtgaggtg
1020

gatgccgtac
gttgtagatt gggaacgatg tgtaaccttg cgctatctac tcctttccta
1080

atggagcata
ctatgcctgt gactgctcct cctgaagtgg ctcaaagaac agctgatgct
1140

tgtaacgaag
gtgtgaaagc tgcttggtcc ctaaaggagt tacatacaca ccaactttgt
1200

ccacgatcca
gtgactacag aaacatgatc attcatgcag ctacgcctgt agatctactt
1260

ggagctctta
acctatgtct tcctttgatg cagaagttcc ctaagcaagt gatggtgaga
1320

atcttctcga
cgaatcaagg aggattcatg ttaccgatat acgagacagc tgcaaaggct
1380

tacgctgtcg
gtcagttcga gcaaccgact gaaacgcctc ctgaggactt agatacattg
1440

tctttggcga
tagaagcagc gattcaggat cttagaaaca
agagtcag
1488


<210>
18
<211>
1488
<212>
DNA
<213>
Artificial Sequence

<220>
<223>
Description of Artificial Sequence: Synthetic

polynucleotide IE2 VacO
H363A/H369A DNA sequence

<400>
18
atgggagaca
tcctagcaca agcagtgaac catgctggaa ttgactcatc
ttcgaccgga 60

ccaactctaa
cgactcattc atgttcggtt agttctgctc ctcttaacaa
gcctacacct 120

acctcggtag
ctgttaccaa cacaccttta ccaggagcat cagcaacacc tgagttgtct
180

ccaagaaaga
agcctcgtaa gaccacgaga ccgttcaagg tgatcatcaa
gccaccagta 240

ccacctgctc
cgatcatgtt gccattgatc aagcaggagg acattaagcc
agaacctgac 300

ttcacgatac
agtaccgtaa caagatcata gatacagcag gatgcatagt
gatctcagat 360

agtgaagagg
agcaaggtga ggaagtggag actagaggag ccacagccag
ttcgccttcc 420

acaggatccg
gaactcctag agtaactagt ccgacacatc cactttccca
gatgaatcat 480

ccacctctac
cggatcctct aggacgacca gatgaagatt cttcttcatc
tagttcaagt 540

tcttgctcat
ccgcgagtga tagtgagtca gaaagtgaag agatgaagtg
ctcttctggt 600

ggtggagcta
gtgtcacttc atctcatcat ggacgaggag gatttggagg
tgctgcgagt 660

agttccttac
taagttgtgg acatcagtca tctggtggtg catctactgg
acctagaaag 720

aagaagtcaa
agagaatctc cgaattggat aatgagaaag tgagaaacat catgaaggac
780

aagaacacgc
cgttctgcac tccgaatgtt cagacgagaa gaggacgagt
gaagatagat 840

gaagtatcac
gaatgttcag aaacacaaat cgttctctag agtacaagaa
tcttccgttc 900

accatacctt
cgatgcacca agtattagat gaggctatca aggcatgtaa
gaccatgcaa 960

gttaacaaca
aaggaataca gatcatctac actagaaacc atgaggttaa gagtgaggtg
1020

gatgccgtac
gttgtagatt gggaacgatg tgtaaccttg cgctatctac tcctttccta
1080

atggaggcta
ctatgcctgt gactgctcct cctgaagtgg ctcaaagaac agctgatgct
1140

tgtaacgaag
gtgtgaaagc tgcttggtcc ctaaaggagt tacatacaca ccaactttgt
1200

ccacgatcca
gtgactacag aaacatgatc attcatgcag ctacgcctgt agatctactt
1260

ggagctctta
acctatgtct tcctttgatg cagaagttcc ctaagcaagt gatggtgaga
1320

atcttctcga
cgaatcaagg aggattcatg ttaccgatat acgagacagc tgcaaaggct
1380

tacgctgtcg
gtcagttcga gcaaccgact gaaacgcctc ctgaggactt agatacattg
1440

tctttggcga
tagaagcagc gattcaggat cttagaaaca
agagtcag
1488


<210>
19
<211>
496
<212>
PRT
<213>
Artificial Sequence

<220>
<223>
Description of Artificial Sequence: Synthetic

polypeptide IE2-VacO amino
acid sequence

<400>
19
Met Gly Asp
Ile Leu Ala Gln Ala Val Asn His Ala Gly Ile Asp Ser
1
5
10
15


Ser Ser Thr
Gly Pro Thr Leu Thr Thr His Ser Cys Ser Val Ser Ser

20
25
30


Ala Pro Leu
Asn Lys Pro Thr Pro Thr Ser Val Ala Val Thr Asn Thr

35
40
45



Pro Leu Pro
Gly Ala Ser Ala Thr Pro Glu Leu Ser Pro Arg Lys Lys

50
55
60



Pro Arg
Lys Thr Thr Arg Pro Phe Lys Val Ile Ile Lys Pro Pro Val
65
70
75
80


Pro Pro
Ala Pro Ile Met Leu Pro Leu Ile Lys Gln Glu Asp Ile Lys

85
90
95


Pro Glu
Pro Asp Phe Thr Ile Gln Tyr Arg Asn Lys Ile Ile Asp Thr

100
105
110


Ala Gly Cys
Ile Val Ile Ser Asp Ser Glu Glu Glu Gln Gly Glu Glu

115
120
125


Val Glu Thr
Arg Gly Ala Thr Ala Ser Ser Pro Ser Thr Gly Ser Gly

130
135
140



Thr Pro
Arg Val Thr Ser Pro Thr His Pro Leu Ser Gln Met Asn His
145
150
155
160


Pro Pro Leu
Pro Asp Pro Leu Gly Arg Pro Asp Glu Asp Ser Ser Ser

165
170
175


Ser Ser Ser Ser
Ser Cys Ser Ser Ala Ser Asp Ser Glu Ser Glu Ser

180
185
190


Glu Glu Met
Lys Cys Ser Ser Gly Gly Gly Ala Ser Val Thr Ser Ser

195
200
205


His His
Gly Arg Gly Gly Phe Gly Gly Ala Ala Ser Ser Ser Leu Leu

210
215
220



Ser Cys
Gly His Gln Ser Ser Gly Gly Ala Ser Thr Gly Pro Arg Lys
225
230
235
240


Lys Lys
Ser Lys Arg Ile Ser Glu Leu Asp Asn Glu Lys Val Arg Asn

245
250
255


Ile Met
Lys Asp Lys Asn Thr Pro Phe Cys Thr Pro Asn Val Gln Thr

260
265
270


Arg Arg
Gly Arg Val Lys Ile Asp Glu Val Ser Arg Met Phe Arg Asn

275
280
285


Thr Asn
Arg Ser Leu Glu Tyr Lys Asn Leu Pro Phe Thr Ile Pro Ser

290
295
300



Met His
Gln Val Leu Asp Glu Ala Ile Lys Ala Cys Lys Thr Met Gln
305
310
315
320


Val Asn
Asn Lys Gly Ile Gln Ile Ile Tyr Thr Arg Asn His Glu Val

325
330
335


Lys Ser
Glu Val Asp Ala Val Arg Cys Arg Leu Gly Thr Met Cys Asn

340
345
350


Leu Ala
Leu Ser Thr Pro Phe Leu Met Glu His Thr Met Pro Val Thr

355
360
365


His Pro
Pro Glu Val Ala Gln Arg Thr Ala Asp Ala Cys Asn Glu Gly

370
375
380



Val Lys
Ala Ala Trp Ser Leu Lys Glu Leu His Thr His Gln Leu Cys
385
390
395
400


Pro Arg
Ser Ser Asp Tyr Arg Asn Met Ile Ile His Ala Ala Thr Pro

405
410
415


Val Asp
Leu Leu Gly Ala Leu Asn Leu Cys Leu Pro Leu Met Gln Lys

420
425
430


Phe Pro
Lys Gln Val Met Val Arg Ile Phe Ser Thr Asn Gln Gly Gly

435
440
445


Phe Met Leu
Pro Ile Tyr Glu Thr Ala Ala Lys Ala Tyr Ala Val Gly

450
455
460



Gln Phe Glu
Gln Pro Thr Glu Thr Pro Pro Glu Asp Leu Asp Thr Leu
465
470
475
480


Ser Leu Ala
Ile Glu Ala Ala Ile Gln Asp Leu Arg Asn Lys Ser Gln

485
490
495


<210>
20
<211>
496
<212>
PRT
<213>
Artificial Sequence

<220>
<223>
Description of Artificial Sequence: Synthetic

polypeptide IE2 amino acid sequence

<400>
20
Met Gly
Asp Ile Leu Ala Gln Ala Val Asn His Ala Gly Ile Asp Ser
1
5
10
15


Ser Ser
Thr Gly Pro Thr Leu Thr Thr His Ser Cys Ser Val Ser Ser

20
25
30


Ala Pro
Leu Asn Lys Pro Thr Pro Thr Ser Val Ala Val Thr Asn Thr

35
40
45



Pro Leu
Pro Gly Ala Ser Ala Thr Pro Glu Leu Ser Pro Arg Lys Lys

50
55
60



Pro Arg
Lys Thr Thr Arg Pro Phe Lys Val Ile Ile Lys Pro Pro Val
65
70
75
80


Pro Pro
Ala Pro Ile Met Leu Pro Leu Ile Lys Gln Glu Asp Ile Lys

85
90
95


Pro Glu
Pro Asp Phe Thr Ile Gln Tyr Arg Asn Lys Ile Ile Asp Thr

100
105
110


Ala Gly Cys
Ile Val Ile Ser Asp Ser Glu Glu Glu Gln Gly Glu Glu

115
120
125


Val Glu Thr
Arg Gly Ala Thr Ala Ser Ser Pro Ser Thr Gly Ser Gly

130
135
140



Thr Pro
Arg Val Thr Ser Pro Thr His Pro Leu Ser Gln Met Asn His
145
150
155 160



Pro Pro Leu
Pro Asp Pro Leu Gly Arg Pro Asp Glu Asp Ser Ser Ser

165
170
175


Ser Ser Ser
Ser Ser Cys Ser Ser Ala Ser Asp Ser Glu Ser Glu Ser

180
185 190



Glu Glu Met
Lys Cys Ser Ser Gly Gly Gly Ala Ser Val Thr Ser Ser

195
200
205


His His
Gly Arg Gly Gly Phe Gly Gly Ala Ala Ser Ser Ser Leu Leu

210
215 220



Ser Cys
Gly His Gln Ser Ser Gly Gly Ala Ser Thr Gly Pro Arg Lys
225
230
235
240


Lys Lys
Ser Lys Arg Ile Ser Glu Leu Asp Asn Glu Lys Val Arg Asn

245 250
255


Ile Met
Lys Asp Lys Asn Thr Pro Phe Cys Thr Pro Asn Val Gln Thr

260
265
270


Arg Arg
Gly Arg Val Lys Ile Asp Glu Val Ser Arg Met Phe Arg Asn

275 280
285


Thr Asn
Arg Ser Leu Glu Tyr Lys Asn Leu Pro Phe Thr Ile Pro Ser

290
295
300



Met His
Gln Val Leu Asp Glu Ala Ile Lys Ala Cys Lys Thr Met Gln
305
310
315
320


Val Asn
Asn Lys Gly Ile Gln Ile Ile Tyr Thr Arg Asn His Glu Val

325
330
335


Lys Ser
Glu Val Asp Ala Val Arg Cys Arg Leu Gly Thr Met Cys Asn

340
345
350


Leu Ala
Leu Ser Thr Pro Phe Leu Met Glu His Thr Met Pro Val Thr

355
360
365


His Pro
Pro Glu Val Ala Gln Arg Thr Ala Asp Ala Cys Asn Glu Gly

370
375
380



Val Lys
Ala Ala Trp Ser Leu Lys Glu Leu His Thr His Gln Leu Cys
385
390
395
400


Pro Arg
Ser Ser Asp Tyr Arg Asn Met Ile Ile His Ala Ala Thr Pro

405
410
415


Val Asp
Leu Leu Gly Ala Leu Asn Leu Cys Leu Pro Leu Met Gln Lys

420
425
430


Phe Pro
Lys Gln Val Met Val Arg Ile Phe Ser Thr Asn Gln Gly Gly

435
440
445


Phe Met Leu
Pro Ile Tyr Glu Thr Ala Ala Lys Ala Tyr Ala Val Gly

450
455
460



Gln Phe Glu
Gln Pro Thr Glu Thr Pro Pro Glu Asp Leu Asp Thr Leu
465
470
475
480


Ser Leu Ala
Ile Glu Ala Ala Ile Gln Asp Leu Arg Asn Lys Ser Gln

485
490
495


<210>
21
<211>
496
<212>
PRT
<213>
Artificial Sequence

<220>
<223>
Description of Artificial Sequence: Synthetic

polypeptide IE2-4nt amino acid sequence

<400>
21
Met Gly
Asp Ile Leu Ala Gln Ala Val Asn His Ala Gly Ile Asp Ser
1
5
10 15



Ser Ser
Thr Gly Pro Thr Leu Thr Thr His Ser Cys Ser Val Ser Ser

20
25
30


Ala Pro
Leu Asn Lys Pro Thr Pro Thr Ser Val Ala Val Thr Asn Thr

35
40 45



Pro Leu
Pro Gly Ala Ser Ala Thr Pro Glu Leu Ser Pro Arg Lys Lys

50
55
60



Pro Arg
Lys Thr Thr Arg Pro Phe Lys Val Ile Ile Lys Pro Pro Val
65
70 75
80


Pro Pro
Ala Pro Ile Met Leu Pro Leu Ile Lys Gln Glu Asp Ile Lys

85
90
95


Pro Glu
Pro Asp Phe Thr Ile Gln Tyr Arg Asn Lys Ile Ile Asp Thr

100
105
110


Ala Gly Cys
Ile Val Ile Ser Asp Ser Glu Glu Glu Gln Gly Glu Glu

115
120
125


Val Glu Thr
Arg Gly Ala Thr Ala Ser Ser Pro Ser Thr Gly Ser Gly

130
135
140



Thr Pro
Arg Val Thr Ser Pro Thr His Pro Leu Ser Gln Met Asn His
145
150
155
160


Pro Pro Leu
Pro Asp Pro Leu Gly Arg Pro Asp Glu Asp Ser Ser Ser

165
170
175


Ser Ser Ser
Ser Ser Cys Ser Ser Ala Ser Asp Ser Glu Ser Glu Ser

180
185
190


Glu Glu Met
Lys Cys Ser Ser Gly Gly Gly Ala Ser Val Thr Ser Ser

195
200
205


His His
Gly Arg Gly Gly Phe Gly Gly Ala Ala Ser Ser Ser Leu Leu

210
215
220



Ser Cys
Gly His Gln Ser Ser Gly Gly Ala Ser Thr Gly Pro Arg Lys
225
230
235
240


Lys Lys
Ser Lys Arg Ile Ser Glu Leu Asp Asn Glu Lys Val Arg Asn

245
250
255


Ile Met
Lys Asp Lys Asn Thr Pro Phe Cys Thr Pro Asn Val Gln Thr

260
265
270


Arg Arg
Gly Arg Val Lys Ile Asp Glu Val Ser Arg Met Phe Arg Asn

275
280
285


Thr Asn
Arg Ser Leu Glu Tyr Lys Asn Leu Pro Phe Thr Ile Pro Ser

290
295
300



Met His
Gln Val Leu Asp Glu Ala Ile Lys Ala Cys Lys Thr Met Gln
305
310
315
320


Val Asn
Asn Lys Gly Ile Gln Ile Ile Tyr Thr Arg Asn His Glu Val

325
330
335


Lys Ser
Glu Val Asp Ala Val Arg Cys Arg Leu Gly Thr Met Cys Asn

340
345
350


Leu Ala
Leu Ser Thr Pro Phe Leu Met Glu His Thr Met Pro Val Thr

355
360
365


His Pro
Pro Glu Val Ala Gln Arg Thr Ala Asp Ala Cys Asn Glu Gly

370
375
380



Val Lys
Ala Ala Trp Ser Leu Lys Glu Leu His Thr His Gln Leu Cys
385
390
395
400


Pro Arg
Ser Ser Asp Tyr Arg Asn Met Ile Ile His Ala Ala Thr Pro

405
410
415


Val Asp Leu
Leu Gly Ala Leu Asn Leu Cys Leu Pro Leu Met Gln Lys

420
425
430


Phe Pro
Lys Gln Val Met Val Arg Ile Phe Ser Thr Asn Gln Gly Gly

435
440
445


Phe Met Leu
Pro Ile Tyr Glu Thr Ala Ala Lys Ala Tyr Ala Val Gly

450
455
460



Gln Phe Glu
Gln Pro Thr Glu Thr Pro Pro Glu Asp Leu Asp Thr Leu
465
470
475
480


Ser Leu Ala
Ile Glu Ala Ala Ile Gln Asp Leu Arg Asn Lys Ser Gln

485
490
495


<210>
22
<211>
496
<212>
PRT
<213>
Artificial Sequence

<220>
<223>
Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide IE2 H363A amino acid sequence

<400>
22
Met Gly Asp
Ile Leu Ala Gln Ala Val Asn His Ala Gly Ile Asp Ser
1
5
10
15


Ser Ser Thr
Gly Pro Thr Leu Thr Thr His Ser Cys Ser Val Ser Ser
20
25
30


Ala Pro Leu
Asn Lys Pro Thr Pro Thr Ser Val Ala Val Thr Asn Thr

35
40
45



Pro Leu Pro
Gly Ala Ser Ala Thr Pro Glu Leu Ser Pro Arg Lys Lys

50
55
60



Pro Arg
Lys Thr Thr Arg Pro Phe Lys Val Ile Ile Lys Pro Pro Val
65
70
75
80


Pro Pro
Ala Pro Ile Met Leu Pro Leu Ile Lys Gln Glu Asp Ile Lys

85
90
95


Pro Glu
Pro Asp Phe Thr Ile Gln Tyr Arg Asn Lys Ile Ile Asp Thr

100
105
110


Ala Gly Cys
Ile Val Ile Ser Asp Ser Glu Glu Glu Gln Gly Glu Glu

115
120
125


Val Glu Thr
Arg Gly Ala Thr Ala Ser Ser Pro Ser Thr Gly Ser Gly

130
135
140



Thr Pro
Arg Val Thr Ser Pro Thr His Pro Leu Ser Gln Met Asn His
145
150
155
160


Pro Pro Leu
Pro Asp Pro Leu Gly Arg Pro Asp Glu Asp Ser Ser Ser

165
170
175


Ser Ser Ser
Ser Ser Cys Ser Ser Ala Ser Asp Ser Glu Ser Glu Ser

180
185
190


Glu Glu Met
Lys Cys Ser Ser Gly Gly Gly Ala Ser Val Thr Ser Ser

195
200
205


His His
Gly Arg Gly Gly Phe Gly Gly Ala Ala Ser Ser Ser Leu Leu

210
215
220



Ser Cys
Gly His Gln Ser Ser Gly Gly Ala Ser Thr Gly Pro Arg Lys
225
230
235
240


Lys Lys
Ser Lys Arg Ile Ser Glu Leu Asp Asn Glu Lys Val Arg Asn

245
250
255


Ile Met
Lys Asp Lys Asn Thr Pro Phe Cys Thr Pro Asn Val Gln Thr

260
265
270


Arg Arg
Gly Arg Val Lys Ile Asp Glu Val Ser Arg Met Phe Arg Asn

275
280
285


Thr Asn
Arg Ser Leu Glu Tyr Lys Asn Leu Pro Phe Thr Ile Pro Ser

290
295
300



Met His
Gln Val Leu Asp Glu Ala Ile Lys Ala Cys Lys Thr Met Gln
305
310
315
320


Val Asn
Asn Lys Gly Ile Gln Ile Ile Tyr Thr Arg Asn His Glu Val

325
330
335


Lys Ser
Glu Val Asp Ala Val Arg Cys Arg Leu Gly Thr Met Cys Asn

340
345
350


Leu Ala
Leu Ser Thr Pro Phe Leu Met Glu Ala Thr Met Pro Val Thr

355
360
365



His Pro
Pro Glu Val Ala Gln Arg Thr Ala Asp Ala Cys Asn Glu Gly

370
375
380



Val Lys
Ala Ala Trp Ser Leu Lys Glu Leu His Thr His Gln Leu Cys
385
390
395
400


Pro Arg
Ser Ser Asp Tyr Arg Asn Met Ile Ile His Ala Ala Thr Pro

405
410
415


Val Asp
Leu Leu Gly Ala Leu Asn Leu Cys Leu Pro Leu Met Gln Lys

420
425
430


Phe Pro
Lys Gln Val Met Val Arg Ile Phe Ser Thr Asn Gln Gly Gly

435
440
445


Phe Met Leu
Pro Ile Tyr Glu Thr Ala Ala Lys Ala Tyr Ala Val Gly

450
455
460



Gln Phe Glu
Gln Pro Thr Glu Thr Pro Pro Glu Asp Leu Asp Thr Leu
465
470
475
480


Ser Leu Ala
Ile Glu Ala Ala Ile Gln Asp Leu Arg Asn Lys Ser Gln

485
490
495


<210>
23
<211>
496
<212>
PRT
<213>
Artificial Sequence

<220>
<223>
Description of Artificial Sequence: Synthetic

polypeptide IE2 H369A amino
acid sequence

<400>
23
Met Gly Asp
Ile Leu Ala Gln Ala Val Asn His Ala Gly Ile Asp Ser
1
5
10
15


Ser Ser Thr
Gly Pro Thr Leu Thr Thr His Ser Cys Ser Val Ser Ser

20
25
30


Ala Pro Leu
Asn Lys Pro Thr Pro Thr Ser Val Ala Val Thr Asn Thr

35
40
45



Pro Leu Pro
Gly Ala Ser Ala Thr Pro Glu Leu Ser Pro Arg Lys Lys

50
55
60



Pro Arg
Lys Thr Thr Arg Pro Phe Lys Val Ile Ile Lys Pro Pro Val
65
70
75
80


Pro Pro
Ala Pro Ile Met Leu Pro Leu Ile Lys Gln Glu Asp Ile Lys

85
90
95


Pro Glu Pro
Asp Phe Thr Ile Gln Tyr Arg Asn Lys Ile Ile Asp Thr

100
105
110


Ala Gly Cys
Ile Val Ile Ser Asp Ser Glu Glu Glu Gln Gly Glu Glu

115
120
125


Val Glu Thr
Arg Gly Ala Thr Ala Ser Ser Pro Ser Thr Gly Ser Gly

130
135
140



Thr Pro
Arg Val Thr Ser Pro Thr His Pro Leu Ser Gln Met Asn His
145
150
155
160


Pro Pro Leu
Pro Asp Pro Leu Gly Arg Pro Asp Glu Asp Ser Ser Ser

165
170
175


Ser Ser Ser
Ser Ser Cys Ser Ser Ala Ser Asp Ser Glu Ser Glu Ser

180
185
190


Glu Glu Met
Lys Cys Ser Ser Gly Gly Gly Ala Ser Val Thr Ser Ser

195
200
205


His His
Gly Arg Gly Gly Phe Gly Gly Ala Ala Ser Ser Ser Leu Leu

210
215
220



Ser Cys
Gly His Gln Ser Ser Gly Gly Ala Ser Thr Gly Pro Arg Lys
225
230
235
240


Lys Lys
Ser Lys Arg Ile Ser Glu Leu Asp Asn Glu Lys Val Arg Asn

245
250
255


Ile Met
Lys Asp Lys Asn Thr Pro Phe Cys Thr Pro Asn Val Gln Thr

260
265
270


Arg Arg
Gly Arg Val Lys Ile Asp Glu Val Ser Arg Met Phe Arg Asn

275
280
285


Thr Asn
Arg Ser Leu Glu Tyr Lys Asn Leu Pro Phe Thr Ile Pro Ser

290
295
300



Met His
Gln Val Leu Asp Glu Ala Ile Lys Ala Cys Lys Thr Met Gln
305
310
315
320


Val Asn
Asn Lys Gly Ile Gln Ile Ile Tyr Thr Arg Asn His Glu Val

325
330
335


Lys Ser
Glu Val Asp Ala Val Arg Cys Arg Leu Gly Thr Met Cys Asn

340
345
350


Leu Ala
Leu Ser Thr Pro Phe Leu Met Glu His Thr Met Pro Val Thr

355
360
365


Ala Pro Pro
Glu Val Ala Gln Arg Thr Ala Asp Ala Cys Asn Glu Gly
370
375
380



Val Lys Ala
Ala Trp Ser Leu Lys Glu Leu His Thr His Gln Leu Cys
385
390
395
400


Pro Arg Ser
Ser Asp Tyr Arg Asn Met Ile Ile His Ala Ala Thr Pro

405
410
415


Val Asp Leu
Leu Gly Ala Leu Asn Leu Cys Leu Pro Leu Met Gln Lys

420
425
430


Phe Pro
Lys Gln Val Met Val Arg Ile Phe Ser Thr Asn Gln Gly Gly

435
440
445


Phe Met Leu
Pro Ile Tyr Glu Thr Ala Ala Lys Ala Tyr Ala Val Gly

450
455
460



Gln Phe Glu
Gln Pro Thr Glu Thr Pro Pro Glu Asp Leu Asp Thr Leu
465
470
475
480


Ser Leu Ala
Ile Glu Ala Ala Ile Gln Asp Leu Arg Asn Lys Ser Gln

485
490
495


<210>
24
<211>
496
<212>
PRT
<213>
Artificial Sequence

<220>
<223>
Description of Artificial Sequence: Synthetic

polypeptide IE2 H363A/H369A
amino acid sequence

<400>
24
Met Gly Asp
Ile Leu Ala Gln Ala Val Asn His Ala Gly Ile Asp Ser
1
5
10 15



Ser Ser Thr
Gly Pro Thr Leu Thr Thr His Ser Cys Ser Val Ser Ser

20
25
30


Ala Pro Leu
Asn Lys Pro Thr Pro Thr Ser Val Ala Val Thr Asn Thr

35
40 45



Pro Leu Pro
Gly Ala Ser Ala Thr Pro Glu Leu Ser Pro Arg Lys Lys

50
55
60



Pro Arg
Lys Thr Thr Arg Pro Phe Lys Val Ile Ile Lys Pro Pro Val
65
70 75
80


Pro Pro
Ala Pro Ile Met Leu Pro Leu Ile Lys Gln Glu Asp Ile Lys

85
90
95


Pro Glu
Pro Asp Phe Thr Ile Gln Tyr Arg Asn Lys Ile Ile Asp Thr

100
105
110


Ala Gly Cys
Ile Val Ile Ser Asp Ser Glu Glu Glu Gln Gly Glu Glu

115
120
125


Val Glu Thr
Arg Gly Ala Thr Ala Ser Ser Pro Ser Thr Gly Ser Gly

130
135
140



Thr Pro
Arg Val Thr Ser Pro Thr His Pro Leu Ser Gln Met Asn His
145
150
155
160


Pro Pro Leu
Pro Asp Pro Leu Gly Arg Pro Asp Glu Asp Ser Ser Ser

165
170
175


Ser Ser Ser
Ser Ser Cys Ser Ser Ala Ser Asp Ser Glu Ser Glu Ser

180
185
190


Glu Glu Met
Lys Cys Ser Ser Gly Gly Gly Ala Ser Val Thr Ser Ser

195
200
205


His His
Gly Arg Gly Gly Phe Gly Gly Ala Ala Ser Ser Ser Leu Leu

210
215
220



Ser Cys
Gly His Gln Ser Ser Gly Gly Ala Ser Thr Gly Pro Arg Lys
225
230
235
240


Lys Lys
Ser Lys Arg Ile Ser Glu Leu Asp Asn Glu Lys Val Arg Asn

245
250
255


Ile Met
Lys Asp Lys Asn Thr Pro Phe Cys Thr Pro Asn Val Gln Thr

260
265
270


Arg Arg
Gly Arg Val Lys Ile Asp Glu Val Ser Arg Met Phe Arg Asn

275
280
285


Thr Asn
Arg Ser Leu Glu Tyr Lys Asn Leu Pro Phe Thr Ile Pro Ser

290
295
300



Met His
Gln Val Leu Asp Glu Ala Ile Lys Ala Cys Lys Thr Met Gln
305
310
315
320


Val Asn
Asn Lys Gly Ile Gln Ile Ile Tyr Thr Arg Asn His Glu Val

325
330
335


Lys Ser
Glu Val Asp Ala Val Arg Cys Arg Leu Gly Thr Met Cys Asn

340
345
350


Leu Ala
Leu Ser Thr Pro Phe Leu Met Glu Ala Thr Met Pro Val Thr

355
360
365


Ala Pro
Pro Glu Val Ala Gln Arg Thr Ala Asp Ala Cys Asn Glu Gly

370
375
380



Val Lys
Ala Ala Trp Ser Leu Lys Glu Leu His Thr His Gln Leu Cys
385
390
395
400


Pro Arg
Ser Ser Asp Tyr Arg Asn Met Ile Ile His Ala Ala Thr Pro

405
410
415


Val Asp Leu
Leu Gly Ala Leu Asn Leu Cys Leu Pro Leu Met Gln Lys

420
425
430


Phe Pro
Lys Gln Val Met Val Arg Ile Phe Ser Thr Asn Gln Gly Gly

435
440
445


Phe Met Leu
Pro Ile Tyr Glu Thr Ala Ala Lys Ala Tyr Ala Val Gly

450
455
460



Gln Phe Glu
Gln Pro Thr Glu Thr Pro Pro Glu Asp Leu Asp Thr Leu
465
470
475
480


Ser Leu Ala
Ile Glu Ala Ala Ile Gln Asp Leu Arg Asn Lys Ser Gln

485
490
495


<210>
25

<400>
25
000


<210>
26

<400>
26
000


<210>
27
<211>
1224
<212>
DNA
<213>
Artificial Sequence

<220>
<223>
Description of Artificial Sequence: Synthetic

polynucleotide IE1 VacO

<400>
27
atggtgaagc
aaatcaaggt cagagtggac atggtaagac acagaattaa
ggaacacatg 60

ttgaagaagt
atactcaaac agaggagaag ttcaccggtg ccttcaatat
gatgggtgga 120

tgtctacaga
acgctttgga tatcttagat aaggtacatg aaccattcga
agaaatgaag 180

tgcattggat
tgacaatgca atcaatgtat gagaactaca tagtgccaga
ggataagcgt 240

gaaatgtgga
tggcatgcat caaggagtta catgatgtat ccaaaggagc
agccaacaag 300

ctaggtggtg
ctttgcaagc gaaggcaaga gcgaagaagg atgaattgag
acgaaagatg 360

atgtacatgt
gctatcgaaa catcgaattc ttcactaaga actcagcgtt
tcctaagact 420

accaatggat
gcagtcaagc tatggctgcg cttcagaact tgcctcaatg
tagtcctgat 480

gaaatcatgg
catatgcaca gaagatcttc aagatcttag atgaggaaag
agacaaggta 540

ttgactcata
tcgatcacat attcatggat atactaacaa catgtgtaga
aacgatgtgt 600

aacgagtaca
aggtaacttc ggacgcttgt atgatgacta tgtacggagg
aatatctcta 660

cttagtgagt
tctgtcgagt tctatgctgt tacgtattag aagaaactag
tgtaatgtta 720

gcgaagagac
cattgatcac taagcctgaa gtgatctcgg ttatgaagag
acgaatagag 780

gagatctgta
tgaaggtgtt cgcacaatac atcttaggag ctgatcctct
aagagtgtgt 840

agtccatcgg
tagacgattt gagagctata gcggaggaat ctgacgagga
agaggcaata 900

gttgcataca
cacttgctac agctggagta tccagttctg attctcttgt
aagtcctccg 960

gagtcacctg
tgccagcaac cataccgttg agtagtgtga ttgtggctga gaactcggat
1020

caggaagagt
ctgagcaatc cgatgaagaa gaggaggaag gagcacaaga ggagagagaa
1080

gatactgtct
ctgtgaagag tgaacctgta tctgaaatcg aggaagtagc acctgaggaa
1140

gaggaggatg
gagccgaaga accaacagct tcgggtggta agtcaactca tccgatggta
1200

accagatcta
aggcagacca
gtaa
1224


<210>
28
<211>
1194
<212>
DNA
<213>
Artificial Sequence

<220>
<223>
Description of Artificial Sequence: Synthetic

polynucleotide IE1

<400>
28
atggtgcggc
atagaatcaa ggagcacatg ctgaaaaaat atacccagac
ggaagagaaa 60

ttcactggcg
cctttaatat gatgggagga tgtttgcaga atgccttaga
tatcttagat 120

aaggttcatg
agcctttcga ggagatgaag tgtattgggc taactatgca gagcatgtat
180

gagaactaca
ttgtacctga ggataagcgg gagatgtgga tggcttgtat
taaggagctg 240

catgatgtga
gcaagggcgc cgctaacaag ttggggggtg cactgcaggc
taaggcccgt 300

gctaaaaagg
atgaacttag gagaaagatg atgtatatgt gctacaggaa
tatagagttc 360

tttaccaaga
actcagcctt ccctaagacc accaatggct gcagtcaggc
catggcggca 420

ctgcagaact
tgcctcagtg ctcccctgat gagattatgg cttatgccca
gaaaatattt 480

aagattttgg
atgaggagag agacaaggtg ctcacgcaca ttgatcacat
atttatggat 540

atcctcacta
catgtgtgga aacaatgtgt aatgagtaca aggtcactag
tgacgcttgt 600

atgatgacca
tgtacggggg catctctctc ttaagtgagt tctgtcgggt
gctgtgctgc 660

tatgtcttag
aggagactag tgtgatgctg gccaagcggc ctctgataac
caagcctgag 720

gttatcagtg
taatgaagcg ccgcattgag gagatctgca tgaaggtctt tgcccagtac 780

attctggggg
ccgatcctct gagagtctgc tctcctagtg tggatgacct
acgggccatc 840

gccgaggagt
cagatgagga agaggctatt gtagcctaca ctttggccac
cgctggtgtc 900

agctcctctg
attctctggt gtcaccccca gagtcccctg tacccgcgac
tatccctctg 960

tcctcagtaa
ttgtggctga gaacagtgat caggaagaaa gtgagcagag tgatgaggaa
1020

gaggaggagg
gtgctcagga ggagcgggag gacactgtgt ctgtcaagtc tgagccagtg
1080

tctgagatag
aggaagttgc cccagaggaa gaggaggatg gtgctgagga acccaccgcc
1140

tctggaggca
agagcaccca ccctatggtg actagaagca aggctgacca
gtaa 1194


<210>
29
<211>
1224
<212>
DNA
<213>
Artificial Sequence

<220>
<223>
Description of Artificial Sequence: Synthetic

polynucleotide IE1-4nt

<400>
29
atggtcaaac
agattaaggt tcgagtggac atggtgcggc atagaatcaa
ggagcacatg 60

ctgaagaagt
atacccagac ggaagagaaa ttcactggcg cctttaatat
gatgggagga 120

tgtttgcaga
atgccttaga tatcttagat aaggttcatg agcctttcga
ggagatgaag 180

tgtattgggc
taactatgca gagcatgtat gagaactaca ttgtacctga
ggataagcgg 240

gagatgtgga
tggcttgtat taaggagctg catgatgtga gcaagggcgc
cgctaacaag 300

ttaggaggtg
cactgcaggc taaggcccgt gctaagaagg atgaacttag
gagaaagatg 360

atgtatatgt
gctacaggaa tatagagttc tttaccaaga actcagcctt
ccctaagacc 420

accaatggct
gcagtcaggc catggcggca ctgcagaact tgcctcagtg
ctctcctgat 480

gagattatgg
cttatgccca gaagatattt aagatcttgg atgaggagag
agacaaggtg 540

ctcacgcaca
ttgatcacat atttatggat atcctcacta catgtgtgga
aacaatgtgt 600

aatgagtaca
aggtcactag tgacgcttgt atgatgacca tgtacggagg
catctctctc 660

ttaagtgagt
tctgtcgggt gctgtgctgc tatgtcttag aggagactag
tgtgatgctg 720

gccaagcggc
ctctgataac caagcctgag gttatcagtg taatgaagcg
ccgcattgag 780

gagatctgca
tgaaggtctt tgcccagtac attctaggtg ccgatcctct
gagagtctgc 840

tctcctagtg
tggatgacct acgggccatc gccgaggagt cagatgagga
agaggctatt 900

gtagcctaca
ctttggccac cgctggtgtc agctcctctg attctctggt
gtcacctcca 960

gagtcacctg
tacccgcgac tatccctctg tcctcagtaa ttgtggctga gaacagtgat
1020

caggaagaaa
gtgagcagag tgatgaggaa gaggaggagg gtgctcagga ggagcgggag
1080

gacactgtgt
ctgtcaagtc tgagccagtg tctgagatag aggaagttgc tccagaggaa
1140

gaggaggatg
gtgctgagga acccaccgcc tctggaggca agagcaccca ccctatggtg
1200

actagaagca
aggctgacca
gtaa
1224
図面の簡単な説明
図１は、再導出されたトリプレックスの発達を描写する概略図を示す。ｐｐ６５を発現するＭＶＡ ＢＡＣは、Ｔｒｉｐｌｅｘについての他のＨＣＭＶ抗原の添加の基礎として使用される。ＢＡＣテクノロジーとアンパッサン(en passant)変異誘発を利用して、目的のＴｒｉｐｌｅｘ抗原を発現する遺伝子をＭＶＡに順次組み込む。すべての目的の抗原が存在し、最終コンストラクトの安定性を分析した後、ＢＡＣをＭＶＡから削除する。黒い実線の矢印は最終的な再誘導Ｔｒｉｐｌｅｘコンストラクトを示す。；灰色の矢印は中間ステップを示す。最終的な潜在的トリプレックス候補の３つの例がある。： Ｉ） ＭＶＡのさまざまなサイトにあるＩＥ２、ＩＥ１、及びｐｐ６５； ＩＩ） ０４４Ｌ／０４５ＬにおけるＩＥｆｕｓｉｏｎ；及び Ｉｌｌ） ＩＧＲ３におけるＩＥｆｕｓｉｏｎ。３つのコンストラクトの例はすべて、Ｄｅｌ３にｐｐ６５がある。； （＊）は、サイトに挿入された遺伝子のバリアントを示す。 図２Ａ−２Ｃは、改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）ウイルスのトリプレックス遺伝子構成とニワトリ胚性線維芽細胞（ＣＥＦ）の継代後の安定性を示す。図２Ａは、ＴｒｉｐｌｅｘでのＩＥｆｕｓｉｏｎの元の構造の簡略図を示す。ＩＥ１とＩＥ２についてのＨＣＭＶＡＤ１６９エクソン４と５は、それぞれ、シームレスな接合のためにＡｐａｌサイトで設計されており、ＩＥｆｕｓｉｏｎをもたらした。ＩＥｆｕｓｉｏｎは、ｍＨ５プロモーターによって制御されるＭＶＡのＤｅｌ２サイトに挿入された。ＭＶＡ Ｄｅｌ３サイトにはｐｐ６５があり、これもｍＨ５プロモーターによって制御される。図２Ｂは、ＣＥＦでさらに７回（Ｐ６−Ｐ１２）継代された臨床トリプレックスのウエスタンブロット分析を示している。「ＣＥＦ」とラベル付けされたレーンは感染しておらず、ネガティブコントロールである。；「ＭＶＡ」とラベル付けされたレーンは、ＣＭＶ抗原を発現しない野生型ＭＶＡである。；「Ｔｒｉｐｌｅｘ」とラベル付けされたレーンは、Ｐ５でＴｒｉｐｌｅｘの臨床ロットを生成するために使用されるウイルスである。ＩＥｆｕｓｉｏｎは、精製された抗ＩＥ１マウスモノクローナル抗体（ｍＡＢ）ｐ６３−２７を使用してプローブされた［１１］。；ｐｐ６５は、精製されたマウスｍＡＢ２８−１０３を使用してプローブされた［４］。感染／ローディングコントロールとして、ＢＲ５抗体を使用してエンベロープＭＶＡ糖タンパク質をプローブした。図２Ｃは、Ｐ６−Ｐ１２からのＤｅｌ２におけるＩＥｆｕｓｉｏｎのＰＣＲ増幅を視覚化した１％アガロースゲルを示す。ここで、プライマーはＤｅｌ２サイト内の遺伝子に隣接している。 図３Ａ〜３Ｄは、連続するシトシン及びグアニンへの変異を伴うＩＥｆｕｓｉｏｎコンストラクトの核酸配列アラインメントを示しており、それによってタンパク質発現の不安定性及び／又はワクシニアコドンの最適化を低減している。配列番号１〜３。 図４Ａ〜４Ｃは、ＭＶＡ−ＢＡＣ上のＩＧＲ３挿入部位におけるＩＥｆｕｓｉｏｎ ４ｎｔの安定性分析を示す。図４Ａは、ＩＥｆｕｓｉｏｎ（４ｎｔ）のＩＧＲ３サイトへの挿入を表す概略図を示す（矢印で示されている）。評価されたすべてのＭＶＡＢＡＣ挿入部位、Ｇ１Ｌ／Ｉ８Ｒ、０４４Ｌ／０４５Ｌ、及びＩＧＲ３、は矢印で示されている。図４Ｂは、ＩＧＲ３でＩＥｆｕｓｉｏｎ（４ｎｔ）の安定性を分析し、ニワトリ胚性線維芽細胞（ＣＥＦ）で最大１０回（Ｐ１−Ｐ１０）継代したＰＣＲ産物の１％アガロースゲルを示している。図４Ｃは、ＣＥＦ細胞でＰ１０まで継代されたＩＥｆｕｓｉｏｎ（４ｎｔ）のウエスタンブロット分析を示している。ＩＥｆｕｓｉｏｎは、精製された抗ＩＥ１マウスモノクローナル抗体（ｍＡＢ）ｐ６３−２７を使用してプローブされた［１１］。；ｐｐ６５は、精製されたマウスｍＡＢ２８−１０３を使用してプローブされた［４］。感染／ローディングコントロールとして、ＢＲ５抗体を使用してエンベロープＭＶＡ糖タンパク質をプローブした。図４Ｂ及び４Ｃの場合、「ＣＥＦ」とラベル付けされたレーンは感染しておらず、ネガティブコントロールである。；「ＭＶＡ」とラベル付けされたレーンは、いずれの抗原を発現しない野生型ＭＶＡである。；「Ｔｒｉｐｌｅｘ」というラベルの付いたレーンは、臨床ロットのＴｒｉｐｌｅｘを生成するために使用されるウイルス（Ｐ６で）である。 図５は、ＭＶＡ−ＢＡＣ上の潜在的なサイトと、ＩＥ１及びＩＥ２へのＩＥｆｕｓｉｏｎの分解の概略図である。ＩＥ１又はＩＥ２遺伝子の挿入に利用できるＭＶＡ ＢＡＣの潜在的な部位は、０４４Ｌ／０４５Ｌ、ＩＧＲ３、及びＧ１Ｌ／Ｉ８Ｒである。ＩＥ１とＩＥ２が分離されると、各遺伝子はｍＨ５プロモーターによって制御される。 図６Ａ〜６Ｅは、ＩＥ２タンパク質変異体（６Ａ〜６Ｃ）を発現する構築物の核酸配列アラインメント（配列番号７〜９及び２６）及びＩＥ１タンパク質変異体（６Ｄ−６Ｅ）を発現するコンストラクトの核酸配列アラインメントを示す。配列番号２７−２９。 図７Ａ〜７Ｃは、ＭＶＡの０４４Ｌ／０４５Ｌ挿入部位におけるＩＥ２の安定性分析を示す。図７Ａは、０４４Ｌ／０４５Ｌ部位へのＩＥ２の挿入を表す概略図を示す（矢印で示される）。図７Ｂは、ニワトリ胚性線維芽細胞（ＣＥＦ）で最大１０回継代（Ｐ１−Ｐ１０）された０４４Ｌ／０４５ＬでのＩＥ２の安定性を分析するＰＣＲ産物の１％アガロースゲルを示す。図７Ｃは、ＣＥＦ細胞でＰ１０まで継代されたＩＥ２のウエスタンブロット分析を示す。ＩＥ２は、抗ｌＥ２マウスモノクローナル抗体（ｍＡＢ）２．９．５を使用してプローブされた［１１］。；ｐｐ６５は、精製されたマウスｍＡＢ２８−１０３を使用してプローブされた［４］。感染／ローディングコントロールとして、ＢＲ５抗体を使用してエンベロープＭＶＡ糖タンパク質をプローブした。図７Ｂ及び７Ｃの場合、「ＣＥＦ」とラベル付けされたレーンは感染しておらず、ネガティブコントロールである。；「ＭＶＡ」とラベル付けされたレーンは、いずれの抗原を発現しない野生型ＭＶＡである。；「Ｔｒｉｐｌｅｘ」とラベル付けされたレーンは、Ｐ６でＴｒｉｐｌｅｘの臨床ロットを生成するために使用されるウイルスである。 図８Ａ−８Ｃは、ＭＶＡ上の０４４Ｌ／０４５Ｌ挿入部位におけるＩＥ２ Ｈ３６３Ａ変異体の安定性分析を示す。図８Ａは、ＩＥ２の概略図を示しており、特定の必須モジュレーター（ＳＥＭ、対応する矢印で濃い灰色）及びコア（対応する矢印で薄い陰影）内の位置３６３及び３６９（Ｈ３６３及びＨ３６９）にある２つのヒスチジン残基の位置を示している。ＩＥ２アミノ酸配列内で、推定約４０ｋＤａの産物を転写するための内部ＴＡＴＡボックスがラベル付けされる［１８］。このアミノ酸注釈は、核局在化シグナル又はシグナルペプチドを欠くＩＥ２に対応するアミノ酸番号と一致している。図８Ｂは、ニワトリ胚性線維芽細胞（ＣＥＦ）で最大１０回継代（Ｐ１−Ｐ１０）された０４４Ｌ／０４５ＬでのＩＥ２ Ｈ３６３Ａの安定性を分析するＰＣＲ産物の１％アガロースゲルを示す。図８Ｃは、ＣＥＦ細胞でＰ１０まで継代されたＩＥ２ Ｈ３６３Ａのウエスタンブロット分析を示す。ＩＥ２ Ｈ３６３Ａは、抗ｌＥ２マウスモノクローナル抗体（ｍＡＢ）２．９．５を使用してプローブされた［１１］。感染／ローディングコントロールとして、ＢＲ５抗体を使用してエンベロープＭＶＡ糖タンパク質をプローブした。図８Ｂ及び８Ｃの場合、「ＣＥＦ」とラベル付けされたレーンは感染しておらず、ネガティブコントロールである。「ＭＶＡ」とラベル付けされたレーンは、いずれの抗原を発現しない野生型ＭＶＡである。；「ＩＥ２（０４４Ｌ／０４５Ｌ）」とラベル付けされたレーンは、非コドン最適化ＩＥ２を発現することが以前に示されたウイルスである（図７Ｃ）。 図９Ａ〜９Ｃは、ＭＶＡ−ＢＡＣのＧ１Ｌ／Ｉ８Ｒ挿入部位におけるＩＥ１ ＮＣＯ、４ｎｔ、及びＶａｃＯの安定性分析を示す。ＩＥ１ ＮＣＯ（９Ａ）、４ｎｔ（９Ｂ）、及びＶａｃＯ（９Ｃ）のＰＣＲ（左）及びウエスタンブロット分析（右）。左： ＣＥＦでＰ１０まで継代されたＧ１Ｌ ／ Ｉ８ＲでのＩＥ１の安定性を分析するＰＣＲ産物の１．０％アガロースゲル。右： ＣＥＦ細胞でＰ１０まで継代されたＩＥ１のウエスタンブロット分析。ＩＥ１及びＩＥｆｕｓｉｏｎは、精製された抗ｌＥ１マウスモノクローナル抗体（ｍＡＢ）ｐ６３−２７を使用してプローブされた。感染／ローディングコントロール（下部）として、ＢＲ５抗体を使用してエンベロープＭＶＡ糖タンパク質をプローブした。「ＣＥＦ」は感染していない、ネガティブコントロールである。；「ＭＶＡ」とラベル付けされたレーンは、いずれの抗原を発現しない野生型ＭＶＡである。；（＋）とラベル付けされたレーンは、トリプレックスの臨床ロットを生成するために使用されるウイルスである。 図１０Ａ−１０Ｂは、ＭＶＡ−ＢＡＣのＩＧＲ３挿入部位におけるＩＥ１４ｎｔとＶａｃＯの安定性分析を示す。ＩＥ１ ４ｎｔ（１０Ａ）及びＶａｃＯ（１０Ｂ）のＰＣＲ（左）及びウエスタンブロット分析（右）。左： ＣＥＦでＰ１０まで継代された、ＩＥ１ ＩＧＲ３の安定性を分析するＰＣＲ産物の１．０％アガロースゲル。右： ＣＥＦ細胞でＰ１０まで継代されたＩＥ１のウエスタンブロット分析。ＩＥ１及びＩＥｆｕｓｉｏｎは、精製された抗ｌＥ１マウスモノクローナル抗体（ｍＡＢ）ｐ６３−２７を使用してプローブされた。感染／ローディングコントロール（下部）として、ＢＲ５抗体を使用してエンベロープＭＶＡ糖タンパク質をプローブした。「ＣＥＦ」は感染していない、ネガティブコントロールである。；「ＭＶＡ」とラベル付けされたレーンは、いずれの抗原を発現しない野生型ＭＶＡである。；（＋）とラベル付けされたレーンは、トリプレックスの臨床ロットを生成するために使用されるウイルスである。 図１１Ａ−１１Ｂは、ＭＶＡ−ＢＡＣのＧ１Ｌ／Ｉ８Ｒ挿入部位におけるＩＥ２ ＮＣＯ及び４ｎｔの安定性分析を示す。ＩＥ２ ＮＣＯ（１１Ａ）及び４ｎｔ（１１Ｂ）のＰＣＲ（左）及びウエスタンブロット分析（右）。左： ＣＥＦでＰ１０まで継代された、ＩＥ２ Ｇ１Ｌ／Ｉ８Ｒの安定性を分析するＰＣＲ産物の１．０％アガロースゲル。右： ＣＥＦ細胞で１０回継代されたＩＥ２（Ｐ１−Ｐ１０）のウエスタンブロット分析。ＩＥ２は、ａｎｔｉ−ｌＥ２ ｍＡＢ２．９．５を使用してプローブされた。感染／ローディングコントロール（下）として、ＢＲ５抗体を使用してエンベロープＭＶＡ糖タンパク質をプローブした。「ＣＥＦ」は感染していない、ネガティブコントロールである。；「ＭＶＡ」とラベル付けされたレーンは、いずれの抗原を発現しない野生型ＭＶＡである。；（＋）とラベル付けされたレーンは、トリプレックスの臨床ロットを生成するために使用されるウイルスである。 図１２は、ＭＶＡ−ＢＡＣのＩＧＲ３挿入部位におけるＩＥ２ ＶａｃＯの安定性分析を示す。ＩＥ２ ＶａｃＯのＰＣＲ（左）及びウエスタンブロット分析（右）。左： ＣＥＦでＰ１０まで継代された、ＩＥ２ ＩＧＲ３の安定性を分析するＰＣＲ産物の１．０％アガロースゲル。右： ＣＥＦ細胞でＰ１０まで継代されたＩＥ２のウエスタンブロット分析。ＩＥ２は、ａｎｔｉ−ｌＥ２ ｍＡＢ２．９．５を使用してプローブされた。感染／ローディングコントロール（下部）として、ＢＲ５抗体を使用してエンベロープＭＶＡ糖タンパク質をプローブした。「ＣＥＦ」は感染していない、ネガティブコントロールである。；「ＭＶＡ」とラベル付けされたレーンは、いずれの抗原を発現しない野生型ＭＶＡである。；（＋）とラベル付けされたレーンは、トリプレックスの臨床ロットを生成するために使用されるウイルスである。 図１３Ａ〜１３Ｂは、ＭＶＡ−ＢＡＣ上の０４４／０４５Ｌ挿入部位におけるＩＥ２Ｈ３６３Ａ ＮＣＯ及び４ｎｔの安定性分析を示す。ＩＥ２ ＮＣＯ（１３Ａ）及び４ｎｔ（１３Ｂ）のＰＣＲ（左）及びウエスタンブロット分析（右）。左： ＣＥＦでＰ１０まで継代された、０４４／０４５ＬでＩＥ２変異体の安定性を分析するＰＣＲ産物の１．０％アガロースゲル。右： ＣＥＦ細胞でＰ１０まで継代されたＩＥ２変異体のウエスタンブロット分析。ＩＥ２は、ａｎｔｉ−ｌＥ２ ｍＡＢ２．９．５を使用してプローブされた。感染／ローディングコントロール（下部）として、ＢＲ５抗体を使用してエンベロープＭＶＡ糖タンパク質をプローブした。「ＣＥＦ」は感染していない、ネガティブコントロールである。；「ＭＶＡ」とラベル付けされたレーンは、いずれの抗原を発現しない野生型ＭＶＡである。；（＋）とラベル付けされたレーンは、トリプレックスの臨床ロットを生成するために使用されるウイルスである。 図１４Ａ〜１４Ｃは、ＭＶＡ−ＢＡＣ上の０４４／０４５Ｌ挿入部位におけるＩＥ２Ｈ３６９Ａ ＮＣＯ、４ｎｔ、及びＶａｃＯの安定性分析を示す。ＩＥ２ ＮＣＯ（１４Ａ）、４ｎｔ（１４Ｂ）、及びＶａｃＯ（１４Ｃ）のＰＣＲ（左）及びウエスタンブロット分析（右）。左： ＣＥＦでＰ１０まで継代された、０４４／０４５ＬでＩＥ２変異体の安定性を分析するＰＣＲ産物の１．０％アガロースゲル。右： ＣＥＦ細胞でＰ１０まで継代されたＩＥ２変異体のウエスタンブロット分析。ＩＥ２は、ａｎｔｉ−ｌＥ２ ｍＡＢ２．９．５を使用してプローブされた。感染／ローディングコントロール（下部）として、ＢＲ５抗体を使用してエンベロープＭＶＡ糖タンパク質をプローブした。「ＣＥＦ」は感染していない、ネガティブコントロールである。；「ＭＶＡ」とラベル付けされたレーンは、いずれの抗原を発現しない野生型ＭＶＡである。；（＋）とラベル付けされたレーンは、トリプレックスの臨床ロットを生成するために使用されるウイルスである。 図１５Ａ−１５Ｃは、ＭＶＡ−ＢＡＣの０４４／０４５Ｌ挿入部位におけるＩＥ２Ｈ３６３／３６９Ａ ＮＣＯ、４ｎｔ、及びＶａｃＯの安定性分析を示す。ＩＥ２ ＮＣＯ（１５Ａ）、４ｎｔ（１５Ｂ）、及びＶａｃＯ（１５Ｃ）のＰＣＲ（左）及びウエスタンブロット分析（右）。左： ＣＥＦでＰ１０まで継代された、０４４／０４５ＬでＩＥ２変異体の安定性を分析するＰＣＲ産物の１．０％アガロースゲル。右： ＣＥＦ細胞でＰ１０まで継代されたＩＥ２変異体のウエスタンブロット分析。ＩＥ２は、ａｎｔｉ−ｌＥ２ ｍＡＢ２．９．５を使用してプローブされた。感染／ローディングコントロール（下部）として、ＢＲ５抗体を使用してエンベロープＭＶＡ糖タンパク質をプローブした。「ＣＥＦ」は感染していない、ネガティブコントロールである。；「ＭＶＡ」とラベル付けされたレーンは、いずれの抗原を発現しない野生型ＭＶＡである。；（＋）とラベル付けされたレーンは、トリプレックスの臨床ロットを生成するために使用されるウイルスである。 図１６Ａ−１６Ｃは、ＭＶＡ−ＢＡＣのＩＧＲ３挿入部位におけるＩＥｆｕｓｉｏｎ ４ｎｔ変異体の安定性分析を示す。ＩＥｆｕｓｉｏｎ ４ｎｔ Ｈ３６３Ａ（１６Ａ）、Ｈ３６９Ａ（１６Ｂ）、及びＨ３６３Ａ／Ｈ３６９Ａ（１６Ｃ）のＰＣＲ（左）及びウエスタンブロット分析（右）。左： ＣＥＦでＰ１０まで継代された、ＩＧＲ３のＩＥｆｕｓｉｏｎ変異体の安定性を分析するＰＣＲ製品の１．０％アガロースゲル。右： ＣＥＦ細胞でＰ１０まで継代されたＩＥｆｕｓｉｏｎ変異体のウエスタンブロット分析。ＩＥｆｕｓｉｏｎは、精製された抗ｌＥ１マウスモノクローナル抗体（ｍＡＢ）ｐ６３−２７を使用してプローブされた。感染／ローディングコントロール（下部）として、ＢＲ５抗体を使用してエンベロープＭＶＡ糖タンパク質をプローブした。「ＣＥＦ」は感染していない、ネガティブコントロールである。；「ＭＶＡ」とラベル付けされたレーンは、いずれの抗原を発現しない野生型ＭＶＡである。；（＋）とラベル付けされたレーンは、トリプレックスの臨床ロットを生成するために使用されるウイルスである。 図１７は、コンストラクトＡ（ｉ）の安定性分析を示す。ＩＥ１、ＩＥ２、及びｐｐ６５のＰＣＲ（左）及びウエスタンブロット分析（右）。左： ＣＥＦでＰ１０まで継代された、ＩＧＲ３のＩＥ１、０４４／０４５ＬのＩＥ２、及びＤｅｌ３のｐｐ６５の安定性を分析するＰＣＲ産物の１．０％アガロースゲル。右： ＣＥＦ細胞でＰ１０まで継代されたＩＥｆｕｓｉｏｎ及びｐｐ６５のウエスタンブロット分析。ＩＥ１は、精製された抗ｌＥ１マウスモノクローナル抗体（ｍＡＢ）ｐ６３−２７を使用してプローブされた。；ＩＥ２は、抗ｌＥ２ ｍＡＢ２．９．５を使用してプローブされた。；ｐｐ６５は、精製されたマウスｍＡＢ２８−１０３を使用してプローブされた。感染／ローディングコントロール（下部）として、ＢＲ５抗体を使用してエンベロープＭＶＡ糖タンパク質をプローブした。「ＣＥＦ」は感染していない、ネガティブコントロールである。；「ＭＶＡ」とラベル付けされたレーンは、いずれの抗原を発現しない野生型ＭＶＡである。；（＋）とラベル付けされたレーンは、トリプレックスの臨床ロットを生成するために使用されるウイルスである。 図１８は、コンストラクトＡ（ｖ）の安定性分析を示す。ＩＥ１、ＩＥ２、及びｐｐ６５のＰＣＲ（左）及びウエスタンブロット分析（右）。左： ＣＥＦでＰ１０まで継代された、ＩＧＲ３のＩＥ１、０４４／０４５ＬのＩＥ２、及びＤｅｌ３のｐｐ６５の安定性を分析するＰＣＲ産物の１．０％アガロースゲル。右： ＣＥＦ細胞でＰ１０まで継代されたＩＥｆｕｓｉｏｎ及びｐｐ６５のウエスタンブロット分析。ＩＥ１は、精製された抗ｌＥ１マウスモノクローナル抗体（ｍＡＢ）ｐ６３−２を使用してプローブされた。；ＩＥ２は、抗ｌＥ２ ｍＡＢ２．９．５を使用してプローブされた。；ｐｐ６５は、精製されたマウスｍＡＢ２８−１０３を使用してプローブされた。感染／ローディングコントロール（下部）として、ＢＲ５抗体を使用してエンベロープＭＶＡ糖タンパク質をプローブした。「ＣＥＦ」は感染していない、ネガティブコントロールである。；「ＭＶＡ」とラベル付けされたレーンは、いずれの抗原を発現しない野生型ＭＶＡである。；（＋）とラベル付けされたレーンは、トリプレックスの臨床ロットを生成するために使用されるウイルスである。 図１９は、コンストラクトＡ（ｖｉ）の安定性分析を示す。ＩＥ１、ＩＥ２、及びｐｐ６５のＰＣＲ（左）及びウエスタンブロット分析（右）。左： ＣＥＦでＰ１０まで継代された、ＩＧＲ３のＩＥ１、０４４／０４５ＬのＩＥ２、及びＤｅｌ３のｐｐ６５の安定性を分析するＰＣＲ産物の１．０％アガロースゲル。右： ＣＥＦ細胞でＰ１０まで継代されたＩＥｆｕｓｉｏｎ及びｐｐ６５のウエスタンブロット分析。ＩＥ１は、精製された抗ｌＥ１マウスモノクローナル抗体（ｍＡＢ）ｐ６３−２７を使用してプローブされた。；ＩＥ２は、抗ｌＥ２ ｍＡＢ２．９．５を使用してプローブされた。ｐｐ６５は、精製されたマウスｍＡＢ２８−１０３を使用してプローブされた。感染／ローディングコントロール（下部）として、ＢＲ５抗体を使用してエンベロープＭＶＡ糖タンパク質をプローブした。「ＣＥＦ」は感染していない、ネガティブコントロールである。；「ＭＶＡ」とラベル付けされたレーンは、いずれ抗原を発現しない野生型ＭＶＡである。；（＋）とラベル付けされたレーンは、トリプレックスの臨床ロットを生成するために使用されるウイルスである。 図２０は、コンストラクトＢ（ｉ）の安定性分析を示す。ＩＥ１、ＩＥ２、及びｐｐ６５のＰＣＲ（左）及びウエスタンブロット分析（右）。左： ＣＥＦでＰ１０まで継代された、ＩＧＲ３のＩＥ１、０４４／０４５ＬのＩＥ２、及びＤｅｌ３のｐｐ６５の安定性を分析するＰＣＲ産物の１．０％アガロースゲル。右： ＣＥＦ細胞でＰ１０まで継代されたＩＥｆｕｓｉｏｎ及びｐｐ６５のウエスタンブロット分析。ＩＥ１は、精製された抗ｌＥ１マウスモノクローナル抗体（ｍＡＢ）ｐ６３−２７を使用してプローブされた。；ＩＥ２は、抗ｌＥ２ ｍＡＢ２．９．５を使用してプローブされた。；ｐｐ６５は、精製されたマウスｍＡＢ２８−１０３を使用してプローブされた。この図では（＋）は機能しなかったため、α−ｐｐ６５又はα−ｌＥ１ウエスタンブロットではバンドは観察されなかった。感染／ローディングコントロール（下部）として、ＢＲ５抗体を使用してエンベロープＭＶＡ糖タンパク質をプローブした。「ＣＥＦ」は感染していない、ネガティブコントロールである。；「ＭＶＡ」とラベル付けされたレーンは、いずれの抗原を発現しない野生型ＭＶＡである。；（＋）とラベル付けされたレーンは、トリプレックスの臨床ロットを生成するために使用されるウイルスである。 図２１は、コンストラクトＢ（ｉｉ）の安定性分析を示す。ＩＥ１、ＩＥ２、及びｐｐ６５のＰＣＲ（左）及びウエスタンブロット分析（右）。左： ＣＥＦでＰ１０まで継代された、ＩＧＲ３のＩＥ１、０４４／０４５ＬのＩＥ２、及びＤｅｌ３のｐｐ６５の安定性を分析するＰＣＲ産物の１．０％アガロースゲル。右： ＣＥＦ細胞でＰ１０まで継代されたＩＥｆｕｓｉｏｎ及びｐｐ６５のウエスタンブロット分析。ＩＥ１は、精製された抗ｌＥ１マウスモノクローナル抗体（ｍＡＢ）ｐ６３−２７を使用してプローブされた。；ＩＥ２は、抗ｌＥ２ ｍＡＢ２．９．５を使用してプローブされた。；ｐｐ６５は、精製されたマウスｍＡＢ２８−１０３を使用してプローブされた。感染／ローディングコントロール（下）として、ＢＲ５抗体を使用してエンベロープＭＶＡ糖タンパク質をプローブした。「ＣＥＦ」は感染していない、ネガティブコントロールである。；「ＭＶＡ」とラベル付けされたレーンは、いずれの抗原を発現しない野生型ＭＶＡである。；（＋）とラベル付けされたレーンは、トリプレックスの臨床ロットを生成するために使用されるウイルスである。（＊）Ｐ１ ＰＣＲの場合、レーンが欠落していることを示す。 図２２は、コンストラクトＢ（ｉｉｉ）の安定性分析を示す。ＩＥ１、ＩＥ２、及びｐｐ６５のＰＣＲ（左）及びウエスタンブロット分析（右）。左： ＣＥＦでＰ１０まで継代された、ＩＧＲ３のＩＥ１、０４４／０４５ＬのＩＥ２、及びＤｅｌ３のｐｐ６５の安定性を分析するＰＣＲ産物の１．０％アガロースゲル。右： ＣＥＦ細胞でＰ１０まで継代されたＩＥｆｕｓｉｏｎ及びｐｐ６５のウエスタンブロット分析。ＩＥ１は、精製された抗ｌＥ１マウスモノクローナル抗体（ｍＡＢ）ｐ６３−２７を使用してプローブされた。；ＩＥ２は、抗ｌＥ２ ｍＡＢ２．９．５を使用してプローブされた。；ｐｐ６５は、精製されたマウスｍＡＢ２８−１０３を使用してプローブされた。感染／ローディングコントロール（下部）として、ＢＲ５抗体を使用してエンベロープＭＶＡ糖タンパク質をプローブした。「ＣＥＦ」は感染していない、ネガティブコントロールである。；「ＭＶＡ」とラベル付けされたレーンは、いずれの抗原を発現しない野生型ＭＶＡである。；（＋）とラベル付けされたレーンは、トリプレックスの臨床ロットを生成するために使用されるウイルスである。分子量に基づくタンパク質同定を明確にするために、ＩＥｆｕｓｉｏｎとＩＥ１は矢印で示されている。 図２３は、コンストラクトＢ（ｖ）の安定性分析を示す。ＩＥ１、ＩＥ２、及びｐｐ６５のＰＣＲ（左）及びウエスタンブロット分析（右）。左： ＣＥＦでＰ１０まで継代された、ＩＧＲ３のＩＥ１、０４４／０４５ＬのＩＥ２、及びＤｅｌ３のｐｐ６５の安定性を分析するＰＣＲ産物の１．０％アガロースゲル。右： ＣＥＦ細胞でＰ１０まで継代されたＩＥｆｕｓｉｏｎ及びｐｐ６５のウエスタンブロット分析。ＩＥ１は、精製された抗ｌＥ１マウスモノクローナル抗体（ｍＡＢ）ｐ６３−２７を使用してプローブされた。；ＩＥ２は、抗ｌＥ２ ｍＡＢ２．９．５を使用してプローブされた。；ｐｐ６５は、精製されたマウスｍＡＢ２８−１０３を使用してプローブされた。感染／ローディングコントロール（下部）として、ＢＲ５抗体を使用してエンベロープＭＶＡ糖タンパク質をプローブした。「ＣＥＦ」は感染していない、ネガティブコントロールである；「ＭＶＡ」とラベル付けされたレーンは、いずれの抗原を発現しない野生型ＭＶＡである；（＋）とラベル付けされたレーンは、トリプレックスの臨床ロットを生成するために使用されるウイルスである。 図２４は、コンストラクトＢ（ｖｉｉ）の安定性分析を示す。ＩＥ１、ＩＥ２、及びｐｐ６５のＰＣＲ（左）及びウエスタンブロット分析（右）。左： ＣＥＦでＰ１０まで継代された、ＩＧＲ３のＩＥ１、０４４／０４５ＬのＩＥ２、及びＤｅｌ３のｐｐ６５の安定性を分析するＰＣＲ産物の１．０％アガロースゲル。右： ＣＥＦ細胞でＰ１０まで継代されたＩＥｆｕｓｉｏｎ及びｐｐ６５のウエスタンブロット分析。ＩＥ１は、精製された抗ｌＥ１マウスモノクローナル抗体（ｍＡＢ）ｐ６３−２７を使用してプローブされた。；ＩＥ２は、抗ｌＥ２ ｍＡＢ２．９．５を使用してプローブされた。；ｐｐ６５は、精製されたマウスｍＡＢ２８−１０３を使用してプローブされた。感染／ローディングコントロール（下部）として、ＢＲ５抗体を使用してエンベロープＭＶＡ糖タンパク質をプローブした。「ＣＥＦ」は感染していない、ネガティブコントロールである；「ＭＶＡ」とラベル付けされたレーンは、いずれの抗原を発現しない野生型ＭＶＡである；（＋）とラベル付けされたレーンは、トリプレックスの臨床ロットを生成するために使用されるウイルスである。 図２５は、ＩＥｆｕｓｉｏｎ ４ｎｔ Ｈ３６３Ａ（ＩＧＲ３）：ｐｐ６５（Ｄｅｌ３）の安定性分析を示す。ＩＥｆｕｓｉｏｎ ４ｎｔ Ｈ３６３Ａ及びｐｐ６５のＰＣＲ（左）及びウエスタンブロット分析（右）。左： ＣＥＦでＰ１０まで継代された、ＩＧＲ３でのＩＥｆｕｓｉｏｎ及びＤｅｌ３でのｐｐ６５の安定性を分析するＰＣＲ産物の１．０％アガロースゲル。右： ＣＥＦ細胞でＰ１０まで継代されたＩＥｆｕｓｉｏｎ及びｐｐ６５のウエスタンブロット分析。ＩＥｆｕｓｉｏｎは、精製された抗ｌＥ１マウスモノクローナル抗体（ｍＡＢ）ｐ６３−２７を使用してプローブされた。；ｐｐ６５は、精製されたマウスｍＡＢ２８−１０３を使用してプローブされた。感染／ローディングコントロール（下部）として、ＢＲ５抗体を使用してエンベロープＭＶＡ糖タンパク質をプローブした。「ＣＥＦ」は感染していない、ネガティブコントロールである；「ＭＶＡ」とラベル付けされたレーンは、抗原を発現しない野生型ＭＶＡである；（＋）とラベル付けされたレーンは、トリプレックスの臨床ロットを生成するために使用されるウイルスである。 図２６は、ＩＥｆｕｓｉｏｎ ４ｎｔ Ｈ３６９Ａ（ＩＧＲ３）：ｐｐ６５（Ｄｅｌ３）の安定性分析を示す。ＩＥｆｕｓｉｏｎ ４ｎｔ Ｈ３６９Ａ及びｐｐ６５のＰＣＲ（左）及びウエスタンブロット分析（右）。左： ＣＥＦでＰ１０まで継代された、ＩＧＲ３でのＩＥｆｕｓｉｏｎ及びＤｅｌ３でのｐｐ６５の安定性を分析するＰＣＲ産物の１．０％アガロースゲル。右： ＣＥＦ細胞でＰ１０まで継代されたＩＥｆｕｓｉｏｎ及びｐｐ６５のウエスタンブロット分析。ＩＥｆｕｓｉｏｎは、精製された抗ｌＥ１マウスモノクローナル抗体（ｍＡＢ）ｐ６３−２７を使用してプローブされた。；ｐｐ６５は、精製されたマウスｍＡＢ２８−１０３を使用してプローブされた。感染／ローディングコントロール（下部）として、ＢＲ５抗体を使用してエンベロープＭＶＡ糖タンパク質をプローブした。「ＣＥＦ」は感染していない、ネガティブコントロールである；「ＭＶＡ」とラベル付けされたレーンは、いずれの抗原を発現していない野生型ＭＶＡである；（＋）とラベル付けされたレーンは、トリプレックスの臨床ロットを生成するために使用されるウイルスである。 図２７Ａ〜２７Ｂは、第２世代のトリプレックス免疫化後のＴ細胞応答及び刺激を示す。図２７Ａ： 第２世代トリプレックスによって誘発されたヒトＭＨＣ制限Ｔ細胞応答。表６のデータのグラフ表示。図２７Ｂ： 第２世代トリプレックスによるＨＬＡ−B＊０７０２−又はＨＬＡ−Ａ＊０２０１制限ＣＤ８＋ Ｔ細胞刺激。表７のデータのグラフ表示。エラーバーはＳＥＭで計算され、表６及び７に報告されている。 図２８Ａ−２８Ｂは、重複するＩＥ２遺伝子を発現するコンストラクトの安定性分析を示す。ＩＥ２及びＩＥ２変異体のＰＣＲ（上部）及びウエスタンブロット分析（下部）。図２８Ａ： ＣＥＦでＰ５まで継代された、Ｇ１ＬでのＩＥ２及び０４４／０４５ＬでのＩＥ２変異体の３つのバージョンの安定性を分析するＰＣＲ産物の１．０％アガロースゲル。図２８Ｂ： ＩＥ２及び３つの変異体のウエスタンブロット分析は、ＣＥＦ細胞でＰ５まで継代された。ＩＥ２は、ａｎｔｉ−ｌＥ２ ｍＡＢ２．９．５を使用してプローブされた。感染／ローディングコントロール（下部）として、ＢＲ５抗体を使用してエンベロープＭＶＡ糖タンパク質をプローブした。「ＣＥＦ」は感染していない、ネガティブコントロールである；「ＭＶＡ」とラベル付けされたレーンは、いずれの抗原を発現しない野生型ＭＶＡである；（＋）とラベル付けされたレーンは、トリプレックスの臨床ロットを生成するために使用されるウイルスである。

Claims (20)

  1. ２つ以上のＣＭＶ抗原又はその抗原性部分をコードする２つ以上の核酸配列が挿入された遺伝子改変組換えワクシニアアンカラ（ｒＭＶＡ）ベクターを含む、２つ以上のサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）抗原を共発現させるための発現システムであって、ここで、前記ＣＭＶ抗原又はその抗原性フラグメントは、ＩＥ１エクソン４（ＩＥ１／ｅ４）、ＩＥ２エクソン５（ＩＥ２／ｅ５）、ＩＥｆｕｓｉｏｎ、及びｐｐ６５を包含し、且つここで、前記２つ以上の核酸配列は、０４４Ｌ／０４５Ｌ、ＩＧＲ３、Ｇ１Ｌ／Ｉ８Ｒ、及びＤｅｌ３から選択される１つ以上の挿入部位に挿入される、発現系。
  2. 前記２つ以上の核酸配列が、単一のプロモーターに作動可能に連結され、且つ単一のプロモーターの制御下にある、請求項１に記載の発現系。
  3. 前記プロモーターがｍＨ５プロモーターである、請求項２に記載の発現系。
  4. 同じアミノ酸を発現しながら、連続するシトシン又はグアニンを除去するために１つ又は複数の核酸配列がコドン最適化されている、請求項１〜３のいずれか一項に記載の発現系。
  5. 前記ＣＭＶ抗原のアミノ酸配列が、ウイルス継代時の前記ｒＭＶＡの遺伝的安定性を改善するための１つ又は複数の突然変異を含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の発現系。
  6. ＩＥ１及びＩＥ２又はそれらの抗原性フラグメントがＩＥ融合タンパク質として発現される、請求項１から５のいずれか一項に記載の発現系。
  7. 前記ＣＭＶ抗原を発現する前記ｒＭＶＡが少なくとも１０継代にわたって遺伝的に安定である、請求項１から６のいずれか一項に記載の発現系。
  8. ２つ以上のＣＭＶ抗原又はその抗原部分をコードする２つ以上の核酸配列が挿入された、免疫学的に有効な量の組換え改変ワクシニアアンカラ（ｒＭＶＡ）ベクターを含むワクチン組成物であって、ここで、前記ＣＭＶ抗原又はその抗原性フラグメントには、ＩＥ１エクソン４（ＩＥ１／ｅ４）、ＩＥ２エクソン５（ＩＥ２／ｅ５）、ＩＥｆｕｓｉｏｎ、及びｐｐ６５を包含し、且つここで、前記２つ以上の核酸配列は、０４４Ｌ／０４５Ｌ、ＩＧＲ３、Ｇ１Ｌ／Ｉ８Ｒ、及びＤｅｌ３から選択される１つ以上の挿入部位に挿入される、ワクチン組成物。
  9. 前記２つ以上の核酸配列が、単一のプロモーターに作動可能に連結され、且つ単一のプロモーターの制御下にある、請求項８に記載のワクチン組成物。
  10. 前記プロモーターがｍＨ５プロモーターである、請求項９に記載のワクチン組成物。
  11. １つ又は複数の核酸配列が、同じアミノ酸を発現しながら連続するシトシン又はグアニンを除去するようにコドン最適化されている、請求項８から１０のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
  12. 前記ＣＭＶ抗原のアミノ酸配列が、ウイルス継代時の前記ｒＭＶＡの遺伝的安定性を改善するための１つ又は複数の突然変異を含む、請求項８から１１のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
  13. ＩＥ１及びＩＥ２又はそれらの抗原性フラグメントがＩＥ融合タンパク質として発現される、請求項８から１２のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
  14. 前記ＣＭＶ抗原を発現する前記ｒＭＶＡが少なくとも１０継代にわたって遺伝的に安定である、請求項８から１３のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
  15. 請求項８から１４のいずれか一項に記載のワクチンを、それを必要とする対象に投与することにより、対象において免疫応答を誘発又は改変する方法。
  16. 前記対象が哺乳動物である、請求項１５に記載の方法。
  17. 前記対象がヒトである、請求項１５に記載の方法。
  18. ２つ以上のＣＭＶ抗原又はその抗原性フラグメントを発現するｒＭＶＡの安定性を改善する方法であって、
    （１）前記ＣＭＶ抗原又はその抗原性断片をコードする１つ又は複数の核酸配列を、０４４Ｌ／０４５Ｌ、ＩＧＲ３、Ｇ１Ｌ／Ｉ８Ｒ、及びＤｅｌ３を包含する１つ又は複数の挿入部位に挿入すること；
    （２）前記ＣＭＶ抗原をコードする前記核酸配列をコドン最適化すること；及び
    （３）前記ＣＭＶ抗原の前記アミノ酸配列に１つ又は複数の変異を導入すること；
    からなる群から選択される１つ以上の改変を組み込むことによる方法。
  19. 前記ＣＭＶ抗原又はその抗原性フラグメントが、ＩＥ１エクソン４（ＩＥ１／ｅ４）、ＩＥ２エクソン５（ＩＥ２／ｅ５）、ＩＥfusion（例えば、ＩＥ１とＩＥ２又はＩＥ１／ｅ４とＩＥ２／ｅ５の融合）、及びｐｐ６５を包含する、請求項１８に記載の方法。
  20. 前記コドン最適化が、前記核酸配列から連続するシトシン又はグアニンを除去することを含む、請求項１８に記載の方法。

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