EA024749B1 - Экспрессионный вектор со сниженным уровнем внутримолекулярной рекомбинации, содержащий гомологичные или гетерологичные нуклеотидные последовательности - Google Patents

Экспрессионный вектор со сниженным уровнем внутримолекулярной рекомбинации, содержащий гомологичные или гетерологичные нуклеотидные последовательности Download PDF

Info

Publication number
EA024749B1
EA024749B1 EA201170715A EA201170715A EA024749B1 EA 024749 B1 EA024749 B1 EA 024749B1 EA 201170715 A EA201170715 A EA 201170715A EA 201170715 A EA201170715 A EA 201170715A EA 024749 B1 EA024749 B1 EA 024749B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
nucleotides
nucleotide sequences
virus
sequences
mua
Prior art date
Application number
EA201170715A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201170715A1 (ru
Inventor
Робин Штайгервальд
Original Assignee
Бавариан Нордик А/С
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Бавариан Нордик А/С filed Critical Бавариан Нордик А/С
Publication of EA201170715A1 publication Critical patent/EA201170715A1/ru
Publication of EA024749B1 publication Critical patent/EA024749B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C12N15/863—Poxviral vectors, e.g. entomopoxvirus
    • C12N15/8636—Vaccina virus vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/64—General methods for preparing the vector, for introducing it into the cell or for selecting the vector-containing host
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C12N15/863—Poxviral vectors, e.g. entomopoxvirus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C12N15/861—Adenoviral vectors
    • C12N15/8613—Chimaeric vector systems comprising heterologous sequences for production of another viral vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/24011—Poxviridae
    • C12N2710/24111—Orthopoxvirus, e.g. vaccinia virus, variola
    • C12N2710/24121—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/24011—Poxviridae
    • C12N2710/24111—Orthopoxvirus, e.g. vaccinia virus, variola
    • C12N2710/24134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/24011—Poxviridae
    • C12N2710/24111—Orthopoxvirus, e.g. vaccinia virus, variola
    • C12N2710/24141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/24011—Poxviridae
    • C12N2710/24111—Orthopoxvirus, e.g. vaccinia virus, variola
    • C12N2710/24141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/24143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/24011—Poxviridae
    • C12N2710/24111—Orthopoxvirus, e.g. vaccinia virus, variola
    • C12N2710/24151—Methods of production or purification of viral material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/11011—Alpharetrovirus, e.g. avian leucosis virus
    • C12N2740/11022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/14011—Filoviridae
    • C12N2760/14111—Ebolavirus, e.g. Zaire ebolavirus
    • C12N2760/14122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2799/00—Uses of viruses
    • C12N2799/02—Uses of viruses as vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/22—Vectors comprising a coding region that has been codon optimised for expression in a respective host

Abstract

Изобретение относится к векторам, содержащим две или более гомологичные нуклеотидные последовательности, и к способам их получения. Изобретение затрагивает замещение оснований в гомологичных нуклеотидных последовательностях на отличающиеся основания таким образом, чтобы не изменять кодируемую аминокислотную последовательность. Изобретение делает возможным снижение внутримолекулярной рекомбинации между гомологичными нуклеотидными последовательностями, в особенности в клетках млекопитающих.

Description

Феномен гомологичной рекомбинации нуклеиновых кислот предусматривает физический разрыв и воссоединение разнородных цепей нуклеиновых кислот в пределах гомологичных последовательностей. Рекомбинация и генная конверсия в клетках млекопитающих исследовались многими группами, которые наблюдали восстановление селектируемых генов после инфицирования соответствующим образом сконструированными вирусными или плазмидными субстратами (СЬакгаЬагй е! а1., Мо1. Се11. ΒίοΙ. 6:25202526, 1986). Результаты этих экспериментов показывают, что клетки эффективно поддерживают как внутри-, так и межмолекулярную рекомбинацию и генную конверсию (И). Межмолекулярная рекомбинация относится к рекомбинации между гомологичными последовательностями, представленными в двух различных молекулах нуклеиновой кислоты, тогда как внутримолекулярная рекомбинация относится к рекомбинации между гомологичными последовательностями, представленными в одной и той же молекуле нуклеиновой кислоты.
Межмолекулярная рекомбинация может произойти между генами в плазмиде или вирусе и гомологичными последовательностями внутри клетки (МШег е! а1., Мо1. Се11. Βίο1. 6:2895-2902, 1986). Этот тип рекомбинации может быть причиной образования инфекционного вируса из ослабленного вируса. Рц11ег е! а1. кодон-оптимизировали выделенные последовательности генов Н1У-1 дад и Н1У-1 ро1 для увеличения их экспрессии в клетках млекопитающих. Эти оптимизации также снизили идентичность нуклеотидов в перекрывающейся области длиной примерно 200 нуклеотидных пар, представленной в Ηΐν гене дад-ро1, что также привело к сниженным уровням внутримолекулярной рекомбинации между открытыми рамками считывания дад и ро1, расположенными в двух независимых плазмидах, и усеченным геном дад, содержащимся в рекомбинантном ретровирусном векторе (Ри11ег е! а1., Нит. Сепе ТНег. 12:2081-2093, 2001.)
Внутримолекулярная рекомбинация может происходить между векторами, в которых дуплицированные области гена или генного фрагмента представлены как прямые повторы, разделенные вставочными последовательностями. Этот тип рекомбинации обычно приводит к делеции вставочных последовательностей и одной копии повторяющихся последовательностей. Частота внутримолекулярной рекомбинации обычно намного выше, чем частота межмолекулярной рекомбинации.
Уровень внутримолекулярной рекомбинации в плазмидных векторах был подсчитан для клеток животных (КиЬпН/ апб 8иЬгат1, Мо1. Се11. Βίο1. 4:2253-2258, 1984). В зависимости от размера гомологичных областей, частота межмолекулярной рекомбинации в трансфицированной плазмидной ДНК варьирует между 0,306 и 0,002% (И). Низкая эффективность рекомбинации наблюдалась для гомологии всего лишь 14 нуклеотидных пар (И).
Внутримолекулярная рекомбинация между гомологичными последовательностями также подтверждена документально для многих животных вирусов, включая пикорнавирусы, вирус гриппа, аденовирусы и поксвирусы (СгН/ е! а1., 1. νίΐΌ1. 64:5948-5957, 1990). Для вирусов вакцины было показано, что тандемно дуплицированные последовательности являются генетически нестабильными (И). Для вирусов наблюдаемый уровень внутримолекулярной рекомбинации был гораздо более высоким, чем для плазмидных векторов.
Например, для ретровируса частота рекомбинации между двумя идентичными последовательностями в одной и той же РНК молекуле была найдена равной примерно 62% (2Ьапд е! а1., 1. νίΐΌ1. 75:63486358, 2001). 99% этих рекомбинаций были внутримолекулярными (между двумя последовательностями одной молекулы РНК), в противоположность межмолекулярной (между двумя молекулами РНК) (И). Для аденоассоциированного вируса внутримолекулярная рекомбинация также была найдена гораздо более эффективной по сравнению с межмолекулярной рекомбинацией (Окн е! а1., 1. νίΐΌ1. 79:6801-6807, 2005). Было показано, что Негрек 5ипр1е.\ вирус тип I также демонстрирует высокие уровни рекомбинации (Όιιίαΐι е! а1., 1. νίΐΌ1. 66:277-285). Для поксвирусов наблюдали высокую частоту гомологичной рекомбинации. Экспериментальную систему использовали для определения рекомбинации для вирусов вакцины путем расположения гена тимидинкиназы (!к) между двумя прямыми повторами 1,5 тпо ДНК (Ва11, 1. νίΐΌ1. 61: 1788-1795, 1987). В течение каждого из первых восьми пассажей при неселективных условиях 40% !к+ вирусов вакцины потеряли свой !к+ фенотип (И). При неселективных условиях относительное количество !к- вирусов увеличилось до 99,73% общей популяции вируса (И). Даже при селективных условиях рекомбинация происходила с такой высокой частотой, что большинство инфекционных вирусных частиц, которые было возможно выделить из единичных бляшек, содержали ДНК, которая уже подверглась рекомбинации, с последующей потерей гена !к (И). Используя рекомбинантный вирус вакцины, сконструированный для экспрессии трех гетерологичных генов, все экспрессируемые с νν р7.5промоторов, Но\\1еу е! а1., Сепе 172:233-237, 1996, продемонстрировали рекомбинацию между повторяющимися последовательностями промоторов. Рекомбинант вируса вакцины, сконструированный как содержащий область С-повтора (СКК) из М-белка 8!гер!ососсик руодепек, содержит сложную смесь вариантов, содержащих от 1 до более чем 20 копий СКК (НгиЬу е! а1., Ρ.Ν.Α.δ. 88:3190-3194, 1991).
Хотя и было показано, что множественные гены с гомологией примерно 60-75%, вставленные в различные сайты интеграции МVΑ, приводят к стабильному множественному рекомбинантному вирусу (\νϋ 03/097846), в области техники существует, однако, необходимость в композициях и способах, кото- 1 024749 рые снижают уровень внутримолекулярной рекомбинации в векторах, таких как, например, вирусные векторы, для обеспечения получения стабильных векторов, содержащих множественные гомологичные нуклеотидные последовательности, содержащие более длинные идентичные участки.
Изобретение
Настоящее изобретение относится к рекомбинантным векторам и способам их изготовления и применения.
В особенности, настоящее изобретение охватывает вектор, содержащий две нуклеотидные последовательности размером 300 нуклеотидов, каждая кодирующая 100 аминокислот, где 100 аминокислот, кодируемые каждой из двух нуклеотидных последовательностей, имеют по меньшей мере 75% идентичных аминокислот и где одна из двух нуклеотидных последовательностей имеет по меньшей мере 75 отличных от другой нуклеотидной последовательности нуклеотидов, где отличающиеся нуклеотиды не изменяют идентичные аминокислоты, кодируемые названными двумя нуклеотидными последовательностями.
Поразительно, как было показано в соответствии с настоящим изобретением, риск межмолекулярной рекомбинации может быть не только значительно снижен, но и даже избегнут путем систематического замещения однозначных кодонов в по меньшей мере двух похожих или идентичных нуклеотидных последовательностях внутри одной молекулы нуклеиновой кислоты, такой, например, как вектор, таким образом, приводя к созданию стабильных векторов, содержащий по меньшей мере две или более похожие или идентичные нуклеотидные последовательности. Неожиданно, стратегия, используемая в настоящем изобретении, является также применимой для векторов, содержащих три или более похожих нуклеотидных последовательностей.
Результаты, полученные в настоящем изобретении, показывают, что является возможным заменить большое количество нуклеотидов в нуклеотидной последовательности для снижения внутримолекулярной рекомбинации в векторе, тогда как, неожиданно, экспрессия кодируемого белка в то же время все еще сохраняется. При введении большого количества нуклеотидных вариантов в длинные участки нуклеотидных последовательностей, как было сделано по настоящему изобретению, квалифицированный специалист может ожидать, что экспрессия указанной последовательности или гена более не будет правильно работать, т.е. не ожидалось, что измененная нуклеотидная последовательность будет оставаться подходящей для эффективной экспрессии. Используемая здесь стратегия пригодна не только для коротких участков нуклеотидных последовательностей длиной 300 нуклеотидов, но также и для гораздо более длинных участков, например, полноразмерных генов, которые, конечно, содержат участки длиной 300 нуклеотидов как заявлено. Результаты являются применимыми для множества различных генов, векторов и вирусов и являются крайне полезными для разработки вакцин, как, например, разработка мультивалентных вакцин, но также могут быть полезными для других технологий, как, например, экспрессия белков или для получения рекомбинантных клеточных линий.
В других вариантах осуществления изобретение также охватывает способы получения вирусов и векторов и способы для снижения внутримолекулярной рекомбинации.
Изобретение охватывает способ получения вектора, как описано выше, и названный способ включает стадии а) получения первой нуклеотидной последовательности длиной 300 нуклеотидов, кодирующей 100 аминокислот; б) получения второй нуклеотидной последовательности длиной 300 нуклеотидов, кодирующей 100 аминокислот, где 100 аминокислот, кодируемые каждой из двух нуклеотидных последовательностей, имеют по меньшей мере 75% аминокислотной идентичности и где одна из двух нуклеотидных последовательностей имеет по меньшей мере 75 нуклеотидов, отличающихся от другой нуклеотидной последовательности, где отличающиеся нуклеотиды не изменяют идентичные аминокислоты, кодируемые названными двумя нуклеотидными последовательностями; в) интеграции двух различающихся нуклеотидных последовательностей в вектор.
В особенно предпочтительном варианте осуществления изобретение охватывает способ для снижения внутримолекулярной рекомбинации в векторе, содержащем две нуклеотидные последовательности длиной 300 нуклеотидов, кодирующих каждая 100 аминокислот, где 100 аминокислот, кодируемые каждой из двух нуклеотидных последовательностей, имеют по меньшей мере 75% аминокислотной идентичности, названный способ включает замену нуклеотидов в одной или обеих нуклеотидной(ых) последовательности(ях) для получения двух различающихся последовательностей, которые имеют отличие по меньшей мере в 75 нуклеотидов, где отличающиеся нуклеотиды не изменяют идентичные аминокислоты, кодируемые названными двумя нуклеотидными последовательностями.
При использовании вирусных векторов способ снижает уровень внутримолекулярной рекомбинации в течение каждого поколения вирусного распространения. Предпочтительно гомологичные нуклеотидные последовательности рекомбинируют менее чем в 20, 15, 10, 5, 3, 2, 1, 0,5, 0,1, 0,05 или 0,01% вирусного потомства на поколение.
В другом предпочтительном варианте осуществления изобретение охватывает способ получения вируса, предпочтительно поксвируса, содержащего две гомологичные нуклеотидные последовательности, где указанный способ включает стадии а) получения вируса, содержащего нуклеотидную последовательность длиной 300 нуклеотидов, кодирующую 100 аминокислот, и Ь) интеграции второй нуклеотид- 2 024749 ной последовательности длиной 300 нуклеотидов, кодирующей 100 аминокислот, в вирус; где 100 аминокислот, кодируемые каждой из двух нуклеотидных последовательностей, имеют по меньшей мере 75% аминокислотной идентичности и где одна из двух нуклеотидных последовательностей имеет по меньшей мере 75 нуклеотидов, отличающихся от другой нуклеотидной последовательности, где отличающиеся нуклеотиды не изменяют идентичные аминокислоты, кодируемые названными двумя нуклеотидными последовательностями.
Как используется здесь, вектор может быть любым средством, способным доставлять и экспрессировать молекулы нуклеиновой кислоты в клетку-хозяина или объект. Так, вектор может быть ПЦРпродуктом или любым фрагментом нуклеиновой кислоты, введенным в клетку и/или интегрированным в клеточный геном; или репликоном, таким как плазмида, фаг или космида, в который может быть вставлен другой фрагмент ДНК таким образом, чтобы осуществлять репликацию вставленного фрагмента. В общем случае, вектор может реплицироваться, когда он ассоциирован с подходящими контрольными элементами. Подходящие векторные основы для использования по настоящему изобретению включают, например, те, что используются повсеместно в области техники, такие как плазмиды, вирусы, искусственные хромосомы, ВАС, УАС или РАС, или даже рекомбинантные клетки, такие как бактерии или эукариотические клетки. Термин вектор включает векторы для клонирования и экспрессии, также как и вирусные векторы и интегрирующие векторы. Экспрессионный вектор является вектором, который содержит регуляторную область. Подходящие экспрессионные векторы для использования в настоящем изобретении включают, без ограничения, плазмиды и вирусные векторы, полученные из, например, растительных вирусов, бактериофагов, бакуловирусов, вируса табачной мозаики, ретровирусов и поксвирусов. Подходящие невирусные векторы включают плазмиды, такие как рРЕР4, рСЕР4 (1иу1!годеие), рС1 (Рготеда), рСЭМ8 (§еей, 1987, Ыа!иге 329, 840), рУАХ и ρ^Αίζ (Сеие ТЬегару 8ук!ет 1ис; ШтоиФ е! а1, 2002, 1. У1го1. 76, 12735-12746). Многочисленные векторы и экспрессионные системы являются коммерчески доступными у различных корпораций, таких как Ыоуадеи (Май1кои, Αίδ.), С1ои!есЬ (Ра1о А1!о, СайГ.). §!га!адеие (Ьа 1о11а, СаНГ.) и ТиуйгодеиЫГе ТесЬио1од1ек (Саг1кЪай, СаНГ.).
При разработке вакцин рекомбинантный вирус может быть использован в качестве векторапереносчика или вектора вакцины для доставки генетического материала в клетку. Оказавшись в клетке, генетическая информация транскрибируется и транслируется в белки, включая интегрированный антиген, направленный против определенного заболевания. Лечение является успешным, если антиген, доставленный вектором в клетку, индуцирует иммунный ответ организма против антигена, который защищает от заболевания.
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения вектор является плазмидой или вирусным вектором.
Вирусный вектор может быть основан на ослабленном вирусе, который не может реплицироваться в клетке-хозяине, но способен индуцировать и экспрессировать чужеродный ген в инфицированной клетке. Вирус или рекомбинантный вирус является, таким образом, способным продуцировать белок и презентировать его иммунной системе хозяина. Некоторые основные характеристики вирусных векторов таковы, что они могут вызывать гуморальный (В-клеточный) и/или клеточно-опосредованный (Тклеточный) иммунный ответ.
Вирусные векторы могут быть получены из множества различных вирусов. В одном варианте осуществления, вирус является вирусом животных. Вектор может быть получен специально из вируса, выбранного из группы вирусов, состоящей из ретровируса, пикорнавируса, вируса гриппа, аденовируса, адено-ассоциированного вируса (ААУ), поксвируса, вируса герпеса (например, Н8У-1), вируса кори и губчатого вируса.
Вирусные векторы часто используются исследователями для разработки вакцин для предотвращения и лечения инфекционных заболеваний и рака. Из этих, поксвирусы (включая чуму канареек, коровью оспу и оспу птиц) относятся к группе наиболее распространенных кандидатов для векторных вакцин. Поксвирусы являются предпочтительным выбором для переноса генетического материала в новые хозяева из-за их относительно большой вместимости для вставки последовательностей в вирусный геном и из-за их способности реплицировать их геном и проводить транскрипцию в цитоплазме инфицированной клетки вместо ядра, таким образом минимизируя риск инсерционного мутагенеза путем интегрирования генетического материала в геном клетки-хозяина, как происходит для других векторов, например, ретровирусных векторов. Вирионы поксвирусов являются более большими по сравнению с большинством других вирусов животных (более детально см. РтеЩк е! а1., ейк., Уио1оду, 3гй ЕйШон Уо1ите 2, СЬар!ег 83, радек 2637 ГГ).
В предпочтительном варианте осуществления изобретения вирусный вектор получен из поксвируса (см., например, Сох е! а1. ш Уиикек ш Нитаи Сеие ТЬегару, Ей 1. М. Нок, СагоЬиа Асайетю Ргекк). Он может быть получен из любого члена рохутйае и может быть, в частности, авипоксвирусом или ортопоксвирусом.
Примеры авипоксвирусов, подходящих для использования в настоящем изобретении, включают любой авипоксвирус, такой как РоМрохутк, Саиагурохутк, иисороху1гик, Муиайрохутк, Р1деоироху1гик, РкЫастерохуиик, Риайрохуиик, Реасоскроху1гик, Реидширохутк, 8рагго№роху1гик, 81аг1шдроху1гик и
- 3 024749
Тигкеуроху1гик. Предпочтительными авипоксвирусами являются Сапагурохукик и Ро\у1рохуйик.
Авипоксвирусы являются в природе ограниченными по хозяину и продуктивно реплицируются только в птичьих видах и клетках (Тау1ог е! а1., Вю1одюа1 апб нптиподепю ргорегйек оГ а сапагурох-гаЫек гесотЬшап!, АЬУАС-КС (уСР65) ίη поп-ау1ап креаек. Уассте 13: 539-549, 1995). Если человеческие клетки инфицированы авипоксвирусами, гетерологичные гены экспрессируются с вирусного генома. Однако авипоксвирус не полностью реплицируется в человеческих клетках и, таким образом, нет риска, что человеческому существу будет нанесен вред продуктивной вирусной репликацией. Различные рекомбинантные авипоксвирусы были сконструированы таким образом, чтобы экспрессировать так называемые продукты лентивирусных генов (ИЗ 5766598), цитокины и/или рак-ассоциированые антигены (ИЗ 5833975) или О-гликопротеин бешенства (Тау1ог е! а1., Вю1одюа1 апб нптиподепю ргорегйек оГ а сапагурох-гаЫек гесотЫпап!, АЬУАС-КО (уСР65) ш поп-ау1ап кретек, Уассте 13: 539-549, 1995). Рекомбинантный сапагурох вирус, экспрессирующий четыре Н1У гена дад, ро1, епу и пеГ, был уже использован в клинических испытаниях (Ре1егк, В.З., Тке Ьак1к Гог Н1У нптипобюгареШю уассшек, Уассте 20: 688705, 2001).
Поскольку авипоксвирусы продуктивно реплицируются только в птичьих клетках, эти клетки должны быть использованы для амплификации вируса и для получения рекомбинантных вирусов.
Примером сапагурох вируса является штамм Кеп!кск1ег. Очищенный на бляшках Сапагурох штамм, названный АЬУАС (ИЗ 5766598), был помещен в соответствии с условиями Будапештского договора в Атепсап Туре СиИиге Со11ес!юп (АТСС), номер доступа УК-2547. Другой штамм Сапагурох является коммерческим сапагурох вакцинным штаммом, обозначенным ЬР2 СЕР 52 4 24 10 75, имеющимся в наличии в 1пкй!и!е Мейеих, 1пс.
Примерами РоМрох вируса являются штаммы РР-1, РР-5 и ТКОУАС (ИЗ 57 66598). РР-1 является Ииуейе штаммом, модифицированным для использования в качестве вакцины для цыплят возрастом один день. Штамм является коммерческим вакцинным штаммом Го\\1рох вируса, обозначенным 0 Ώί',ΈΡ 25/СЕР67/2309 Ос!оЬег 1980 и имеющимся в наличии в 1пкй!и!е Мейеих, 1пс. РР-5 является коммерческим вакцинным штаммом Го\\1рох вируса, выделенным из эмбрионов цыплят, имеющимся в наличии в Атепсап Зтепййс ЬаЬога!ойек (ТОйакюп оГ Зскеппд Согр.) Мабюоп, ХУйсопкнг Ипкеб З!а!ек Уе!ейпагу Шепке Ыо. 165, кейа1 Ыо. 30321.
Из поксвирусов виды уастта (коровья оспа) и уайо1а (натуральная оспа) являются наиболее известными. Вирус уайо1а является причиной натуральной оспы. В отличие от вируса уайо1а, вирус уастта обычно не вызывает системного заболевания у иммунокомпетентных индивидуумов и, таким образом, использовался как живая вакцина для иммунизации против натуральной оспы. Успешная по всему миру вакцинация вирусом уастта привела в 1980-х к эрадикации натуральной оспы как природного заболевания (Тке д1оЬа1 егабюабоп оГ кта11рох. Р1па1 герой оГ !ке д1оЬа1 сотпнккюп Гог !ке сегОГюаОоп оГ кта11рох егабюабоп; Шк!огу оГ РиЬкс Неа1!к, Ыо. 4, Оепеуа: \Уог1б Неа1!к Огдаш/аОот 1980). С этого времени вакцинация была приостановлена на много лет, за исключением людей, имеющих высокий риск поксивирусной инфекции (например, работников лабораторий). Однако, возрастает опасение, что, например, уагю1а, вызывающая натуральную оспу, может быть использована как оружие биотерроризма. Более того, существует риск, что другие поксвирусы, такие как коровья оспа, верблюжья оспа и обезьянья оспа, могут потенциально мутировать, посредством механизмов селекции, и приобрести сходные с уагю1а фенотипы. Таким образом, некоторые правительства накапливают запасы уастша-основанных вакцин для использования как перед воздействием (перед встречей с вирусом уайо1а), так и после воздействия (после встречи с вирусом уайо1а) предполагаемой или актуальной атаки натуральной оспы.
В детальном предпочтительном варианте осуществления изобретения вектор является вектором на основе уастта вируса (вируса коровьей оспы).
Вирус уастта (вирус коровьей оспы) является чрезвычайно иммуностимулирующим и вызывает сильный В- (гуморальный) и Т-опосредованный (клеточный) иммунитет как к его собственным генным продуктам, так и к множеству продуктов чужеродных генов, экспрессируемых с генов, интегрированных в уастта геном. Вирус уастта представляется, таким образом, идеальным вектором для вакцин против натуральной оспы и других инфекционных заболеваний и рака в форме рекомбинантных вакцин. Многие из рекомбинантных вирусов коровьей оспы, описанных в литературе, основаны на полностью компетентном в репликации штамме уастта вируса ХУекЮгп Кекегуе. Однако, известно, что этот штамм имеет чрезвычайную нейровирулентность и является, таким образом, плохо подходящим для применения у людей и животных (Могйа е! а1. 1987, Уассше 5, 65-70).
Подходящий вирус уастта (вирус коровьей оспы) может быть выбран из группы, состоящей из штамма Сорепкадеп (ОоеЬе1 е! а1., 1990, У1го1. 179, 247-266 апб 517-563; 1окпкоп е! а1., 1993, Уиок 196, 381- 401), штамма \\>е1к ЫУУАС (см. \кО 92/15672 и Тайадка е! а1., 1992, Уйо1оду 188, 217-232) и сильно ослабленного модифицированного Апкага (МУА) штамма (Мауг е! а1., 1975, 1пГес!юп 3, 6-16).
Предпочтительным примером подходящего вируса уастта является сильно ослабленный штамм вируса уастта ЫУУАС, который получен из клонированного на бляшках изолята вакцинного штамма Сорепкадеп путем делеции 18 открытых рамок считывания (ОКР) из вирусного генома (ТайадИа е! а1., ЫУУЛС: А Ыдк1у а!!епиа!еб кйаш оГ уастта уник, Уйо1оду 188, 217-232, 1992). ЫУУЛС характеризуется
- 4 024749 существенно сниженной способностью к репликации в различных клетках культуры тканей человека, но остающейся способностью к индуцированию сильных иммунных ответов на посторонние антигены.
Все вышеописанные вирусы являются одинаково подходящими для использования в настоящем изобретении.
В наиболее предпочтительном варианте осуществления изобретения вирус является модифицированным вирусом коровьей оспы Апкага (МУА), который известен как исключительно безопасный при вакцинации.
Модифицированный вирус коровьей оспы Апкага (МУА) относится к вирусу Уаеейиа. члену рода ОйЬороху1ги5 в семействе Рохутбае. МУА был получен в 516 последовательных пассажах на фибробластах эмбриона цыпленка дермального уасшша штамма Апкага (СНог1оа11апЮ15 уасшша У1ги8 Апкага, СУА) (для обзора см. Мауг, А., е! а1., Ра55аде Н15!огу: ЛЬ51аттипд. Е1деи5сЬайеп ипб Уепуепбипд бе5 а!1епшепеп Уасшта-81атте5 МУА, ЬКесОоп 3, 6-14, 1975). Вследствие этих долговременных пассажей результирующий вирус МУА потерял примерно 31 килобаз своей геномной последовательности и, таким образом, был описан как сильно ограниченный по хозяину к птичьим клеткам (Меуег, Н. е! а1., Марршд о£ бе1еПоп5 ш 1Не депоте о£ 1Не ЫдЫу айеииа!еб уасшша уйи5 МУА апб 1Не1г тПиепсе оп ν^^и1еисе, 1. Сеп. У1го1. 72, 1031-1038, 1991; (Ме^5^иде^-Неи5сЬе1 е! а1., Сепоппс 5ес.1иепсе о£ сНопоа11апЮ15 уасшша У1ги5 Апкага, (Не апсе51ог о£ тобйгеб уасшша У1ги5 Апкага, 1. Сеп. Уйо1. 88, 3249-3259, 2007). Было показано на множестве животных моделей, что результирующий МУА является достоверно авирулентным (Мауг, А. & Вагтет К. УасшпаОоп адате! рох б15еа5е5 ипбег ^ттиио5ирр^е55^νе сопбйющ, Эсу. Вю1. 81апб. 41: 22534, 1978). Дополнительно, этот штамм МУА был протестирован в клинических испытаниях в качестве вакцины для иммунизации против натуральной оспы человека (Мауг е! а1., ΖΒ1. Вак!. Нуд. I, АЬ!. Огд. В 167, 375-390 [1987], 80ск1 е! а1., МУА уасшпаОоп адате! 5та11рох: с1йпса1 !е5!5 \\ЙН ап айепиа!еб йуе уасстеа У1ГЦ5 51гаш (МУА) (аи!Ьог'5 1гап51)„ ЭШсН. теб. \У5сНг. 99, 2386-2392, 1974). В этих испытаниях участвовали более 120000 человек, включая пациентов с высоким риском, и было доказано, что в сравнении с вакцинами на основе Уасшша МУА имеет уменьшенную вирулентность или инфективность, тогда как сохраняет хорошую иммуногенность.
Изобретение охватывает рекомбинантные МУА вирусы, полученные с любым и всеми МУА вирусами. Примером МУА штамма является депозит УК-1508, размещенный в Атепсап Туре Си1!иге со11есОоп (АТСС), Маиа55а5, УА 20108, И8А. В другом варианте осуществления штамм МУА-Уего или его производный может быть использован в соответствии с настоящим изобретением. Штамм МУА-Уего был помещен в Европейскую Коллекцию Животных Клеточных Культур под номером доступа ЕСАСС У99101431 и ЕСАСС 01021411. Дополнительными примерами для МУА вирусных штаммов, используемых в настоящем изобретении, являются штаммы МУА 572 и 575, помещенные в Европейскую Коллекцию Животных Клеточных Культур (ЕСАСС) под номерами доступа ЕСАСС У94012707 и ЕСАСС У00120707 соответственно. Особенно предпочтительные МУА вирусы являются МУА вариантными штаммами МУА-ΒΝ®, как, например, помещенный в ЕСАСС под номером У00083008, и производные, имеющие те же свойства, что МУА-ΒΝ®.
МУА-ΒΝ® является вирусом, используемым в производстве обособленной противооспенной вакцины третьего поколения. МУА-ΒΝ® был разработан для дополнительных пассажей МУА штамм 571/572. В настоящее время более чем 1500 субъектов, включая субъекты с атопическим дерматитом (АО) и ВИЧ-инфекцией, были вакцинированы в клинических испытаниях вакциной на основе МУАΒΝ®.
Производные, имеющие те же свойства, что и помещенный в коллекцию штамм МУА-ΒΝ®, имеют способность репродуктивной репликации ш уйго в фибробластах эмбриона цыпленка (СЕР), но не способность репродуктивной репликации в человеческих клетках, в которых МУА 575 или МУА 572 могут репродуктивно реплицироваться. Наиболее предпочтительно, МУА не имеет способности репродуктивной репликации в клеточной линии кератиноцитов человека НаСаТ, линии клеток почки эмбриона человека 293, клеточной линии человеческой остеосаркомы кости 143В и клеточной линии человеческой цервикальной аденосаркомы НеЬа.
Термин не способен к репродуктивной репликации использован в настоящем изобретении, как определено в \УО 02/42480 и патенте США № 6761893 соответственно. Так, указанный термин применяется к вирусу, который имеет коэффициент вирусной амплификации на 4 день после инфицирования менее чем 1, используя анализ, описанный в патенте США № 6761893, который включен здесь посредством ссылки. Коэффициент амплификации вируса является отношением количества вируса, продуцированного инфицированной клеткой (Выход), к количеству первоначально используемого для инфицирования клеток вначале (Ввод). Соотношение 1 между Выходом и Вводом определяет статус амплификации, где количество вируса, продуцируемого инфицированной клеткой, является тем же самым, что и количество, первоначально используемое для инфицирования клеток.
В наиболее предпочтительном варианте осуществления штамм МУА, используемый в настоящем изобретении, является МУА-ΒΝ® или его производным, как описано выше. Особенности МУА-ΒΝ®, описание биологических подходов, позволяющих определить, является ли МУА штамм МУА-ΒΝ® или
- 5 024749 его производным, и способы, позволяющие получить МУА-ΒΝ® или МУЛ, имеющих свойства МУАΒΝ®, раскрыты в \¥О 02/42480. Содержание этих заявок включено в настоящую заявку посредством ссылки. Высоко ослабленный МУА-ΒΝ® вирус может быть получен, например, путем дополнительного пассирования модифицированного вируса коровьей оспы Апкага (МУА), такого как МУА-572 или МУА575, и, при желании, очисткой на клонах или бляшках. МУА-ΒΝ® не имеет примерно 13% (26,5 тпо из шести больших и множественных мелких сайтов делеций) генома по сравнению с родовым СУА вирусом. Делеции затрагивают некоторое количество генов вирулентности и круга хозяев, также как и большой фрагмент гена, кодирующего А-тип белка включения (АТ1), и гена, кодирующего структурный белок, направляющий зрелые вирусные частицы в тельца включения А-типа.
В особенности, сделана ссылка на определение свойств МУА по изобретению, как описано в \¥О 02/42480, таких как свойства МУА-ΒΝ® и свойства МУА-ΒΝ® и определение производных МУА-ΒΝ®. Указанная ссылка также раскрывает, как МУА и другие вирусы коровьей оспы могут быть размножены. Коротко, эукариотические клетки инфицируются вирусом. Эукариотические клетки являются клетками, которые подвержены инфицированию соответствующим поксвирусом и позволяют репликацию и продукцию инфекционного вируса. Для МУА примером такого типа клеток являются фибробласты эмбриона цыпленка (СЕР) и ВНК клетки (Эгех1ег с1 а1., НщЫу айепиа1е4 тоФйеб уасшта Апкага герйса1е8 ίη ЬаЬу НатЦег кМпеу сеШ, а ро1епОа1 Нот £ог νίηΐδ ргорадайоп, ЬШ ηοΐ ίη уагюиз Нитап йапв&гтеб ап4 рптагу се1к, 1. Сеп. Уио1. 79, 347-352, 1998). СЕР клетки можно культивировать при условиях, известных специалисту в области техники. Предпочтительно, СЕР клетки культивируют в бессывороточной среде в стационарных флаконах или роллерных флаконах. Инкубацию предпочтительно продолжают 48-96 ч при 37°С. Для инфицирования МУА предпочтительно используется при множественности заражения (МО1) 0,05-1 ТСГО50; инкубация продолжается предпочтительно 48-72 ч при 37°С.
Вирус, при использовании по настоящему изобретению, может быть размножен на различных клеточных культурах, в особенности на культурах клеток животных. Вирусу позволяют инфицировать чувствительные клеточные культуры и репродуктивно реплицироваться. Вирусное потомство собирают с применением обычных в области техники методик.
Например, для МУА вирусов и других вирусов коровьей оспы, фибробласты эмбриона цыпленка (СЕР) в среде с сывороткой или в бессывороточной среде могут быть инфицированы вирусами. После того, как вирусу позволили репродуктивно реплицироваться, собирают вирусное потомство.
Настоящее изобретение также относится к рекомбинантным поксвирусам, предпочтительно вирусу коровьей оспы, в особенности МУА, допускающему экспрессию двух или более гомологичных нуклеотидных последовательностей, в частности, кодирующих последовательностей. Вирус может содержать две, три, четыре или более гомологичных нуклеотидных кодирующих последовательностей.
Вектор по настоящему изобретению содержит две нуклеотидные последовательности размером 300 нуклеотидов. В предпочтительном варианте осуществления вектор содержит три, четыре, пять, шесть и более нуклеотидных последовательностей, которые, конечно, включают также две заявленные нуклеотидные последовательности. 300 нуклеотидов могут, конечно, быть также частью более длинной нуклеотидной последовательности.
Кроме того, в различных вариантах осуществления две или более нуклеотидных последовательностей имеют размер 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 2500 или 3000 или даже более нуклеотидов, которые все могут быть частью более длинной нуклеотидной последовательности и которые, конечно, включают 300 нуклеотидов, как заявлено.
Как используется здесь, термины полинуклеотид, нуклеотидная последовательность, нуклеиновая кислота, молекула нуклеиновой кислоты используются взаимозаменяемо и определяют полимер либо полидезоксирибонуклеотидных (ДНК), либо полирибонуклеотидных (РНК) молекул или любую их комбинацию. Определение включает одно- и двухцепочечные, линейные или кольцевые, встречающиеся в природе или синтетические полинуклеотиды.
Нуклеотидная последовательность по настоящему изобретению может быть кодирующей последовательностью и может содержать полные гены соответственно. Термин кодирующая последовательность, как используется здесь, относится к нуклеотидной последовательности, которая кодирует определенную аминокислотную последовательность. Некодирующие последовательности генов включают интроны и контрольные области, такие как промоторы, операторы и терминаторы.
Нуклеотидные последовательности также могут содержать фрагменты генов. Нуклеотидные последовательности могут содержать синтетические последовательности, такие как нуклеотидные последовательности, кодирующие аминокислотные линкерные последовательности или эпитопы. Нуклеотидные последовательности могут состоять из смеси генов, фрагментов генов и синтетических последовательностей. Нуклеотидные последовательности могут также содержать аналоги, такие как нуклеотидные аналоги, аналоги фосфатных эфиров и/или аналоги пентозного сахара. Также в определение нуклеотидных аналогов включены нуклеотиды, в которых фосфатный эфир и/или сахаро-фосфатные эфирные связи замещены другими типами связей, такими как Ш(2-аминоэтил)глицин амиды и другие амиды (см., например, №е1веп е! а1., 1991, §аепсе 254: 1497-1500; \¥О 92/20702; патент США № 5719262; патент США
- 6 024749 № 5698685;); морфолины (см., например, патент США № 5698685; патент США № 5378841; патент США № 5185144); карбаматы (см., например, БйгсЬак & БиттеПоп. 1987, 1. Огд. СЬет. 52: 4202); метилен(метилимино) (см., например, Уаккеиг е! а1., 1992, 1. Ат. СЬет. Бос. 114: 4006); 3'-тиоформацетали (см., например, 1опек е! а1., 1993, 1. Огд. СЬет. 58: 2983); сульфаматы (см., например, патент США № 5470967); 2-аминоэтилглицин, часто упоминаемый как ΡΝΑ (см., например, ВисЬагб!, \УО 92/20702; №е1кеп (1991), Баепсе 254:1497-1500); и другие (см., например, патент США № 581781; Рйег & АЬтап, 1997, №с1. Ашбк Кек. 25:4429 и ссылки, процитированные в них). Аналоги фосфатных эфиров включают, но не ограничиваются, (ί) С1-С4-алкилфосфонат, например метилфосфонат; (ίί) фосфорамидат; (ίίί) С1-С6-алкил-фосфотриэфир; (ίν) фосфоротиоат и (ν) фосфородитиоат.
Дополнительные модификации включают химические модификации (например, см. \УО 92/03568; И8 5118672) с целью увеличения ίη νίνο стабильности нуклеиновой кислоты, усиления ее доставки, или снижения уровня очистки от объектов хозяина.
Более того, в одном варианте осуществления нуклеотидная последовательность может содержать гибридные гены, искусственные гены и полиэпитопы.
Гибридный ген, как обозначает здесь, является гибридным геном, сформированным из двух ранее самостоятельных генов, генных фрагментов или искусственной ДНК или эпитопов. Он может возникнуть в результате транслокации, интерстициальной делеции или инверсии.
Гибридный ген может быть сконструирован путем соединения по меньшей мере двух ДНК фрагментов, где ДНК фрагменты кодируют идентичные или различные аминокислотные последовательности.
Гибридные белки могут облегчать экспрессию и/или очистку белков. Например, полипептид по изобретению может быть получен как глутатион-Б-трансфераза (ΟδΤ) гибридный белок. Такие ΟδΤ гибридные белки могут быть использованы для облегчения очистки полипептида по изобретению, а именно путем использования глутатион-производных матриксов (см., например, Сиггеп! Рго!осо1к ίη Мо1еси1аг Вю1оду, ебк. АикиЬе1 е! а1. (Ν.Υ.: 1оЬп \УПеу & Бопк, 1991)). В другом варианте осуществления, гибридный ген, кодирующий лидерную последовательность для очистки, такую как поли-(Н1к)/сайт расщепления энтерокиназой на Ν-конце желаемой части рекомбинантного белка, может сделать возможным очистку проэкспрессированного гибридного белка способом аффинной хроматографии с использованием Νί2+ металлической смолы. Лидерная последовательность для очистки может быть удалена при обработке энтерокиназой для получения очищенного белка (например, см. НосЬиЬ е! а1. (1987), 1. СЬгота!одгарЬу 411: 177; апб 1апкпесЬ! е! а1., ΡΝΑδ υδΑ 88:8972). Дополнительные гетерологичные последовательности, кодирующие полипептид, позволяющий детекцию, изоляцию, растворение и/или стабилизацию полипептида, который был слит, включают поли-Ηίκ !ад, тус, НА, протеин А, протеин О, кальмодулинсвязывающий пептид, тиоредоксин, мальтозасвязывающий белок, полиаргинин, поли-Ηίκ-Ακρ, РЬАО, часть иммуноглобулинового белка и пептид трансцитоза.
Методы получения гибридных генов хорошо известны. Фактически, соединение различных ДНК фрагментов, кодирующих различные полипептидные последовательности, проводится в соответствии с обычными методами, включая тупые и липкие концы для лигирования, расщепление рестрикционными ферментами для получения соответствующих концов, достройка липких концов в случае необходимости, обработка щелочной фосфатазой для избегания нежелаемого соединения и ферментативное лигирование. В другом варианте гибридный ген может быть синтезирован традиционным методом, включающим автематическое синтезирование ДНК. Альтернативно, ПЦР амплификация фрагментов генов может проводиться с использованием якорных праймеров, что приводит к комплементарному перекрыванию между двумя последовательными фрагментами, которые могут быть последовательно соединены для получения химерной последовательности гена (см., например, Сиггеп! Рго!осо1к ш Мо1еси1аг Вю1оду, ейк. АикиЬе1 е! а1., 1оЬп \УПеу & Бопк: 1992) и способом гибридизационной ПЦР, где два или более полинуклеотида имеют участок идентичности, который в реакции ПЦР может приводить к гибридной полинуклеотидной последовательности.
В другом предпочтительном варианте осуществления нуклеотидная последовательность по настоящему изобретению кодирует полиэпитоп. Полиэпитом является химерным белком, содержащим отдельные эпитопы из по меньшей мере одного белка/антигена, предпочтительно из более чем одного белка/антигена.
Указанные эпитопы могут быть очищенными или биологически чистыми. Термин очищенный относится материалу, который является главным образом свободным от компонентов, которые обычно сопутствуют ему, как найдено в его встречающемся в природе окружении. Очищенный эпитоп относится к эпитопу, который не содержит соседних аминокислот из всей последовательности антигена или белка, из которого эпитоп происходит.
По отношению к аминокислотной последовательности, эпитоп является набором аминокислотных остатков, которые вовлечены в распознавание определенным иммуноглобулином, или в контексте Тклеток, эти остатки необходимы для узнавания Т-клеточными рецепторными белками и/или молекулами Главного Комплекса Гистосовместимости (Мфог НМосотраОЬПЬу Сотр1ех (МНС)). Термин пептид относится к ряду аминокислот, соединенных друг с другом, обычно пептидными связями между аминои карбоксильной группами прилегающих аминокислот.
- 7 024749
Эпитопы имеют определенную длину и связываются с молекулами, функционирующими в иммунной системе, предпочтительно НЬА класс I и Т-клеточным рецептором. Эпитопы в полиэпитопном конструкте могут быть эпитопами НЬЛ класса I и, возможно, эпитопами НЬЛ класса II. Эпитопы НЬЛ класса I называют СТЬ эпитопами, и эпитопы НЬЛ класса II называют НТЬ эпитопами. Некоторые полиэпитопные конструкты могут иметь подгруппу эпитопов НЬЛ класса I, и другие - подгруппу эпитопов НЬЛ класса II. СТЬ эпитоп обычно состоит из 13 или менее аминокислотных остатков в длину, 12 или менее аминокислотных остатков в длину или 11 или менее аминокислотных остатков в длину, предпочтительно 8-13 аминокислотных остатков в длину, наиболее предпочтительно 8-11 аминокислотных остатков в длину (т.е. 8, 9, 10 или 11). НТЬ эпитоп состоит из 50 или менее аминокислотных остатков в длину, и обычно из 6-30 остатков, более обычно из 12-25 и предпочтительно состоит из 15-20 (т.е. 15, 16, 17, 18, 19 или 20) аминокислот в длину. Полиэпитопный конструкт по настоящему изобретению предпочтительно включает 2 или более, 5 или более, 10 или более, 13 или более, 15 или более, 20 или более или 25 или более СТЬ эпитопов. Более точно, полиэпитопный конструкт включает по меньшей мере 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 55, 60 или более СТЬ эпитопов.
Гомологичные нуклеотидные последовательности по настоящему изобретению могут быть получены из любого организма, микроорганизма, такого как любой вирус, любая бактерия, любой гриб или паразит. Гомологичные нуклеотидные последовательности могут быть как гетерологичны последовательности вектора, так и гомологичны ему. Когда, например, вирус используется в качестве вектора, также собственные вирусные нуклеотидные последовательности могут быть размножены по настоящему изобретению, например, чтобы сверхэкспрессировать белок вируса для получения усиленной иммунной реактивности или безопасности. Предпочтительно, гомологичные нуклеотидные последовательности получают из инфекционного или патогенного микроорганизма, и наиболее предпочтительно из различных штаммов или кладов, разновидностей, подтипов или серотипов указанного микроорганизма. Термины штамм или клад являются техническими терминами, известными специалисту, относящимися к таксономии микроорганизмов. Таксономическая система классифицирует все до сих пор охарактеризованные микроорганизмы в иерархическом порядке: семейство, род, вид, штамм (Р1е1б8 Упо1оду, еб. Ьу Нс1бз В. Ν., Ырртеой-Кауеи РиЬШйещ, 4'1' ебйюи 2001). В то время как критерием для членов семейства являются их филогенетические отношения, рода включают всех участников, которые разделяют общие характеристики, и вид определен как политетический класс, который образовывает воспроизводящуюся линию и занимает определенную экологическую нишу. Термин штамм или клад описывает микроорганизм, т.е. вирус, который разделяет общие характеристики, такие как основная морфология или структура генома и организацию, но варьирует по биологическим свойствам, таким как диапазон хозяина, тканевой тропизм, географическое распределение, ослабленность или патогенность. Термин разновидности или серотипы далее различает членов того же самого штамма, также называемых подтипами, которые показывают отдельные спектры инфицирования или аллергенные свойства из-за незначительных геномных изменений.
Согласно дальнейшему варианту осуществления настоящего изобретения гомологичные нуклеотидные последовательности предпочтительно отобраны из вирусов. Типичные примеры вирусов включают без ограничения ВИЧ (ВИЧ-1 или ВИЧ-2), вирусы герпеса (например, Н8У1 или Н8У2), цитомегаловирус (СМУ), вирус Эпштейна-Барр (ЕВУ), вирусы гепатита (например, вирус гепатита А (НАУ), НВУ, НСУ и вирус гепатита Е), флавивирусы (например, вирус желтой лихорадки), вирус ветряной оспы (У/У), парамиксовирусы, респираторно-синтициальные вирусы (КБУ), вирусы парагриппа, вирус кори, вирусы гриппа и папилломавирусы.
В соответствии с другим вариантом осуществления гомологичные нуклеотидные последовательности отобраны из генов вируса Иеидие. Наиболее предпочтительными являются гены, полученные из различных серотипов вируса, где эти гены могут быть получены из одного, двух, трех или из всех четырех серотипов вируса Иеидие.
В предпочтительном варианте осуществления две гомологичные нуклеотидные последовательности кодируют гены респираторно-синцитиального вируса (К.8У). В предпочтительном варианте осуществления гомологичные нуклеотидные последовательности кодируют КБУ-Р и/или КБУ-С белки. Предпочтительно, один из К8У генов является полноразмерным, а другой является усеченным.
В другом предпочтительном варианте осуществления две, предпочтительно три гомологичные нуклеотидные последовательности кодируют белки вируса Эбола (ЕВОУ). Три гомологичные нуклеотидные последовательности, кодирующие белки вируса Эбола (ЕВОУ), конечно, также покрывают две гомологичные нуклеотидные последовательности. В предпочтительном варианте осуществления гомологичные нуклеотидные последовательности кодируют ЕВОУ гликопротеины (СР). В наиболее предпочтительном варианте осуществления нуклеотидные последовательности кодируют белки-предшественники гликопротеина из ЕВОУ штаммов ЕВОУ-В (Вииб1Ьи§уо), ЕВОУ-δ (8ибаи еЬо1ау1ги8 81гаш Си1и) и ЕВОУ-Ζ (2а1ге еЬо1а У1ги8 81гаш Маушда).
В другом варианте осуществления гомологичные нуклеотидные последовательности отобраны из бактерий. Типичные примеры подходящих бактерий включают без ограничения: нессерия (например, Ν.
- 8 024749 допоггйеа и N. тешпдЩфк); бордетелла (например, В. рейикк1к, В. рагарейикк1к и В. ЪгоисЫкерйса), микобактерии (например, М. 1иЪегси1ок1к, М. Ъоу18, М. 1ергае, М. аушш. М. рага1иЪегси1ок1к, М. ктедтаОк); легионелла (например, Ь. риеиторШа); эшерихия (например, энтеротоксическая Е. сой, энтерогеморрагическая Е. сой энтеропатогенная Е. сой); шигелла (например, 8. копией 8. букейепае, 8. Лехпеги); сальмонелла (например, 8. 1урЫ, 8. рага!урЫ, 8. сЬо1егаекшк, 8. ейегШбй); листерия (например, Ь. топосуЮдепек); хеликобактер (например, Н. ру1отт); псевдомона (например, Р. аегидшока); стафилококк (например, 8. аигеик, 8. ерИегпиШк); энтерококк (например, Е. Гаесайк, Е. Гаесшт); бацилла (например, В. апЛиасА); коринебактерия (например, С. б1рЙЬепае), и хламидия (например, С. 1гасЬотабк, С. рпеитотае, С. ркЫасГ).
Типичные примеры паразитов включают без ограничения: плазмодий (например, Р. ГаШрагит); токсоплазма (например, Т. допбп); лейшмания (например, Ь. та)ог); пневмоцистис (например, Р. саппи); и шизостома (например, 8. тапкой). Представительные примеры грибов включают без ограничения: кандида (например, С. а1Ысапк) и апрегиллус.
По меньшей мере две нуклеотидные последовательности могут быть одного размера или разных размеров. В предпочтительном варианте осуществления, одна из двух нуклеотидных последовательностей является усеченной по сравнению с другой. Усечение может быть как с 5'-, так и с З'-конца.
В различных вариантах осуществления 300 нуклеотидов в двух нуклеотидных последовательностях кодируют 100 аминокислот, которые имеют по меньшей мере 75, 80, 85, 90, 95, 98, 99 или 100% аминокислотной идентичности. В предпочтительном варианте осуществления указанная аминокислотная идентичность находится на участке 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900 или 1000 или более последовательных аминокислот.
В особенно предпочтительном варианте осуществления аминокислоты имеют по меньшей мере 75, 80, 85, 90, 95, 98, 99 или 100% аминокислотной идентичности на участке по меньшей мере 150 или 200 последовательных аминокислот.
В других предпочтительных вариантах осуществления белок, кодируемый двумя нуклеотидными последовательностями, имеет по меньшей мере 75, 80, 85, 90, 95, 98, 99 или 100% аминокислотной идентичности на участке 300 или 500 последовательных аминокислот. В других предпочтительных вариантах осуществления белок, кодируемый двумя нуклеотидными последовательностями, имеет 85-100%, в особенности 100% аминокислотной идентичности на участке 100, 200, 400, 600 или 800 последовательных аминокислот в попарном сравнении.
Как используется здесь, любой термин, относящийся к процентной идентичности последовательности, такой как аминокислотная идентичность, относится к степени идентичности между любой данной запрашиваемой последовательностью и последовательностью-объектом.
В частности, следующие термины используются для описания родства последовательности между двумя или более нуклеиновыми кислотами, полинуклеотидами или аминокислотными последовательностями: референсная последовательность, окно сравнения, идентичность последовательности, процент идентичности последовательности и структурная идентичность. Референсная последовательность является определенной последовательностью, используемой как основа для сравнения последовательности; референсная последовательность может быть частью большей последовательности.
Термины идентичный или процентно идентичный, в контексте одной или более последовательностей нуклеиновой кислоты или полипептида, относится к двум или более последовательностям или подпоследовательностям, которые являются теми же самыми или имеют определенный процент аминокислотных остатков или нуклеотидов, которые являются теми же (например, 75% идентичный, 80% идентичный, 85% идентичный, 90% идентичный, 99 или 100% идентичный в попарном сравнении), при сравнении и выравнивании для наибольшего соответствия в окне сравнения или обозначенной области при измерении с использованием алгоритма сравнения последовательности или путем ручного выравнивания и визуального осмотра. Процент вычисляют путем опредения числа позиций, в которых гомологичные основания нуклеиновой кислоты или остатки аминокислот присутствуют в обеих последовательностях для получения числа совпавших позиций, деля число совпавших позиций на общее количество позиций в окне сравнения и умножая результаты на 100 для получения процентности идентичности последовательности.
Фраза значительно идентичный, в контексте двух нуклеиновых кислот или полипептидов, относится к двум или более последовательностям или подпоследовательностям, которые имеют по меньшей мере примерно 85% идентичности, по меньшей мере примерно 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентичности нуклеотидов или аминокислотных остатков, при сравнении и выравнивании попарно для наибольшего соответствия, при измерении с использованием алгоритма сравнения последовательности или путем визуального осмотра. В примере осуществления значительная идентичность имеется в наличии на протяжении области последовательности, которая имеет длину по меньшей мере примерно 50 остатков. В другом примере осуществления значительная идентичность имеется в наличии на протяжении области последовательности, которая имеет длину по меньшей мере примерно 100 остатков. В еще другом примере осуществления значительная идентичность имеется в наличии на протяжении области последовательности, которая имеет длину по меньшей мере примерно 150 или более остатков. В
- 9 024749 одном примере осуществления последовательности значительно идентичны на протяжении всей длины последовательности нуклеиновой кислоты или последовательности белка.
Для сравнения последовательностей, как правило, одна последовательность служит референсной последовательностью, с которой сравнивают тестовые последовательности. При использовании алгоритма сравнения последовательности тестовую и референсную последовательности вводят в компьютер, координаты подпоследовательности определяются, в случае необходимости, и определяются параметры программы алгоритма последовательности. Могут использоваться параметры программы по умолчанию, или альтернативные параметры могут быть определены. Алгоритм сравнения последовательности затем вычисляет процент идентичности последовательностей для тестовой последовательности относительно референсной последовательности на основании параметров программы.
Окно сравнения, как используется здесь, включает ссылку на отрезок с любым количеством последовательных позиций, отобранных из группы, состоящей из от 20 до 600, обычно 20-50, от приблизительно 50 до приблизительно 100, от приблизительно 100 до приблизительно 200, чаще от приблизительно 100 до приблизительно 150 или приблизительно 20, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 2500 или 3000 или даже больше, в котором последовательность может быть сравнена с референсной последовательностью с тем же самым количеством последовательных позиций после того, как эти две последовательности оптимально выровнены.
Процентная идентичность может быть определена с использованием способа сравнения №еб1етап и АипксЬ (1. Мо1. ΒίοΙ. 48; 443-453 (1970)), который является эквивалентным Зе11егк (δΙΑΜ 1. оГ ЛррПеб Ма1б 26; 787-793 (1974)). Процентная идентичность может быть определена, например, путем сравнения информации о последовательности с использованием компьютерной программы САР, версия 6.0, описанной Иеуетеих е! а1. (ΝιιΗ. Ашбк Кек. 12:387, 1984) и доступной в Ишуеткбу оГ Αίκοοηκίη Сепебск Сотри!ет Сгоир (ИАССС), которая использует этот способ сравнения. Предпочтительные параметры по умолчанию для программы САР включают: (1) унарную матрицу сравнения (содержащую значение 1 для идентичности и 0 для неидентичности) для нуклеотидов и утяжеленную матрицу сравнения СпЬккоу и Вигдекк, Νιιο1 Ашбк Кек. 14:6745, 1986, как описано δο1ι\γ;·ιΠζ и ОауНоГГ. ебк., А!1ак оГ Рто1еш Зесщепсе апб 81гис1иге, №бопа1 Вютебюа1 КекеатсЬ Роипбабоп, рр. 353-358, 1979; (2) штраф, равный 3,0 для каждого несоответствия и дополнительный штраф 0,10 для каждого символа в каждом несоответствии; и (3) отсутствие штрафа для окончания несоответствия. Другим подходящим инструментом для применения является СопбдЕхртекк из Уес1отЭТ1 Абуапсе программы (ШУГГКОСЕИ), например, версии 10.3.1 от 2007 года.
В соответствии с настоящим изобретением вырожденность генетического кода используется, чтобы сделать гомологичные или идентичные нуклеотидные последовательности менее гомологичными, с целью предотвращения внутримолекулярной рекомбинации. Указанные различия могут быть уже включены в нуклеотидные последовательности природой и/или включены искусственно путем замещения. В различных вариантах осуществления, количество различных нуклеотидов, берущих начало от природы, плюс от искусственного замещения составляет по меньшей мере 75, 80, 85, 90, 95, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450 или 500. Предпочтительно, количество различных оснований составляет по меньшей мере 75, 200 или 450. Количество различий, конечно, варьирует и увеличивается, соответственно, с количеством нуклеотидов в нуклеотидных последовательностях.
В предпочтительном варианте осуществления замещены по меньшей мере 75, 80, 85, 90, 95, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450 или 500 нуклеотидов. Указанные замены искусственно введены независимо от количества уже присутствующих отличающихся нуклеотидов, внесенных, например, молчащими мутациями.
В различных вариантах осуществления две нуклеотидные последовательности с участками идентичности не более чем 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5 или 4 последовательных нуклеотидов после замещения являются предпочтительными. В случае более чем двух нуклеотидных последовательностей, участки идентичности не более чем 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5 или 4 последовательных нуклеотидов после замещения являются предпочтительными.
В другом варианте осуществления нуклеотидные последовательности могут иметь по меньшей мере 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400 или 450 замещенных нуклеотидов из 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500 или 1600 или более нуклеотидов.
В контексте этого изобретения замещение нуклеотидов отличными нуклеотидами обозначает техническую или искусственную замену нуклеотидов другими нуклеотидами. Предпочтительно, замещенные нуклеотиды не изменяют кодируемую аминокислотную последовательность. Замещение может быть осуществлено путем идентификации кодонов в двух гомологичных нуклеотидных последовательностях, кодирующих одни и те же аминокислоты и изменения кодонов в одной из двух гомологичных нуклеотидных последовательностей таким образом, что кодоны продолжают кодировать те же самые аминокислоты. Изменение может быть совершено в одной, обеих или всех гомологичных нуклеотидных последовательностях.
Например, аминокислота пролин кодируется кодонами ССА, ССС, ССС и ССИ (на уровне ДНК и заменяется на Т). Простая нуклеотидная последовательность, СССССС, первоначально кодирующая два
- 10 024749 пролина в двух гомологичных нуклеотидных последовательностях может быть превращена в ССЛССО, также кодирующую два пролина, в одной из двух гомологичных нуклеотидных последовательностей. Альтернативно, одна из последовательностей, кодирующих пролин-пролин, может быть превращена в СССССО, и другая в ССАССС.
Более сложным примером служит аминокислота серин, которая кодируется кодонами ИСА, ИСС, ИСО, ИСИ, АОС и АОИ. Аналогично, ИСАИСА, первоначально кодирующая два различных серина, может быть превращена в множественных гомологичных последовательностях в АОСАОС (не имеющую общих нуклеотидов с ИСАИСА) и ИСОАОИ (имеющую только одну общую позицию с ИСАИСА или две позиции с АОСАОС) и так далее. Это позволяет большую гибкость во введении различных нуклеотидных вариантов в две или более нуклеотидных последовательностей, кодирующих серин-серин.
Предпочтительно при кодон-оптимизации, как описано в настоящем изобретении, избегают использования редких кодонов для желаемого хозяина, поскольку редкие кодоны могут блокировать или снизить экспрессию кодируемого белка. Также предпочтительно избегают замен, которые могут ввести сигналы нуклеиновых кислот для желаемого хозяина. Такие сигналы включают, но не ограничиваются, сигналы сплайсинга, сигнала терминации и сигналы инициации. Предпочтительно, следующие мотивы последовательности могут избегаться в зависимости от типа используемого вектора, например, сигнал ранней терминации транскрипции вируса коровьей оспы не нуждается в избегании для многих других векторов, которые не являются поксвирусными векторами:
внутренние ТАТА-боксы, сЫ-сайты и сайты связывания рибосомы;
АТ-богатые и ОС-богатые участки последовательности;
АКБ, ΙΝ8 и СК8 элементы последовательности; повторяющиеся последовательности и РНК вторичные структуры;
(неявные) донорные и акцепторные сайты сплайсинга и сайты разветвления; и сигналы ранней терминации транскрипции для вируса коровьей оспы: (ΤΤΤΤΤΝΤ).
Краткое описание фигур
Более полно изобретение может быть понято при обращении к фигурам, на которых изображено следующее.
Фиг. 1 изображает сравнение нуклеотидных последовательностей, кодирующих полноразмерный К8У-Р(Р) белок с нуклеотидной последовательностью, кодирующей замещенный усеченный К8УР_1гипс (Р_1гипс) белок. Идентичные последовательности выделены черным, и замещенные нуклеотиды остаются невыделенными. Показано расположение праймеров А1 и В2.
Фиг. 2 изображает сравнение полноразмерного К8У-Р (Р) белка с усеченным Р8У-Р_1гипс (Р_1гиие) белком. Полноразмерная последовательность К8У-Р усечена на 50 ак, что приводит к получению усеченного К8У-Р_1гипс белка. Белок Р8У-Р_1гипс перекрывает примерно 91% полноразмерного белка.
Фиг. 3 изображает экспрессию К8У-Р и Р8У-Р_1гипс из рекомбинантных МУА-ΒΝ® вирусов в человеческой клеточной линии. Вестерн-блот анализ с экстрактами из инфицированных человеческих клеток после инфицирования различными вирусами на основе МУА-ΒΝ®, с ΜΟΙ 10 и лизисом через 24 ч после инфицирования. МУА-ΒΝ® (контроль с пустым вектором; дорожка 1), МУА-шВМ72В (рекомбинантный МУА-ΒΝ® с полноразмерным К8У-Р; дорожка 2), МУА-шВМ73В (рекомбинантный МУАΒΝ® с усеченным Р8У-Р_1гипс; дорожка 3) и дорожка 4: ΜУА-тΒN175Β (рекомбинантный МУА-ΒΝ® с К8У-Р и Р8У-Р_1гипс). Подсчитанный молекулярный вес белков: К8У-Р (61,6 кДа) и Р8У-Р_1гипс (56,1 кДа).
Фиг. 4А-С изображают ПЦР анализ ΜУА-тΒN175Β. Показаны К8У-Р (Р) и К8У-Р_1гиис (Р_1гиис).
A. Результаты ПЦР с различными праймерными парами. М=маркер (1 1<Ь-1аббсг. Νο\ν Еп§1апб ΒίοΙαΡδ). Дорожка 1 - ΜУА-тΒN175Β. Дорожка 2 - положительная контрольная плазмида (ρΒΝ345). Дорожка 3 ΜУА-тΒN®. Дорожка 4 водный контроль. Дорожка 5 - положительная контрольная плазмида (ρΒΝ343).
B. Схема ΜУА-тΒN175Β, показывающая расположение праймеров, используемых для ПЦР, показанных на фиг. 4А. С. Схема ΜУА-тΒN® дикого типа, показывающая расположение праймеров.
Фиг. 5А-С изображают гипотетическую рекомбинацию Р/Р(Гипс между полноразмерным К8У-Р геном (Р) и усеченным Р геном (Р4гипс) в дважды рекомбинантном МУА, и расположение ПЦР праймеров в рекомбинантном и нерекомбинантном вирусах и контрольных плазмидах. А. ΜУА-тΒN175Β. В. рМ18С173. С. рМ18С172.
Фиг. 6 изображает анализ ДНК, выделенной из клеток, инфицированных ΜУА-тΒN175Β. Дорожки 1 и 7 являются маркерными. Дорожка 2 - ΜУА-тΒN175Β. Дорожка 3 является плазмидным контролем для гена Р (ρΒΝ343). Дорожка 4 является плазмидным контролем для усеченного гена Р (ρΒΝ345). Дорожка 5 - МУА-ΒΝ®. Дорожка 6 - водный контроль. Ожидаемый ПЦР продукт гипотетической рекомбинации между К8У-Р геном и усеченным Р геном К8У-Р_1гнпс в ΜУА-тΒN175Β составляет 613 нуклеотидных пар.
Фиг. 7 изображает сравнение трех ΕΒΟΥ (вирус Эбола) ОР (гликопротеин) белковых последовательностей. Сравнивали аминокислотные последовательности трех ОР белков вируса Эбола штаммов ΕΒΟΥ-Β, ΕΒΟΥ-8 и ΕΒΟΥ-Ζ. В сравнении Оаρ8 были не разрешены. Общая идентичность во всех трех
- 11 024749 белковых последовательностях составила 48,5%. Серый фон: идентичны во всех трех белковых последовательностях. Черный фон: идентичны в двух белках.
Фиг. 8А и 8В изображают сравнение трех ЕВОУ СР кодирующих последовательностей, используемых в рекомбинантном конструкте на основе МУА-ΒΝ®. Кодирующие последовательности для СР генов, происходящих из трех ЕВОУ штаммов ЕВОУ-В, -8 и -Ζ, сравнивали перед (неопт; см. фиг. 8А) и после (опт; см. фиг. 8В) оптимизации. В сравнении Сарк были не разрешены. Серый фон: идентичные нуклеотидные позиции в трех кодирующих последовательностях. Черный фон: идентичные нуклеотидные позиции в двух кодирующих последовательностях. Идентичность в нуклеотидных позициях трех генов перед оптимизацией (неопт) составляет 45,3%, тогда как после оптимизации (опт) составляет 44,6.
Фиг. 9 изображает попарное сравнение трех ЕВОУ СР кодирующих последовательностей, используемых в рекомбинантном конструкте на основе МУА-ВЖА Кодирующие последовательности для СР генов, происходящие из трех ЕВОУ штаммов ЕВОУ-В, -8 и -Ζ сравнивали попарно перед (неопт; см. фиг. 9А) и после (опт; см. фиг. 9В) оптимизации. В сравнении Сарк были не разрешены. Серый фон: идентичные нуклеотидные позиции в кодирующей последовательности. Идентичность в нуклеотидных позициях трех генов перед (неопт) и после (опт) оптимизации сведена в табл. С.
Фиг. 10 изображает расщепление рестрикционными ферментами и плазмидную карту плазмиды рМ18С210, содержащей полноразмерный (К8У-Р) и усеченный (К8У-Р_1гиис) белок. Дорожка 1: плазмида рМ18С210, содержащая К8У-Р и К8У-Р_1гиис; дорожка 2: контрольная плазмида рМ18С209, содержащая только К8У-Р_1гиис; дорожка 3: маркер молекулярного веса. Показан размер полос маркера в парах нуклеотидных оснований (по).
Примеры
Пример 1.
Получение замещенного, усеченного гена Р.
Было желаемо создание рекомбинантного МУА, экспрессирующего как полноразмерный белок К8У-Р, так и усеченную версию К8У-Р_1гиис. Однако на основании результатов с МУА и другими вирусами коровьей оспы, содержащими повторяющиеся последовательности, ожидалось, что внутримолекулярная рекомбинация приведет к рекомбинации между двумя копиями гена Р, результатом чего будет делеция одной из копий гена Р.
Чтобы минимизировать наличие длинных участков идентичных нуклеотидов между двумя генами Р, кодоны в нуклеотидной последовательности, кодирующей ген К8У-Р_1гиис, были замещены с сохранением аминокислотной последовательности генов Р. Избегали использования редких кодонов для млекопитающих и цыплят. Кроме того, избегали замен, которые могли бы ввести сигналы в нуклеиновую кислоту. Такие сигналы включали внутренние ТАТА-боксы, сЫ-сайты и сайты связывания рибосомы; АТ-богатые и СС-богатые участки последовательности; АКБ, ΙΝ8 и СК8 элементы последовательности; повторяющиеся последовательности и РНК вторичные структуры; (неявные) донорные и акцепторные сайты сплайсинга, сайты разветвления; и сигналы терминации для коровьей оспы (ΤΤΤΤΤΝΤ). Замещенная нуклеотидная последовательность показана на фиг. 1, в сравнении с кодирующей последовательностью полноразмерного К8У-Р белка. Хотя значительная идентичность сохраняется на всем протяжении двух кодирующих последовательностей, в двух кодирующих последовательностях нет остающихся больших участков идентичности, более чем девять последовательных нуклеотидов. На фиг. 2 представлено сравнение белков, кодируемых двумя кодирующими последовательностями. Два белка имеют 100% идентичность на протяжении первых 524 аминокислот (замещенный белок Р усечен с карбоксильного конца). Таким образом, хотя эти две кодирующие последовательности кодируют участок идентичных аминокислот, одна из последовательностей была замещена по отношению к другой.
Пример 2.
Получение рекомбинантных вирусов, содержащих К8У-Р гены.
ДНК, кодирующая полноразмерный К8У-Р ген, была интегрирована в МУА в двух различных сайтах интеграции для получения МУА-тВЖ70В и МУА-тВЖ72В (в сайте 1СК88/89). Замещенный К8УР_1гиис ген был интегрирован в МУА в сайт 1СК148/149 для получения МУА-тВЖ73В.
Затем был создан дважды рекомбинантный МУА, содержащий полноразмерный К8У-Р ген, интегрированный в МУА в сайте 1СК88/89, и замещенный К8У-Р_1гиис ген, интегрированный в тот же МУА в сайте 1СК148/149. Дважды рекомбинантный вирус был назван МУА-тВЖ75В. Схематическое изображение этого вируса представлено на фиг. 4В.
Пример 3.
Экспрессия Р белков с рекомбинантных вирусов.
С целью определить, экспрессируется ли белок с замещенной нуклеотидной последовательностью, был проведен вестерн-блот анализ на белковых экстрактах из человеческой клеточной линии, инфицированной рекомбинантным МУА-ΒNО-основанным вирусом, кодирующим полноразмерный К8У-Р ген (МУА-тВЖ72В), вирусом, кодирующим замещенный К8У-Р_1гиис ген (МУА-тВШ73В). и дважды рекомбинантным вирусом, кодирующим оба, полноразмерный и К8У-Р_1гиис гены (МУА-тВЖ75В). Все три вируса показали продукцию К8У-Р белков соответствующего размера на вестерн-блот анализе
- 12 024749 (фиг. 3), тогда как МУА-ΕΝ® контроль (пустой вектор) не показал каких-либо полос, как и ожидалось. Таким образом, полноразмерный Р белок и усеченный Р белок, экспрессированный с замещенной нуклеотидной последовательности, были экспрессированы индивидуально с однократно рекомбинантного МУЛ-ΒΝ®, но оба были ко-экспрессированы с одного дважды рекомбинантного МУА-ΒΝ® вируса (МУА-тВМ75В) в человеческой клеточной линии.
Пример 4.
Наращивание рекомбинантного вируса.
Клетки фибробластов эмбриона цыпленка были инфицированы МУА-тВШ75В. конструктом, содержащим как полноразмерный Р ген, так и замещенный К8У-Р_1типс ген, или конструктом, содержащим только один полноразмерный Р ген, для получения первого вирусного стока. Сходные титры дважды рекомбинантного вируса, содержащего как полноразмерный Р ген, так и замещенный Р ген (1,34х107 ТСГО50), наблюдали в сравнении с титрами вируса, содержащим только один полноразмерный Р ген (1,46х107 ТСГО50). Эти результаты обозначают, что стабильный дважды рекомбинантный МУА был получен, и что рекомбинация между двумя копиями Р гена была ограничена путем замещения нуклеотидных оснований в последовательностях.
Пример 5.
ПЦР анализ рекомбинантных вирусов.
ПЦР анализ проводился на ДНК из клеток, инфицированных МУА-тВМ75В или МУА-ΒΝ®, с использованием вставка-специфических или фланк-специфических праймерных пар, изображенных на фиг. 4В и С. ПЦР А с праймерами А1/А2, которые являются специфическими для полноразмерного Р гена, детектировала полосу размером 663 нуклеотидные пары (по) в клетках, инфицированных МУАтВ№75В, и в специфическом плазмидном положительном контроле, как и ожидалось. Эта полоса, как и ожидалось, отсутствовала в клетках, инфицированных МУА-ΒN® или в водном контроле (фиг. 4А).
ПЦР В с праймерами В1/В2, которые являются специфическими для замещенного, усеченного Р гена, детектировала полосу размером 625 по в клетках, инфицированных МУА-тВ№75В, и в специфическом плазмидном положительном контроле, как и ожидалось. Эта полоса, как и ожидалось, отсутствовала в клетках, инфицированных МУА-ΒN® или в водном контроле (фиг. 4А). ПЦР С праймерами С1/С2, которые детектируют вставки в сайте 1ОК88/89, детектировала полосу размером 2047 по в клетках, инфицированных МУА-тВ№75В, и в специфическом плазмидном положительном контроле, как ожидалось. Эта полоса, как ожидалось, отсутствует в клетках, инфицированных пустым векторным контролем МУА-ΒN®, вместо этого полоса 161 по указывает на ситуацию дикого типа в ЮК.88/89 в МУА-ΒN® (фиг. 4А). ПЦР Ό с праймерами Ό1/Ό2, которые детектируют вставки в сайте ЮК148/149, детектировала полосу размером 2062 по в клетках, инфицированных МУА-тВ№75В, и в специфическом плазмидном положительном контроле, как ожидалось. Эта полоса, как ожидалось, отсутствует в клетках, инфицированных пустым векторным контролем МУА-ΒN®, вместо этого полоса 360 по указывает на ситуацию дикого типа в ЮК88/89 в МУА-ΒN® (фиг. 4А).
Рекомбинация между генами Р привела бы к гибридному Р гену, имеющему части Р гена дикого типа и части усеченного Р гена (фиг. 5А). Для определения наличия каких-либо рекомбинантов был проведен ПЦР анализ на ДНК из клеток, инфицированных МУА-тВМ75В или МУА-ΒN®, с использованием праймерных пар А1/В2 (фиг. 5В), которым соответствует продукт 613 по, специфический для рекомбинантного гена Р. Результаты этой ПЦР не показали детектируемых рекомбинантов (фиг. 6). Эти результаты означают, что был получен стабильный дважды рекомбинантный МУА, и рекомбинация между двумя копиями Р гена была ограничена.
Пример 6.
Получение рекомбинантных генов гликопротеина (ОР) трех различных штаммов вируса Эбола (ЕВОУ).
Было желаемым получение рекомбинантного МУА, экспрессирующего три гликопротеина (ОР) вируса Эбола (ЕВОУ). Штаммы ЕВОУ, используемые здесь, были ЕВОУ-В (ВипЛЬидуо), ЕВОУ-8 (Судан) и ЕВОУ-Ζ (Заир), все принадлежащие к вирусным штаммам, которые высоко детальны для инфицированных людей. Названные три ОР имеют общую идентичность 48,5%, что означает, что практически каждая вторая аминокислота в ОР белках является идентичной для всех трех штаммов, тогда как процентная идентичность на всем протяжении полноразмерной белковой последовательности в сравнении комбинаций двух штаммов находится между 57,0 и 64,2% (фиг. 7).
Для минимизирования наличия длинных участков идентичных нуклеотидов в трех ЕВОУ ОР генах, кодоны в трех нуклеотидных последовательностях были замещены, с сохранением кодируемой аминокислотной последовательности трех ОР генов. Избегали использования редких для млекопитающих и цыплят кодонов, также как и избегали замен, которые могут ввести в нуклеиновую кислоту сигналы. Такие сигналы включали внутренние ТАТА-боксы, сЫ-сайты и сайты связывания рибосомы; АТ-богатые и ОС-богатые участки последовательности; АКЕ, ΙΝ8 и СК8 элементы последовательности; повторяющиеся последовательности и РНК вторичные структуры; (неявные) донорные и акцепторные сайты сплайсинга, сайты разветвления; и сигналы терминации для коровьей оспы (ΤΤΤΤΤΝΤ). О после АТО старт- 13 024749 кодона предусматривает сильную экспрессию и присутствует в оригинальной кодирующей последовательности всех трех ΕΒΟν ОР генов, и он был сохранен.
Хотя от 23,3 до 24,9% нуклеотидов в каждой из 3 оптимизированных ΕΒΟν ОР кодирующих последовательностей были заменены (см. табл. А), общая идентичность между тремя ОР кодирующими последовательностями изменилась несущественно (табл. В). В двух случаях попарное сравнение показало даже незначительно более высокую идентичность после оптимизации кодирующих последовательностей, как показано ниже в табл. В.
Таблица А
Нуклеотидные замены в трех оптимизированных ΕΒΟν ОР генах. Таблица показывает количество измененных нуклеотидов в соответствующих позициях в оптимизированных ОР кодирующих последовательностях (опт) по сравнению с неоптимизированной (неопт) последовательностью различных штаммов ΕΒΟν, на основании общего количества нуклеотидов в [%].
Общее количество по - 1147
измененные нуклеотидные позиции в оптимизированных СР кодирующих последовательностях по сравнению с неоптимизированными последовательностями [%]
ΕΒΟν-Β неопт:ΕΒΟν-Β опт 23,3
ΕΒΟν-Ξ неопт:ΕΒ0ν-5 опт 24,9
ΕΒΟν-Ζ неопт:ΕΒΟν-Ζ ОПТ 23,9
Таблица В
Идентичные нуклеотидные позиции трех ΕΒΟν ОР кодирующих последовательностей. Таблица показывает количество идентичных нуклеотидов в соответствующих позициях в двух кодирующих последовательностях различных штаммов ΕΒΟν, на основании общего количества нуклеотидов в [%].
попарное сравнение СР генов идентичность идентичность
нуклеотидов в нуклеотидов в
неоптимизированных генах [%] оптимизированных генах [%]
ΕΒΟν-Β:ΕΒ0ν-3 57, 0 57,3
ΣΒΟν-Β:ΕΒΟν-Ζ 64,2 61,1
ΕΒ0ν-2:ΕΒΟν-Ζ 57,6 60, 4
Попарные сравнения ОР кодирующих последовательностей трех штаммов ΕΒΟν ΕΒΟν-Β, -8 и -Ζ показало идентичность нуклеотидных позиций и распределение идентичностей (фиг. 9). Соответственно, способ по настоящему изобретению привел к укорочению участков нуклеотидной идентичности в ΕΒΟν ОР-последовательностях. При рассмотрении длинных участков идентичных последовательных нуклеотидов очевидно, что размыкание или укорочение таких участков идентичности является важной частью стратегии для избежания рекомбинации между последовательностями, имеющими некий уровень нуклеотидной идентичности. В таблице С (см. ниже) показано количество участков последовательных идентичных нуклеотидов из попарного сравнения ОР кодирующих последовательностей. Перед оптимизацией имеются участки длинной до 23 по, и суммарно имеется 41 участок из 10 или более идентичных нуклеотидов. В оптимизированной версии ОР генов найден только один участок длиной 13 по, и могут быть найдены 7 участков длиной 10 или более идентичных нуклеотидов.
- 14 024749
Таблица С
Длинные участки последовательных идентичных нуклеотидов. Таблица показывает количество участков последовательных идентичных нуклеотидов определенной длины в попарном сравнении ΕΒΟν СР кодирующих последовательностей перед (неопт) и после (опт) оптимизации. Количество попарных сравнений суммировано в колонке общее количество. Наиболее длинный участок в неоптимизированном сравнении состоит из 23 последовательных идентичных нуклеотидов, тогда как в оптимизированных генах он уменьшен до максимум 13 нуклеотидов. Показаны только участки длиной 10 или более нуклеотидов.
длина ΕΒ0ν-Β:ΕΒ0ν-8 ΕΒθν-Β:ΕΒΓ>ν-Ζ ΕΒ0ν-5:ΕΒ0ν-Ζ общее количество
неопт опт неопт ОПТ неопт опт неопт опт
23 о 1 1
20 о 2 2
17 о 1 1
16 о 2 2
14 о 2 2 4
13 о 1 1 1 2 1
12о 1 2 3
11 о 10 2 4 1 8 22 3
10о 1 2 1 1 2 4 3
Пример 7.
Получение рекомбинантных МVΑ-ΒN® вирусов с СР генами штаммов ΕΒΟν.
Три ΕΒΟν СР гена были синтезированы СепеАг! (КедепкЬигд, Сегтапу) и клонированы в рекомбинантные векторы, учитывая интеграцию в МVА-ΒN®. Был получен рекомбинантный вирус, содержащий три оптимизированных последовательности гомологичных СР генов из трех различных штаммов ΕΒΟν. Транскрипция трех интегрированных СР кодирующих последовательностей контролировалась различными отдельными ранний-поздний промоторами.
Специфические ПЦР реакции для трех оптимизированных ΕΒΟν-СР последовательностей показали наличие трех отдельных генов в рекомбинантном МVА-ΒN®.
Пример 8.
Получение плазмиды, содержащей КЕШ-Р гены.
Две версии К8У-Р гена, используемые в примерах 1-5 и показанные на фиг. 1, были клонированы в одну плазмиду и помещены в Б.соП ΤΖ101 (Тгеп/уте СтЬН, Копк1ап/. Сегтапу) с использованием стандартных техник клонирования. Плазмида (см. карту плазмиды на фиг. 10) была выделена и расщеплена рестрикционными ферментами А1е I, Эга III и §ре I, и разделена в 1% ТАЕ агарозном геле (см. фиг. 10). Паттерн полос для рМI§С210, кодирующей полноразмерный К§У-Р белок и белок К§У-Р_1гипс (дорожка 1), также как и контрольная плазмида рМТЗС209, кодирующая только белок К§У-Р_!гипс (дорожка 2) был сравнен с паттернами, ожидаемыми после результатов анализа электронной последовательности плазмид. Ожидаемый размер полос для рМI§С210 был 404, 573, 809, 1923 и 4874 по, тогда как для рМКС209 был ожидаем паттерн полос с размерами 573, 661, 809 и 4874 по. Экспериментально были обнаружены все ожидаемые полосы и никаких дополнительных полос. В случае прохождения рекомбинации между вариантами К§У-Р в рМТЗС210, один или больше наиболее мелких фрагментов были бы утрачены, в зависимости от сайта рекомбинации. В настоящем эксперименте такого однозначно не было найдено. Таким образом, результаты показывают, что плазмида рМТ5С210 с двумя генами К§У-Р (К§У-Р и К§У-Р_1гипс) является стабильной в Б.сой.
- 15 024749
Список последовательностей <110> Вауагхап ИогсЦс А/5 <120> Вектор, содержащий множественные гомологичные нуклеотидные последовательности <130> ВЫ65РСТ <140> РСТ/ЕР2009/008275 <141> 2009-11-20 <150> из 61/116672 <151> 2003-11-21 <160> 13 <170> РаРепР1п уегзхоп 3.3 <210> 1 <211> 1725 <212> ДНК <213> респираторно-синцитиальный вирус <400> 1
аРддаРРРдс сааРссРсаа аасаааРдса аРРассасаа рсрррдсрдс адРсасасРс 60
РдРРРсдсРР ссадРсаааа саРсасРдРа дааРРРРаРс ааРсаасаРд садрдсадрр 120
адсаааддсР аРсРРадРдс РРРаадаасР ддРРддРаРа сРадРдРРаР аасРаРадаа 180
РРаадРааРа Рсааддаааа РаадРдРааР ддаасадасд сРааддРааа аРРдаРаааа 240
саадааРРад аРаааРаРаа аааРдсРдРа асадааРРдс адРРдсРсаР дсааадсаса 300
ссадсадсса асааРсдддс садаададаа сРассааддР РРаРдааРРа РасасРсаас 360
ааРассаааа араасаардр аасаРРаадс аадаааадда ааадаадаРР рсррддсррс 420
РРдРРаддРд РРддаРсРдс ааРсдссадр ддсаРРдсРд РаРсРааадР ссРдсассРа 480
дааддддаад РдаасааааР саааадрдср РРасРаРсса сааасааддс РдРадРсадс 540
РРаРсаааРд дадРРадРдР сРРаассадс ааадРдРРад ассРсааааа сРаРаРадаР 600
ааасааРРдР РасссаРРдР даасаадсаа адсрдсадса РаРсааасаР рдааасрдрд 660
аРадааРРсс аасаааадад саасадасРа сРададаРРа ссадддааРР радрдрраар 720
дсаддрдраа сРасассРдР аадсасррар аСдРРаасаа арадрдаарр аРРаРсаРРа 780
аРсааРдаРа РдссРаРаас аааРдаРсад ааааадРРаа РдРссаасаа РдРРсаааРа 840
дррадасадс ааадРРасРс рарсардрсс аРааРааадд аддаадРсРР адсарардра 900
дРасааРРас сасРаРаРдд РдРааРадаР асассРРдРР ддааасРаса сасаРссссР 960
сРаРдсасаа ссаасасааа ддаадддРсс аасаРсРдРР Раасаадаас сдасададда 1020
РддРасРдРд асаардсадд аРсадРдРсР РРсРРсссас аадсрдааас аРдсааадРР 1030
сааРсдааРс дадРаРРРРд РдасасааРд аасадРРРаа саРРассаад рдаадрааар 1140
- 16 024749
сгсгдсааса стдасасагь саасссСааа ЁаГдаСИдса ааа££а£дас ££саааааса 1200
дабдбаадса дсбссдШаС сасаЦсбсСа ддадссаббд 5дЬсаЬдсЬа бддсаааасЬ 1260
аааЦдбасад саЬссаабаа ааабсдбдда аЬсаЬааада саШШскаа сдддЦдЦдаЬ 1320
5а£д1а5саа асаадддддс ддасасСдСа 5с1д5аддСа аТасдПаба £5а£д5аааС 1380
аадсаадаад дааааадЬсб сбаСдЬаааа ддЬдаассаа £аа£ааа£1:£ с£а£дассса 1440
СТад'ЬдС^сс сбСсТдаДда аТШдабдса £саа£аЕсГс аад£саа£да даада5£аас 1500
сададсс5ад саСШаЦЦсд СаааСссдаб даа££а£(:ас а£аа£д1ааа ЪдббддЪааа 1560
бссассасаа абаЬсаЦдаЦ аасЦасбаЦа а^Ьабадбда ЪТабадЬааб айдиаНа 1620
5СааЫдсад 5£дддс£д5£ ссСаТасбдс ааддссадаа дсасассад£ сасасСаадс 1680
ааддаЪсаас £дад£ддЪа£ ааа£аа£а!£ дсаЪЬЬадДа асЪда 1725
<210> 2 <211> 1575 <212> ДНК <213> респираторно-синцитиальный вирус <400> 2
а£ддаСс£сс ссаСТсСсаа дассаасдсс аСсассасса СсССодСсдС сдСдассебд 60
ЬдЬсЪсдсса дсадссадаа саСсассдСд дадССсСасс ададсассСд садсдссдСд 120
адсаадддс! ассСдадсдс ссСдаддасс ддсСддСаса ссадсдСдаС сассаСсдад 180
сЪдТссааса Ссааадаааа саадСдсаас ддсассдасд ссааадСдаа дсСдаСсаад 240
саддаас^дд асаадСасаа даасдссдСд ассдадсСдс адссдссдас дсададсасс 300
ссЕдссдсса асаасададс саддсдсдад сСдссссддС СсаСдаасСа сасссСдаас 360
аасассаада асаасаасдС дасссСдадс аадаадсдда адсддсддСС ссСдддсСЬС 420
сбдсТдддсд Сдддсадсдс саССдссадс ддсаССдссд СдСсСааддС ссСдсаЬсСд 480
дааддсдадд СсаасаадаС Саададсдсс сСдсСдСсса ссаасааддс сдСддСдСсс 540
сбдадсаасд дсдСдадсдС дсСдассадс ааддСдсСдд аСсСдаадаа сСасаСсдас 600
аадсадсСдс СдсссаСсдС дааСаадсад СссСдсадса СсадсаасаС сдадасадСд 660
аСсдадЦСсс адсадаадад саассддсСд сСддаааСса сссдддадСС садсдСдааС 720
дссддсдСда ссасссссдС дСссассСас аСдсСдасса асадсдадсС дсСдСсссСд 780
аСсааСдаса СдсссаСсас саасдассаа аадааасСда Сдадсаасаа сдСдсадаСс 840
дСдсддсадс ададсСасад саСсаСдадс аСсаСсааад аададдсдес ддссСасдСд 900
дСдсадсСдс сссСдСасдд сдСдаСсдас асссссСдсС ддаадсСдса сассадсссс 960
сСдСдсасса ссаасассаа ададддсадс аасаСсСдсс Сдасссддас сдаСаддддс 1020
СддСасСдсд асаасдссдд садсдСдСсс ССсОССсССс аадссдадас ССдсааддСд 1080
сададсааса дддСдССсСд сдасассаСд аасадссСда сссСдсссад сдаадСдаас 1140
- 17 024749
сЪд^дсааса ^сдасаЪсЬЪ Раассссаад РасдасРдса адаРсаРдас сРссаадасс 1200
дасд^д^сса дсЬссдПда1: РассадссРд ддсдссаРсд РдСссСдсРа сддсаадасс 1260
аад12дсассд ссадсаасаа даассддддс аРсаРсаада ссРРсадсаа сддсрдсдас 1320
Ъасд^дЪсса а£аадддсд£ ддасассдрд РссдРдддса асасасрдра сРасдРдаас 1330
аадсаддаад дсаададсс£ драсдрдаад ддсдадссса РсаРсаасРР сРасдасссс 1440
с^дд^д^Ссс ссадсдасда дррсдасдсс адсаРсадсс аадрдаасда даадаРсааР 1500
сад’Ьссс^дд ссМ:са1;сад даададсдас дадсРдсСдс асаардрдаа сдрдддсаад 1560
^ссассасса аседа 1575
<210> 3 <211> 574 <212> Белок <213> респираторно-синцитиальный вирус <400> 3
Мер Азр Ьеи Рго Не Ьеи Ьуз ТЬг Азп А1а Не ТЬг ТЬг 11е РЬе А1а 15 10 15
А1а ’»’а1 ТЬг Ьеи Суз РНе А1а Зег Зег С1п Азп Не ТЬг Уа1 С1и РЬе 20 25 30
Туг С1п Зег ТЬг Суз Зег А1а Уа1 Зег Ьуз С1у Туг Ьеи Зег А1а Ьеи 35 40 45
Агд ТЬг 61у Тгр Туг ТНг Зег Уа1 Не ТНг 11е С1и Ьеи Зег Азп 11е 50 55 60
Ьуз С1и Азп Ьуз Суз Азп С1у ТНг Азр А1а Ьуз \7а1 Ьуз Ьеи Не Ьуз 65 70 75 80
С1п С1и Ьеи Азр Ьуз Туг Ьуз Азп А1а Уа1 ТНг С1и Ьеи С1п Ьеи Ьеи 85 90 95
Мер С1п Зег ТНг Рго А1а А1а Азп Азп Агд А1а Агд Агд С1и Ьеи Рго 100 105 110
Агд РНе Мер Азп Туг ТНг Ьеи Азп Азп ТНг Ьуз Азп Азп Азп Уа1 ТЬг 115 120 125
Ьеи Зег Ьуз Ьуз Агд Ьуз Агд Агд РНе Ьеи С1у РЬе Ьеи Ьеи С1у 7а1 130 135 140
С1у Зег А1а Не А1а Зег С1у 11е А1а Уа1 Зег Ьуз \7а1 Ьеи Шз Ьеи 145 150 155 160
Туг СЬу Ьуз ТНг 420 Ьуз Суз ТНг АЬа Зег 425 Азп Ьуз Азп Агд СЬу 430 Не 11е
Ьуз ТНг РНе Зег Азп СЬу Суз Азр Туг УаЬ Зег Азп Ьуз СЬу УаЬ Азр
435 440 445
ТНг УаЬ Зег УаЬ СЬу Азп ТЬг Ьеи Туе Туг УаЬ Азп Ьуз СЬп СЬи СЬу
450 455 460
Ьуз Зег Ьеи Туг УаЬ Ьуз СЬу СЬи Рго Не Пе Азп РЬе Туг Азр Рго
465 470 475 480
Ьеи УаЬ РНе Рго Зег Азр СЬи РНе Азр АЬа Зег Не Зег СЬп УаЬ Азп
485 490 495
СЬи Ьуз Не Азп СЬп Зег Ьеи АЬа РНе Не Агд Ьуз Зег Азр СЬи Ьеи
500 505 510
Ьеи НЬз Азп УаЬ Азп УаЬ СЬу Ьуз Зег ТНг ТНг Азп Не МеЬ ЬЬе ТНг
515 520 525
ТНг Не Не Не УаЬ Не 11е УаЬ Не Ьеи Ьеи Ьеи Ьеи Не АЬа УаЬ
530 535 540
СЬу Ьеи РЬе Ьеи Туг Суз Ьуз АЬа Агд Зег ТЬг Рго УаЬ ТНг Ьеи Зег
545 550 555 560
Ьуз Азр СЬп Ьеи Зег СЬу Не Азп Азп Не АЬа РНе Зег Азп
565 570 <210> 4 <2Ы> 524 <212> Белок <213> респираторно-синцитиальный вирус
<400> 4 1
МеН 1 Азр Ьеи Рго ЬЬе 5 Ьеи Ьуз ТНг Азп АЬа 10 Не ТНг ТНг Не РЬе 15 АЬа
АЬа УаЬ ТНг Ьеи 20 Суз РНе АЬа 5ег Зег 25 СЬп Азп Не ТНг УаЬ 30 СЬи РЬе
Туг СЬп Зег 35 ТНг Суз Бег АЬа УаЬ 40 Зег Ьуз СЬу Туг Ьеи 45 Зег АЬа Ьеи
Агд ТЬг 50 СЬу Тгр Туг ТНг Зег 55 УаЬ 11е ТЬг Не СЬи 60 Ьеи Зег Азп 11е
- 20 024749
- 21 024749
Ьеи Суз ТЬг ТЬг Азп ТНг 325 Ьуз СЬи СЬу Зег Азп 330 Ые Суз Ьеи ТНг 335 Агд
ТНг Азр Агд СЬу Тгр Туг Суз Азр Азп АЬа СЬу Зег УаЬ Зег РЬе РНе
340 345 350
Рго СЬп АЬа СЬи ТЬг Суз Ьуз УаЬ СЬп Зег Азп Агд УаЬ РНе Суз Авр
355 360 365
ТЬг МеС Азп Зег Ьеи ТЬг Ьеи Рго Зег СЬи УаЬ Азп Ьеи Суз Азп Ые
370 375 380
Азр Не РНе Азп Рго Ьуз Туг Азр Суз Ьуз Не МеЬ ТЬг Зег Ьуз ТНг
385 390 395 400
Азр УаЬ Зег Зег Зег УаЬ Ые ТНг Зег Ьеи СЬу АЬа Ые УаЬ Зег Суз
405 410 415
Туг СЬу Ьуз ТНг Ьуз Суз ТНг АЬа Зег Азп Ьуз Азп Агд СЬу Ые Ые
420 425 430
Ьуз ТНг РНе Зег Азп СЬу Суз Азр Туг УаЬ Зег Азп Ьуз СЬу УаЬ Азр
435 440 445
ТНг УаЬ Зег УаЬ СЬу Азп ТНг Ьеи Туг Туг УаЬ Азп Ьуз СЬп СЬи СЬу
450 455 460
Ьуз Зег Ьеи Туг УаЬ Ьуз СЬу СЬи Рго Ые Ые Азп РНе Туг Азр Рсо
465 470 475 480
Ьеи УаЬ РНе Рго Зег Азр СЬи РНе Азр АЬа Зег Ые Зег СЬп УаЬ Азп
485 490 495
СЬи Ьуз Ые Азп ОЬп Зег Ьеи АЬа РНе Ые Аид Ьуз Зег Азр СЬи Ьеи
500 505 510
Ьеи НЬз Азп УаЬ Азп УаЬ СЬу Ьуз Зег ТНг ТНг Азп
515 520
<210> ! 5
<211> ' 676
<212> 1 Белок
<213> ι вирус Эбола ВипсЧЪидуо
<400> I 5
Мес УаЬ ТНг Зег СЬу Ые Ьеи СЬп Ьеи Рго Агд СЬи Агд РНе Агд Ьуз
1 5 10 15
ТНг Зег РНе РНе УаЬ Тгр УаЬ Ые Ые Ьеи РНе НЬз Ьуз УаЬ РНе Рго
- 22 024749
- 23 024749
- 24 024749
530 535 540
С1и 545 Б1у 11е НеЬ ΗΪ3 Азп С1п Азп С1у Ьеи 550 11е 555 Суз С1у Ьеи Агд С1п 560
Ьеи А1а Азп С1и ТЬг ТЬг С1п А1а Ьеи С1п Ьеи РЬе Ьеи Агд А1а ТЬг
565 570 575
ТЬг С1и Ьеи Агд ТЬг РЬе Зег 11е Ьеи Азп Агд Ьуз А1а 11е Азр РЬе
580 585 590
Ьеи Ьеи Б1п Агд Тгр С1у С1у ТЬг Суз ΗΪ3 Не Ьеи С1у Рго Азр Суз
595 600 605
Суз Не Е1и Рго Н1з Азр Тгр ТЬг Ьуз Азп 11е ТЬг Азр Ьуз Не Азр
610 615 620
С1п Не 11е НЬз Азр РЬе Не Азр Ьуз Рго Ьеи Рго Азр С1п ТЬг Азр
625 630 635 640
Азп Азр Азп Тгр Тгр ТЫ С1у Тгр Агд С1п Тгр Уа1 Рго А1а С1у Не
645 650 655
С1у 11е ТЬг С1у Уа1 11е Не А1а Уа1 11е А1а Ьеи Ьеи Суз 11е Суз
660 665 670
Ьуз РЬе Ьеи Ьеи
675
<210> 6
<211> 676
<212> : белок
<213> ; вирус Эбола, Судан, штамм Си1и
<400> 6
Мер Б1у С1у Ьеи Зег Ьеи Ьеи С1п Ьеи Рго Агд Азр Ьуз РЬе Агд Ьуз
1 5 10 15
Зег Зег РЬе РЬе Уа1 Тгр Уа1 Не 11е Ьеи РЬе С1п Ьуз А1а РЬе Зег
20 25 30
МеЬ Рго Ьеи С1у Уа1 \7а1 ТЬг Азп Зег ТЬг Ьеи С1и Уа1 ТЬг С1и Не
35 40 45
Азр Б1п Ьеи Уа1 Суз Ьуз Азр Шз Ьеи А1а Зег ТЬг Азр С1п Ьеи Ьуз
50 55 60
Зег Уа1 С1у Ьеи Азп Ьеи С1и Б1у Зег С1у Уа1 Зег ТЫ Азр Не Рго
65 70 75 80
- 25 024749
- 26 024749
- 27 024749
Ьеи Ьеи Агд Агд Тгр С1у С1у ТЬг 600 Суз Агд Не Ьеи С1у 605 Рго Азр Суз
595
Суз Не 61и Рго ΗΪ3 Азр Тгр ТЬг Ьуз Азп 11е ТЬг Азр Ьуз 11е Азп
610 615 620
С1п Не 11е ΗΪ3 Азр РЬе Не Азр Азп Рго Ьеи Рго Азп С1п Азр Азп
62 5 630 635 640
Азр Азр Азп Тгр Тгр ТЬг С1у Тгр Агд С1п Тгр 11е Рго А1а С1у 11е
645 650 655
61у Г1е ТЬг С1у 11е Не Не А1а Не Не А1а Ьеи Ьеи Суз Уа1 Суз
660 665 670
Ьуз Ьеи Ьеи Суз
675
<210> 7
<211> 676
<212> 1 Белок
<213> вирус Эбола, Заир, штамм Мау1пда
<400> 7
МеЬ С1у Уа1 ТЬг С1у Не Ьеи С1п Ьеи Рго Агд Азр Агд РЬе Ьуз Агд
1 5 10 15
ТЬг Зег РЬе РЬе Ьеи Тгр Уа1 11е 11е Ьеи РЬе С1п Агд ТЬг РЬе £ег
20 25 30
11е Рго Ьеи С1у Уа1 Не Н1з Азп Зег ТЬг Ьеи С1п Уа1 Зег Азр Уа1
35 40 45
Азр Ьуз Ьеи Уа1 Суз Агд Азр Ьуз Ьеи 5ег Зег ТЬг Азп С1п Ьеи Агд
50 55 60
5ег Уа1 С1у Ьеи Азп Ьеи С1и С1у Азп Е1у Уа1 А1а ТЬг Азр Уа1 Рго
65 70 75 80
Зег А1а ТЬг Ьуз Агд Тгр С1у РЬе Агд Зег С1у Уа1 Рго Рго Ьуз Уа1
85 90 95
Уа1 Азп Туг С1и А1а С1у С1и Тгр А1а С1и Азп Суз Туг Азп Ьеи С1и
100 105 110
Г1е Ьуз Ьуз Рго Азр еьу Зег Е1и Суз Ьеи Рго А1а А1а Рго Азр С1у
115 120 125
- 28 024749
Не Агд С1у РЬе Рго Агд Суз Агд Туг Уа1 НЬз Ьуз Уа1 Зег СЬу ТНг 130 135 140
С1у Рго Суз АЬа С1у Азр РЬе А1а РНе НЬз Ьуз С1и С1у АЬа РНе РНе 145 150 155 160
Ьеи Туг Азр Агд Ьеи А1а Зег ТЬг 7а1 11е Туг Агд С1у ТНг ТНг РНе 165 170 175
А1а СЬи 61у Уа1 Уа1 А1а РНе Ьеи Не Ьеи Рго Е1п АЬа Ьуз Ьуз Азр 180 185 1Э0
РНе РНе Зег Зег НЬз Рго Ьеи Агд СЬи Рго Уа1 Азп А1а ТНг С1и Азр 195 200 205
Рго Зег Зег СЬу Туг Туг Зег ТНг ТНг Не Агд Туг 61п А1а ТНг СЬу 210 215 220
РНе СЬу ТНг Азп С1и ТНг СЬи Туг Ьеи РНе СЬи УаЬ Азр Азп Ьеи ТНг 225 230 235 240
Туг УаЬ СЬп Ьеи СЬи 5ег Агд РЬе ТЬг Рго СЬп РЬе Ьеи Ьеи СЬп Ьеи 245 250 255
Азп СЬи ТНг Не Туг ТНг Зег СЬу Ьуз Агд Зег Азп ТНг ТНг СЬу Ьуз 260 265 270
Ьеи 11е Тгр Ьуз 17а1 Азп Рго СЬи 11е Азр ТЬг ТЬг Не С1у СЬи Тгр 275 280 285
А1а РНе Тгр СЬи ТНг Ьуз Ьуз Азп Ьеи ТНг Агд Ьуз Не Агд Зег С1и 290 295 300
С1и Ьеи Зег РНе ТНг Уа1 Уа1 Зег Азп СЬу А1а Ьуз Азп Не Зег СЬу 305 310 315 320
СЬп Зег Рго АЬа Агд ТНг Зег Зег Азр Рго СЬу ТЬг Азп ТНг ТНг ТНг 325 330 335
СЬи Азр НЬз Ьуз Не Мер А1а Зег СЬи Азп Зег Зег АЬа Меб УаЬ С1п 340 345 350
УаЬ Н1з Зег СЬп С1у Агд СЬи АЬа А1а \7а1 Зег НЬз Ьеи ТЬг ТНг Ьеи 355 360 365
А1а ТНг Не Зег ТНг Зег Рго СЬп Зег Ьеи ТНг ТЬг Ьуз Рго С1у Рго 370 375 380
Азр Азп Зег ТНг НЬз Азп ТНг Рго УаЬ Туг Ьуз Ьеи Азр Не Зег СЬи 335 390 395 400
АЬа ТНг СЬп 7а1 СЬи СЬп НЬз НЬз Агд Агд ТНг Азр Азп Азр Зег ТНг 405 410 415
АЬа Зег Азр ТНг Рго Зег АЬа ТНг ТНг АЬа АЬа СЬу Рго Рго Ьуз АЬа 420 425 430
СЬи Азп ТНг Азп ТНг Зег Ьуз Зег ТНг Азр РНе Ьеи Азр Рго АЬа ТЬг 435 440 445
ТНг ТНг Зег Рго СЬп Азп НЬз Зег СЬи ТНг АЬа СЬу Азп Азп Азп ТНг 450 455 460
НЬз НЬз Е1п Азр ТЬг СЬу СЬи СЬи Зег АЬа Зег Зег СЬу Ьуз Ьеи С1у 465 470 475 480
Ьеи Не ТНг Азп ТНг Не АЬа СЬу 7а1 АЬа СЬу Ьеи 11е ТНг СЬу СЬу 485 490 495
Агд Агд ТНг Агд Агд СЬи АЬа Не УаЬ Азп АЬа СЬп Рго Ьуз Суз Азп 500 505 510
Рго Азп Ьеи НЬз Туг Тгр ТНг ТНг СЬп Азр СЬи 61у АЬа АЬа 11е СЬу 515 520 525
Ьеи АЬа Тгр Не Рго Туг РНе СЬу Рго АЬа АЬа СЬи СЬу Не Туг Не 530 535 540
СЬи 61у Ьеи МеН НЬз Азп С1п Азр СЬу Ьеи Не Суз С1у Ьеи Агд СЬп 545 550 555 560
Ьеи АЬа Азп СЬи ТЬг ТЬг СЬп АЬа Ьеи СЬп Ьеи РЬе Ьеи Агд АЬа ТЬг 565 570 575
ТНг СЬи Ьеи Агд ТЬг РНе Зег 11е Ьеи Азп Агд Ьуз АЬа Не Азр РНе 580 585 590
Ьеи Ьеи 61п Агд Тгр СЬу СЬу ТНг Суз НЬз Не Ьеи СЬу Рго Азр Суз 595 600 605
Суз Не СЬи Рго НЬз Азр Тгр ТНг Ьуз Азп Не ТНг Азр Ьуз 11е Азр 610 615 620
СЬп Не Не НЬз Азр РЬе 7а1 Азр Ьуз ТНг Ьеи Рго Азр СЬп СЬу Азр 625 630 635 640
- 30 024749
Азп Азр Азп Тгр Тгр ТЬг С1у Тгр Агд С1п Тгр Не Рго А1а С1у 11е 645 650 655
С1у Уа1 ТЬг С1у Уа1 11е 11е А1а Уа1 11е А1а Ьеи РЬе Суз 11е Суз 660 665 670
Ьуз РЬе Уа1 РЬе 675
<210> 8 <211> 2031 <212> ДНК <213> вирус Эбола ВипсИЪидуо <400> 8 абддЬЬасаЬ саддааЬЬсЬ асааббдссс сдЬдаасдсб Ьсадааааас абсаббЫ/ЬЬ 60
дЬЬЬдддбаа ЬааЬссЪаЬб ЬсасааадН ЫсссЬаЬсс саЫдддсдЬ адЫсасаас 120
аасасЬсбсс аддбаадбда ЬаЬадабааа ЬЬддЬдбдсс дддаЬааасЬ ЫссЬссаса 180
адбсадсбда аассддьсдд дсЬСаабсСа дааддбааСд дадббдссас адаСдСасса 240
асадсаасда ададабдддд аЬЬссдадсЬ ддбдЬЬссас ссааадЬддЬ даасСасдаа 300
дсбддддадб дддсбдаааа сЬдсЬасаас сЬддасабса адааадсада ЬддЬадсдаа 360
ЬдссбассЬд аадссссбда дддЬдбаада ддсЫсссбс дсбдссдЫа Ьдбдсасаад 420
дЫЬсбддаа садддссдбд сссЬдааддб Сасдсьььсс асааадаадд сдсЫЬсЫс 480
сбдбаЬдаСс дассддсаСс аасааЬсаЬс СаЬсдаадса ссасдбЬССс адааддьдсь 540
дбддсЬЬЬсЬ ЬдабссЬссс сдааасбааа ааддасЬЬЬЬ Ьссаабсдсс ассасбасаб 600
даассддсса абабдасаас адасссаЬсс адсЬасЬасс асасадЬсас асНааНаЪ 660
дЬддсбдаса абЫЬдддас саабаЬдасЬ аасЬЫсбдЬ ЬЬсаадЬдда ЬсаЬсЪаасЪ 720
ЬаЬдЬдсаас Ьбдаассаад аССсасасса сааббСсЫд ЬссаасСсаа бдадассаы 780
ЬаЬасбааЬд ддсдЬсдсад саасассаса ддаасасбаа Ы-ЬддааадЬ ааабссЬасЬ 840
дЫдасассд дсдбаддЬда абдддссЬЬс ЬдддааааЬа адаадаасЬЬ сасааааасс 900
сСЬСсаадСд аададсСдбс СдбсабаЫЬ дсассаадад сссаддабсс аддсадсаас 960
садаадасда аддЬсасЬсс сассадсЬЪс дссаасаасс ааассЬссаа даассасдаа 1020
дасЫддЫс сададдабсс сдсЫсадбд дЫсаадЬдс дадассЬсса дадддаааас 1080
асадбдссда ссссассссс адасасадЬс сссасаасЬс ЬдаЬссссда сасаабддад 1140
даасааасса ссадссасЬа сдаассасса аасаЫЬсса дааассаЬса адададдаас 1200
аасассдсас ассссдааас ЬсЬсдссаас аабсссссад асаасасаас сссдбсдаса 1260
ссассЬсаад асддбдадсд дасаадббсс сасасаасас ссбссссссд сссадбссса 1320
ассадсасаа ЬссаЪсссас сасасдадад асЬсасаЫс ссассасааЬ дасаасаадс 1380
- 31 024749
саСдасассд асадсааЬсд асссаассса аССдасабса дсдадЬсСас ададесадда 1440
ссасЬсасса асассасаад аддддсТдса ааСсбдсЬда саддсЕсаад аадаасссда 1500
адддаааЬса сссЬдадаас асаадссааа Ьдсаасссаа ассЕасасЬа ЕЕддасаасс 1560
саадаЬдаад дддсЬдссаЪ ЬддЬЬЬадсс СддаСассЬЬ асЕЕсдддсс сдсадсадад 1620
ддааТУЬаЬа сддаадддаЬ аа^дсасааУ саааа1:дддс ЕааЕЕЕдсдд дЬЬдаддсад 1680
сСадсааа^д адасдасСса адсссСасад «аСЪскЛдс дСдсеассас ддааЕЕдсдс 1740
асСССсЬсСа сассдааЬсд аааадссаЕс дасССЬСЬас СссааадаСд дддаддаасд 1800
ЬдссасаЬсС Таддсссада ЬЬдсСдСагЬ дадссссаЬд аСЕддасСаа даасаССасЬ 1860
дасааааЬад аСсаааЬсаЬ ЬсаЬда-ЬЬЬс аЬСдаЬааас сСсЕассада ЕсааасадаЕ. 1920
аабдасаабб ддбддасадд дЬддаддсаа СдддЬЬссЬд ссдддаЕсдд даЕсасдддд 1980
дСааГааЬсд садЬТаСадс асЬдсЬдСдс аСССдсаааС ьсс£асгсьа а 2031
<210> 9 <211> 2031
<212> ДНК
<213> вирус Эбола, Судан, штамм Си1и
<400> 9 аЬддддддУс ЕЕадссЕасС ссааЕЕдссс адддасаааЕ ЕЕсддаааад сЕсЕЕЕсЕЕЕ 60
дСЕЕдддЬса ЕсаЕсЕЕаЕЕ ссааааддсс ЕЕЕЕссаЕдс сЕЕЕдддЕдЕ ЕдЕдасЕаас 120
адсасИ-Ьад аадЕаасада даЕЕдассад сЕадЕсЕдса аддаЕсаЕсЕ ЕдсаЕсЕасЕ 180
дассадсЕда ааЕсадЕЕдд ЕсЕсаассЕс даддддадсд дадЕаЕсЕас ЕдаЕаЕссса 240
ЕсЕдсаасаа адсдЕЕдддд сЕЕсадаЕсЕ ддЕдЕЕссЕс ссааддЕддЕ садсЕаЕдаа 300
дсдддадааЕ дддсЕдаааа ЕЕдсЕасааЕ сЕЕдаааЕаа адаадссдда сдддадсдаа 360
ЕдсЬЕасссс сассдссада ЕддЕдЕсада ддсЕЕЕссаа ддЕдссдсЕа ЕдЕЕсасааа 420
дсссааддаа ссдддсссЕд сссаддЕдас ЕасдссЕЕЕс асааддаЕдд адсЕЕЕсЕЕс 430
сЕсЕаЕдаса ддсЕддсЕЕс аасЕдЕааЕЕ Еасададдад ЕсааЕЕЕЕдс ЕдадддддЕа 540
аЕЕдсаЕЕсЕ ЕдаЕаЕЕддс Еааассаааа дааасдЕЕсс ЕЕсадЕсасс ссссаЕЕсда 600
даддсадсаа асЕасасЕда аааЕасаЕса адЕЕаЕЕаЕд ссасаЕссЕа сЕЕддадЕаЕ 660
даааЬсдааа аЕЕЕЕддЕдс ЕсаасасЕсс асдасссЕЕЕ ЕсааааЕЕда сааЕааЕасЕ 720
ЕЕЕдЕЕсдЕс Еддасаддсс ссасасдссЕ садЕЕссЕЕЕ ЕссадсЕдаа ЕдаЕассаЕЕ 780
сассЕЕсасс аасадЕЕдад ЕааЕасаасЕ дддадасЕаа ЕЕЕддасасЕ адаЕдсЕааЕ 840
аЕсааЕдсЕд аЕаЕЕддЕда аЕдддсЕЕЕЕ ЕдддааааЕа аааааааЕсЕ сЕссдаасаа 900
сЕасдЕддад аададсЕдЕс ЕЕЕсдаадсЕ ЕЕаЕсдсЕса асдадасада адасдаЕдаЕ 960
дсддсаЕсдЕ сдадааЕЕас ааадддаада аЕсЕссдасс дддссассад даадЕаЕЕсд 1020
- 32 024749
дассЕддЕЕс сааадааЕЕс сссЕдддаЕд дЕЕссаЕЕдс асаЕассада аддддаааса 1080
асаЕЕдссдЕ сЕсадааЕЕс дасадааддЕ сдаададЕад дЕдЕдаасас Есаддадасс 1140
аЕЕасадада садсЕдсаас ааЕЕаЕаддс асЕаасддса ассаЕаЕдса даЕсЕссасс 1200
аЕсдддаЕаа дассдадсЕс садссаааЕс ссдадЕЕссЕ сассдассас ддсассаадс 1260
ссЕдаддсЕс адасссссас аасссасаса ЕсаддЕссаЕ садЕдаЕддс сассдаддаа 1320
ссаасаасас сассдддаад сЕсссссддс ссаасаасад аадсасссас ЕсЕсассасс 1380
ссадааааЕа Еаасаасадс ддЕЕаааасЕ дЕссЕдссас аддадЕссас аадсаасддЕ 1440
сЕааЕаасЕЕ саасадЕаас адддаЕЕсЕЕ дддадЕсЕЕд ддсЕЕсдааа асдсадсада 1500
адасааасЕа асассааадс сасдддЕаад ЕдсааЕссса асЕЬасасЕа сЕддасЕдса 1560
саадаасаас аЕааЕдсЕдс ЕдддаЕЕдсс ЕддаЕсссдЕ асЕЕЕддасс дддЕдсддаа 1620
ддсаЕаЕаса сЕдааддссЕ даЕдсаЬаас сааааЕдссЕ ЕадЕсЕдЕдд асЕЕаддсаа 1680
сЕЕдсаааЕд ааасаасЕса адсЕсЕдсад сЕЕЕЕсЕЕаа дадссасаас ддадсЕдсдд 1740
асаЕаЕасса ЕасЕсааЕад дааддссаЕа даЕЕЕссЕЕс ЕдсдасдаЕд дддсдддаса 1800
ЕдсаддаЕсс Едддассада ЕЕдЕЕдсаЕЕ дадссасаЕд аЕЕддасааа ааасаЕсасЕ 1860
даЕааааЕса ассаааЕсаЕ ссаЕдаЕЕЕс аЕсдасааес ссЕЕассЕаа ЕсаддаЕааЕ 1920
даЕдэсагЕЕ ддЕддасддд сЕддадасад ЕддаЕсссЕд саддааЕадд саЕЕасЕдда 1980
аСЕаЕЕаЕЕд сааЕЕаЕЕдс ЕсЕЕсЕЕЕдс дЕЕЕдсаадс ЕдсЕЕЕдсЕд а 2031
<210> 10 <211> 2031 <212> ДНК <213> вирус Эбола, Заир, штамм Мау1пда <400> 10
аЕдддсдЕЕа саддааЕаЕЕ дсадЕЕассЕ сдЕдаЕсдаЕ Есаададдас аЕсаЕЕсЕЕЕ 60
сЕЕЕдддЕаа ЕЕаЕссЕЕЕЕ ссааадааса ЕЕЕЕссаЕсс сасЕЕддадЕ саЕссасааЕ 120
адсасаЕЕас аддЕЕадЕда ЕдЕсдасааа сЕадЕЕЕдЕс дЕдасааасЕ дЕсаЕссаса 180
ааЕсааЕЕда даЕсадЕЕдд асЕдааЕсЕс даадддааЕд дадЕддсаас ЕдасдЕдсса 240
ЕсЕдсаасЕа ааадаЕдддд сЕЕсаддЕсс ддЕдЕсссас саааддЕддЕ сааЕЕаЕдаа 300
дсЕддЕдааЕ дддсЕдаааа сЕдсЕасааЕ сЕЕдаааЕса ааааассЕда сдддадЕдад 360
ЕдЕсЕассад садсдссада сдддаЕЕсдд ддсЕЕссссс ддЕдссддЕа ЕдЕдсасааа 420
дЕаЕсаддаа сдддассдЕд Едссддадас ЕЕЕдссЕЕсс аЕааададдд ЕдсЕЕЕсЕЕС 480
сЕдЕаЕдаЕс дасЕЕдсЕЕс сасадЕЕаЕс Еассдаддаа сдасЕЕЕсдс ЕдааддЕдЕс 540
дЕЕдсаЕЕЕс ЕдаЕасЕдсс ссаадсЕаад ааддасЕЕсЕ ЕсадсЕсаса ссссЕЕдада 600
дадссддЕса аЕдсаасдда ддасссдЕсЕ адЕддсЕасЕ аЕЕсЕассас ааЕЕадаЕаЕ 660
саддсЕассд дЕЕЕЕддаас сааЕдадаса дадЕасЕЕдЕ ЕсдаддЕЕда сааЕЕЕдасс 720
- 33 024749
Ьасдбссаас ССдааСсаад аССсасасса садСССсСдс СссадсСдаа ТдадасааУа 780
£а£асаад1д ддааааддад сааСассасд ддаааасСаа СССддааддС саассссдаа 840
аЬЬдаЬасаа сааСсдддда дСдддссССс СдддааасСа ааааааассС сасЬадаааа 900
аЬЬсдсадЬд аададССдСс СССсасадСС дСаСсааасд дадссааааа са^садЬддС 960
сададСссдд сдсдаасССс ССссдассса дддассааса саасаасСда адассасааа 1020
абса^ддсЫ садааааССс сСсСдсааСд дССсаадСдс асадСсаадд аадддаадс£ 1080
дсадСдТсдс аСсСаасаас ссССдссаса аСсСссасда дСссссааСс ссЬсасаасс 1140
ааассаддСс сддасаасад сасссаСааС асасссдСдС аСааасССда саЬсСсСдад 1200
дсаасЬсаад ССдаасааса Ссассдсада асадасаасд асадсасадс сЬссдасасС 1260
ссс£сСдсса сдассдсадс сддассссса ааадсадада асассаасас дадсаададс 1320
асЬдасИзсс Сддассссдс сассасааса адСссссааа ассасадсда дассдсЬддс 1380
аасаасааса сСсаСсасса адаСассдда даадададсд ссадсадсдд даадсСаддс 1440
С^аа^касса асассаССдс Сддадссдса ддасСдаСса саддсдддад аадаас^сда 1500
ададаадсаа ССдСсааСдс Ссаасссааа СдсаасссСа а^СЬасаЪЬа с£ддасЪас£ 1560
саддаСдаад дСдсСдсааС сддасСддсс СддаСассаС аГССсдддсс адсадссдад 1620
ддааССЬаса СададдддсС ааСдеасааС саадаСддСс ЬааЬсЬдЪдд дЬЬдадасад 1680
сСддссаасд адасдасСса адссссссаа сСдССссСда дадссасаас СдадсЬасдс 1740
ассСсССсаа СссСсаассд СааддсааСЬ да!:1:СсСЬдс ЬдсадсдаЬд дддсддсаса 1800
СдссасаССс сдддассдда сСдсГдСаСс даассасаСд аСЕ-ддассаа дааса£ааса 1860
дасааааССд аСсадаССаС СсаСдасССС дССдаСаааа сссИссдда ссадддддас 1920
ааСдасааСС ддСддасадд аСддадасаа СддаСассдд садд^аССдд адЬСасаддс 1980
дССаСааССд садсСаСсдс СССаССсСдС аСаСдсаааС -ЁдЪсХЬЬГа д 2031
<210> 11 <211> 2031 <212> ДНК <213> вирус Эбола ВипсНЬидуо <400> 11
а6дд1саса1; сСддааСесИ ссадсСсссИ адддаасддС Сссддаааас садСй-СсСЫ 60
дбсСдддОса ЬсаЬссЪсЬС ссаСааддЬд И.ссс1а1сс ссс£дддддС сдСссаСаас 120
аабасаСЬдс аадбдСсада ЬабсдаСаад С^ддбдЬдСс дсдабааасЬ д^саСсбасс 180
ИсТсадсСда ааадсдгсдд ссСсаассСс даадддааЬд дТдЬсдссас СдаСдЬсссЬ 240
асЬдссасаа аасдаЬдддд Ь'Ы.ссдддс'Ь ддЬдЬссссс саааад!дд(; саасСа^даа 300
дсПддсдааТ дддсададаа ЬУдсСаСааС сИддасаСЬа ааааддссда Тддс1:ссдад 360
- 34 024749
ЕдЕсЕсссЕд аадсЕссЕда дддсдЕдсдд ддаЕЕссеаа даЕдЕсдсЕа сдЕссаЕааа 420
дЕдЕсЕддса ссддсссЕЕд сссЕдаадда ЕасдссЕЕЕс аЕааадаадд ддссЕЕЕЕЕс 480
сЕсЕаЕдаЕс дссЕддсЕЕс сасааЕЕаЕс ЕаЕсдсЕсЕа сЕассЕЕЕЕс сдадддддЕд 540
дЕсдсЕЕЕЕс ЕсаЕссЕссс сдадасааад ааадаЕЕЕсЕ ЕЕсададЕсс сссссЕдсаЕ 600
дадссЕдсса аЕаЕдасЕас сдаЕссЕЕсс ЕсЕЕасЕаЕс аЕассдЕдас асЕсааЕЕаЕ 660
дЕсдсЕдаЕа асЕЕсддсас ЕаасаЕдасс аасЕЕЕсЕдЕ ЕссаддЕсда ссассЕдаса 720
ЕаЕдЕссадс ЕсдадссЕсд сЕЕЕасссса садЕЕссЕдд ЕссадсЕсаа ЕдааасЕаЕс 780
ЕаЕасЕаасд дасддсдсЕс ЕааЕассасс дддасссЕса ЕЕЕддааадЕ сааЕсссасЕ 840
дЕсдаЕассд дсдЕсддада дЕдддссЕЕЕ Едддааааса адаадаасЕЕ Еассаадасс 900
сЕдадЕадсд аддаасЕсЕс ЕдЕдаЕсЕЕЕ дЕдссЕсдсд сЕсаддаЕсс ЕддаЕссаас 960
садаааасса эадЪдасасс ЕасаЕсЕ11. дссаасаасс адасаадсаа даассаЕдад 1020
дассЕсдЕсс ссдаадаЕсс ЕдссЕсЕдЕд дЕссаддЕсс дддассЕсса дсдсдааааЕ 1080
ассдЕдссЕа сЕсссссссс ЕдаЕассдЕс ссЕасЕассс ЕсаЕЕсссда ЕасааЕддаа 1140
даасадасса ссЕсЕсаЕЕа сдадссассЕ аасаЕсЕсса даааЕсасса ддаасдаааЕ 1200
аасассдсЕс аЕсссдадас ЕсЕддсЕааЕ аасссссссд асааЕасЕас сссЕадЕасс 1260
сссссЕсадд асддддадад аассадЕЕсс саЕасЕасас ссЕссссаад асссдЕсссЕ 1320
асаЕсЕасса ЕЕсаЕсссас сасссдсдад асасасаЕЕс сЕассасЕаЕ дассасаЕсс 1380
саЕдасассд аЕЕссааЕсд сссЕаасссс аЕсдаЕаЕса дсдааЕсЕас сдадсссдда 1440
ссссЕсасаа аЕасаасссд сддадссдсЕ ааЕсЕдсЕда сЕддсЕсссд дсдсасЕсда 1500
ададаааСса сссЕдсдаас асаддссаад ЕдЕаасссаа ассЕссаЕЕа ЕЕддасаасс 1560
саддаЕдаад дддссдсЕаЕ ЕддссЕсдсЕ ЕддаЕсссЕЕ аЕЕЕсдддсс Едсадссдад 1620
дддаЕсЕаЕа ссдааддЕаЕ ааЕдсаЕааЕ садаасдддс ЕдаЕЕЕдсдд дсЕдсдссад 1680
сЕсдссаасд адасЕассса ддсссЕссад сЕсЕЕЕсЕсс дддсЕасЕас сдаасЕдсда 1740
ассЕЕЕЕеса ЕЕсЕсааЕад дааадсЕаЕс даЕЕЕсЕЕдс ЕссадсдсЕд ддддддаасс 1800
ЕдЕсаЕаЕсс Есддасссда ЕЕдсЕдЕаЕЕ дадссасаСд аЕЕддасЕаа ааасаЕсасЕ 1360
дасааааЕЕд аЕсадаЕсаЕ ЕсаЕдаЕЕЕс аЕЕдаЕааас сссЕссссда ЕсадасЕдаЕ 1920
ааЕдасааЕЕ ддЕддасддд аЕддсдссад СдддЕдсссд сЕдддаЕЕдд саЕЕасаддЕ 1900
дЕсаЕЕаЕЕд ссдЕдаЕЕдс асЕссЕдЕдЕ аЕсЕдЕаааЕ ЕЕсЕдсЕдЕд а 2031
<210> 12 <211> 2031 <212> ДНК <213> вирус Эбола, Судан, штамм Си1и <400> 12 аЕдддсддсс ЕдадссЕдсЕ дсадсЕдссс сдддасаадЕ ЕссддаадЕс садсЕЕсЕЕс 60
- 35 024749
дГдНдддОда йсаЬссЕд'ЬС ссадааадсс НОсадсайдс ссс£дддсд1: дд'Ьдассаас 120
адсасссбдд аадбдассда да1:сдассад сНддСдНдса аддассассх ддссадсасс 180
да£садс1:да адРссдСддд ссЪдаассЬд дааддсадсд дсд^дадсас сдасаСсссс 240
адсдссасса ададаСдддд с^сада^сс ддсдСдсссс ссаадд£дд1: д1:сЁС.а1:дад 300
дссддсдад-е дддссдадаа с£дс£асаас сОддаааОса адаадсссда сддсадсдад 360
СдИс£дсс1:с ссссНсссда СддсдСдада ддеРЬсессс дд£дсада1:а сд1:дсасаад 420
дсасааддса ссддГссаед сссаддсдас СасдссГСсс асааддасдд сдсс£ЛМ:ис 480
с£д£асдасс ддсрддссйс сассд£да£с Ьассддддсд ЬдаасЪЪЪдс сдадддсд£д 540
а£сдсс1Лсс ОдаСссЬддс саадсссааа дадасаНсс Ъдсададссс ссссаЪссдд 600
даддссдСда асСасассда даасассадс адсРасЬасд ссасс1:сс±а сс£ддаа£ас 660
дада^сдада асССсддсдс ссадсасадс ассасссйдр Ьсаада£сда саасаасасс 720
ЁСсд^дсддс Сддасадасс ссасассссс садСССсбдН 1ссадсСдаа сдасасса'Ьс 780
са1;с£дса£с адсадсНдНс саасассасс ддсадаоЬда 1с1:ддассс£ ддасдссаас 840
аСсаасдссд асаСсддНда а ϋ ддд с С ¢.1:1: Сдддадааса адаадаа1:с1: дадсдадсад 900
с^дсддддсд аадаасЬсад сМ:сдаддсс сЬдадссЬда асдадасада ддасдасдас 960
дссдссадса дссддассас саадддссдд аСсадсдасс дддссассад ааад1:асадс 1020
дасс^ддСдс ссаадаасад ссссддса1:д дЬдссйсбдс асаЪссссда дддсдадаса 1080
ас£с£ссс£а дЬсадааЬад сассдадддс адасдсдЬдд дсдЬдаасас ссаддааасс 1140
а^сассдада садссдссас са£са1:Ьдд£ асЬаасддса ассасаЬдса да^садсасо 1200
а£сддса^сс ддсссадсад садссада'Ьс ссаадОадОа дЬссЬассас адсссс£адс 1260
сс’Ьдаддссс адассссЬас сасасасасс адсддсссОа дсдЪдаЪддс сассдаддаа 1320
сс^ассассс сбссЬддсад садсссадд'Ь ссаасЬассд аддсассаас сс±дасеасс 1380
сссдадааса гсассассдс сд¢даааасс дСдсРдсссс аддааадсас садсаасддс 1440
ехда^сасса дсассдОдас сддса1:сс£д ддсадссйдд дссЬдсддаа дсддадсада 1500
сддсадасса асассааддс сассддсаад Ьдсаасссса асс£дсас£а с£ддассдсс 1560
саддаасадс асаасдссдс £ддда£сдсс ЬддаЬссссЬ ас£Ъ£дд£сс £дд£дс£дад 1620
ддааъаьаса есдадддссС да^дсасаас садаасдссс ЬддЬдЬдсдд ссЁдадасад 1680
с1;ддссаасд ааассасЬса ддсасЪдсад сЬдЬЬссЬдс дддссассас сдадсЪдсдд 1740
асс±асасса ЬссЬдаасад дааддссаЪс дасЫЬсЬдс ЬдсддадаЬд дддсддсасс 1800
1;д-Ьадаа1;сс Сдддссссда с£дсСдса1:с дадссссасд асЬддассаа дааЬаСсасс 1860
дасаадаЪса ассадайсаЬ ссасдас£Лс аЬсдасаасс сссЬдсссаа ссаддасаас 1920
дасдасаасЪ ддЬддасЬдд ЁЬддсдасад ЬддаЬсссЬд ссддсаЬсдд са£сассддс 1930
- 36 024749 аЕсаЕсаЕЕд ссаЕЕаЕсдс ЕсЕссЕсЕдс дЕдЕдсаадс ЕссЕсЕдсЕд а 2031 <210> 13 <211> 2031 <212> ДНК <213> вирус Эбола, Заир, штамм Мау1пда <400> 13
аЕдддсдЕда саддсаЕЬсЕ дсадсЕсссс ададасадаЕ Есаадсддас сЕссЕЕЕЕЕс 60
сЕсЕдддЕса ЕсаЕЕсЕдЕЕ Есадсддасс ЕЕсЕссаЕсс сЕсЕдддсдЕ даЕссасааЕ 120
адсасссЕсс аддЕдЕссда сдСддасаад сЕсдЕдЕдсс дддасаадсЕ дЕссЕссасс 180
аассадсЕда даадсдЕддд дсЕдааЕсЕс дадддсааЕд дсдЕддссас адасдЕдссс 240
Ессдссасаа адсдсЕдддд сЕЕЕсддадс ддсдЕсссЕс сЕааадЕсдЕ даасЕасдад 300
дсаддддааЕ дддсЕдаааа ЕЕдЕЕасааЕ сЕсдадаЕса ааааассада ЕддсЕсЕдад 360
ЕдссЕдссЕд ссдсассада сддсаЕсадд ддсЕЕсссЕа даЕдссдсЕа ЕдЕдсасаад 420
дЕдадЕддЕа саддсссЕЕд ЕдссддсдаЕ ЕЕЕдссЕЕЕс асааададдд ддсЕЕЕсЕЕЕ 480
сЕдЕасдаса ддсЕсдссад ЕасадСдаЕа ЕассдаддЕа сЕассЕЕсдс сдааддсдЕд 540
дЕддссЕЕЕс ЕдаСЕсЕдсс ссаддссаад ааддасЕЕсЕ Есадсадсса сссссЕдада 600
даасссдЕда асдссасада ддассссадс адсддсЕасЕ асадсассас ааЕсадаЕас 660
саддссасад дсЕЕсддсас сааЕдадаса дадЕассЕдЕ ЕсдаддЕдда саассЕдасс 720
ЕасдЕдсадс Еддааадссд дЕЕЕассссЕ садЕЕссЕсс ЕдсадсЕсаа сдадасааЕс 780
ЕасассЕссд дсаадсддад саасасааса ддсаадсЕса ЕсЕддааадЕ даассссдад 840
аЕсдаЕасса сЕаЕадддда дЕдддсЕЕЕс ЕдддааасЕа адаадаассЕ сасссддаад 900
аЕсадаЕссд аддаасЕдЕс сЕЕсассдЕд дЕдЕссаасд дсдссаадаа саЕЕЕсадда 960
сададссссд ссадаасаад садсдасссс ддсассааса ссасаассда ддассасаад 1020
аЕсаЕддсса дсдадаасЕс садсдссаЕд дЕдсаддЕсс асадссаддд аададаадсс 1080
дссдЕдадсс ассЕдассас асЕддссасс аЕсадсасса дсссссадад ссЕдассасс 1140
аадссЕддсс ссдасаасад сасасасаас асссссдЕдЕ асаадсЕдда саЕсадсдад 1200
дссасссадд Еддадсадса ссасадасдд ассдасаасд асадсассдс садсдаЕасс 1260
ссЕЕсЕдсса ссасадссдс сддасссссЕ ааддссдада аЕассаасас садсаададс 1320
ассдасЕЕЕс ЕддаЕссадс сассассасс адЕссасада ассасадсда аассдссддс 1380
аасаасааЕа сссассасса ддасассддс даддааадсд ссадсЕсЕдд саадсЕдддс 1440
сЕдаЕЕасса асасааЕсдс сддсдЕддсс ддасЕдаЕса ссддсддсад асддассада 1500
сдддаддсса ЕсдЕдаасдс ссадсссааа ЕдЕааЕссЕа аЕсЕссасЕа ЕЕддассаса 1560
саддасдадд дсдсЕдссаЕ сддасЕддса ЕддаЕЕссЕЕ асЕЕсддасс адссдсЕдаа 1620
- 37 024749
дддабсбаба бсдаддддсб сабдсабаас саддабддбс бдабббдбдд есхссддсад 1680
сбддсбаабд адасаасаса ддсбсбссад сбдбббсбда дадссасаас адгдссдада 1740
ассббсадса ббсбсаассд сааддсбабб дасббссбдс бсеаасдабд дддаддсаса 1800
бдссасабсс Ьддддссбда ббдббдбабс даассбсасд аббддасааа дааса££аса 1860
дабаадабсд абсадаббаб ссабдасббб дбддасаада сссбдсссда Ъсадддсдас 1920
аасдабаабб ддбддасадд дбддадасад бддаббссад ссдддаббдд сд^дассддс 1980
дбдаббабсд ссдбдабсдс ссбдббсбдс абсбдсаадб бсдбдббсбд а 2031

Claims (11)

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Стабильный экспрессионный вектор со сниженным уровнем внутримолекулярной рекомбинации, содержащий две гомологичные или гетерологичные нуклеотидные последовательности длиной 300 нуклеотидов, кодирующие 100 аминокислот, имеющие по меньшей мере 75%-ную идентичность, где в одной или двух указанных нуклеотидных последовательностях по меньшей мере 75 нуклеотидов заменены другими нуклеотидами посредством вырожденности генетического кода, и отличающиеся нуклеотиды не изменяют аминокислоты, кодируемые указанными двумя нуклеотидными последовательностями, причем после указанной замены эти нуклеотидные последовательности имеют участки не более чем с 13 последовательно расположенными идентичными нуклеотидами.
2. Вектор по п.1, который является вирусным вектором, предпочтительно поксвирусным вектором.
3. Вектор по п.2, где поксвирус является вирусом коровьей оспы, предпочтительно модифицированным вирусом коровьей оспы Апкага (МУА).
4. Вектор по любому из пп.1-3, где две указанные нуклеотидные последовательности являются генами респираторно-синцитиального (К8У) вируса, в частности генами К8У-Р и/или К8У-О, или двумя, предпочтительно тремя, генами филовируса, в частности генами филовирусного гликопротеина (ОР).
5. Вектор по п.4, где две указанные нуклеотидные последовательности после указанной замены нуклеотидов кодируют белки К8У-Р, содержащие последовательность 8Еф ΙΌ ΝΟ: 1 и 8Еф ГО ΝΟ: 2, или белки ОР филовируса, содержащие последовательности 8Еф ГО ΝΟ: 12 и 13.
6. Способ получения вектора по п.1, включающий стадии:
a) получения первой нуклеотидной последовательности длиной 300 нуклеотидов, кодирующей 100 аминокислот;
b) получения второй нуклеотидной последовательности длиной 300 нуклеотидов, кодирующей 100 аминокислот, где указанные 100 аминокислот, кодируемые каждой из двух указанных нуклеотидных последовательностей, имеют по меньшей мере 75%-ную идентичность и в одной или двух указанных нуклеотидных последовательностях по меньшей мере 75 нуклеотидов заменены другими нуклеотидами посредством вырожденности генетического кода, причем отличающиеся нуклеотиды не изменяют аминокислоты, кодируемые указанными двумя нуклеотидными последовательностями, и после замены эти последовательности имеют участки не более чем с 13 последовательно расположенными идентичными нуклеотидами; и
c) интеграции двух указанных нуклеотидных последовательностей в вектор.
7. Способ снижения внутримолекулярной рекомбинации в векторе по п.1, который содержит две гомологичные или гетерологичные нуклеотидные последовательности длиной 300 нуклеотидов, кодирующие каждая 100 аминокислот, которые имеют по меньшей мере 75%-ную идентичность, включающий замену нуклеотидов в одной или двух указанных нуклеотидных последовательностях для получения двух различающихся последовательностей вследствие вырожденности генетического кода, которые имеют отличие по меньшей мере в 75 нуклеотидов, где отличающиеся нуклеотиды не изменяют аминокислоты, кодируемые указанными двумя нуклеотидными последовательностями, причем после замены эти последовательности имеют участки не более чем с 13 последовательно расположенными идентичными нуклеотидами.
8. Способ по п.6 или 7, где вектор является вирусным вектором, предпочтительно поксвирусным вектором.
9. Способ по п.8, где поксвирус является вирусом коровьей оспы, предпочтительно модифицированным вирусом коровьей оспы Апкага (МУА).
10. Способ по любому из пп.6-9, где две указанные нуклеотидные последовательности являются генами респираторно-синцитиального (К8У) вируса, в частности генами К8У-Р и/или К8У-О, или двумя, предпочтительно тремя, генами филовируса, в частности генами филовирусного гликопротеина (ОР).
11. Вирус МУА со сниженным уровнем внутримолекулярной рекомбинации, содержащий последовательности 8Еф ГО ΝΟ: 1 и 8Еф ГО ΝΟ: 2 или содержащий последовательности 8Еф ГО ΝΟ: 12 и 13.
EA201170715A 2008-11-21 2009-11-20 Экспрессионный вектор со сниженным уровнем внутримолекулярной рекомбинации, содержащий гомологичные или гетерологичные нуклеотидные последовательности EA024749B1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US11667208P 2008-11-21 2008-11-21
PCT/EP2009/008275 WO2010057650A1 (en) 2008-11-21 2009-11-20 Vector comprising multiple homologous nucleotide sequences

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201170715A1 EA201170715A1 (ru) 2012-03-30
EA024749B1 true EA024749B1 (ru) 2016-10-31

Family

ID=40547753

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201170715A EA024749B1 (ru) 2008-11-21 2009-11-20 Экспрессионный вектор со сниженным уровнем внутримолекулярной рекомбинации, содержащий гомологичные или гетерологичные нуклеотидные последовательности

Country Status (18)

Country Link
US (4) US8999637B2 (ru)
EP (1) EP2352834B1 (ru)
JP (2) JP2012509073A (ru)
KR (1) KR101702956B1 (ru)
CN (2) CN102325888B (ru)
AU (1) AU2009317517B2 (ru)
CA (1) CA2742247C (ru)
DK (1) DK2352834T3 (ru)
EA (1) EA024749B1 (ru)
ES (1) ES2618103T3 (ru)
HK (1) HK1160884A1 (ru)
IL (1) IL211498A (ru)
MX (1) MX2011005171A (ru)
MY (1) MY161849A (ru)
NZ (2) NZ602322A (ru)
UA (1) UA105193C2 (ru)
WO (1) WO2010057650A1 (ru)
ZA (1) ZA201306331B (ru)

Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013031827A1 (ja) 2011-08-29 2013-03-07 国立大学法人徳島大学 Rsv粘膜ワクチン
AU2013245729B2 (en) * 2012-04-12 2016-09-29 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Filovirus consensus antigens, nucleic acid constructs and vaccines made therefrom, and methods of using same
EA201891945A3 (ru) 2012-08-01 2019-05-31 Бавариан Нордик А/С Вакцина рекомбинантного модифицированного вируса осповакцины анкара (mva) респираторно-синцитиального вируса (rsv)
US20140099445A1 (en) 2012-10-09 2014-04-10 University Of Massachusetts Method for producing a film having a nano-structure on the surface of the film
JPWO2014097762A1 (ja) * 2012-12-20 2017-01-12 国立大学法人 熊本大学 高病原性トリインフルエンザに対する抗体
EP3068896B1 (en) 2013-11-12 2018-08-08 Life Technologies Corporation Reagents and methods for sequencing
KR101963985B1 (ko) 2014-09-03 2019-07-31 버베리안 노딕 에이/에스 필로바이러스 감염에 대한 보호 면역을 유도하기 위한 방법 및 조성물
MX2017002791A (es) 2014-09-03 2017-05-30 Bavarian Nordic As Vacuna contra filovirus de virus vaccinia ankara modificado (mva) recombinante.
SG11201701745TA (en) * 2014-09-03 2017-04-27 Bavarian Nordic As Methods and compositions for enhancing immune responses
FR3042121A1 (fr) 2015-10-08 2017-04-14 Jean-Marc Limacher Composition anti-tumorale
EP3484507A1 (en) 2016-07-15 2019-05-22 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Methods and compositions for inducing protective immunity against a marburg virus infection
EP3606553A1 (en) 2017-04-06 2020-02-12 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Mva-bn and ad26.zebov or ad26.filo prime-boost regimen

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1990012880A1 (en) * 1989-04-18 1990-11-01 Applied Biotechnology, Inc. Generation of hybrid genes and proteins by virus-mediated recombination
WO2003097846A1 (en) * 2002-05-16 2003-11-27 Bavarian Nordic A/S Recombinant poxvirus expressing homologous genes inserted into the poxviral genome

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE19629828A1 (de) * 1996-07-24 1998-01-29 Bayer Ag Carbanilide
FR2774699B1 (fr) * 1997-11-17 2003-10-03 Rhone Poulenc Rorer Sa Methode de reduction des evenements de recombinaison homologue
CA2466413C (en) 2001-12-04 2014-11-04 Bavarian Nordic A/S Flavivirus ns1 subunit vaccine
US7501127B2 (en) 2002-05-16 2009-03-10 Bavarian Nordic A/S Intergenic regions as novel sites for insertion of HIV DNA sequences in the genome of Modified Vaccinia virus Ankara
PT1567653E (pt) 2002-11-25 2007-10-01 Bavarian Nordic As Poxvírus recombinante que compreende pelo menos dois promotores do vírus da varíola bovina ati
JP2012509678A (ja) 2008-11-27 2012-04-26 バヴァリアン・ノルディック・アクティーゼルスカブ 組換えウイルス発現のためのプロモーター

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1990012880A1 (en) * 1989-04-18 1990-11-01 Applied Biotechnology, Inc. Generation of hybrid genes and proteins by virus-mediated recombination
WO2003097846A1 (en) * 2002-05-16 2003-11-27 Bavarian Nordic A/S Recombinant poxvirus expressing homologous genes inserted into the poxviral genome

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ANTONIS, A.F.G. VAN DER MOST, R.G. SUEZER, Y. STOCKHOFE-ZURWIEDEN, N. DAUS, F. SUTTER, G. SCHRIJVER, R.S.: "Vaccination with recombinant modified vaccinia virus Ankara expressing bovine respiratory syncytial virus (bRSV) proteins protects calves against RSV challenge", VACCINE, ELSEVIER LTD, GB, vol. 25, no. 25, 30 May 2007 (2007-05-30), GB, pages 4818 - 4827, XP022098626, ISSN: 0264-410X, DOI: 10.1016/j.vaccine.2007.04.002 *
FULLER M , ANSON D S: "Helper plasmids for production of HIV-1-derived vectors.", HUMAN GENE THERAPY, MARY ANN LIEBERT, INC. PUBLISHERS, US, vol. 12, no. 17, 20 November 2001 (2001-11-20), US, pages 2081 - 2093, XP002287261, ISSN: 1043-0342, DOI: 10.1089/10430340152677421 *
HRUBY D E, ET AL: "Assembly and analysis of a functional vaccinia virus "amplicon" containing the C-repeat region from the M protein of Streptococcus pyogenes.", PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES, NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES, US, vol. 88, no. 8, 15 April 1991 (1991-04-15), US, pages 3190 - 3194, XP002524649, ISSN: 0027-8424, DOI: 10.1073/pnas.88.8.3190 *
ZHAO SHENG, ET AL: "Analysis of synonymous codon usage in 11 Human Bocavirus isolates", BIOSYSTEMS., NORTH-HOLLAND, AMSTERDAM., NL, vol. 92, no. 3, 1 June 2008 (2008-06-01), NL, pages 207 - 214, XP002575799, ISSN: 0303-2647, DOI: 10.1016/j.biosystems.2008.01.006 *

Also Published As

Publication number Publication date
MX2011005171A (es) 2011-05-30
WO2010057650A1 (en) 2010-05-27
JP2015128443A (ja) 2015-07-16
US20170211098A1 (en) 2017-07-27
US20190055582A1 (en) 2019-02-21
HK1160884A1 (zh) 2012-08-17
JP2012509073A (ja) 2012-04-19
CN102325888B (zh) 2016-09-07
UA105193C2 (ru) 2014-04-25
US20160017369A1 (en) 2016-01-21
KR20110105780A (ko) 2011-09-27
AU2009317517B2 (en) 2014-12-04
US8999637B2 (en) 2015-04-07
US11225673B2 (en) 2022-01-18
CA2742247C (en) 2017-07-04
US9540660B2 (en) 2017-01-10
US10072274B2 (en) 2018-09-11
AU2009317517A1 (en) 2010-05-27
CA2742247A1 (en) 2010-05-27
DK2352834T3 (en) 2017-03-13
CN106318978B (zh) 2020-06-23
MY161849A (en) 2017-05-15
JP6316227B2 (ja) 2018-04-25
ES2618103T3 (es) 2017-06-20
CN106318978A (zh) 2017-01-11
EP2352834A1 (en) 2011-08-10
NZ591662A (en) 2012-10-26
CN102325888A (zh) 2012-01-18
ZA201306331B (en) 2016-07-27
NZ602322A (en) 2013-12-20
IL211498A (en) 2016-06-30
EP2352834B1 (en) 2016-12-21
KR101702956B1 (ko) 2017-02-06
EA201170715A1 (ru) 2012-03-30
US20110236976A1 (en) 2011-09-29
IL211498A0 (en) 2011-05-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA024749B1 (ru) Экспрессионный вектор со сниженным уровнем внутримолекулярной рекомбинации, содержащий гомологичные или гетерологичные нуклеотидные последовательности
JP5783642B2 (ja) Ｍｖａの主なゲノム欠失を含むワクシニアウイルス変異体
Wang et al. Modified H5 promoter improves stability of insert genes while maintaining immunogenicity during extended passage of genetically engineered MVA vaccines
AU2017346788A1 (en) Cytomegalovirus vectors eliciting T cells restricted by major histocompatibility complex E molecules
US20220265812A1 (en) Hiv antigens and mhc complexes
Wennier et al. A novel naturally occurring tandem promoter in modified vaccinia virus ankara drives very early gene expression and potent immune responses
CN114072516A (zh) 经修饰的腺病毒
CA3173996A1 (en) Recombinant poxvirus based vaccine against sars-cov-2 virus
JP2004531232A (ja) 高められた転写および複製能力をもつインフルエンザウイルス
CN1723285B (zh) 重组的mva及其产生方法
JP5639736B2 (ja) ポックスウイルスゲノムへの異種遺伝子の組込みのためのベクター
US20210062221A1 (en) Genetically modified recombinant vaccinia ankara (rmva) vaccines of improved stability and methods of preparation thereof
CN116549627A (zh) 基于腺病毒载体的广谱新冠疫苗及其应用
US20230381299A1 (en) Vaccination of hematopoietic stem cell donors with cytomegalovirus triplex composition
Neckermann et al. Transgene expression knock-down in recombinant Modified Vaccinia virus Ankara vectors improves genetic stability and sustained transgene maintenance across multiple passages
CN116426489A (zh) 一种基于CRISPR-Cas9技术的表达新型鹅星状病毒ORF2蛋白C端的重组血清4型禽腺病毒及其制备方法
JP2019187249A (ja) 増殖性ヘルパーワクシニアウイルスを使用するポックスウイルスの製造方法

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ KZ KG MD TJ TM