CN112512568A - 遗传修饰的重组痘苗安卡拉(rmva)疫苗改善的稳定性及其制备方法 - Google Patents

遗传修饰的重组痘苗安卡拉(rmva)疫苗改善的稳定性及其制备方法 Download PDF

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Abstract

一种疫苗组合物，包含免疫有效量的重组修饰的痘苗安卡拉(rMVA)病毒，所述病毒包含IE1，IE2，和pp65或其抗原性片段，至少10次传代后在遗传上稳定。一种通过包括以下一种或多种修饰来改善这种rMVA在传代时的稳定性的方法：(1)将编码CMV抗原或其抗原性片段的一个或多个核酸序列插入一个或多个插入位点，包括但不限于044L/045L，IGR3，G1L/I8R，和Del3，但不包括Del2；(2)通过去除连续的胞嘧啶或鸟嘌呤来对编码CMV抗原的核酸序列进行密码子优化；和(3)将一个或多个突变引入CMV抗原的氨基酸序列。

Description

遗传修饰的重组痘苗安卡拉(RMVA)疫苗改善的稳定性及其制 备方法
优先权声明
本申请要求于2018年5月11日提交的美国临时申请号62/670,656的优先权，其全部内容包括附图通过引用纳入本文。
政府权益声明
本发明在美国国立卫生研究院(NIH)国立癌症研究所授予的批准号CA077544的政府支持下完成。政府拥有本发明的某些权利。
背景
修饰的痘苗安卡拉(MVA)是遗传工程化的高度减毒的痘苗病毒株，其在大多数哺乳动物细胞中均不繁殖(propagate)。该特性最低限度地影响病毒或外源基因，因为MVA在哺乳动物细胞中繁殖的能力在后期的病毒装配中受阻。但是，DNA继续复制，并因此充当RNA生物合成的有效模板，导致高水平的蛋白质合成。MVA还具有大的外源基因容量和多个整合位点，这两个特征使其成为表达疫苗抗原的期望载体。MVA在生产异源蛋白质方面具有公认的安全记录和多功能性。实际上，已经开发了用于治疗传染病和癌症的基于MVA的疫苗，并已达到I/II期临床试验。
MVA具有很长的成功递送入啮齿动物，猕猴，和其他非人灵长类动物的历史，并且在最近作为癌症患者的临床疫苗。最初的MVA病毒在1970年代施用至欧洲的120,000名年轻人和老年人。MVA因为在鸡细胞中重复序列传代期间发生的25个突变和缺失中丢失了两个重要的宿主范围基因而无毒。
MVA作为个体中的CMV抗原的疫苗载体是具有吸引力的，所述个体同时具有严重的免疫抑制并经受额外的并发症，如恶性肿瘤或器官衰竭，从而需要移植。CMV感染是移植手术(procedure)中的重要并发症，影响多种类的个体，包括新生儿和具有进展的疾病的HIV患者。人巨细胞病毒(HCMV)是实体器官和造血干细胞移植受体的主要风险因素。之前被CMV感染的或接受CMV感染的实体器官或干细胞同种异体移植(allograft)的个体是针对该病毒的细胞库的疫苗策略的候选者。
据报道，rMVA疫苗的外源抗原的体外表达水平与rMVA疫苗的免疫原性(immunogenicity)相关联。但是，在连续传代后，外源抗原的表达可能会降低，这可导致免疫原性的降低。因此，尽管MVA是用于重组疫苗开发的有吸引力的病毒载体，但是在连续传代后具有遗传不稳定性和降低的免疫原性的重大担忧。高抗原表达水平和改善的免疫原性的有益效果可能因rMVA删除其生命周期中的不必要基因的倾向而受到限制。
构建第一代“三链体(Triplex)”疫苗以减轻或抑制进行中的CMV病毒血症及其繁殖。第一代三链体包括三种免疫显性蛋白：pp65(主要外皮(tegument)蛋白)和即早蛋白IE1和IE2之间的融合体(IEfusion)。这些抗原此前已被合并并在单个MVA载体中表达；但是，目前在MVA中这些抗原的组装对于疫苗的大规模生产而言并不是最佳的。在延长的病毒传代后，观察到IE融合体的表达降低。该疫苗已在24位健康志愿者的I期安全性和剂量递增试验中进行了成功评估[31]。
开发具有改善的外源蛋白抗原的稳定表达和延长的连续传代后的有效免疫原性的rMVA疫苗将是有利的，这将使得能够大规模生产表达某些HCMV抗原的MVA作为用于更广泛的传染性病原体和癌症抗原的组合的临床载体。
概要
在一方面，本公开涉及一种用于共表达两个或更多个巨细胞病毒(CMV)抗原(例如，人CMV抗原)的表达系统。所述表达系统包括遗传重组修饰的痘苗安卡拉(rMVA)载体，该载体中插入了编码两个或更多个CMV抗原或其抗原性部分的两个或更多个核酸序列。在一些实施方式中，所述CMV抗原或其抗原性片段包括IE1外显子4(IE1/e4)，IE2外显子5(IE2/e5)，IE融合体(例如，IE1/e4和IE2/e5的融合体)，和pp65。在多种实施方式中，pp65可与IE1/e4，IE2/e5，或IE融合体共表达。所述表达系统可从单个载体同时共表达所述CMV抗原。在一些实施方式中，编码所述两个或更多个CMV抗原的核酸序列被插入包括044L/045L，IGR3，G1L/I8R，和Del3的一个或多个插入位点。额外的插入位点包括表1所列的那些位点。
在一些实施方式中，两个或更多个核酸序列可操作地连接至单个启动子(例如mH5启动子)并受所述单个启动子的控制。在其他实施方式中，每个核酸序列可操作地连接至单独的(separate)mH5启动子并受所述单独的mH5启动子的控制。另外，可使用其他痘病毒启动子，且不必使用mH5启动子。在一些实施方式中，一个或多个核酸序列被密码子优化以去除连续的胞嘧啶或鸟嘌呤并表达且不改变同样的氨基酸。在一些实施方式中，所述CMV抗原的氨基酸序列包含一个或多个突变以改善所述rMVA在病毒传代时的遗传稳定性。在一些实施方式中，IE1和IE2或其抗原性片段被表达为IE融合体蛋白，例如IE1/外显子4和IE2/外显子5的融合体。在一些实施方式中，表达CMV抗原的rMVA至少10次传代后在遗传上稳定。
本公开的另一方面涉及疫苗，包含本文公开的免疫有效量的重组修饰的痘苗安卡拉(rMVA)，所述rMVA至少10次传代后在遗传上稳定。
本公开的另一方面涉及通过向受试者施用如上所述的疫苗组合物来诱发或改变针对病毒血症或疾病的免疫应答和临床保护的方法，所述病毒血症和疾病由CMV在受试者中的不受控的繁殖导致。在一些实施方式中，所述受试者是哺乳动物，例如人。
本公开的又一方面涉及通过导入选自以下的一个或多种修饰来改善表达两种或更多种CMV抗原或其抗原性片段的rMVA在传代时的稳定性的方法：(1)将编码CMV抗原或其抗原性片段的一个或多个核酸序列插入一个或多个插入位点，包括044L/045L，IGR3，G1L/I8R，和Del3，以及表1所列的额外的插入位点，不包括Del2；(2)通过去除连续的胞嘧啶或鸟嘌呤来对编码CMV抗原的核酸序列进行密码子优化；和(3)将一个或多个突变引入CMV抗原的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述CMV抗原或其抗原性片段包括IE1外显子4(IE1/e4)，IE2外显子5(IE2/e5)，IE融合体(例如IE1和IE2或IE1/e4和IE2/e5的融合体)，和pp65。
附图简述
图1示出了描绘重新衍生的三链体的开发的示意图。表达pp65的MVA BAC被用作针对三链体的其它HCMV抗原的添加的基础。利用BAC技术和伴随(en passant)诱变，表达所期望的三链体抗原的基因被依次导入MVA。在所有的期望的抗原呈现并分析了最终的构建物的稳定性后，将BAC从MVA除去。实心黑色箭头表示最终重新衍生的三链体构建体；灰色箭头表示中间步骤。最终潜在的三链体候选物有三个示例：I)MVA上不同位点的IE2，IE1和pp65；II)044L/045L中的IE融合体；III)IGR3中的IE融合体。所有三个示例构建体在Del3中均具有pp65。(*)表示插入所述位点的基因变体。
图2A-2C示出了在修饰的痘苗安卡拉(MVA)病毒中的三链体基因组织及其在鸡胚成纤维细胞(CEF)中传代后的稳定性。图2A示出了三链体中IE融合体的原始构造的简化示意图。分别针对IE1和IE2的HCMV AD169外显子4和5被工程化为具有Apal位点以进行无缝连接，从而形成IE融合体。将IE融合体插入由mH5启动子控制的MVA的Del2位点。在MVA Del3位点的是pp65，也由mH5启动子控制。图2B示出了在CEF中额外传代多达七次(P6-P12)的临床三链体的免疫印迹分析(Western blot analysis)。标签为“CEF”的泳道是未感染的阴性对照；标签为“MVA”的泳道是不表达CMV抗原的野生型MVA；标签为“三链体”的泳道是用于在P5产生临床批次(lots)的三链体的病毒。使用纯化的抗-IE1小鼠单克隆抗体(mAB)p63-27探测IE融合体[11]；使用纯化的小鼠mAB 28-103探测pp65[4]。作为感染/上样对照，BR5抗体被用来探测包膜(envelope)MVA糖蛋白。图2C示出了1％琼脂糖凝胶，可视化了来自P6-P12的Del2中的IE融合体的PCR扩增，并且在Del2位点内的基因侧翼具有引物。
图3A-3D示出了具有连续的胞嘧啶和鸟嘌呤的突变的IE融合体构建体的核酸序列比对(alignment)，从而减少了不稳定性和/或痘苗密码子优化的蛋白表达。SEQ ID NOs：1-3和25。
图4A-4C示出了MVA-BAC上的IGR3插入位点中的IE融合体4nt的稳定性分析。图4A示出了表示IE融合体(4nt)插入IGR3位点的示意图(用箭头表示)。所有被评估的MVABAC插入位点，G1L/I8R，044L/045L，和IGR3用箭头标记。图4B显示了PCR产物的1％琼脂糖凝胶，分析了IGR3中的IE融合体(4nt)的稳定性，在鸡胚成纤维细胞(CEF)中传代至10次(P1-P10)。图4C示出了IE融合体(4nt)的免疫印迹分析，在CEF细胞中传代至P10。使用纯化的抗IE1小鼠单克隆抗体(mAB)p63-27探测IE融合体[11]；使用纯化的小鼠mAB 28-103探测pp65[4]。作为感染/上样对照，BR5抗体被用来探测包膜MVA糖蛋白。对于图4B和4C，标签为“CEF”的泳道是未感染的阴性对照。标签为“MVA”的泳道是不表达任何抗原的野生型MVA；标签为“三链体”的泳道是病毒(在P6)，用于产生临床批次的三链体。
图5是MVA-BAC上的潜在位点和IE融合体解构成IE1和IE2的示意图。MVA BAC中可供IE1或IE2基因之一插入的潜在位点是044L/045L，IGR3，和G1L/I8R。在IE1和IE2分开后，每个基因均受mH5启动子控制。
图6A-6E示出了表达IE2蛋白变体的构建体的核酸序列比对(图6A-6C)(SEQ IDNOs：7-9和26)和表达IE1蛋白变体的构建体的核酸序列比对(6D-6E)。SEQ ID NOs：27-30。
图7A-7C示出了MVA上044L/045L插入位点中IE2的稳定性分析。图7A示出了表示IE2向044L/045L位点的插入的示意图(用箭头表示)。图7B示出了PCR产物的1％琼脂糖凝胶，分析了IE2在044L/045L中的稳定性，在鸡胚成纤维细胞(CEF)中传代至10次(P1-P10)。图7C示出了在CEF细胞中传代至P10的IE2的免疫印迹分析。使用抗IE2小鼠单克隆抗体(mAB)2.9.5探测IE2[11]；使用纯化的小鼠mAB 28-103探测pp65[4]。作为感染/上样对照，BR5抗体被用来探测包膜MVA糖蛋白。对于图7B和7C，标签为“CEF”的泳道是未感染的阴性对照；标签为“MVA”的泳道是不表达任何抗原的野生型MVA；标签为“三链体”的泳道是用于在P6处产生临床批次的三链体的病毒。
图8A-8C示出了MVA上的044L/045L插入位点中的IE2 H363A的稳定性分析。图8A示出了IE2的示意代表图，显示了特定和基本调节子(SEM，具有相应箭头的深阴影灰色)和核(core)(具有相应箭头的浅阴影)内363和369位(H363和H369)的两个组氨酸残基的位置。在IE2氨基酸序列中，对用于推定的～40kDa产物的转录的内部TATA框加上标签[18]。该氨基酸注释与对应于缺乏细胞核(nuclear)定位信号或信号肽的IE2的氨基酸编号一致。图8B显示了PCR产物的1％琼脂糖凝胶，分析了IE2 H363A在044L/045L中的稳定性，在鸡胚成纤维细胞(CEF)中传代至10次(P1-P10)。图8C示出了在CEF细胞中传代至P10的IE2 H363A的免疫印迹分析。使用抗IE2小鼠单克隆抗体(mAB)2.9.5探测IE2 H363A[11]。作为感染/上样对照，BR5抗体被用来探测包膜MVA糖蛋白。对于图8B和8C，标签为“CEF”的泳道是未感染的阴性对照；标签为“MVA”的泳道是不表达任何抗原的野生型MVA；标签为“IE2(044L/045L)”的泳道是此前显示为表达未密码子优化的IE2的病毒(图7C)。
图9A-9C示出了MVA-BAC上的G1L/I8R插入位点中IE1 NCO，4nt，和VacO的稳定性分析。IE1 NCO(9A)，4nt(9B)，和VacO(9C)的PCR(左)和免疫印迹分析(右)。左：PCR产物的1.0％琼脂糖凝胶，分析IE1在G1L/I8R中的稳定性，在CEF传代至P10。右：在CEF细胞中传代至P10的IE1的免疫印迹分析。使用纯化的抗小鼠IE1单克隆抗体(mAB)p63-27探测IE1和IE融合体。作为感染/上样对照(下图)，BR5抗体被用来探测包膜MVA糖蛋白。“CEF”是未感染的阴性对照；标签为“MVA”的泳道是不表达任何抗原的野生型MVA；标签为(+)的泳道是用于产生临床批次的三链体的病毒。
图10A-10B示出了MVA-BAC上IGR3插入位点中IE1 4nt和VacO的稳定性分析。IE14nt(10A)，和VacO(10B)的PCR(左)和免疫印迹分析(右)。左：PCR产物的1.0％琼脂糖凝胶，分析IE1 IGR3的稳定性，在CEF中传代至P10。右：在CEF细胞中传代至P10的IE1的免疫印迹分析。使用纯化的抗-IE1小鼠单克隆抗体(mAB)p63-27探测IE1和IE融合体。作为感染/上样对照(下图)，BR5抗体被用来探测包膜MVA糖蛋白。“CEF”是未感染的阴性对照；标签为“MVA”的泳道是不表达任何抗原的野生型MVA；标签为(+)的泳道是用于产生临床批次的三链体的病毒。
图11A-11B示出了MVA-BAC上G1L/I8R插入位点中IE2 NCO和4nt的稳定性分析。IE2NCO(11A)和4nt(11B)的PCR(左)和免疫印迹分析(右)。左：PCR产物的1.0％琼脂糖凝胶，分析IE2 G1L/I8R的稳定性，在CEF中传代至P10。右：在CEF细胞中传代10次(P1-P10)的IE2的免疫印迹分析。使用抗-IE2 mAB 2.9.5探测IE2。作为感染/上样对照(下图)，BR5抗体被用来探测包膜MVA糖蛋白。“CEF”是未感染的阴性对照；标签为“MVA”的泳道是不表达任何抗原的野生型MVA；标签为(+)的泳道是用于产生临床批次的三链体的病毒。
图12示出了MVA-BAC上IGR3插入位点中IE2 VacO的稳定性分析。IE2 VacO的PCR(左)和免疫印迹分析(右)。左：PCR产物的1.0％琼脂糖凝胶，分析IE2 IGR3的稳定性，在CEF中传代至P10。右：在CEF细胞中传代至P10的IE2的免疫印迹分析。使用抗-IE2 mAB 2.9.5探测IE2。作为感染/上样对照(下图)，BR5抗体被用来探测包膜MVA糖蛋白。“CEF”是未感染的阴性对照；标签为“MVA”的泳道是不表达任何抗原的野生型MVA；标签为(+)的泳道是用于产生临床批次的三链体的病毒。
图13A-13B示出了MVA-BAC上044/045L插入位点中的IE2H363A NCO和4nt的稳定性分析。IE2 NCO(13A)和4nt(13B)的PCR(左)和免疫印迹分析(右)。左：PCR产物的1.0％琼脂糖凝胶，分析IE2突变体在044/045L中的稳定性，在CEF中传代至P10。右：在CEF细胞中传代至P10的IE2突变体的免疫印迹分析。使用抗-IE2 mAB 2.9.5探测IE2。作为感染/上样对照(下图)，BR5抗体被用来探测包膜MVA糖蛋白。“CEF”是未感染的阴性对照；标签为“MVA”的泳道是不表达任何抗原的野生型MVA；标签为(+)的泳道是用于产生临床批次的三链体的病毒。
图14A-14C示出了在MVA-BAC的044/045L插入位点中IE2H369A NCO，4nt，和VacO的稳定性分析。IE2 NCO(14A)，4nt(14B)，和VacO(14C)的PCR(左)和免疫印迹分析(右)。左：PCR产物的1.0％琼脂糖凝胶，分析IE2突变体在044/045L中的稳定性，在CEF中传代至P10。右：在CEF细胞中传代至P10的IE2突变体的免疫印迹分析。使用抗-IE2 mAB 2.9.5探测IE2。作为感染/上样对照(下图)，BR5抗体被用来探测包膜MVA糖蛋白。“CEF”是未感染的阴性对照；标签为“MVA”的泳道是不表达任何抗原的野生型MVA；标签为(+)的泳道是用于产生临床批次的三链体的病毒。
图15A-15C示出了MVA-BAC上的044/045L插入位点中的IE2H363/369A NCO，4nt，和VacO的稳定性分析。IE2 NCO(15A)，4nt(15B)，和VacO(15C)的PCR(左)和免疫印迹分析(右)。左：PCR产物的1.0％琼脂糖凝胶，分析IE2突变体在044/045L中的稳定性，在CEF中传代至P10。右：在CEF细胞中传代至P10的IE2突变体的免疫印迹分析。使用抗-IE2 mAB 2.9.5探测IE2。作为感染/上样对照(下图)，BR5抗体被用来探测包膜MVA糖蛋白。“CEF”是未感染的阴性对照；标签为“MVA”的泳道是不表达任何抗原的野生型MVA；标签为(+)的泳道是用于产生临床批次的三链体的病毒。
图16A-16C示出了MVA-BAC上IGR3插入位点中IE融合体4nt突变体的稳定性分析。IE融合体4nt H363A(16A)，H369A(16B)，和H363A/H369A(16C)的PCR(左)和免疫印迹分析(右)。左：PCR产物的1.0％琼脂糖凝胶，分析IGR3中IE融合体突变体的稳定性，在CEF中传代至P10。右：在CEF细胞中传代至P10的IE融合体突变体的免疫印迹分析。使用纯化的抗-IE1小鼠单克隆抗体(mAB)p63-27探测IE融合体。作为感染/上样对照(下图)，BR5抗体被用来探测包膜MVA糖蛋白。“CEF”是未感染的阴性对照；标签为“MVA”的泳道是不表达任何抗原的野生型MVA；标签为(+)的泳道是用于产生临床批次的三链体的病毒。
图17示出了构建体A(i)的稳定性分析。IE1，IE2，和pp65的PCR(左)和免疫印迹分析(右)。左：PCR产物的1.0％琼脂糖凝胶，分析IGR3中的IE1，044/045L中的IE2，和Del3中的pp65的稳定性，在CEF细胞中传代至P10。右：CEF细胞中传代至P10的IE融合体和pp65的免疫印迹分析。使用纯化的抗IE1小鼠单克隆抗体(mAB)p63-27探测IE1；使用抗-IE2 mAB 2.9.5探测IE2；使用纯化的小鼠mAB 28-103探测pp65。作为感染/上样对照(下图)，BR5抗体被用来探测包膜MVA糖蛋白。“CEF”是未感染的阴性对照；标签为“MVA”的泳道是不表达任何抗原的野生型MVA；标签为(+)的泳道是用于产生临床批次的三链体的病毒。
图18示出了构建体A(v)的稳定性分析。IE1，IE2，和pp65的PCR(左)和免疫印迹分析(右)。左：PCR产物的1.0％琼脂糖凝胶，分析IGR3中的IE1，044/045L中的IE2，和Del3中的pp65的稳定性，在CEF中传代至P10。右：在CEF细胞中传代至P10的IE融合体和pp65免疫印迹分析。使用纯化的抗-IE1小鼠单克隆抗体(mAb)p63-2探测IE1；使用抗-IE2 mAB 2.9.5探测IE2；使用纯化的小鼠mAB 28-103探测pp65。作为感染/上样对照(下图)，BR5抗体被用来探测包膜MVA糖蛋白。“CEF”是未感染的阴性对照；标签为“MVA”的泳道是不表达任何抗原的野生型MVA；标签为(+)的泳道是用于产生临床批次的三链体的病毒。
图19示出了构建体A(vi)的稳定性分析。IE1，IE2，和pp65的PCR(左)和免疫印迹分析(右)。左：PCR产物的1.0％琼脂糖凝胶，分析IGR3中的IE1，044/045L中的IE2，和Del3中的pp65的稳定性，在CEF中传代至P10。右：在CEF细胞中传代至P10的IE融合体和pp65的免疫印迹分析。使用纯化的抗-IE1小鼠单克隆抗体(mAB)p63-27探测IE1；使用抗-IE2 mAB 2.9.5探测IE2；使用纯化的小鼠mAB 28-103探测pp65。作为感染/上样对照(下图)，BR5抗体被用来探测包膜MVA糖蛋白。“CEF”是未感染的阴性对照；标签为“MVA”的泳道是不表达任何抗原的野生型MVA；标签为(+)的泳道是用于产生临床批次的三链体的病毒。
图20示出了构建体B(i)的稳定性分析。IE1，IE2，和pp65的PCR(左)和免疫印迹分析(右)。左：PCR产物的1.0％琼脂糖凝胶，分析IGR3中的IE1，044/045L中的IE2，和Del3中的pp65的稳定性，在CEF中传代至P10。右：在CEF细胞中传代至P10的IE融合体和pp65的免疫印迹分析。使用纯化的抗-IE1小鼠单克隆抗体(mAB)p63-27探测IE1；使用抗-IE2 mAB 2.9.5探测IE2；使用纯化的小鼠mAB 28-103探测pp65。在该图中，(+)未起作用，因此没有观察到α-pp65或α-IE1免疫印迹的条带。作为感染/上样对照(下图)，BR5抗体被用来探测包膜MVA糖蛋白。“CEF”是未感染的阴性对照；标签为“MVA”的泳道是不表达任何抗原的野生型MVA；标签为(+)的泳道是用于产生临床批次的三链体的病毒。
图21示出了构建体B(ii)的稳定性分析。IE1，IE2，和pp65的PCR(左)和免疫印迹分析(右)。左：PCR产物的1.0％琼脂糖凝胶，分析IG1中的IE1，044/045L中的IE2，和Del3中的pp65的稳定性，在CEF中传代至P10。右：在CEF细胞中传代至P10的IE融合体和pp65的免疫印迹分析。使用纯化的抗-IE1小鼠单克隆抗体(mAb)p63-27探测IE1；使用抗-IE2 mAB 2.9.5探测IE2；使用纯化的小鼠mAB 28-103探测pp65。作为感染/上样对照(下图)，BR5抗体被用来探测包膜MVA糖蛋白。“CEF”是未感染的阴性对照；标签为“MVA”的泳道是不表达任何抗原的野生型MVA；标签为(+)的泳道是用于产生临床批次的三链体的病毒。P1 PCR的(*)表示丢失泳道。
图22示出了构建体B(iii)的稳定性分析。IE1，IE2，和pp65的PCR(左)和免疫印迹分析(右)。左：PCR产物的1.0％琼脂糖凝胶，分析IGR3中的IE1，044/045L中的IE2，和Del3中的pp65的稳定性，在CEF中传代至P10。右：在CEF细胞中传代至P10的IE融合体和pp65的免疫印迹分析。使用纯化的抗-IE1小鼠单克隆抗体(mAB)p63-27探测IE1；IE2使用抗IE2 mAB2.9.5探测；使用纯化的小鼠mAB 28-103探测pp65。作为感染/上样对照(下图)，BR5抗体被用来探测包膜MVA糖蛋白。“CEF”是未感染的阴性对照；标签为“MVA”的泳道是不表达任何抗原的野生型MVA；标签为(+)的泳道是用于生成临床批次三链体的病毒。为了使基于分子量的蛋白质鉴定更加清晰，用箭头表示了IE融合体和IE1。
图23示出了构建体B(v)的稳定性分析。IE1，IE2，和pp65的PCR(左)和免疫印迹分析(右)。左：PCR产物的1.0％琼脂糖凝胶，分析IGR3中的IE1，044/045L中的IE2，和Del3中的pp65的稳定性，在CEF中传代至P10。右：在CEF细胞中传代至P10的IE融合体和pp65的免疫印迹分析。使用纯化的抗-IE1小鼠单克隆抗体(mAb)p63-27探测IE1；使用抗IE2 mAB 2.9.5探测IE2；使用纯化的小鼠mAB 28-103探测pp65。作为感染/上样对照(下图)，BR5抗体被用来探测包膜MVA糖蛋白。“CEF”是未感染的阴性对照；标签为“MVA”的泳道是不表达任何抗原的野生型MVA；标签为(+)的泳道是用于产生临床批次的三链体的病毒。
图24显示了构建体B(vii)的稳定性分析。IE1，IE2，和pp65的PCR(左)和免疫印迹分析(右)。左：PCR产物的1.0％琼脂糖凝胶，分析IG1中的IE1，044/045L中的IE2，和Del3中的pp65的稳定性，在CEF中传代至P10。右：在CEF细胞中传代至P10的IE融合体和pp65免疫印迹分析。使用纯化的抗-IE1小鼠单克隆抗体(mAB)p63-27探测IE1；使用抗-IE2 mAB 2.9.5探测IE2；使用纯化的小鼠mAB 28-103探测pp65。作为感染/上样对照(下图)，BR5抗体被用来探测包膜MVA糖蛋白。“CEF”是未感染的阴性对照；标签为“MVA”的泳道是不表达任何抗原的野生型MVA；标签为(+)的泳道是用于生成临床批次的三链体的病毒。
图25示出了IE融合体4nt H363A(IGR3)：pp65(Del3)的稳定性分析。IE融合体4ntH363A和pp65的PCR(左)和免疫印迹分析(右)。左：PCR产物的1.0％琼脂糖凝胶，分析IGR3中IE融合体以及Del3中pp65的稳定性，在CEF中传代至P10。右：CEF细胞中传代至P10的IE融合体和pp65的免疫印迹分析。使用纯化的抗-IE1小鼠单克隆抗体(mAB)p63-27探测IE融合体；使用纯化的小鼠mAB 28-103探测pp65。作为感染/上样对照(下图)，BR5抗体被用来探测包膜MVA糖蛋白。“CEF”是未感染的阴性对照；标签为“MVA”的泳道是不表达任何抗原的野生型MVA；标签为(+)的泳道是用于产生临床批次的三链体的病毒。
图26示出了IE融合体4nt H369A(IGR3)：pp65(Del3)的稳定性分析。IE融合体4ntH369A和pp65的PCR(左)和免疫印迹分析(右)。左：PCR产物的1.0％琼脂糖凝胶，分析IGR3中IE融合体以及Del3中pp65的稳定性，在CEF中传代至P10。右：在CEF细胞中传代至P10的IE融合体和pp65的免疫印迹分析。使用纯化的抗-IE1小鼠单克隆抗体(mAB)p63-27探测IE融合体；使用纯化的小鼠mAB 28-103探测pp65。作为感染/上样对照(下图)，BR5抗体被用来探测包膜MVA糖蛋白。“CEF”是未感染的阴性对照；标签为“MVA”的泳道是不表达任何抗原的野生型MVA；标签为(+)的泳道是用于产生临床批次的三链体的病毒。
图27A-27B示出了第二代三链体免疫后的T细胞应答和刺激。图27A：第二代三链体诱发的人MHC限制性T细胞应答。表6中数据的图形表示。图27B：第二代三链体的HLA-B*0702-或HLA-A*0201-限制的CD8+T-细胞刺激。表7中数据的图形表示。误差线通过SEM计算并报告在表6和7中。
图28A-28B示出了表达加倍(duplicate)IE2基因的构建体的稳定性分析。IE2和IE2突变体的PCR(上图)和免疫印迹分析(下图)。图28A：PCR产物的1.0％琼脂糖凝胶，分析G1L中IE2和044/045L中的三个版本的IE2突变体的稳定性，在CEF中传代至P5。图28B：IE2和三个突变体的免疫印迹分析，在CEF细胞中传代至P5。使用抗IE2 mAB 2.9.5探测IE2。作为感染/上样对照(下图)，BR5抗体被用来探测包膜MVA糖蛋白。“CEF”是未感染的阴性对照；标签为“MVA”的泳道是不表达任何抗原的野生型MVA；标签为(+)的泳道是用于产生临床批次的三链体的病毒。
发明详述
现有的三链体疫苗制剂包括三种免疫显性蛋白：pp65和即早蛋白IE1和IE2的融合体，但具有受限的生产特性：1)其必须进行有限的传代以维持IE融合体插入的稳定性；2)受限的生长条件，以允许病毒繁殖而不会引起IE融合体的不稳定性；和3)对大规模临床批次的批量生产，现有的三链体制剂不是最有效率的长期生产策略。
组合利用经修饰的痘苗安卡拉(MVA)疫苗平台与细菌人工染色体(BAC)技术，产生了一种新形式的三链体，可在超过10次的传代期间的单独的插入位点稳定表达IE1和IE2蛋白。MVA是一种良好表征且临床耐受性良好的疫苗载体，广泛用于开发治疗性疫苗策略以治疗或预防传染病或癌症。由HCMV抗原IE1，IE2，和pp65诱导细胞免疫应答被认为对疫苗候选物的构建体而言是不可或缺的，以预防感染或已有或将经历造血干细胞或实体器官移植的个体的再感染。本文公开了同时表达多个HCMV抗原的MVA载体的构建体，具有MVA内的插入位点，对IE融合体的IE1和IE2成分的修饰，以及将IE融合体拆成其各成分IE1(外显子4)和IE2(外显子5)。被插入的HCMV抗原序列基于其天然HCMV DNA序列或已进行了密码子优化以实现高效的痘苗病毒表达。各个HCMV抗原分开插入三个独特的MVA插入位点。有四个候选插入位点，包括MVA缺失位点III(Del3)，MVA必需基因I8R和G1L之间的位点，基因间区域IGR3，和MVA 044/045L位点。异位插入的修饰的启动子H5从MVA载体诱导HCMV抗原的表达。此外，IE2的C-末端DNA结合结构域上的His至Ala氨基酸取代已在至少10次传代期间帮助IE2稳定表达。因此，通过定位引导的诱变将His至Ala取代插入以进一步稳定IE2。这些突变已在10次传代期间帮助了IE2的稳定表达。
在一方面，本公开涉及改善三链体的延长的传代时的稳定性，以及保留免疫原性并同时保持有效疫苗制剂所需的全部三个抗原。例如，可进行一个或多种修饰以产生稳定表达IE1，IE2，和pp65的MVA，以有效率地生产病毒疫苗，包括但不限于：1)使用MVA中的多个独特的基因插入位点，可作为基因稳定性的优选环境；2)去除基因序列中的DNA突变“热点”，所述突变此前已被鉴定为包括密码子“摇摆(wobble)”位置的突变，从而破坏了连续的C或G核苷酸；和3)用于增加蛋白表达的痘病毒密码子优化。在一些实施方式中，IE融合体被插入MVA内的其他位点。候选位点包括Del3[5，6]，G1L/I8R[7，8]，IGR3[9]，和044L/045L[10]。表1中列出了额外的插入位点。在一些实施方式中，插入位点不包括Del2。在一些实施方式中，基因序列中的3个或更多个，4个或更多个，5个或更多个，6个或更多个连续的C或G核苷酸被保持相同的氨基酸一致性的摇摆碱基取代所扰乱。
本文公开的是插入位点和基因修饰的最稳定的组合，以产生在最少10次传代期间稳定表达全部三个CMV抗原的MVA，以大规模繁殖(propagation)疫苗。考虑了多种组合以找到允许IE1，IE2，和pp65的稳定表达的插入位点的最稳定组合：1)将IE融合体拆分为其IE1和IE2基因成分；2)将全部三个基因插入MVA中的单独的插入位点，并使用插入物的变体基因序列；和3)在MVA中探索新的插入位点。
表1提供了一些插入位点的示例：
Figure BDA0002892541820000121
Figure BDA0002892541820000131
多种修饰和/或插入位点选择的目的在于增加同时表达IE1，IE2和pp65的三链体在单个MVA载体中的稳定性，如图1所示。一些MVA插入位点提供了产生IE1或IE2之一的更强的稳定性的环境，可能基于其核苷酸序列。例如，将IE1，IE2和pp65基因中的一个或多个插入一个或多个插入位点，包括044L/045L，IGR3，G1L/I8R，和Del3。在一些实施方式中，插入位点不包括Del2。另外或可替代地，IE1基因和/或IE2基因的DNA序列，和/或IE1蛋白质和/或IE2蛋白的氨基酸序列被修饰成与MVA生命周期更相容或不存在细胞毒性。在一些实施方式中，对IE1基因和/或IE2基因的DNA序列进行密码子优化。例如，对胞嘧啶或鸟嘌呤的连续DNA序列进行密码子优化，并用编码相同氨基酸残基且不含连续的胞嘧啶或鸟嘌呤的DNA序列替代。在一些实施方式中，IE1蛋白或IE2蛋白的氨基酸序列包含一个或多个突变，使得该突变的IE1蛋白或突变的IE2蛋白的稳定性相比野生型IE1蛋白或野生型IE2蛋白得到提高。在一些实施方式中，一个或多个氨基酸突变扰乱IE2蛋白的Zn-指结构域。例如，IE2蛋白的氨基酸序列在C-末端中包含一个或多个His→Ala突变。在一些实施方式中，IE2蛋白的氨基酸序列包含H363A突变，H369A突变，或这两者。
本文使用的“免疫有效量”是指既安全而能被受试者(动物或人)免疫又足以改善受试者的免疫力的量。“免疫有效量”可变化，并可通过常规试验用已知的手段确定。
在另一实施方式中，包含免疫有效量的rMVA病毒的CMV疫苗在连续传代后在遗传上稳定，可通过本文公开的方法制备，导入上述一个或多种修饰。
CMV抗原可以是CMV蛋白抗原，CMV蛋白抗原的片段，被修饰的CMV蛋白抗原，被修饰的CMV蛋白抗原的片段，已突变的CMV蛋白抗原或融合体CMV蛋白抗原。CMV蛋白抗原和CMV片段的实例可包括pp65，IE1外显子4(IE1/E4)，IE2外显子5(IE2/e5)，以及它们的抗原性片段。被修饰的CMV蛋白抗原及其片段的实例可以在Diamond等人的美国专利号7，163,685中找到，其通过引用整体并入本文。已突变的CMV蛋白抗原的实例可在Zaia等人的美国专利号6,835,383中找到，其通过引用整体并入本文。此外，通过评估健康成年人的免疫应答而建立的全部分级抗原都可相加，直到达到供基因插入的MVA载体的最大容量(见图1C和4D)[32]。
融合体CMV蛋白抗原可包含2种或更多种CMV蛋白，被修饰的CMV蛋白，已突变的CMV蛋白或其任何抗原性片段。在一方面中，示例性融合体蛋白是IE1外显子4(IE1/e4)和IE2外显子5(IE2/e5)，IE1/e4-IE2/e5的融合体(“IE融合体”)。在一个实施方式中，融合体蛋白的使用涉及在单个基因中产生一个IE融合体蛋白，包含来自IE1的外显子4和来自IE2基因的外显子5而没有额外的遗传物质。所述IE融合体蛋白包含相比任一单独的蛋白而言独特的即早抗原的代表(representation)。在另一实施方式中，对编码IE融合体的核酸序列进行了密码子优化。在又一实施方式中，IE融合体蛋白的氨基酸序列在IE2的C-末端包含一个或多个His向Ala的突变。
本文所用的术语“遗传稳定性”是指基因的DNA序列，基因的表达水平，或这两者在病毒连续传代的情况下对变化的抵抗性。rMVA载体中靶基因的遗传稳定性是疫苗开发中的一个担忧。由于基因序列或表达水平的改变，靶基因的遗传稳定性的降低可具有降低rMVA载体的免疫原性的效果。插入基因序列的遗传不稳定性可导致基因插入侧翼的序列的改变。抑制插入基因的不稳定性似乎可以减少侧翼病毒DNA序列的不稳定性。
重组病毒的遗传稳定性可以通过本领域已知的多种方法进行测量或评估，例如，通过免疫印迹(WB)或免疫染色病毒空斑(plaque)测试每次传代的外源蛋白表达水平并计算连续传代之前和之后的外源蛋白产生的焦点(foci)的百分比。评估遗传稳定性的一种替代性手段是通过实时定量PCR(RT-qPCR)方法，该方法可扩增分离的MVA基因组DNA并在每次传代后计算被插入的感兴趣的基因和MVA载体的拷贝数。感兴趣的基因拷贝数与MVA骨架载体拷贝数的比率用于确定基因或携带该基因的MVA疫苗的遗传稳定性。更高的感兴趣的基因拷贝数与MVA骨架载体拷贝数的比率反映了更高的遗传稳定性，最高的比率＝1意味着连续传代后保留约100％的基因表达。与其他方法(例如免疫印迹或免疫染色)相比，RT-qPCR具有更高的灵敏度和高通量，并提供了高度可重复的结果。RT-qPCR的方法可以按照本领域熟知的步骤或市售RT-qPCR试剂盒的手册来执行。但是，如果没有附带的序列信息，则该方法可能无法检测到单个核苷酸的变化。IE1或IE2插入物的编码序列的扰乱可以防止会识别完整形式的单克隆抗体的识别。
在疫苗的连续传代期间，特别是在10次或更多次传代后，携带感兴趣的基因的rMVA疫苗在基因的DNA序列和基因的表达基本不变时在遗传上是稳定的。
另一方面是通过向受试者施用本文公开的在遗传上稳定的rMVA疫苗来预防或治疗哺乳动物受试者中的感染或癌症的方法，其中所述rMVA疫苗包含两个或更多个受mH5或其他痘病毒启动子(包括IE1，IE2，和pp65或其抗原性片段)控制的两个或更多个CMV抗原。在一些实施方式中，哺乳动物受试者是人受试者。
以下公开了某些IE融合体，IE蛋白，及其变体的核酸序列和氨基酸序列。
IE融合体-VacO DNA序列(SEQ ID NO：1)：
Figure BDA0002892541820000151
Figure BDA0002892541820000161
IE融合体DNA序列(SEQ ID NO：2)：
Figure BDA0002892541820000171
Figure BDA0002892541820000181
IE融合体-4nt DNA序列(SEQ ID NO：3)：
Figure BDA0002892541820000182
Figure BDA0002892541820000191
IE融合体-VacO氨基酸序列(SEQ ID NO：4)：
Figure BDA0002892541820000192
IE融合体氨基酸序列(SEQ ID NO：5)：
Figure BDA0002892541820000201
IE融合体-4NT氨基酸序列(SEQ ID NO：6)：
Figure BDA0002892541820000202
Figure BDA0002892541820000211
IE2-VacO DNA序列(SEQ ID NO：7)：
Figure BDA0002892541820000212
IE2 DNA序列(SEQ ID NO：8)：
Figure BDA0002892541820000221
IE2-4nt DNA序列(SEQ ID NO：9)：
Figure BDA0002892541820000222
Figure BDA0002892541820000231
IE2 4nt H363A DNA序列(突变以粗体和下划线示出)(SEQ ID NO：10)：
Figure BDA0002892541820000232
IE2 4nt H369A DNA序列(突变以粗体和下划线示出)(SEQ ID NO：11)：
Figure BDA0002892541820000241
IE2 4nt H363A/H369A DNA序列(突变以粗体和下划线示出)(SEQ ID NO：12)：
Figure BDA0002892541820000242
Figure BDA0002892541820000251
IE2 H363A DNA序列(突变以粗体和下划线示出)(SEQ ID NO：13)：
Figure BDA0002892541820000252
Figure BDA0002892541820000261
IE2 H369A DNA序列(突变以粗体和下划线示出)(SEQ ID NO：14)：
Figure BDA0002892541820000262
IE2 H363A/H369A DNA序列(突变以粗体和下划线示出)(SEQ ID NO：15)：
Figure BDA0002892541820000263
Figure BDA0002892541820000271
IE2 VacO H363A DNA序列(突变以粗体和下划线示出)(SEQ ID NO：16)：
Figure BDA0002892541820000272
Figure BDA0002892541820000281
IE2 VacO H369A DNA序列(突变以粗体和下划线示出)(SEQ ID NO：17)：
Figure BDA0002892541820000282
IE2 VacO H363A/H369A DNA序列(突变以粗体和下划线示出)(SEQ ID NO：18)：
Figure BDA0002892541820000283
Figure BDA0002892541820000291
IE2-VacO氨基酸序列(SEQ ID NO：19)：
Figure BDA0002892541820000292
IE2氨基酸序列(SEQ ID NO：20)：
Figure BDA0002892541820000293
Figure BDA0002892541820000301
IE2-4nt氨基酸序列(SEQ ID NO：21)：
Figure BDA0002892541820000302
IE2 H363A氨基酸序列(一个或多个突变以粗体和下划线示出)(SEQ ID NO：22)：
Figure BDA0002892541820000303
IE2 H369A氨基酸序列(一个或多个突变以粗体和下划线示出)(SEQ ID NO：23)：
Figure BDA0002892541820000304
Figure BDA0002892541820000311
IE2 H363A/H369A氨基酸序列(一个或多个突变以粗体和下划线示出)(SEQ IDNO：24)：
Figure BDA0002892541820000312
已参考实施方式和说明性示例描述了本发明，本领域技术人员可理解，所描述和说明的对本发明的修改不脱离说明书中所公开的发明的精神和范围。阐述示例以帮助理解本发明，但无意于且不应被解释为以任何方式限制其范围。实例不包括常规方法的详细描述。这样的方法是本领域普通技术人员熟知的，并在许多出版物中都有描述。本文提及的所有参考文献均全文并入。
材料和方法
数据库搜索：通过凝胶内胰蛋白酶消化和随后的肽提取从梯度4-20％SDS-PAGE凝胶(Bio-Rad，美国)中提取串联质谱(MS/MS)。未进行电荷状态去卷积和去同位素。使用Sequest(仅XCorr)(Thermo Fisher Scientific，美国加利福尼亚州圣何塞；ProteomeDiscoverer 2.1.0.81中IseNode版本)分析了所有MS/MS样品。设置Sequest(仅XCorr)以搜索crap_ncbi.fasta；Heidi_20170828.fasta；human_refseq.fasta(未知版本，73204条目)，假设消化酶是非特异性的。搜索Sequest(仅XCorr)，片段离子质量容限为0.60Da，母离子容限为10.0PPM。半胱氨酸的脲甲基(carbamidomethyl)在Sequest(仅XCorr)中指定为固定修饰。天冬酰胺的脱酰胺化，甲硫氨酸的氧化和N-末端的乙酰基在Sequest(仅XCorr)中被指定为可变修饰。
蛋白质鉴定的标准：支架(Scaffold)(版本Scaffold 4.8.4，ProteomeSoftwareInc.，俄勒冈州波特兰)用于验证基于MS/MS的肽和蛋白质鉴定。如果能够通过Scaffold Local FDR算法以大于36.0％的概率建立肽鉴定，则可接受。如果能够以大于98.0％的概率实现小于1.0％FDR并包含至少5种已鉴定的肽建立蛋白质鉴定，则可接受。蛋白质概率由Protein Prophet算法分配[33]。包含相似的肽且不能仅基于MS/MS分析来区分的蛋白质被归类以满足简约性原则。
实施例1.第一代三链体的评估
在该研究中，通过聚合酶链反应(PCR)，DNA测序和免疫印迹监测MVA内感兴趣的基因的完整性，藉此来评估“稳定性”，以确保出现全长基因和全长蛋白质。三链体的原始设计包含一个pSyn启动子，在连续传代时导致不稳定，从而导致蛋白质表达大幅降低。pSyn启动子此前已被经修饰的痘苗病毒H5(mH5)启动子替代(图2A)，此时观察到IE融合体蛋白稳定性增加且同时保持了免疫原性[1，2]。为了进一步提高表达稳定性，省略了在外显子2/外显子3内被编码的核定位序列和转录激活结构域以及来自HCMV AD169的IE1和IE2的重叠读数框，以防止可能与致癌作用相关的基因激活事件并减少可能的转录单位的数量。(图2A)[3]。因此，在不添加额外的核苷酸或氨基酸的情况下将具有无缝连接的IE1/IE2融合体插入修饰的痘苗安卡拉(MVA)的Del2位点，而未修饰的磷蛋白pp65[4]被插入MVA的Del3位点[1]。经过这些修饰后，尽管未在蛋白质(图2B)或DNA水平(图2C)上观察到，但在CEF中超过10次病毒传代后在RNA水平观察到了IE融合体稳定性[1]。为进行繁殖，IE融合体样品在评价前进行了约5次传代。因此，在图2B中，标记为P1的样品在CEF中分析之前可能传代了5次。另一方面，图2B中使用的临床三链体未进行同样多的传代；因此，在IE融合体的P1中已经观察到稳定性降低(图2B和2C)。
因此，如果没有严格的验证，则第一代三链体可能不被美国食品药品管理局(FDA)接受为3期生产方案。
实施例2.IE融合体变体的生成
尽管本文公开的第一代三链体和新三链体构建体的基因组结构相似，但除了探索对IE融合体的基因修饰外，还评估了插入在MVA中其他位点的IE融合体(图1所示的方案I)，以通过针对痘病毒的密码子优化(即，摆动位置(4nt)和痘苗病毒表达(VacO)优化)来减少自发突变热点和/或增加表达。第一代三链体使用HCMV AD169 DNA序列而在MVA中的Del2中包含IE融合体，在Del3中包含pp65，该序列通过转移质粒而生成，该质粒有助于将IE融合体同源重组为野生型MVA[3]。见图2。由于该过程可能是耗时的，因此使用了细菌人工染色体(BAC)技术。通过应用BAC技术[11，12]和伴随诱变[13，14]来生成表达pp65和IE融合体的多种迭代的新MVA构建体，快速生成并测试了每种提议的病毒构建体(表2)。
Figure BDA0002892541820000331
Figure BDA0002892541820000341
“X”表示不稳定；“√”表示稳定位点；以及“ND”表示未测定。
如表2所示，IE融合体(IEfus)的一些版本被插入MVA中的以下位点：Del2，G1L，IGR3，或044L/045L。将IE融合体插入Del3，G1L/I8R，IGR3，和044L/045L中后，一些位点确实在一定程度上帮助了基因表达的稳定(数据未示出)，但可能不足以满足FDA来用于后期临床评估的标准。图3显示了IE融合体构建体的核酸序列比对。图4显示在MVA中的IGR3位点中构建时IE融合体4nt使IE融合体表达稳定了超过五个病毒传代(P5)。
实施例3.IE融合体变体的评估
通过扰乱连续的C或G核苷酸碱基[15]的运行，接着通过痘苗病毒密码子(命名为VacO)优化IE融合体的DNA序列，藉此去除了突变热点。通过PCR和免疫印迹分析了标记为“X”的表2所示的构建体的稳定性，以监测传代后其插入位点内的基因的完整性和表达。这种类型的分析提供了有关DNA或蛋白质水平上的不稳定性的见解。
基于自发突变热点的去除会使不稳定性最小化的知识，对表2所示的所有IE融合体构建体进行了评价。
插入IGR3中的IE融合体4nt(图4)显示出比经修饰并插入Del2，G1L，和044L/045L插入位点的多种IE融合体构建体更高的稳定性(表2和图4A)。感兴趣的基因通过PCR被扩增以分析基因稳定性，包括MVA中的侧翼区域(预期的IE融合体大小示于表3)。
Figure BDA0002892541820000342
Figure BDA0002892541820000351
当全长基因的完整性在传代过程中受损时，非特异性PCR产物将出现并在3次传代左右(P3)观察到异常的DNA测序的结果，或者是类似于阴性对照的尺寸的产物(图4B)；但是，由于蛋白质水平上的不稳定性，在P7观察到全长产物的表达的下降(图4C)。尽管似乎在CEF中的连续传代期间观察到了一些稳定性的改善(数据未示出)，在延长的传代期间全长IE融合体的蛋白表达未得到维持。根据该信息可得出结论，除非在DNA或氨基酸水平上进行修饰，否则IE1和IE2将不能稳定表达为～130kDa的蛋白质融合体。因此，作为融合序列的未经进一步修饰的IE融合体可能不是维持经受10次或更多次传代的MVA中的IE融合体的稳定表达的最佳选择。
实施例4：MVA中IE1，IE2，和pp65的稳定表达的创新策略的开发
目的是找到插入位点和基因修饰的最稳定组合，以产生在最少10次传代期间稳定表达所有三种抗原的MVA，以大规模繁殖疫苗病毒。考虑到三个主要问题来开启新的疫苗构建策略，以找到最稳定的插入位点组合，以实现IE1，IE2，和pp65的稳定表达：1)将IE融合体拆分成其IE1/IE2成分；2)将全部三种基因的变体基因序列插入MVA中的单独的插入位点；3)探索MVA中的新插入位点。由于用IE1和IE2作为核苷酸修饰后的融合蛋白在增强稳定性方面的成功性有限，因此将IE1和IE2分离并将各基因插入单独的插入位点，然后分析每个新的位点中的每个基因的稳定性。原始的IE融合体构建体被用作模板来拆分IE1和IE2，每个成分都受不同的mH5启动子的控制[1]。表2示出了所有的为尝试产生在≥10次传代期间稳定地表达IE1和IE2的MVA的而生成的构建体。此外，还导入了其它修饰，例如连续的C和G核苷酸的去除以及如针对IE融合体所进行的基因的密码子优化。分析了IE1和IE2基因的不同序列修饰在CEF中的稳定性，也使用BAC技术以生成多种MVA构建体。因为已经观察到Del2中的不稳定性[15]，所以不再进一步寻求将Del2位点作为候选位点。
基于该实验设置，为评估CEF中的基因的稳定性，获得了要在G1L或IGR3之一中表达的IE1基因的5个候选物(表2)。只有IE1(未密码子优化的(NCO)，4核苷酸优化(4nt)，和痘苗优化的(VacO))在G1L中显示了稳定性(图9)，而只有IE1(4nt)和IE1(VacO)显示了在IGR3中的稳定性(图10)。使用禽痘辅助病毒在BHK细胞中进行病毒重构(reconstitution)时，IE2构建体更难生成[11，16]。含有IE2的MVA的重构尝试比IE1的情况更为困难。经过多次转染尝试并随后进行稳定性分析后，未获得在CEF中经过几次病毒传代后产生全长IE2蛋白的稳定的表达IE2的MVA构建体(图11和12)。图6显示了IE2构建体的核酸序列比对。
实施例5：IE2 DNA和氨基酸序列的探索
尽管表达IE2的MVA构建体均未产生全长IE2蛋白，但一个构建体MVA：：IE2(044L/045L)(表2)在全部10个病毒传代期间均表达了IE2相关产物(图7)。IE2的替代蛋白产物产生～20kDa和～40kDa的片段，已在此前针对IE2时进行了描述[17-19]。为了确定这些替代蛋白产物的类别(identity)，进行了凝胶内胰蛋白酶消化，然后进行了LC-MS/MS。质谱数据分析显示，～20kDa产物主要是IE2的C-末端部分(覆盖率48％)，而～40kDa产物主要是N-末端(覆盖率34％)(表4)。全长IE2被包括在分析中作为对照(如材料和方法中所进行的蛋白概率计算)。
Figure BDA0002892541820000361
如在图7B中所观察到的，～20kDa和全长～60kDa产物这两者伴随(concomitant)消失，而～40kDa的产物在超过10次传代后仍保持“稳定”。这些结果表明或许在～20kDa产物中存在元素，其不会被CEF细胞或MVA所容忍。在对PCR产物进行DNA测序以试图鉴定DNA序列的区域内的突变时，观察到IE2基因序列在传代过程中发生了随机突变，从而导致IE2内的过早的(premature)终止密码子，产生了截短但稳定的IE2产物，可以被IE2特异性抗体识别[17]。
实施例6：C-末端组氨酸的IE2突变的产生
IE1在核苷酸水平上的性质使其在某些位置中不稳定；将IE1插入MVA中的不同位点可减轻不稳定性。IE2不稳定性不能仅通过此方法来解决。推定的(putative)IE2功能结构域已有报道[20]。IE2的C-末端已被描述为“核”结构域的一部分，对DNA结合，反式激活，和自动阻遏很重要(图8A)。邻近核结构域的区域包含可在不影响IE2蛋白与DNA的相互作用的情况下进行突变的Zn-指结合结构域。与核结构域相邻的区域被称为“特定且必要的调节子”结构域(SEM)(图8A)。尽管SEM区域内的突变不会损害此前与IE2相关的所有功能，但已观察到该区域内不同的序列要求会影响不同的IE2功能。IE2的C-末端的两个His残基在假定的Zn-指结合结构域(图8A)中被确定为His446和His452[21，22]。使这些IE2残基突变并不会废除DNA结合能力或者阻碍HCMV内或异源系统(例如腺病毒)内IE2的表达[23]。作为使最后37个氨基酸残基突变的结果，确定其对IE2自抑制和反式激活功能是所需的[24-27]。使用位点引导的诱变使两个组氨酸(H)残基突变为丙氨酸(A)，尽管没有来自SEM或核结构域的其他C-末端残基被改变。该决定基于，如果C-末端的最后～37个氨基酸残基对IE2活性很重要，则这些残基可能会编码免疫原性表位。SEM中的突变残基被良好地耐受，不会影响IE2活性[20]；因此，进一步研究了在CEF中病毒传代后，该区域内的修饰是否有助于IE2基因及其蛋白产物在MVA中的遗传和蛋白稳定性。
在为IE2寻找位置并鉴定序列以使其在MVA中的表达“稳定”方面存在挑战。与包含IE融合体的三链体的原始结构类似，在生成表达IE2的MVA时，会省略N-末端信号肽，细胞核定位序列，以及激活结构域(外显子1，2，和3；氨基酸1-85)[18，26]；因此，这些缺失将氨基酸残基编号从His446和His452分别改变为His363和H369。生成以下IE2的单和双突变体以插入MVA上的044/045L位点：H363A，H369A，H363A/H369A(表5)。在下面的表5中，×＝不稳定；√＝稳定。罗马数字标识了IE2的迭代和变异。
Figure BDA0002892541820000381
在转染和病毒重构后，所有构建体均在CEF中传代。据观察，在连续传代后，基于免疫印迹分析，IE2表达是稳定的(图8C)。此外，PCR分析揭示预期的基因产物的扩增会在10次传代后产生“稳定的”构建体(图8B，13-15)。虽然只能针对H363A突变生成IE2 NCO和IE24nt迭代(图13)，但是构建了H369A(图14)和H363A/H369A(图15)的IE2 NCO，4nt，和VacO版本。传代了8个版本的IE2突变体，并通过PCR和免疫印迹分析进行了分析。这些结果表明，使包含推定的Zn-结合结构域的C-末端内的His残基发生突变有助于在病毒传代后使IE2表达和基因序列稳定。
重新评估了IE融合体以鉴定IE2是造成不稳定的主要因素。对应的His在IE融合体的C-末端被突变为Ala残基。基于此前的数据(图4)，被工程化以插入IGR3位点的IE融合体的4nt版本上的残基被突变-IE融合体4nt的H363A和/或H369A突变体之一。与三链体相反，观察到IE融合体4nt的全部三种突变体版本在蛋白水平上的达P10的延长的稳定性；然而，在双突变体上观察到极少的非特异性PCR产物(图16C，左)。这些构建体与pp65结合作为进一步分析的候选物。
实施例7：将全部三种HCMV抗原组合成单个MVA
已鉴定出两个构建体会稳定表达IE1和pp65：(A)MVA BAC：：IE1 4nt(IGR3)：：pp65(Del3)和(B)MVABAC：：IE1 VacO(IGR3)：：pp65(Del3)。对突变的H363A和/或H369A对IE2稳定性的效果进行评价后，则将多种突变体IE2版本插入前述构建体之一的MVA位点044L/045L。根据此前的评估IE2稳定性的研究，很明显的是尽管IE1具有的在核苷酸水平上的性质使其在某些位置不稳定，但通过将IE1插入MVA的不同位点可以减轻该不稳定性。相反，IE2难以找到使其在MVA中的表达“稳定”的位置和序列。C-末端His突变后，044L/045L位点的基因和蛋白稳定性得到了改善。鉴定IE2是不稳定的主要因素，因此重新评估了IE融合体。生成了IE融合体的突变体，包括使IE2部分的C-末端上的His残基发生诱变。然而，由于插入Del2中的基因的不稳定性，未寻求该位点内的插入基因。生成了IE融合体，IE融合体4nt，和IE融合体VacO的H363A和/或H369A突变体之一。IE融合体的这些变体插入IGR3或044L/045L，同时还含有在Del3中的pp65。三链体变体完成后，转基因的表达HLA的小鼠的接种可用来比较由IE融合体突变体生成的免疫原性和重新衍生的具有单独的IE1和IE2基因的三链体，均具有图8所示的His突变。
此外，C-末端His突变延长了IE2的044L/045L位点和IE融合体的IGR3位点内的基因和蛋白质的稳定性。三种构建体(IE2 NCO H363A(i)；IE2 4nt H369A(v)，IE2 4ntH363A/H369A(vi))在(A)情境下至P10是稳定的，所有三种抗原(IE1，IE2，pp65)均从单个MVA表达(图17-19)。(B)背景下的5个构建体(B)从单个MVA稳定地表达全部三种抗原(图20-24)。然而，构建体B(ii)(图21)似乎在P10显示降低的pp65表达。在P10也观察到了构建体B(v)中IE1表达的降低(图23)。总体而言，6个构建体(A(i)，A(v)，A(vi)，B(i)，B(iii)和B(vii))显示所有3种抗原在超过10次病毒连续传代期间的稳定表达，如PCR和免疫印迹分析所评估的那样。这些结果表明，IE2的推定的Zn-指结合结构域内的单和双突变帮助稳定了所有3种抗原的表达。
也表征了IE融合体的突变体的10次连续病毒传代期间稳定表达(图25和26)。与IE融合体IGR3(图9)相比，IE融合体4nt H363A(IGR3)：：pp65(Del3)显示了超过P7的更高的稳定性(图25)。对于P10，观察到IE融合体PCR产物的轻微降低(图25，左)，通过免疫印迹在P10观察到了pp65蛋白的轻微降低(图25，右)。相反，IE融合体4nt H369A(IGR3)：：pp65(Del3)显示在P7<n>P10有IE融合体和pp65蛋白的减少(图26，右)。IE融合体PCR产物未见明显降低；但是，在P10有pp65 PCR产物的明显减少。这些结果表明，IE融合体4nt H363A(IGR3)：：pp65(Del3)稳定地表达这些CMV抗原，H363A突变有助于维持蛋白表达和PCR产物完整性。
实施例8：第二代三链体的免疫原性
新的三链体变体的构建完成后，进行免疫原性研究以将由IE融合体变体突变体和重新衍生的具有分开的IE1和IE2变体的第二代三链体生成的免疫原性与第一代三链体进行对比。除三链体外，用6个第二代三链体构建体(A(i)，A(v)，B(i)，B(iii)，B(vii)，IE融合体4nt H363A(IGR3)：：pp65(Del3))将表达HLA-B HLA-B*0702(B7)或HLA-A*0201(HHD-II)I类分子的转基因C56BL/6小鼠免疫。通过腹膜内(i.p.)途径以2.5x107PFU(对于B7小鼠)或5x107PFU(对于HHD-II)以3周的间隔给小鼠接种两次多种构建体，然后分离脾细胞。通过ELISpot评估，将第二代三链体诱发的人MHC限制性T-细胞反应与原始三链体和未接种疫苗的未处理(naive)组进行了比较(表6)。对于表6，用表达IE融合体/pp65(IEFus)或IE1/IE2/pp65的多种构建体对表达HLA-B*0702(B7，上)或HLA-A*0201(HHD-II，下)I类分子的转基因C57BL/6小鼠进行免疫。通过IFN-γ酶联免疫斑点吸收剂(ELISPOT)试验用pp65-，IE1-，和IE2-特异性文库，pp65和IE1的HLA-B*0702-或HLA-A*0201限制性免疫显性表位确定了抗原特异性T-细胞应答。DMSO用作阴性对照。从HLA-B7(上)或HHD-II(下)小鼠的(N)数量计算了平均值和标准平均误差(SEM)。SFC：细胞因子特异性斑点形成细胞。
表6.由第二代三链体诱发的人MHC-限制性T-细胞应答
Figure BDA0002892541820000411
图27A显示第二代三链体构建体诱发了与三链体可比的T-细胞应答。然而，构建体B(i)相比其他第二代三链体构建体在B7小鼠(图27A，左)中表现不佳。在诱发的T-细胞应答方面，构建体A(i)与B7和HHD-II小鼠的三链体最为相似(图27的A)。
如FACS分析所分析的那样，还进行了来自从免疫小鼠分离的脾细胞的T细胞刺激以评估抗原特异性T-细胞应答(表7)。对于表7，用表达IE融合体/pp65(IEFus)或IE1/IE2/pp65之一的多种构建体对表达HLA-B*0702(B7，上)或HLA-A*0201(HHD-II，下)I类分子的转基因C57BL/6小鼠进行免疫。用细胞内细胞因子染色(ICS)以及随后的用pp65-，IE1-，和IE2特异性文库或pp65和IE1的HLA-B*0702-或HLA-A*0201限制性免疫显性表位对抗原特异性T-细胞应答进行了评价。DMSO被用作阴性对照。示出了来自具有不同刺激的B7或HHD-II免疫小鼠的脾细胞刺激后分泌IFN-γ的CD8+-T细胞的百分比。从HLA-B7(上)或HHD-II(下)小鼠的(N)数量计算平均值和标准平均值误差(SEM)。
表7.第二代三链体的HLA-B*0702-或HLA-A*0201-限制性CD8+T-细胞刺激
Figure BDA0002892541820000421
图27B重申了通过ELISpot分析的观察结果(图27A)。然而，在B7小鼠中，B(vii)相比其他构建体似乎具有更高的T细胞刺激，包括三链体(图27B，左)。总体而言，所有的构建体在B7(图27B，左)和HHD-II(图27B，右)中表现得与三链体同样地好。
实施例9：通过Zn-指His突变的IE2稳定性的机制
已经观察到位于IE2蛋白的C-末端内的一个或两个His残基发生突变后在MVA中表达的IE2的稳定性的增加。为了检查IE2突变体对整体IE2稳定性的影响，构建了MVA以携带IE2的两个拷贝：G1L中的IE2 NCO(野生型)，另一个在携带IE2突变体的044/045L位点中。携带两个IE2拷贝的MVA构建体在小仓鼠肾脏(BHK)细胞中传代至P5(图28)。IE2的两个拷贝的PCR分析均未显示非特异性PCR产物，仅有尺寸正确的产物(图28A)。另一方面，免疫印迹分析显示IE2在含有两个IE2拷贝的构建体中的一致的表达，而MVA：IE2 NCO(G1L)显示全长IE2表达的下降，出现了～40kDa的条带(图28B)，证实了此前观察到的截短的产物(图7)。虽然免疫印迹显示来自带有两个IE2拷贝的MVA的IE2的表达具有一些降解产物，但是在MVA：IE2 NCO(G1L)中没有观察到预期会从传代中累积的降解产物的伴随增加以及IE2的降解。这些结果可能暗示了突变体IE2基因插入体的存在“挽救(rescue)”了此前观察到的IE2不稳定性。
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Claims (20)

1.一种用于共表达两个或更多个巨细胞病毒(CMV)抗原的表达系统，包含遗传修饰的重组痘苗安卡拉(rMVA)载体，该载体中插入了编码两个或更多个CMV抗原或其抗原性部分的两个或更多个核酸序列，其中所述CMV抗原或其抗原片段包括IE1外显子4(IE1/e4)，IE2外显子5(IE2/e5)，IE融合体，和pp65，并且其中所述两个或更多个核酸序列被插入选自044L/045L，IGR3，G1L/I8R，和Del3的一个或多个插入位点。
2.如权利要求1所述的表达系统，其中，所述两个或更多个核酸序列可操作地连接至单个启动子并受所述单个启动子的控制。
3.如权利要求2所述的表达系统，其中，所述启动子是mH5启动子。
4.如权利要求1-3中任一项所述的表达系统，其中，一个或多个核酸序列被密码子优化以去除连续的胞嘧啶或鸟嘌呤且仍表达同样的氨基酸。
5.如权利要求1-4中任一项所述的表达系统，其中，所述CMV抗原的氨基酸序列包含一个或多个突变以改善所述rMVA在病毒传代时的遗传稳定性。
6.如权利要求1-5中任一项所述的表达系统，其中，IE1和IE2或其抗原性片段被表达为IE融合蛋白。
7.如权利要求1-6中任一项所述的表达系统，其中，表达所述CMV抗原的所述rMVA在至少10次传代后在遗传上稳定。
8.一种疫苗组合物，包含免疫有效量的重组修饰的痘苗安卡拉(rMVA)载体，其中插入了编码两个或更多个CMV抗原或其抗原性部分的两个或更多个核酸序列，其中所述CMV抗原或其抗原性片段包括IE1外显子4(IE1/e4)，IE2外显子5(IE2/e5)，IE融合，和pp65，并且其中所述两个或更多个核酸序列被插入选自044L/045L，IGR3，G1L/I8R，和Del3的一个或多个插入位点。
9.如权利要求8所述的疫苗组合物，其中，所述两个或更多个核酸序列可操作地连接至单个启动子并受所述单个启动子的控制。
10.如权利要求9所述的疫苗组合物，其中，所述启动子是mH5启动子。
11.如权利要求8-10中任一项所述的疫苗组合物，其中，一个或多个核酸序列被密码子优化以去除连续的胞嘧啶或鸟嘌呤且仍表达同样的氨基酸。
12.如权利要求8-11中任一项所述的疫苗组合物，其中，所述CMV抗原的氨基酸序列包含一个或多个突变以改善所述rMVA在病毒传代时的遗传稳定性。
13.如权利要求8-12中任一项所述的疫苗组合物，其中，IE1和IE2或其抗原性片段被表达为IE融合体蛋白。
14.如权利要求8-13中任一项所述的疫苗组合物，其中，表达所述CMV抗原的所述rMVA至少10次传代后在遗传上稳定。
15.一种通过向有此需要的受试者施用权利要求8-14中任一项所述的疫苗来诱发或改变受试者的免疫应答的方法。
16.如权利要求15所述的方法，其中，所述受试者是哺乳动物。
17.如权利要求15所述的方法，其中，所述受试者是人。
18.一种通过导入选自以下的一种或多种修饰来改善表达两个或更多个CMV抗原或其抗原性片段的rMVA的稳定性的方法：(1)将编码所述CMV抗原或其抗原性片段的一个或多个核酸序列插入一个或多个插入位点，包括044L/045L，IGR3，G1L/I8R，和Del3；(2)对编码所述CMV抗原的所述核酸序列进行密码子优化；和(3)将一个或多个突变引入所述CMV抗原的氨基酸序列。
19.如权利要求18所述的方法，其中，所述CMV抗原或其抗原性片段包括IE1外显子4(IE1/e4)，IE2外显子5(IE2/e5)，IE融合体(例如IE1和IE2或IE1/e4和IE2/e5的融合体)，和pp65。
20.如权利要求18所述的方法，其中，所述密码子优化包括从所述核酸序列去除连续的胞嘧啶或鸟嘌呤。
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