CN101610847A - 样品分析仪 - Google Patents
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Abstract
提供用于分析复数的不同样品的方法。该方法包括步骤：a)把样品施于固定了分析组分的支持物上；和b)允许样品与分析组分相互作用，从而允许样品的分析。步骤a)中，样品施于支持物上的不同区域，在支持物上产生样品的空间排列。在步骤b)中维持样品的空间排列，从而允许匹配分析结果与单个样品。
Description
本文中所有引用的文献通过引用其全文并入。
技术领域
本发明属于样品分析领域，尤其是生物样品的平行分析。
背景技术
样品的平行分析在包括生物学研究在内的许多技术领域中是重要的。平行分析的一些已知方法涉及平行地独立分析不同的样品，例如在微量滴定板的不同孔中分析不同的样品。其它已知的方法可同时分析样品，但是需要差别标记不同的样品，使每种样品产生的信号都可以被识别。DNA微阵列已经用于差别标记样品的同步平行分析(例如参见参考文献1)。
对于样品，特别是生物学样品的平行分析，存在对新的以及改良的方法和装置的需要。本发明的目的是提供此类方法和装置。
发明公开
本发明提供了用于样品，特别是用于生物样品的平行分析的方法和装置。在本发明的方法中，通过使样品与支持物上的分析组分相互作用，来分析样品。当样品与分析组分相互作用时，检测到样品中的目标分析物。
本发明提供了用于分析复数的不同样品的方法。该方法包括下列步骤：a)将样品施于支持物，所述支持物上固定了分析组分；和b)使样品与分析组分相互作用，从而实现样品的分析。在步骤a)中，样品施于支持物的不同区域，从而在支持物上产生样品的空间排列。在步骤b)中，维持样品的空间排列，从而允许分析结果与单个样品相匹配。大体的方法示意性地说明于图1。
本发明的方法涉及样品在支持物上的空间排列的产生和维持，其提供了与用于平行样品分析的已知方法相比的优点。例如，本发明的方法允许使用相同的分析组分平行分析多个样品，使每种样品受到基本相同的处理和分析，可以直接比较结果。此外，本发明的方法不需要差别标记不同的样品——单个样品在支持物上分布的区域是已知的或可以鉴别的，因此可以方便的鉴别每个独立样品产生的信号。
在一些实施方案中，不同的分析组分固定在支持物上的不同块(patches)中。在这类实施方案中，可以使用相同的支持物，针对多个目标分析物，平行分析多个样品，如图2示例。
本发明的方法可用于生物样品的分析，例如包含细胞或细胞来源材料的样品。本发明的方法特别可用于分析单个细胞或来源于单个细胞的材料。
在一个实施方案中，本发明提供了用于分析复数的不同单个细胞的方法，包括下列步骤：a)将来源于单个细胞的材料施于支持物上，所述支持物上固定了分析组分；和b)使材料与分析组分相互作用，从而实现材料的分析。在步骤a)中，来源于不同的单个细胞的材料施于支持物的不同区域，从而在支持物上产生材料的空间排列，在步骤b)中，维持所述空间排列，从而允许分析结果与单个细胞相匹配。
在一些方法中，样品直接施于支持物上，产生样品的空间排列，如图1所示。因此，当样品是包括细胞的生物样品时，样品施于支持物上的步骤a)可以包括：(i)将细胞施于支持物；然后(ii)从细胞释放材料。可选择地，步骤a)可以包括：(i)从细胞释放材料；然后(ii)把释放的材料施于支持物。当独立地分析细胞时，来源于每个细胞的材料施于支持物的不同区域，从而在支持物上产生材料的空间排列。在步骤b)中，维持材料的空间排列，因此分析结果可以与单个细胞相匹配。在一些实施方案中，此类直接的样品施用方法是有利的，因为使用简单的装置和少数的样品处理步骤即可实施。
在一些方法中，首先把样品施于转移基底，产生样品的空间排列，然后，将目标分析物从转移基底转移到支持物上。当使用转移基底时，目标分析物在转移到支持物后的空间排列与样品在转移基底上的初始空间排列相匹配，从而允许分析结果与单个样品相匹配。大体的方法示例于图3中。
在一些实施方案中，上述间接的样品施用方法是有利的，因为直接向支持物施用样品时，并非总能够在支持物上方便的产生和维持合适的样品空间排列。此外，转移基底可以协助样品制备，通过在允许目标分析物转移到支持物上的同时，阻止或降低样品的其它组分转移到支持物上。
因此，本发明提供了分析复数的不同样品的方法，包括下列步骤：a)把样品施于转移基底的不同区域，从而在转移基底上产生样品的空间排列；然后，b)把目标分析物从转移基底转移到支持物上，所述支持物上固定了分析组分；以及c)使目标分析物与分析组分相互作用，从而实现样品的分析。在步骤b)和c)中维持了目标分析物的空间排列，从而使分析结果可以与单个样品匹配。
把目标分析物从转移基底转移到支持物，同时维持目标分析物的空间排列，可以用本文中其它地方描述的多种方法实现。转移基底可以相对或紧靠支持物放置，以便于从基底向支持物转移目标分析物。转移基底和/或支持物可以经受这样的条件，所述条件有利于从转移基底向支持物转移目标分析物。例如，可以向转移基底和/或支持物施用电位或磁场，或者可以向转移基底和/或支持物施用试剂，以便于目标分析物从基底到支持物的转移。
本发明还提供了在本发明的方法中使用的装置和试剂盒。
本发明的装置包括支持物，其上固定了分析组分。在使用过程中，本发明的装置包括固定了分析组分的支持物，并且所述支持物上以空间排列的方式设置了复数个样品，所述空间排列使利用分析组分的分析结果可与单个样品匹配。
因此，本发明提供了分析复数的不同单个细胞的装置，其包括固定了分析组分的支持物，并且所述支持物上以空间排列的方式设置了源自复数个不同单个细胞的材料，所述空间排列使利用分析组分的分析结果可与单个细胞匹配。
本发明还提供用于分析复数的不同样品的装置，其包括：(i)固定了分析组分的支持物；以及(ii)相对或者紧靠着支持物放置的转移基底。
本发明还提供用于分析复数的不同样品的试剂盒，其包括：(i)固定了分析组分的支持物；以及(ii)材料施用器，用于将复数的不同样品以空间排列的方式施于支持物上，所述空间排列使利用分析组分的分析结果可与单个样品匹配。
本发明还提供用于分析复数的不同单个细胞的试剂盒，其包括：(i)固定了分析组分的支持物；以及(ii)材料施用器，用于将来源于复数的不同单个细胞的材料以空间排列的方式施于支持物上，所述空间排列使利用分析组分的分析结果可与单个细胞匹配。材料施用器可以是这样的施用器，其用于把各个细胞施于支持物的不同区域，然后从单个细胞释放材料。可选地，材料施用器可以是这样的施用器，其用于从单个细胞释放材料，然后把从各个细胞释放的材料施于支持物的不同区域，例如本文中描述的转移基底。按照本文中其它地方指出的，当分别地分析细胞时，可以将源自每个细胞的材料施于支持物的不同区域，以在支持物上产生材料的空间排列。
本发明还提供用于分析复数的不同样品的试剂盒，其包括：(i)固定了分析组分的支持物；(ii)转移基底；以及(iii)用于把目标分析物从转移基底转移到支持物的工具，其允许在将目标分析物转移到支持物上时，维持样品在转移基底上的空间排列。
本发明的装置和试剂盒的多种特征的尺寸和参数可以根据特定的需要和应用而变化。同样地，本发明的方法的精确步骤可以根据特定的需要和应用而变化。不同的分析可以需要在本发明范围内的不同装置或方法。例如，不同的样品类型可以需要具有不同尺寸的装置，或者可以需要不同的样品制备步骤或不同的检测方法。相同样品类型的不同分析可以使用不同的分析组分，例如，蛋白质组分析vs转录物组分析。此外，可以基于先前实验数据设计和使用装置。例如，如果在最初的实验中装置没能提供有效数据，在进一步的实验中可以改变诸如分析组分类型、操作温度、缓冲剂、时间等变量。
在一些实施方案中，本发明的方法、装置和试剂盒能够检测单个目标分析物分子，例如单个mRNA分子。
下文详细的描述了本发明的方法和装置。
支持物
本发明的装置包括固定了分析组分的支持物。
支持物可以由任何合适的材料构成。支持物材料的选择受多种设计考虑的影响，本领域技术人员根据特定装置的需求可以容易地选择合适的材料。例如，材料应该对使用期间施于装置的试剂是稳定的，并且和用于检测目标分析物的方法相容。
在一些实施方案中，用于构建支持物的材料是对装置使用期间使用的试剂不可渗透的材料(例如，参见本文中的实施例1-10和13)。
在其它实施方案中，用于构建支持物的材料是对装置使用期间使用的试剂可渗透的材料(例如，参见本文中的实施例11、12和14)。因此，本发明提供了用于分析复数的不同单个细胞的装置，其包括对使用期间施于装置的试剂可渗透的支持物，其上固定了分析组分，并且所述支持物上以空间排列的方式设置了源自复数个不同单个细胞的材料，所述空间排列使利用所述分析组分的分析结果可与单个细胞匹配。所述装置可以包括用于把试剂施于支持物的一面或两面的工具，和/或用于从支持物的一面或两面除去试剂的工具。例如，装置可以包括一个或更多个入口，所述入口使试剂可施于可渗透的支持物的一面或两面，和/或一个或更多个出口，所述出口允许从可渗透的支持物的一面或两面除去试剂。
可渗透的支持物可以是，例如由尼龙、硝酸纤维素、GVHP、稳定素(Immobilon)-P或稳定素-FL构建。
对于一些应用，把组分共价连接到支持物上是有效的，因此技术人员应该选择合适的材料。对于一些应用，理想的是使用硬质材料；其它应用可以需要弹性材料。如果使用荧光检测，那么材料对激发波长和发射波长应该是透明的，并且在这些波长还应该只有低的固有荧光。对于一些检测技术，使用可以(通过全内反射)传播照明的渐消波的材料是优选的。
因此，本发明的支持物可以由多种材料制成，包括但不限于二氧化硅、聚合物、陶瓷、金属等。能够使用的具体材料包括但不限于：玻璃；聚乙烯；PDMS；聚丙烯；和硅。
在本发明的方法中，样品施于固定了分析组分的支持物上。可以使用任何支持物，只要所述支持物可以施用多个样品，产生样品的空间排列，且可以固定分析组分。支持物允许使用单块分析组分分析多个样品。在装置的使用期间，施于块的单个样品是处于液体交流中的，即，它们与同一溶液相的试剂相互作用。块上的样品不需要在装置的整个使用期间都处于液体交流中。当样品施于支持物时，和/或允许样品与分析组分相互作用时，块上的样品可以处于液体交流中。在本发明的方法的其它时期，例如记录分析结果时，块上的样品不需要处于液体交流中。
当不同的分析组分固定于相同支持物上的不同块时，根据需要重复图1显示的排列。
在一些实施方案中，在装置的使用期间，支持物允许支持物上的不同块处于互相液体交流中。例如，不同块可以排列在基本平的表面，例如玻璃显微镜载玻片的表面。在一些实施方案中，不同块处于互相液体交流中的实施方案是有利的，因为它们使同一溶液相的试剂能够施加在施于不同块上的样品(例如，用于分析不同的核酸目标分析物)。如上所述，不同的块不需要在装置的整个使用期间都处于液体交流中。
在其它实施方案中，在装置的使用期间，尽管施于各单个块的不同样品处于液体交流中，但是，支持物不允许不同的块处于互相液体交流之中。例如，不同块可以排列在基本非平面的表面上，例如96孔微量滴定板的孔中。在使用期间，每个孔可以施用多个样品，在每个孔中产生样品的空间排列。在一些实施方案中，不同块不处于互相液体交流中的实施方案是有利的，因为它们使不同的溶液相试剂能够施加于不同的分析组分，例如，用于分析在相同支持物上的蛋白质和核酸目标分析物。
在一些实施方案中，本发明的范围特别的排除了这样的方法和装置，在所述方法和装置中，在装置的使用期间，尤其是在样品施用和/或分析步骤期间(例如，各个样品施用到支持物的不同孔或通道，或者在支持物的不同孔或通道中进行分析)，不同的单个样品不处于液体交流之中。
在一些实施方案中，本发明的范围特别的排除了这样的方法和装置，在所述方法和装置中，在装置的使用期间，尤其是在样品施用和/或分析步骤期间(例如，块位于支持物的不同孔或通道中)，不同块不处于液体交流中。
在本发明的方法中，样品空间排列的维持使每个样品产生的信号可区分，即使样品是施于单块分析组分上，且在装置使用期间的一些阶段处于液体交流之中。适于用于本发明的支持物对本领域技术人员是显而易见的。
分析组分
本发明的装置包括分析组分，其可以与样品中的目标分析物相互作用，提供分析结果。装置可以包括单个或不同的分析组分，所述分析组分可以与样品中不同的目标分析物相互作用，使得根据需要，在装置的不同区域重复图1显示的排列。包括单一分析组分的装置允许使用同一支持物，针对单个类型的目标分析物进行多个样品的平行分析。包括不同分析组分的装置允许使用同一支持物，针对多个不同的目标分析物进行多个样品的平行分析。
为了提供所关心的分析数据，通常根据对样品类型和所关心的目标分析物的认识，选择在任何给定装置中的分析组分。通常，分析组分是生物分子，例如用于杂交的核酸、用于抗原结合的抗体、用于抗体结合的抗原、用于结合糖和/或糖蛋白的外源凝集素等等。从而可以实施基因组、转录物组、蛋白组等分析。
优选的分析组分是固定的结合试剂，例如用于杂交的核酸、用于抗原结合的抗体、用于抗体结合的抗原、用于捕获糖和/或糖蛋白的外源凝集素等等。优选的分析组分是特异性结合试剂，所述试剂对选定的目标是特异的，例如用于与所关心的目标特异性杂交的核酸序列、用于特异性结合所关心的目标抗原的抗体。特异性的程度可以根据单个实验的需要而变化，例如，在一些实验中，捕获相对于固定的序列具有核苷酸错配的目标是理想的，而其它实验可能需要绝对的严格。
当装置包括单一分析组分时，所述分析组分优选排列在支持物上的分散块上，以便于数据分析。
当装置包括一系列不同的分析组分时，该不同的分析组分优选排列在支持物上的分散块上，以便于数据分析。如果不分离不同的分析组分，那么可能不清楚不同的目标分析物的哪个产生了观察信号。然而，不同分析组分的相邻块可以稍微重叠，或者不具有紧密的边界，只要由一个块产生的信号与不同的块产生的信号是可区别的。在一些实施方案中，块重叠，或者甚至在单个块上固定不同的分析组分是有利的(参见本文中其它地方)。
当装置包括一系列不同的分析组分时，该不同的分析组分优选固定在基本上平的表面(例如玻璃显微镜载玻片)上。然而，按照本文中其它地方的描述，也设想了这样的装置，所述装置具有固定在基本非平面的表面的不同部分(例如，在不同的孔或通道中)上的块中的不同分析组分。
装置可以包括用于通过杂交捕获特定核酸的固定核酸。核酸序列可以根据所关心的目标分析物来选择。更优选地，分析组分保留特定的mRNA转录物。固定的核酸优选的是DNA，优选单链，以及优选寡核苷酸(例如短于大约500核苷酸，＜450nt，＜400nt，＜350nt，＜300nt，＜250nt，＜200nt，＜150nt，＜100nt，＜50nt，或更短)。
装置还可以包括用于捕获蛋白质的固定的分析组分。其通常是免疫化学试剂，例如抗体，但也可以使用其它的特异性结合试剂，例如：用于捕获蛋白质配体的受体，反之亦然。还设想了使用适配体(aptamer)来捕获蛋白质。
还设想了分析组分可以是小分子，例如小分子药物候选物。因此，本发明的方法和装置可用于小分子筛选测定，用于鉴别与样品中的组分相互作用的小分子(例如，与来源于细胞的材料相互作用的小分子)，或者用于鉴别样品中与小分子相互作用的组分。优选地，小分子是有机分子，具有低于2000道尔顿的分子量，或低于1500道尔顿，或低于1000道尔顿，或低于750道尔顿，或低于500道尔顿，或低于350道尔顿，或低于250道尔顿。小分子可以是肽或肽类似物，例如包括至少5个氨基酸残基、至少10个氨基酸残基、至少15个氨基酸残基、至少20个氨基酸残基、至少25个氨基酸残基或更多的肽或肽类似物。因此，本发明的方法和装置可被用于肽和肽类似物筛选测定，以鉴别与样品中的组分相互作用的肽或肽类似物(例如，与来源于细胞的材料相互作用的肽或肽类似物)，或者鉴别样品中与肽或肽类似物相互作用的组分。
本发明的单个装置可以包括用于分析核酸和蛋白质的分析组分。
用于固定分析组分到支持物上的方法在本领域是熟知的。用于以可杂交的形式将核酸附着到支持物上的方法是微阵列领域已知的，例如通过接头附着到支持物上的基质上、支持物上的凝胶上等等。最著名的方法是光刻掩蔽法，是Affymetrix用于在玻璃支持物上原位合成核苷酸的方法，电化学原位合成法也是巳知的，像喷墨沉积法。类似地，用于附着蛋白质(尤其是抗体)到支持物的方法也是已知的。
固定的核酸可以预先人工合成，然后再附着于支持物上，或者可以在支持物上原位合成，通过向增长的核酸链递送前体。上述任何一个方法均可用于构建本发明的装置。优选的固定化核酸是通过原位合成形成的，所述原位合成利用了增长的核酸链的电化学脱保护(如参考文献2、3&4描述的)。
本发明可使用的一种分析程序涉及，通过与固定的捕获DNA杂交来捕获mRNA，随后使用固定的DNA作为引物，逆转录所述mRNA。因此，在这个程序中，必须存在逆转录酶，所述逆转录酶可以在固定mRNA后与dNTPs及其他试剂一起引入。逆转录程序使固定的引物延伸合成固定的cDNA，从而导致对本发明的装置的共价修饰。为了便于装置上的DNA通过逆转录进行链延伸，所述DNA通过其5′末端或通过中间核苷酸固定，使其具有游离的3′末端。下文提供了该技术的其它细节。
装置可以包括一个或更多个分析组分。例如，装置可以包含N个不同的分析组分，其中N选自2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、50、75、100、125、150、175、200、250、300、400、500或更大。装置可以包括至少10N个不同的分析组分，其中N选自0、1、2、3、4、5或更大。在单个支持物上固定至少106个不同的寡核苷酸是微阵列领域普遍已知的。N或10N个不同的分析组分通常分别排列在支持物上的N或10N个不同的块上。
装置可以包括两块或更多块单分析组分，例如3或更多，4或更多，5或更多，6或更多，7或更多，8或更多，9或更多，或者10或更多块同样的分析组分。
分析组分的尺寸允许平行分析至少两种样品。优选地，块的尺寸允许5或更多(例如10或更多，15或更多，20或更多，25或更多，50或更多，75或更多，100或更多，150或更多，或者200或更多的)不同的样品施于块上，并具有足够的间隔，使每个样品产生的信号是可区分的。
因此，在使用中，本发明的装置可以包括固定了分析组分的支持物，并且在所述支持物上5或更多(诸如10或更多，15或更多，20或更多，25或更多，50或更多，75或更多，100或更多，150或更多，或者200或更多的)不同的样品位于单块分析组分上。
允许样品平行分析所需要的块尺寸可根据因素而变化，所述因素例如每个样品的体积，当施于支持物时样品的扩散，检测仪器的灵敏度和分辨率，以及块上需要平行分析的样品数目。优选地，块尺寸允许多个样品不重叠的施于块的不同区域(参见图1)，以便于数据分析--如果不同的样品间隔不充分，则不清楚哪个样品产生了观察信号。然而，施于一块的相邻样品也可以稍微重叠，只要由一个样品产生的信号与另一个样品产生的信号是可区别的。
在施于块后，样品的平均中心到中心的间隔优选的是至少2p，其中p是施于块后，样品的平均最长尺寸(长度或直径)。例如，如果在施于块后，样品具有大约25μm的平均直径，则样品的中心到中心间隔优选至少50μm。施于块后，样品的中心到中心间隔可以是3p、4p、5p、6p、8p、10p、或更大。
施于块后，样品的平均中心到中心的间隔优选至少10Ym，其中Y选自-3、-4、-5等。
样品在块上理想的中心到中心的间隔可以通过对不同样品的溶液或悬浮液的适当稀释实现，参见本文中其它地方提到的。当分析单个细胞时，必须处理细胞减少细胞结块，以确保需要的中心到中心的间隔。
当前微阵列中的块尺寸范围从约1μm直径到约1mm直径。本发明的装置中，块优选具有至少10Xm2的面积，其中X选自-2、-3、-4、-5、-6、-7、-8、-9、-10、-11、-12等。使用当前的技术是容易制备块尺寸大约10μm×10μm(即10-10m2)的微阵列的。
当本发明用于块上的单个细胞的平行分析时，块尺寸允许至少两个细胞或来源于至少两个细胞的材料施于块上。这通常需要具有＞2a面积的块，其中a是所关心的细胞类型的平均横截面积。通常，考虑到每种细胞的体积，来源于每种细胞的材料的扩散，检测装置的灵敏度和分辨率，以及在每个块上平行分析的细胞数目，块可＞3a、＞4a、＞5a、＞10a、＞15a、＞20a或＞25a(参见本文中的实施例6)。
典型的细胞和细胞器尺寸于下表给出：
| 酿酒酵母(S.cerevisiae) | 5μm |
| 粟酒裂殖酵母(S.pombe) | 2×7μm |
| 哺乳动物细胞 | 10-20μm |
| 人类T淋巴细胞 | 6-8μm |
| 大肠杆菌 | 1×3μm |
| 哺乳动物线粒体 | 1μm |
| 哺乳动物细胞核 | 5-10μm |
| 植物叶绿体 | 1×4μm |
因此，根据所分析的细胞，块具有的最长尺寸(长度或直径)可大于1μm，例如大于3μm，大于5μm，大于10μm，大于25μm，大于50μm，大于100μm，大于250μm，大于500μm，大于750μm，或者大于1000μm(1mm)。
例如，如果技术人员希望在分析组分块上分析16个单独的人T淋巴细胞，通常要求＞32μm×32μm(1024μm2)的正方形块，保证16个细胞可以在块上容易地分别平行分析。
对于所关心的样品的数目和类型，技术人员可以容易地选择适当的块尺寸。较大的块通常允许较多数目的单个样品在块上平行分析。较大的块还可以允许施用较大的样品，而在该块上维持足够的样品间隔。较大的块还可以通过使样品间隔更远而允许等量的样品更容易地被检测装置分辨。然而，较大的块需要较大的支持物，除非块的总数减少。
本发明的装置中的块可以具有相同的尺寸，或者不同的尺寸。
块的边缘到边缘间隔优选至少10Ym，其中Y选自-3、-4、-5等。相邻的块可以接触或重叠，但是优选相邻的块被缝隙隔开。
块优选具有矩形或正方形的形状，不过也可以具有圆形的形状。在一些实施方案中，块的形状和尺寸由支持物的特性决定(例如当支持物是微量滴定板时，块的尺寸和形状要匹配孔底的尺寸和形状)。本发明的装置中的块可以具有相同的形状，或不同的形状。
当用于平行分析每块分析组分上多个样品时，本发明的方法是特别有利的。然而，本发明也可以用于分析每块分析组分上单个样品。例如，可以在本发明的装置的每个块上分析一个细胞。例如，如果要分析相同的、同步的细胞群体的基因表达模式，此类排列可以是有用的。在此情况下，可以在每个块上分析群体的单个细胞的不同目标分析物。因此，本发明还提供了分析复数的单独细胞的方法，包括下列步骤：a)把来源于各个细胞的材料施加到支持物上，所述支持物上固定了分析组分；和b)使该材料与分析组分相互作用，从而实现材料的分析。在步骤a)中，把来源于不同的单个细胞的材料施于支持物上不同的分析组分块上，在支持物上产生材料的空间排列。在步骤b)中，维持空间排列，从而允许分析结果与单个细胞相匹配。
当在一块分析组分上分析单个细胞时，本发明的方法与荧光原位杂交(FISH)分析相似。然而，在本发明的方法中，在固定了分析组分的支持物上分析单个细胞。相反，在FISH中，分析单个细胞，但是在溶液相中提供分析组分，因此不方便平行的检测不同的目标分析物。
设想本发明的装置和方法可用于从施于装置的细胞群体中选择细胞的子群体。例如，使用固定的抗体或适配体，根据细胞表面抗原表达，可以选择处于细胞周期特定阶段的单个细胞(即，同步的细胞)。在此类实施方案中，各块可以包括超过一个的分析组分(例如2或3个不同的分析组分)，允许在单个块上选择多个细胞类型，或选择具有细胞表面抗原的特定组合的那些细胞。选择细胞可需要洗涤装置，除去不与固定的分析组分结合的细胞类型。
选定细胞亚群后，可以使用本发明的方法进一步分析所述亚群。例如，如果根据细胞表面抗原表达选择细胞亚群，然后可以裂解该细胞亚群，并根据本文的描述平行分析单个细胞的内含物。在此类实施方案中，各块可以包括超过一种类型的分析组分(例如2或3种类型的分析组分)，允许在单个块上选择并分析细胞，例如，在具有固定的抗体和核酸的单个块。
除上述固定的分析组分之外，设想了本发明的装置和方法可以使用溶液相探针。通常，在固定的分析组分捕获目标分析物后，再将溶液相探针施于装置。溶液相探针的选择通常基于对样品类型和所关心的目标分析物的认识，以便提供所关心的分析数据。通常，探针可以是生物分子，参见本文中其它地方的描述。
在一些实施方案中，溶液相探针的使用是有利的，因为它允许更详细的样品分析。例如，在使用固定了oligo dT的块捕获mRNA后，产生的固定cDNA代表了细胞的全体polyA+群(参见本文中的实施例)，溶液相基因特异性探针可施于块上，允许对特异性mRNAs的鉴定和定量。作为进一步示例，在用非特异性分析组分的块(例如，相对非特异性的抗体)捕获抗原后，使用溶液相探针(例如特异性结合抗原的抗体)可以更详细地分析捕获的抗原。
在使用溶液相探针的实施方案中，可以使用一组多个不同的溶液相探针平行分析多个不同的目标分析物。根据需要的分析，这些不同的溶液相探针可以分别特异性针对单个目标分析物(例如特异性针对单个基因)，或可以是特异性针对多个相关的目标分析物(例如特异性针对序列保守的交叉基因)。一组不同的溶液相探针可以由至少2、至少5、至少10、至少25、至少50、至少100、至少150、至少200、至少300、至少400、至少500或至少600个不同的探针组成。
当目标分析物是核酸(例如mRNA)时，溶液相探针不需要是基因特异性的，可以例如鉴别多个不同的基因共有的核苷酸序列，或多个不同的生物体共有的序列。
当目标分析物是核酸时，溶液相探针可以构成引物，使用固定的cDNA作为模板，通过聚合酶延伸。可以选择引物序列来达到基因特异性或非特异性的延伸。
不同的溶液相探针可施于单个块(例如具有固定的cDNAs的块)的不同区域，例如，使用包括通道或针的探针施用器。合适的探针施用器描述于美国设计专利D 413,390中。当使用超过一种的探针时，合适的标记和检测方法可以选自已知的现有技术。例如，用不同的荧光染料标记的不同探针可以同时施用到一个块。可选择地，或此外，不同的探针可以连续施用。在这种情况下，第一探针(或探针组)施用到装置，观察产生的信号，除去该探针。然后，第二探针(或探针组)施用到该装置，观察产生的信号，除去该探针。当需要其它探针时，可以重复这些步骤。
装置的其它特征
本发明的装置还可以包括：
-一个或更多个电极。电极可用于产生跨装置的电位，以引起细胞的电穿孔、样品转移等。
-压电装置用于裂解细胞。
-光源，例如，激光器。激光器可用于裂解细胞和/或数据收集。
-检测器，例如质谱仪。
目标分析物
本发明的方法可以用于多种目标分析物的鉴别和定量。目标分析物可以是样品中技术人员希望检测或定量的任何化学实体。本发明的方法可用于分析生物学或非生物学的目标分析物。优选地，目标分析物是生物学的目标分析物。
本发明特别适于分析生物学的目标分析物，例如核酸和多肽，上文已描述了用于其的微阵列分析。合适的核酸目标分析物包括但不限于，基因组DNA、质粒DNA、扩增产物(例如：来自PCR的)、cDNA和mRNA。
本发明的方法涉及分析样品中目标分析物的存在或数量。可理解不是所有使用本发明的方法测试的样品都包含目标分析物。因此，本文中涉及的转移目标分析物、检测目标分析物等，不局限于样品包含目标分析物的情形(例如，对病原体的检测可以产生阴性结果，或者可以分析阴性对照)。
样品
本发明的方法可以用于分析多种类型的样品。
样品可以是技术人员希望分析目标分析物的存在或数量的任何对象。本发明的方法可用于分析生物学或非生物学样品。优选地，样品是生物样品，例如包含细胞或来源于细胞的材料的样品。
生物学样品可以包括，或源自于多种生物体和细胞类型，包括真核生物和原核生物。例如，本发明可用于分析细菌或来源于细菌的样品，包括但不限于：大肠杆菌(E.coli)；枯草芽孢杆菌(B.subtilis)；脑膜炎奈瑟菌(N.meningitidis)；淋病奈瑟菌(N.gonorrhoeae)；肺炎链球菌(S.pneumoniae)；变异链球菌(S.mutans)；无乳链球菌(S.agalactiae)；化脓链球菌(S.pyogenes)；绿脓杆菌(P.aeruginosa)；幽门螺旋菌(H.pylori)；卡他莫拉菌(M.catarrhalis)；流感嗜血杆菌(H.influenzae)；百日咳鲍特菌(B.pertussis)；白喉杆菌(C.diphtheriae)；破伤风梭菌(C.tetani)等。真核生物中，本发明可用于分析动物细胞、植物细胞、真菌细胞(特别是酵母)等，以及来源于上述细胞的样品。优选的所关心的动物细胞是哺乳动物细胞。优选的哺乳动物是灵长类动物，包括人类。
所关心的特定细胞类型，尤其对于人类细胞，包括但不限于：血细胞(例如，淋巴细胞、天然杀伤细胞、白细胞、嗜中性粒细胞、单核细胞、血小板等)；肿瘤细胞(例如癌、淋巴瘤、白血病细胞)；配子(包括卵子和精子)；心细胞；肾细胞；胰腺细胞；肝细胞；脑细胞；皮肤细胞；干细胞(包括成体干细胞和胚胎干细胞)等。也可以分析细胞系。
当样品包括细胞或来源于细胞的材料时，每种样品可以包括多种细胞或来源于多种细胞的材料，因此本发明用于不同细胞群体的平行分析。可选择地，每种样品可以包括单个细胞或来源于单个细胞的材料，因此本发明用于单个细胞的平行分析。
相应地，在一些实施方案中，每种样品可以包括：少于1×108个细胞，少于1×107个细胞，少于1×106个细胞，少于1×105个细胞，少于1×104个细胞，少于1×103个细胞，少于100个细胞，少于50个细胞，少于25个细胞，少于20个细胞，少于15个细胞，少于10个细胞，少于5个细胞，少于3个细胞，或单个细胞。
在其它实施方案中，每种样品可以包括：多于3个细胞，多于5个细胞，多于10个细胞，多于15个细胞，多于20个细胞，多于25个细胞，多于50个细胞，多于100个细胞，多于1×103个细胞，多于1×104个细胞，多于1×105个细胞，多于1×106个细胞，多于1×107个细胞，或多于1×108个细胞。
在其它实施方案中，每种样品可以包括：来源于少于1×108个细胞的材料，来源于少于1×107个细胞的材料，来源于少于1×106个细胞的材料，来源于少于1×105个细胞的材料，来源于少于1×104个细胞的材料，来源于少于1×103个细胞的材料，来源于少于100个细胞的材料，来源于少于50个细胞的材料，来源于少于25个细胞的材料，来源于少于20个细胞的材料，来源于少于15个细胞的材料，来源于少于10个细胞的材料，来源于少于5个细胞的材料，或来源于少于3个细胞的材料。
在其它实施方案中，每种样品可以包括：来源于多于3个细胞的材料，来源于多于5个细胞的材料，来源于多于10个细胞的材料，来源于多于15个细胞的材料，来源于多于20个细胞的材料，来源于多于25个细胞的材料，来源于多于50个细胞的材料，来源于多于100个细胞的材料，来源于多于1×103个细胞的材料，来源于多于1×104个细胞的材料，来源于多于1×105个细胞的材料，来源于多于1×106个细胞的材料，来源于多于1×107个细胞的材料，或来源于多于1×108个细胞的材料。
本发明尤其适于分析不同的单个细胞，包括真核细胞和原核细胞。例如，当每种样品包括单个细胞或来源于单个细胞的材料时，本发明可用于分析复数的细胞，所述细胞尽管是同样类型(例如一种细胞系)，却是异步的(即在细胞周期的不同时期)。本发明也可以用于分析复数的细胞，所述细胞是同样类型并且是同步的(即在细胞周期的相同时期)。
本发明的装置可用于分析单一类型的细胞。本发明的装置也可用于分析超过一种，例如两种或更多，三种或更多，四种或更多，五种或更多等类型的细胞。例如，本发明的装置可用于分析包含不同类型细菌的样品(例如食物样品)，或包含不同类型人类细胞的样品(例如血液或组织样品)。
本发明的方法理想的包括样品制备步骤，允许所关心的细胞类型与样品的其它组分分离。尤其是，可以理想的使所关心的细胞类型与样品中的其它细胞类型分离。例如，当使用本发明的装置分析血样时，理想的是，在分析白细胞之前从样品中除去红细胞。因此，在一些实施方案中，本发明的方法可以包括使所关心的一种或更多种细胞类型与起始样品中的其它组分分离的步骤。尤其是，本发明的方法可以包括使所关心的一种或更多种细胞类型与起始样品中的其它细胞类型分离的步骤。在一些实施方案中，可以使用本文中其它地方描述的转移基底实现不同细胞类型的分离。其它合适的分离方法为本领域技术人员所知(例如FACS)。使所关心的细胞与起始样品中的其它组分分离后，可以使用本发明的装置分析所关心的细胞。可以丢弃样品的其它组分(即，所关心的细胞与其分离的那些组分)，或者可以使用本发明的装置对其自身进行分析。
优选地，与样品中的一种或更多种其它组分分离所关心的一种或更多种细胞类型后，所获得的分离细胞群体的至少75％或更多(例如，80％或更多，85％或更多，90％或更多，95％或更多，97％或更多，98％或更多，或者99％或更多)是理想类型的细胞。
除分析细胞内含物之外，还可以分析真核细胞中的细胞器，特别是细胞核(例如，转录因子)、线粒体和质体(例如，叶绿体)。可以从细胞制备细胞器，然后按照本文中针对整个细胞描述的那样进行分析。
把样品施于支持物
在本发明的一些方法中，样品直接施于支持物上，产生样品的空间排列。可以通过任何合适的方法，把样品直接施于支持物上，包括但不限于移液、打印、点样(spotting)和扩散。例如，可以使用美国设计专利D 413,390中描述的类型的样品施用器把样品施用到支持物上。
当样品包括细胞时，可以把细胞施于支持物上，然后从该细胞中释放材料。可选择地，可以从细胞中释放材料，然后把释放的材料施于支持物上。
可以通过任何合适的方法从细胞释放材料。设想了机械和化学方法；示例性的方法描述如下。
例如，可以把裂解溶液施加到支持物上的细胞，细胞在原位裂解。能使用的典型裂解溶液可以包括下列组分，例如：表面活性剂，例如：分析核酸时的离子型去垢剂(诸如SDS)，或者分析蛋白质时的非离子型去垢剂(诸如Triton-X100)；消化蛋白质的酶，例如蛋白酶K；消化核酸的酶，例如DNA酶和/或RNA酶；消化糖类的酶，例如β(1-6)和β(1-3)聚糖酶、甘露聚糖酶；失活酶和增溶细胞组分的离液剂，例如胍盐(诸如异硫氰酸胍)；有机溶剂(例如甲苯、醚、苯乙醇DMSO、苯、甲醇或氯仿)；抗生素；硫素；螯合剂(例如EDTA)；碱性蛋白质(例如鱼精蛋白或壳聚糖)等。上述试剂通常在现有技术中用于大批细胞裂解。试剂的选择取决于所关心的分析物的性质，例如如果目的是分析mRNA那么裂解溶液中可以包括蛋白酶和DNA酶，但不能包括降解mRNA的试剂。
已经描述了单个细胞的机械破裂。参考文献5公开了一种通过产生冲击波快速裂解单个细胞(或它的细胞组分)的方法，为了使操作损伤最小化，所述细胞通过激光钳放置或者作为粘附细胞培养。超声波振动也可以用于该装置以裂解细胞，激光也可以，其以前已经用于裂解单个细胞，参见参考文献6。参考文献7报道了在微流体装置中通过渗透压休克裂解单个细胞。参考文献8描述了用光钳导航和操纵单个细胞到微流体网络的不同区域，其中流动特性可以通过电泳和电渗控制。细胞捕获在两个电极之间，在此可以通过电脉冲裂解。
根据电穿孔使用的电场强度，可以只开启膜，允许接触细胞内含物，或者可以破裂膜，引起细胞裂解(参见参考文献9)。优选场强足以引发裂解。
在样品施于支持物之前，或者样品已施于支持物之后，理想的可以从样品中除去一些组分和/或修饰样品中的一些组分。经常在生化分析前加上上述纯化或修饰步骤，从而除去可能干扰目标分析物与分析组分的相互作用的物质，或者干扰获得或解释结果的物质。
制备用于微阵列分析的样品的规程在本领域为大家所熟知，例如细胞破裂、mRNA纯化、cDNA制备、基因组DNA纯化、多肽纯化、标记等。
例如，如果mRNA是需要用固定的探针捕获的分析物，那么DNA或蛋白质可以在分析之前除去。在本文中的实施例中，发现当通过逆转录支持物结合的mRNA分析样品时，使用多特异性蛋白酶组合物减少来源于细胞蛋白质的非特异信号是有利的。按照目标分析物和待分析的样品，合适的样品处理步骤对于技术人员是明显的。
把样品施于转移基底
在本发明的一些方法中，样品施于转移基底的不同区域，产生样品的空间排列，然后目标分析物从该转移基底转移到支持物。当使用转移基底时，转入支持物后目标分析物的空间排列与在转移基底上样品的空间排列相匹配，从而允许分析结果与单个样品相匹配。使用转移基底可以便于初始产生合适的样品空间排列。
可以通过任何合适的方法把样品施于转移基底上，包括但不限于移液、打印、点样和扩散。例如，可以使用美国设计专利D 413,390中描述的类型的样品施用器把样品施用到转移基底上。
转移基底可以由任何合适的材料构成。用于转移基底的材料的选择受许多设计考虑的影响，基于特定装置的需求，技术人员可以容易地选择合适的材料。例如，材料应该对使用期间施于转移基底的试剂是稳定的，并且和选择来转移目标分析物到支持物的方法相适合。在一些实施方案中，转移基底可以由硝酸纤维素制成。
转移基底可以是基本上平的，例如片材。转移基底可以是基本上非平面的，例如可以在点样器的针上产生样品最初的空间排列。点样器通常用于产生DNA阵列，可以容易地用于本发明的方法。点样器的各个针可用于把不同的单个样品施于支持物上不同分析组分的块上。点样器的各个针也可以用于把不同的单个样品施用到支持物上的单一块。技术人员可以选择适当的针排列以补充支持物上块的排列以及需要的分析类型。
可以用多种方法实现目标分析物从转移基底向支持物的转移，同时维持目标分析物的空间排列。可以根据特定的转移基底材料、样品以及涉及的目标分析物选择合适的转移方法。
在一些实施方案中，通过使支持物与转移基底接触促进目标分析物的转移。在其它实施方案中，通过使转移基底与支持物紧靠着放置促进目标分析物的转移。转移基底和/或支持物可以经受有利于目标分析物向支持物转移的条件。例如，转移试剂可以施加到基底和/或支持物。转移试剂是可以促进目标分析物从转移基底到支持物的转移的任何试剂。
可以通过被动转移方法(诸如扩散)，或者通过主动转移方法(诸如通过抽吸或电动)将目标分析物从转移基底转移到支持物。例如，转移基底可以是电导或磁传导材料，因此电势或磁场可以施加到转移基底和/或支持物，以便于目标分析物从基底到支持物的转移。
在一些实施方案中，转移基底对于目标分析物是不可渗透的。当转移基底对于目标分析物是不可渗透时，可以把样品施于转移基底的表面，然后把该表面相对或紧靠着支持物放置，使目标分析物从基底转移到支持物。
在一些实施方案中，转移基底对于转移试剂是不可渗透的。在一些实施方案中，转移基底对于目标分析物和转移试剂是不可渗透的。
在一些实施方案中，转移基底对于目标分析物和转移试剂是可渗透的。当转移基底对于目标分析物和转移试剂是可渗透的时，目标分析物从转移基底到支持物的转移可涉及目标分析物穿越转移基底或自转移基底内部向外的运动。例如，可以把样品施于基底的第一面，在基底上产生样品的空间排列。然后可以把转移试剂施加到基底，使其携带目标分析物穿过基底至基底的第二面，可以从所述第二面转到支持物。例如，转移基底可以是多孔膜，转移试剂可以是缓冲剂。
因此，当使用对于转移试剂可渗透的转移基底时，可以把转移试剂施加到转移基底，引起目标分析物从转移基底到支持物的转移。虽然与对转移试剂可渗透的基底(优选的，其对目标分析物也是可渗透的)合用时，转移试剂是有利的，转移试剂也可以用于不可渗透的基底。技术人员可以选择适当的转移试剂，取决于使用的装置类型和待分析的样品。例如，转移试剂可以是缓冲剂。
在一些实施方案中，不需要把全部样品转入支持物来分析。实际上，在一些实施方案中，只转移各样品的部分组分是优选的，例如，如果样品是可包含不希望的干扰组分的复杂试样(例如细胞)。
因此，在一些实施方案中，转移基底对于目标分析物和转移试剂是可渗透的，但是对于样品的其它组分(诸如细胞或细胞组分)是不可渗透的。例如，转移基底对于完整的细胞、一些细胞类型、细胞碎片(诸如细胞膜和/或细胞器)等可以是不可渗透的。在这类实施方案中，包括细胞(或来源于细胞的材料)的样品可以施于转移基底的第一面，在转移基底上产生样品的空间排列。然后，可以把转移试剂施加到基底，使其携带目标分析物穿越基底至基底的第二面，从所述第二面转入支持物，而不共转移完整的细胞、某些细胞类型、细胞碎片、细胞器等。因此，通过在允许目标分析物转移到支持物的同时，阻止或减少样品的其它组分转移到支持物，转移基底可以协助样品制备。
在细胞施于转移基底的实施方案中，转移试剂优选还起裂解试剂的作用，以便需要的试剂数目最小化。
在一些实施方案中，除了目标分析物，转移基底可以特异性或非特异性捕获样品中的一种或更多种组分。样品组分的特异性或非特异性捕获可以减少由所述组分所引起的背景信号，从而改良分析结果。
例如，如果目标分析物是蛋白质，转移基底可以特异性或非特异性捕获核酸。核酸的特异性捕获可以使用本文中描述的固定的结合试剂实现。核酸的非特异性捕获可以使用吸附或吸收核酸而不是蛋白质的转移基底来实现。例如，利用一些带正电荷的尼龙吸附核酸。
例如，如果目标分析物是核酸，转移基底可以特异性或非特异性捕获蛋白质。蛋白质的特异性捕获可以使用本文中描述的固定的结合试剂实现。蛋白质的非特异性捕获可以使用吸附或吸收蛋白质而不是核酸的转移基底来实现。例如，硝酸纤维素吸附蛋白质和单链DNA，而不是RNA或双链DNA。
在一些实施方案中，各样品中的50％或更多(诸如至少60％，至少70％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少97％，至少98％，至少99％，或者至少99.5％)的特定目标分析物或特定类型的分析物(诸如mRNA)从转移基底转移到支持物。其中，转移了85％或更多(诸如至少90％，至少95％，至少97％，至少98％，至少99％，或者至少99.5％)的实施方案允许更精确的定量目标分析物。
在一些实施方案中，在每种样品中，少于50％(诸如少于5％，少于10％，少于20％，少于30％，或者少于40％)的特定目标分析物或特定类型的分析物(诸如mRNA)从转移基底转移到支持物。上述实施方案在支持物上留下一些目标分析物，用于其它方法的后续操作(例如PCR)。
通过合适的改变用于目标分析物从转移基底向支持物转移的方法，可以改变各样品中，从转移基底转移到支持物的特定目标分析物或特定类型的分析物(诸如mRNA)的分数。例如，可以改变转移基底与支持物的接近度、使用的转移试剂、电位或磁场强度、转移发生的温度和/或允许转移的时间，提供需要水平的目标分析物转移。
还设想了在施于转移基底后，但是在将目标分析物从转移基底转移到支持物前，可以对样品实施酶促反应。
样品的空间排列
在本发明的方法中，把样品施于支持物或转移基底，产生样品的空间排列，而且方法的后续步骤期间，维持所述空间排列。样品空间排列的产生，尤其是目标分析物的空间排列，是本发明的关键特征。
本发明方法中样品空间排列的产生类似于在其它方法(诸如Southern印迹)中分析物空间排列的产生。然而，在本发明的方法中，目标分析物的空间排列是在固定了分析组分的支持物上产生的。相反，在例如Southern印迹中，目标分析物的空间排列是在支持物上产生的，而在溶液相中提供分析组分，从而不能方便的平行检测不同的目标分析物。
产生样品的空间排列
样品的空间排列最初产生于当样品施于支持物或转移基底时。
在一些实施方案中，样品施于支持物或转移基底，以产生样品的随机空间排列(参见图4A)。例如，当样品是包括细胞的生物学样品时，可以适当地稀释细胞悬浮液，然后施于支持物或转移基底，产生细胞的随机空间排列。此类方法中产生的空间排列，与使用常规的血细胞计数器期间观察到的细胞空间排列相似。随机样品施用方法不需要预先确定样品施用模式，于是可以更快地实施。
随机上样方法可需要鉴别样品的空间排列，使分析步骤中观察到的信号的空间排列可以与样品的空间排列相关联(参见图5)。另外，在一些情况中，它也许不能用于鉴别阴性结果。在支持物或转移基底上样品的空间排列可以通过任何合适的方法显像，诸如特异性或非特异性标记(例如当样品包括细胞时，对蛋白质或膜组分染色)。如果需要的话，可以通过任何合适的方法记录样品在支持物或转移基底上的空间排列，诸如数字图像捕获。在本文的实施例中，通过明视野显微镜检查法或高分辨率激光扫描，鉴别单个细胞在玻璃支持物上的空间排列。
如果需要鉴别样品的空间排列，那么选作支持物或转移基底的材料应该和选定的鉴别方法相适合。例如，如果要通过数字图像捕获鉴别空间排列，可以优选半透明的或透明的支持物或转移基底。
在样品随机施于支持物或转移基底上的一些实施方案中，不需要鉴别样品的空间排列。尤其是，如果已知施于各个块或装置的样品实际数或平均数，可以不需要鉴别样品的空间排列。例如，如果在图5的实验中，已知10个样品已施于支持物上，那么当观察到5个信号斑点时可以推断一半的样品包含目标分析物。当细胞悬浮液施于支持物或基底时，这类统计分析是特别有用的，因为每单位体积悬浮液的细胞数目通常是已知的。例如，如果支持物上的每个块平均施用50个细胞，在特定的块上只观察到5个信号斑点，可以推断大约10％的细胞包含有关的目标分析物。
在其它实施方案中，样品施于支持物或转移基底，产生有序的样品空间排列(参见图4B)。例如，当每种样品包括细胞或细胞群体的内含物时，样品可以以直接的方式(例如使用打印机或绘图机)施于支持物或转移基底上，在支持物或转移基底上产生预先确定的样品空间排列。非随机的样品施用方法不需要如上所述鉴别样品的空间排列(因为它是预先确定的)，并且，因为更有效利用了可用空间，还可以允许各个块施用更多的样品。在本文的实施例中，使用手动点样器把样品施于支持物上(参见实施例10)。
样品可以分别施于支持物或转移基底上。当把样品施于支持物或转移基底以产生有序的样品空间排列时，单个样品施用是优选的。
样品可以以一组或更多组样品的方式施于支持物或转移基底上。当把样品施于支持物或转移基底以产生样品的随机空间排列时，分组样品施用是优选的。
优选地，样品只施于分析组分的一个块上，使样品不接触装置上的＞1个块。然而，在一些实施方案中，样品可以优选的施于分析组分的超过一个的块上，使样品接触＞1个块，诸如2个块、3个块、4个块或更多。
目标分析物空间排列的维持
通过把样品施于支持物或转移基底，初始产生了样品的空间排列后，在后续步骤期间，维持样品中的目标分析物的空间排列。目标分析物空间排列的维持是本发明的关键特征。
在本发明的方法和装置中使用的试剂和材料应该选择允许目标分析物空间排列的维持的试剂和材料。在被分析组分捕获之前，目标分析物的空间排列受目标分析物在三维空间中的扩散(即横向和垂直扩散)的影响。发生的扩散的量取决于多种因素，诸如捕获之前目标分析物与分析组分的接近度，使用装置的温度，样品施用和捕获目标分析物之间的时间以及使用的特定试剂。
因此，本发明的装置和试剂可以包括这样的组分，所述组分的选择使目标分析物的横向和/或垂直扩散最小化。例如，可以使用透析膜减少目标分析物离开支持物的垂直扩散，同时允许液体试剂，例如裂解缓冲液施于样品上(参见本文中的实施例)。例如，样品制剂可以包含为阻止目标分析物横向扩散而选择的添加剂(参见本文中的实施例)。
还可以优化本发明方法中的样品操作和分析步骤，从而减少目标分析物的扩散。
在本发明的方法期间维持样品的空间排列，使样品没有相对于其它样品的显著的运动。因此，即使在本发明的方法期间，可以存在一些目标分析物的扩散，以致样品间间隔(边缘到边缘间隔)减少，样品的中心到中心间隔也没有显著的变化。充分维持样品的空间排列，其中，一种样品产生的信号与来自不同样品信号是可区别的，并且，在分析步骤期间产生的信号空间排列可以与最初的样品空间排列相关联。通常，即使没有维持样品的三维排列(例如单个细胞的形状在裂解期间丧失)，也维持了样品的二维排列。
在一些实施方案中，维持目标分析物的空间排列，使目标分析物相对于固定的分析组分没有显著的运动。因此，在一些实施方案中，维持样品中的目标分析物的空间排列，使样品相对于其它样品没有显著的运动，并且，使样品相对于固定的分析组分没有显著的运动。例如，在一些实施方案中，维持了目标分析物相对于支持物上的不同块的位置，即，目标分析物没有显著的跨越支持物的运动。
参见本文中其它地方指出的，本发明的方法不需要差别标记不同样品——单个样品施于支持物或基底上的不同区域将是已知的或可鉴别的，因此可以容易地鉴别每个单个样品产生的信号。然而，差别标记可以用于本发明的一些实施方案。例如，差别标记可以用来允许使用单块分析组分平行分析不同来源的样品(例如，平行分析在两种不同血液样品或食品样品中的单个细胞)。差别标记和本发明结合使用能够从分析组分的每个块读取更多信息，但是也使结果的分析复杂化。
在本发明的方法中，维持的是目标分析物的空间排列，而不是所有样品组分的空间排列。例如，本发明的方法可以包括洗涤步骤，其中装置失去了一些样品组分。在上述方法中，维持了目标分析物的空间排列，但是不维持其它样品组分的空间排列。
如本文所述，样品空间排列的产生和维持允许分析结果与单个样品相匹配。然而，并不始终需要分析结果与单个样品相匹配。因此，把分析结果与单个样品相匹配的步骤是任选的。在一些实施方案中，分析整块观察到的信号是足够的，例如记录块的平均信号强度。在其它实施方案中，分析结果必须与单个样品相匹配。例如，根据本发明的装置可用于检测食物样品中细菌的存在，通过把来自食物样品的多个细胞施于分析组分块上，记录块的平均信号。在该情况下，通过信号的观察(或相对于阴性对照增加的信号的观察)可以定性地显示细菌的存在。如果需要，通过进行更详细的定量分析可以确定样品细胞中细菌的相对丰度。
分析结果
用于分析结果的检测方法取决于目标分析物的性质以及可以使用的任何标记。它们也可以取决于在给定分析位点的信号强度，更详细地说明如下。用于DNA和蛋白质微阵列和/或基于膜的方法的检测方法适于和本发明一起使用；一些此类方法更详细地描述如下。
本发明的方法可以涉及目标分析物的定性和/或定量检测。优选定量检测方法。
在一些实施方案中，分析结果包括使产生的信号的空间排列与样品的空间排列相关联(参见图5)。该关联可以手动进行，但是优选自动实施，例如使用图像分析软件将信号的空间排列与样品的空间排列进行比较。该关联的输出结果可以是合成图像，其中显示样品的空间排列和信号的空间排列。
对于优选的分析物(mRNA和蛋白质)，在目标分析物已近与固定的结合试剂相互作用之后，为了引入可检测的标记，可需要进一步的生物化学处理。本发明优选的使用荧光标记。检测的荧光优选由两个生物分子的特异性结合产生，例如，两个核酸，抗体与抗原，等。嵌合染料可以用于目标分析物的检测。
可以使用渐消波激发荧光。这类波在材料表面延伸出～1/2的照明波长，即，其延伸出～150-350nm，对延伸照明一块固定的寡核苷酸是绰绰有余的。参见本文中其它地方提到的，本发明的装置可以包括激光源(和/或激光探测器)。也可以使用其它激发光源，例如灯、LEDs等。
可以通过利用抗体的若干已知方法中的一种检测蛋白质。例如，可以通过使用第二标记抗体或蛋白质染色来检测已经被固定化抗体捕获的蛋白质，其中，所述第二标记抗体特异针对与第一抗体不同的表位，形成″三明治″复合物。
对于RNA分析物，可以通过使用酶，如逆转录酶(例如鸟类成髓细胞白血病病毒(avian myeloblastosis virus，AMV)逆转录酶)，在互补链中掺入荧光核苷酸来实现检测。例如，通过mRNA与支持物上的寡核苷酸探针杂交，使用固定的探针作为引物，可以原位制备cDNA。为了便于检测杂交，逆转录反应优选在cDNA中掺入标记的核苷酸[10]。可以通过利用与合适的荧光基团连接的dNTPs来实现。与测序反应不同，不需要对不同的核苷酸使用不同颜色的荧光基团，因为不需要区分单个核苷酸。类似地，不必标记每个核苷酸，可以标记dATP、dCTP、dGTP和dTTP中的1、2、3或4种，并且能够使用标记的和未标记的dNTPs的混合物。在cDNA中掺入大量荧光基团(例如掺入的dNTPs的至少5％，诸如≥10％、≥20％、≥30％、≥40％、≥50％、≥75％或更多)意味着可以容易地通过任何惯用的荧光检测方法检测cDNA，从而甚至对于单个杂交事件显示阳性信号。因此，甚至可以检测低丰度mRNAs。
不直接掺入荧光基团，也可以掺入特定的官能团，然后可以在所述官能团上偶联荧光基团(″后标记″)，例如，在诸如逆转录、洗涤等步骤之后。
然而，已有用于单个荧光基团检测的灵敏技术[11，12]，因此检测包含多个荧光基团的单一cDNA/mRNA杂交也完全属于现有技术的能力范围。鉴别单个荧光基团的现有装置可具有～150nm的像素分辨率。例如，参考文献13&14描述了单分子读数器(市场上可作为″CytoScout″购自Upper Austrian Research GmbH)，其中CCD探测器与样品扫描台的运动同步，使连续数据采集能够在129nm的像素大小的水平，在11分钟内从5mm×5mm的面积采集数据。在本文的一些实施例中，用专利的高分辨率激光扫描器来获得130nm分辨率的数据，检测单个mRNA分子是可行的。因此，在一些实施方案中，本发明的方法、装置和试剂盒允许检测单个目标分析物分子，例如单个mRNA分子。
在实施原位逆转录后，首先存在RNA/DNA杂合体，其中DNA通常包括用于检测的标记。在本发明的一些实施方案中，利用例如RNA酶H从该杂合体中去除RNA链。该去除步骤留下了通过固定引物的延伸制备的单链DNA。在去除步骤之后，该单链cDNA可用作合成互补cDNA链的模板，从而产生双链cDNA。该第二条链的合成使用与现有的cDNA链互补的引物起始。在最初的逆转录之后，只有已经延伸至该引物的位置的DNA可用于启动第二条链的合成。第二条cDNA链也可以人工合成以掺入标记，标记可以与第一条链合成期间使用的标记相同或不同。
还可以扩增与固定的分析组分结合的目标分析物，例如通过滚环扩增(RCA，例如，参考文献15和16)或者多重置换扩增(MDA；例如，参考文献17和18)。合适的试剂是市场上可买到的(例如从QiagenLtd.，Crawley)。
还可以通过化学发光法检测与固定的分析组分结合的目标分析物。已经报道了用于通过化学发光检测目标分析物的合适方法(例如参考文献19和20)，合适的试剂是市场上可买到的(例如从AppliedBiosystems，Foster City，CA)。例如，可以使用生物素酰化的dNTPs实施捕获的RNAs的逆转录，通过使用(链霉)抗生物素蛋白-HRP或(链霉)抗生物素蛋白-AP，再继续使用化学发光底物，可以检测产物，然后捕获影像。
参见本文中其它地方提到的，本发明的装置也可以与质谱仪连接。微流体装置与MS的整合是已知的。例如，参考文献21描述了与集成的HPLC柱、样品富集柱和纳米电喷射尖端一起用于肽分析的微流体芯片，该″HPLC-Chip/MS技术″可以从Agilent获得。
在不同的细胞上平行进行相同的单个分析是特别有效的，允许在表面相同的细胞中方便的检测到差异。
本发明允许定量包含目标分析物的一组细胞的比例(例如百分数)。
优选地，对于给定的目标分析物可以平行分析的样品数目至少是5(例如≥10、≥15、≥20、≥25、≥30、≥35、≥40、≥45、≥50、≥60、≥70、≥80、≥90、≥100、≥200、≥300、≥400、≥500、≥600、≥700、≥800、≥900、≥1000等)。
通用的
术语“包括”涵盖了“包含”和“由......组成”，例如“包括”X的组合物可以仅仅由X组成，或者可包括其它物质，例如X+Y。
涉及数值x的术语“约”意指，例如，x+10％。必要时，术语“约”可以省略。
单词“基本上”不排除“完全”，例如“基本上不含”Y的组合物可以完全不含Y。必要时，单词“基本上”可以从本发明的定义中省略。
涉及元件时，术语例如″直径″和″周长″的使用并不必然暗示该元件是圆形的(或者，在三维背景中，球状的)。
术语″抗体″包括任何可获得的天然的和人造的抗体以及抗体衍生的蛋白质，及它们的衍生物，例如无限制地包括多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、单一结构域抗体、完整的抗体、抗体片段例如F(ab′)2和F(ab)片段、Fv片段(非共价的异源二聚体)、单链抗体例如单链Fv分子(scFv)、微抗体(minibodies)、寡聚抗体(oligobodies)、二聚或三聚的抗体片段或构建体等。术语″抗体″不暗示任何特定的来源，包括通过非常规方法获得的抗体，例如噬菌体展示。本发明的抗体可以是任何同种型(例如IgA、IgG、IgM，即α、γ或μ重链)，并且可以具有κ或λ轻链
附图简述
图1示意性地说明当仅使用单个分析组分时的大体方法。
图2示意性地说明当不同的分析组分固定在支持物的不同块上时的大体方法。
图3示意性地说明使用转移基底时本发明的大体方法。
图4说明样品的随机(图4A)和非随机的(图4B)空间排列的产生。
图5说明如何使信号的空间排列与样品的空间排列相关联。
图6示意性地说明本文中实施例1使用的装置。
图7显示本文的实施例1中使用的2张载玻片的扫描图像。
图8更详细地显示本文的实施例1中使用的2张载玻片的区域。
图9示意性地说明本文的实施例2中使用的装置。
图10显示本文的实施例2中使用的2张载玻片的扫描图像。
图11示意性地说明本文的实施例3中使用的装置。
图12详细地显示本文的实施例3中使用的载玻片的区域。
图13显示本文的实施例5中使用的载玻片的区域。
图14显示本文的实施例5中使用的载玻片的区域。
图15显示本文的实施例5中使用的载玻片的区域。
图16更详细地显示本文的实施例5中使用的载玻片的区域。
图17更详细地显示本文的实施例5中使用的载玻片的区域。
图18更详细地显示本文的实施例5中使用的载玻片的区域。
图19显示本文的实施例8中使用的载玻片的区域。
图20显示本文的实施例9中使用的载玻片的区域。
图21显示本文的实施例10中使用的载玻片。
图22示意性地说明包括可渗透的支持物的可能的装置。
图23A示意性地说明实施例12中使用的探针施用模式。
图23B显示实施例12中曝光10秒的结果。
图24A示意性地说明实施例13中使用的探针施用模式。
图24B示意性地说明实施例13中使用的样品施用模式。
图24C示意性地说明实施例13中使用的装置。
图25A显示在杂交后和逆转录前，实施例13中使用的载玻片的扫描图像。
图25B显示在杂交和逆转录后，实施例13中使用的载玻片的另一个扫描图像。
图25C显示在杂交、逆转录以及在SDS溶液中混合过夜之后，实施例13中使用的载玻片的另一个扫描图像。
图26示意性地说明实施例14中使用的样品施用模式。
图27显示实施例14中不同的曝光的结果。
实施本发明的方式
实施例1：单个细胞的分析
实施预实验，证实单个样品，尤其是单个细胞，可以施于支持物产生样品的空间排列，并且，在后续操作和分析步骤期间，可以维持样品的空间排列。
材料和方法
通过添加1μl(100μm)oligo dT30到100μl 1∶1混合的磷酸盐缓冲液(pH9.0)：DMSO中制备Oligo dT30载玻片。使用21mm×40mm×0.1mm Hybriwell室(Sigma)，把寡核苷酸和偶联缓冲液混合物施于NHS衍生的载玻片(Schott)。允许寡核苷酸与载玻片偶联15分钟。除去Hybriwell室，在蒸馏水中洗涤载玻片5分钟。通过寡核苷酸的3′附着来制备阴性对照载玻片。
使用小鼠骨髓瘤悬浮(非附着的)细胞系。通过重复离心并在1×PBS中洗涤制备3000细胞/μl的悬浮液。细胞与PEG 2000(20％)和PEG 200(20％)混合。PEG 200用来防止细胞由于支持物表面的疏水性而结块。PEG 2000用来防止通过聚合物排斥的横向扩散。
在一些实验中，细胞悬浮液中添加1mg/ml链霉蛋白酶。链霉蛋白酶是内切和外切蛋白酶类的混合物，即，其能够裂解几乎任何肽键。
把0.5μl细胞悬浮液涂布到载玻片上，然后干燥。把细胞悬浮液中含有链霉蛋白酶的细胞涂布在载玻片的左边。把细胞悬浮液中不含链霉蛋白酶的细胞涂布在载玻片的右边。
100mm×100mm×1mm的溶于水的10％聚丙烯酰胺(19∶1)的聚丙烯酰胺凝胶垫被灌注，使其凝固。切下约5mm×5mm的矩形凝胶，在1％SDS裂解缓冲液(1％SDS，3×SSC)中浸泡至少30分钟。
把透析膜相对样品细胞放置，使目标分析物的垂直扩散最小化。把凝胶垫相对硝酸纤维素膜放置，允许裂解缓冲液通过膜扩散以接触细胞。把载玻片放置于凝胶垫上方，在凝胶垫、膜和样品细胞之间产生良好的液体接触。装配好的装置示意性地说明于图6。
装配好的装置于50℃孵育30分钟，帮助链霉蛋白酶消化细胞蛋白质。然后，装置在室温下孵育30分钟，允许细胞的mRNA与oligodT结合试剂杂交。在孵育步骤之后，洗涤载玻片，在100μl反应体积中逆转录结合的mRNA。把Hybriwell室施于每张载玻片，在逆转录混合物施用之前，在50℃下孵育。100μl逆转录混合物包括：水(63.6μl)，5×FS缓冲液(20μl)，RNasin(1μl)，0.1M DTT(10μl)，25mMdNTP混合物(0.4μl)，CY3 dCTP(1μl)，Superscript III酶(4μl)。反应于50℃孵育30分钟。然后，洗涤载玻片，用Agilent G2565BA扫描仪扫描。
结果
该oligo dT和阴性对照载玻片的扫描图像显示于图7。
观察图7中oligo dT载玻片的右边，可见大量斑点，明显对应于来自单个细胞的信号。然而，图7中阴性对照载玻片的右边斑点也可见，其暗示一些斑点是源自非特异性信号。推测非特异性信号可来自染料与细胞蛋白质的相互作用。相应地，在第二系列实验中，分析用链霉蛋白酶处理的细胞。观察图7中的左边，清楚可见链霉蛋白酶的添加使观察到的非特异性信号的明显减少。图8更详细的显示了这两块载玻片左侧和右侧区域。该图进一步说明，链霉蛋白酶的添加使观察到的非特异性信号的明显减少。
对于图8中链霉蛋白酶处理的细胞，在oligo dT包被的载玻片上可见的特征很可能是源自寡结合mRNAs的引物延伸的特异信号。观察到8-10像素宽(40-50μm宽)的均匀大小图像，其强度与具有有限的细胞内含物扩散的10μm的单个细胞的转录产物的检测一致。
结论
这些实验说明，可以在支持物上产生细胞的空间排列，并且在裂解细胞的同时仍然维持细胞的空间排列。这些实验提示，对于特定细胞的目标分析物(诸如mRNA)的分析，去除其它样品元件(诸如蛋白质)可以是减少非特异性信号所必需的。
实施例2：裂解时程
进行另一系列实验研究裂解时程的改变对观察到的信号的影响。使用类似于实施例1中描述的装置。
使用小鼠骨髓瘤悬浮(非附着的)细胞系，参见实施例1。 用于实验的细胞悬浮液包含在20％PEG 2000、20％PEG 200和1mg/ml链霉蛋白酶中的3000细胞/μl。把3μl细胞悬浮液涂布到oligo dT载玻片上，干燥并用透析膜覆盖。制备两块相同的oligo dT载玻片，一块用作省略逆转录酶的阴性对照。在两块oligo dT载玻片中的每一块上，使用四块分离的如实施例1中的聚丙烯酰胺凝胶垫，裂解细胞20分钟、55分钟、1小时30分钟或1小时45分钟。在孵育步骤之后，如实施例1所述通过逆转录以及扫描分析载玻片。
图9中示意了装配好的装置。图10中显示了两块载玻片的扫描图像。
对于有逆转录酶的载玻片，发现信号强度随裂解时间减少而减少，除了在20分钟裂解之后观察到的信号比在55分钟裂解之后更高。这可能是由于20分钟之后细胞蛋白质的不完全链霉蛋白酶消化产生的非特异性信号。
在没有添加逆转录酶的对照载玻片上几乎没有观察到信号。
因此，这些实验提示，较长的孵育时间是优选的，以允许完全的细胞裂解、目标分析物的捕获以及细胞蛋白质的消化。
实施例3：火棉胶的使用
在这个实验中，用薄层的火棉胶替换实施例1的装置中使用的透析膜。火棉胶是硝酸纤维素在乙醚或丙酮中的溶液，有时添加乙醇，一般被称为火棉溶液。
吸取100μl火棉胶到载玻片的一端上，然后涂布整张载玻片。在孵育步骤之后，洗涤载玻片，通过在包含少量MgCl2的丙酮中洗涤载玻片，除去火棉胶，并如其它地方的描述逆转录结合的mRNA。
用于该实验的装配的装置示意性地说明于图11。对载玻片的区域捕获的图像显示于图12。在这个实验中，由单个细胞产生的图像相对较小，火棉胶似乎有效的防止了细胞内含物的横向扩散。尤其是，在图12中，对于15μm的细胞尺寸图像是20-25μm，显示只发生了少量细胞内含物扩散。
实施例4：其它试验
也进行了其它实验，研究影响细胞空间排列的产生和维持、目标分析物的检测以及减少假阳性的因素。
在一个实验中，把聚丙烯酰胺凝胶垫直接应用于已经涂布到载玻片表面上并风干了的细胞。在另一个实验中，把细胞与熔化的低Tm琼脂糖混合并以薄层涂布到载玻片的表面上，然后把聚丙烯酰胺凝胶垫直接应用于该琼脂糖。在另一个实验中，把细胞涂布到硝酸纤维素膜上，该膜施加细胞的面置于载玻片的表面上，并在该膜的另一面上放置聚丙烯酰胺凝胶垫。这些实验结果也证实，可以在支持物上产生细胞的空间排列，并且在分析细胞内含物的同时仍然维持细胞的空间排列。
在一些实验中，Triton裂解缓冲液(320mM蔗糖，5mM MgCl2，10mM Hepes缓冲液，1％Triton X-100，0.2％台盼蓝染色剂)用来代替SDS裂解缓冲液。发现Triton裂解缓冲液产生与使用SDS缓冲液时大致相同的结果。
实施例5：单个细胞的进一步分析
本实施例证明，可以在支持物上产生单个细胞的空间排列，可以鉴别细胞的空间排列，以及在分析步骤中观察到的信号空间排列可以与单个细胞的空间排列相关联。
材料和方法
使用如实施例1的包被了5′-固定的oligo dT30的载玻片。使用小鼠骨髓瘤悬浮细胞系，如实施例1。在本实验中，用80％MeOH把细胞固定到载玻片上。载玻片被预先加热(至65℃)。MeOH快速从预热的载玻片上蒸发，以最少的结块把细胞固定到载玻片的表面。载玻片上移吸了约50,000个细胞。本实验中没有使用PEG 2000或PEG 200。在固定到载玻片之后，通过包被(移吸或涂布)或通过气溶胶喷涂，用10mg/ml链霉蛋白酶覆盖细胞。
然后，在专利的高分辨率激光扫描器(130nm像素分辨率)中扫描载玻片，如英国专利申请GB 0618131.7和GB 0618133.3中描述的。
然后，使用聚丙烯酰胺凝胶块(如实施例1中的)，在SDS裂解缓冲液中裂解细胞，并在支持物上捕获释放的mRNA(50℃下1hr)。然后，如前所述，自固定的oligo dT30引物逆转录捕获的mRNA。然后，使用相同的高分辨率激光扫描器再次扫描载玻片，鉴定荧光逆转录产物。
结果
图13说明在链霉蛋白酶处理之前(图13A)和之后(图13B)，通过明视野显微镜观察到的载玻片上的细胞空间排列。显示了三角校准辅助线，以辅助细胞位置的比较。如同那些校准辅助线强调的，在链霉蛋白酶处理之后，仍然维持了细胞在载玻片上的空间排列。图13还说明，明视野显微镜检查法可用于鉴定在支持物上单个细胞的空间排列。
图14显示，通过明视野显微镜检查法(图14A和C)或高分辨率激光扫描(图14B和D)观察到的在有和没有链霉蛋白酶处理的载玻片上的单个细胞的空间排列。在对角线之上的区域没有用链霉蛋白酶处理(图14A和B)。在对角线之下的区域用链霉蛋白酶处理(图14C和D)。图14C和D显示了半圆校准辅助线，以辅助细胞位置的比较。如同那些校准辅助线强调的，在支持物上细胞的空间排列在链霉蛋白酶处理和激光扫描之后仍然维持。在添加链霉蛋白酶之后，由于自发荧光，单个细胞清楚可见(图14D)。因此，链霉蛋白酶的添加便于通过自发荧光鉴别单个细胞的空间排列，以及减少非特异性信号(参见实施例1)。
图15显示，通过明视野显微镜检查法(图15A)或高分辨率激光扫描(图15B和C)观察到的支持物上单个细胞的空间排列。图15B显示链霉蛋白酶处理的自发荧光，而图15C显示捕获的mRNA逆转录之后观察到的荧光信号。校准辅助线显示于图15，以辅助细胞位置的比较。如同那些校准辅助线强调的，在逆转录期间支持物上mRNA的空间排列仍然维持，以致图15C中观察到的荧光信号的空间排列可以容易地与图15A和B中单个细胞的空间排列相关联。
图16显示了，在本实施例的流程的各阶段，载玻片区域的更详细的视图。图16A显示在oligo dT30附着之前的空白载玻片。图16B显示在oligo dT30附着之后的载玻片。图16C显示在细胞固定之后包被oligo dT30的载玻片。图16D显示在用链霉蛋白酶处理之后的载玻片。图16E显示在细胞裂解之后的载玻片。图16F显示在固定的mRNA逆转录之后的载玻片。如该系列图像说明的，链霉蛋白酶的添加导致观察到的固定细胞的自发荧光(尤其是，参见图16D)。链霉蛋白酶处理的细胞的自发荧光在细胞裂解之后丧失(图16E)。
如同图16说明的，可以在支持物上产生单个细胞的空间排列，细胞的空间排列可以被鉴别，以及在分析步骤中观察到的信号空间排列可以与样品的空间排列相关联。
结论
这些结果补充了实施例1-4中的结果，并进一步证实可以在支持物上产生单个细胞的空间排列，细胞的空间排列可以被鉴别，以及在分析步骤中观察到的信号空间排列可以与单个细胞的空间排列相关联。
实施例6：目标分析物扩散的分析
本实施例研究细胞裂解之后目标分析物的扩散。图17显示实施例5中观察到的两个细胞(A和B)的荧光信号的详细分析。如同该图中说明的，在细胞裂解之后样品足迹有3-4倍的增加(从15-20μm到50-80μm)。这些结果暗示每个独立的细胞需要的最小面积是大约100μm2，以防止裂解之后目标分析物重叠。在本发明进一步优化之后可以实现更小的最小面积。
实施例7：单个mRNA分子的检测
本实施例证明，当用高分辨率激光扫描器(130nm像素分辨率)扫描支持物时，实施例5中的方法允许检测单个mRNA分子。图18A显示在支持物的250μm×250μm区域观察到的荧光信号——可区分单个细胞。图18B和C显示在来自单一细胞的mRNA逆转录之后观察到的荧光信号的详细分析。图18B显示来自单一细胞的用10μm栅极覆盖观察到的荧光信号。图18C显示在图18B中单分子分辨率的区域。如图18C中的荧光强度图强调的，以大约1μm间隔观察到一系列四个独立的荧光分子。那些观察到的信号由四个单独的mRNA分子的逆转录产生。相应地，本发明的方法允许检测单个mRNA转录物。这对使用基因特异性分析组分检测特定mRNAs是特别有用的(参见如下实施例8)。
实施例8：特定mRNAs的检测
在本实施例中，沿用实施例5的方法，除了不是用oligo dT30包被载玻片，而用对Arbp看家基因特异的50mer寡核苷酸包被载玻片。相应地，在本实施例中支持物用于检测特异性转录物，而不是总细胞mRNA。图19A显示在支持物的250μm×250μm区域观察到的荧光信号。在图19A中圈出了来自单个细胞观察到的信号。图19B显示用10μm栅极覆盖后，检测的来自单个细胞的基因特异性逆转录。本实施例证明本发明的方法能够用于使用基因特异性分析组分检测特定mRNAs。
实施例9：最佳样品密度的计算
图20显示，在以500细胞/mm2的密度上样细胞之后，固定到载玻片上的鼠骨髓瘤细胞的自发荧光细胞图谱。在固定细胞和高分辨率激光扫描(如实施例5中的)之后，自发荧光细胞图谱显示111细胞/mm2。该分析暗示当沿用实施例5中的方法时，最大细胞上样密度应该是大约100细胞/mm2。
实施例10：样品点样
在前面的实施例中，把单个细胞施于支持物，产生随机的细胞空间排列。在本实施例中，按已知的位置将RNA样品点到大块寡核苷酸探针上，产生非随机的样品空间排列。
通过将寡核苷酸溶液施于盖玻片下，把与polyA互补的寡核苷酸(即，oligo dT)、HPRT的mRNA以及大肠杆菌菌株K12和O157的16S核糖体RNAs的mRNA(具有5′-NH2末端)，以图21显示的模式，与NHS酯衍生的载玻片偶联。
从培养的小鼠淋巴母细胞和大肠杆菌菌株K12中提取的RNA，以～1.5mg/ml的浓度溶于3×SSC。将各1μl的RNA溶液移液入384孔微量滴定板的两个孔中。使用Schleicher和Schuell手动点样器，以9mm的针间隔把样品施用到探针块。如图21所示，把小鼠RNAs和大肠杆菌RNAs分别以字母′M′的模式和字母′C′的模式施于全部四个块。使溶液在室温下干燥，并且冷却载玻片至-20℃。然后洗涤，并且如实施例5中描述的原位合成cDNA，掺入Cy3标记的dCTP。载玻片的扫描(图21)显示，在oligo dT和HPRT块特异的捕获了小鼠RNA并进行了逆转录，而16S寡核苷酸块特异的捕获了大肠杆菌RNA并进行了逆转录。
因此，本实施例证明，样品可以被非随机地施用到支持物以产生非随机的样品空间排列，而且在随后的操作和分析步骤期间样品的空间排列可以被维持。
实施例11：在膜上的扩增
在发明人设想的一些实施方案中，用对在装置使用期间使用的试剂可渗透的材料来构建支持物。上述支持物在一些实施方案中可能是有利的，因为它们允许试剂穿过支持物，可以便于细胞捕获、细胞裂解、目标分析物捕获和/或目标分析物的分析。
一种可能的配置示意性地说明于图22A，其中装置包括在装置中形成的室之内设置的可渗透的支持物(具有固定的分析组分)。装置可以进一步包括一个或更多个用于添加和/或除去试剂的入口和/或出口。入口和/或出口的使用便于试剂施于支持物和从支持物除去试剂。在图22A中，装置包含两个此类口，可渗透的支持物置于室内，使一个口与支持物的第一面相通，而另一个口与支持物的第二面相通。这允许一个口用作为入口(即，把试剂施于支持物)，而另一个口用作为出口(即，从支持物除去试剂)。使用这类配置，样品和试剂可以容易地施加到装置和从装置除去(例如，通过注射或抽吸)。
图22A中的装置还包括盖子，可用于在使用期间保持试剂在装置之内。盖子可以整合到装置，但也可以是可移去的(如图22A和图22B中的)以允许容易地检测目标分析物。如果装置用于通过荧光的检测，那么盖子和/或装置的其它部分对用于荧光检测的激发和发射波长可以是透明的，并且还可以在这些波长具有低的固有荧光。
在显示于图22的配置中，试剂可以通过入口施加到可渗透的支持物，并且穿过出口从装置除去。例如，可以把细胞悬浮液施于装置，细胞捕获在可渗透的支持物材料上(图22B)。然后，可以施加裂解溶液以裂解捕获的细胞，并允许来自单个细胞的目标分析物与支持物的不同区域杂交。然后，可以通过合适的方法分析不同的单个细胞中的目标分析物的存在。
为了研究可与包括可渗透支持物的装置组合使用的检测方法，进行实验以确定膜捕获的DNA是否可以通过″多重置换扩增″(MultipleDisplacement Amplification，MDA，Qiagen)扩增。进行预备试验以显示用于MDA的聚合酶没有被膜抑制。
从在15ml L-肉汤中生长过夜的细胞制备大肠杆菌K12 DNA。通过离心收集细胞，重悬浮于1ml PBS中。添加50μl溶菌酶(10mg/ml)。通过离心收集细胞，重悬浮300mM NaOAc，制备至2％SDS并且于60℃保持30min。在1×酚和2×氯仿萃取之后，抽取水层，在添加1体积异丙醇之后DNA相互缠绕。在80％EtOH中洗涤之后，用100μl TE溶解DNA。DNA的理论产量是25μg。大肠杆菌K12 DNA存储液为1mg/ml。
在REPLI-g变性溶液(Qiagen)和REPLI-g中和溶液(Qiagen)中2.5∶10稀释该存储液。把0.2μl的DNA溶液施于尼龙和硝酸纤维素条带(～1mm×6mm)。根据供应商的说明书(Qiagen)制备MDA母液(master mix)(MM)。把大约15μl的MM施加到每个条带，并且把条在保湿室中于30℃孵育。在约1.5hrs之后尼龙条带表现得干燥了。对尼龙和硝酸纤维素条带两者都添加水。
也进行了其它相关实验，其中用0.2μl大肠杆菌DNA混合物上样的膜条带(～1mm×6mm)浸于管中的5μl MM中。对照管包含MM而没有DNA或没有膜。在16hrs和68hrs时，通过添加1μl终止溶液至4μl上述溶液中，终止扩增反应。把反应产物施用到1％琼脂糖凝胶。把已经用混合物润湿的条带插入凝胶上样槽中。
结果暗示硝酸纤维素抑制扩增，也许是通过吸附酶，而尼龙不抑制反应。与尼龙结合的单链DNA以高产率扩增，并且大量扩增产物保持在尼龙上。
本实施例证明，可以在膜上原位扩增单个DNA分子，这应该使非常灵敏的检测方法能够和可渗透基底组合使用。捕获的目标分析物的原位扩增应该使各类有效应用成为可能，例如，从单拷贝基因而不是核糖体RNAs分类细菌，比较基因组杂交(CGH)，单核苷酸多态性(SNP)检测和单分子测序。
实施例12：在膜上的逆转录
如上所述，在发明人设想的一些实施方案中，用对在装置使用期间使用的试剂可渗透的材料来构建支持物。为了进一步研究可以和包括可渗透支持物的装置一起使用的检测方法，进行了实验以研究与固定在可渗透支持物上的探针杂交的RNA的逆转录。
材料和方法
使用与HPRT mRNA的3′末端和大肠杆菌菌株K12 16S核糖体RNA互补的探针，分别都具有5′-NH2末端。在这些实验中，HPRT-末端探针作为阳性对照，而C1探针作为阴性对照。探针序列为：HPRT-末端
5’[氨基C6]TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT AATTTT TAG CAT TTA TTT ATT TGC ATT TAA AAG GA 3’(65mer)与K12 16S rRNA互补的C1探针
5’[氨基C6]TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TGTTCC CGA AGG CAC ATT CT 3’(50mer)
测试了7种不同的可渗透支持物材料：聚酰胺、尼龙、硝酸纤维素、Durapore GVHP、稳定素PSQ、稳定素P和稳定素FL。把每种膜材料切至大约1cm×2.5cm大小。首先在甲醇中，然后在TE缓冲液(10mM Tris/HCl和1mM EDTA)中润湿PVDF膜(GVHP、稳定素PSQ、稳定素P和稳定素FL)，其它膜直接在TE缓冲液中润湿。用甲醇预润湿PVDF膜，因为它们是极端疏水性的，如果不预润湿就不能在水溶液中润湿。然后，把膜置于用TE缓冲液润湿的薄纸上，施用探针。
尤其是，在TE缓冲液中配制5μM浓度的两种探针，然后以显示于图23A的模式，把2×0.2μl的每种探针施用到7种膜的每一种上。然后，使用Stratalinker交联剂把探针交联至膜2分钟(加热Stratalinker10分钟，然后把膜置于湿润的薄纸上的Stratalinker中)。在交联之后，把膜放置于15ml Falcon管中(每个Falcon管3或4张膜)，在旋转培养箱中于55℃用5×SSPE/0.5％SDS洗涤30分钟。
在这些实验中，施于探针的目标是长度大约1250碱基的小鼠HPRT mRNA的未标记体外转录物(IVT)。使用Epicentre AmpliCapT7 High Yield Messenger Maker试剂盒制备HPRT IVT。在体外转录之后，使用Qiagen RNeasy MinElute Spin柱提纯RNA。
在50ml Falcon管中配制20ml的杂交缓冲液(参考文献22)。把10.2μl未标记的HPRT IVT添加到20ml杂交缓冲液(2ug/10ml)。然后，从每个Falcon管中除去5×SSPE/0.5％SDS，并把10ml杂交缓冲液添加到每个Falcon管。于45℃把管放置在旋转培养箱中1小时。在孵育之后，除去杂交缓冲液，并把10mls 1×FS缓冲液添加到每个Falcon管(5×＝250mM Tris-HCl，15mM MgCl2和375mM KCl)。然后把Falcon管放置在滚动振荡器上直到可用于逆转录(～10mins)。
使用鸟类成髓细胞白血病病毒(AMV)逆转录酶进行逆转录。500μl逆转录混合物配制如下：428μl水，50μl 10×AMV逆转录酶反应缓冲液(New England Biolabs，1×＝50mM Tris-HCl，75mM乙酸钾，8mM乙酸镁和10mM DTT)，5μl RNasin，5μl生物素dUTP，2μl 25mMdNTPs和10μl AMV逆转录酶(New England Biolabs，M0277S 10000单位/ml)。把膜从Falcon管除去，并把每张膜放入一个小塑料夹中，用热封封闭三条边(即，保留一条边开放)。把70μl逆转录混合物添加到每张膜，然后使用热封机密封所述夹，在42℃置于培养箱1小时。
在孵育之后，从塑料夹中移出膜，置于Petri培养皿中(所有7张膜在一个Petri培养皿中)，然后，添加25ml洗涤缓冲液(参考文献22)，并在振荡器上洗涤膜5min。然后，除去洗涤缓冲液，替换为第二洗涤缓冲液(参考文献22)，然后再洗涤膜5min。然后除去第二洗涤缓冲液，替换为PBS/0.1％Tween，洗涤膜5min。把PBS/0.1％Tween替换为新鲜的PBS/0.1％Tween，然后再洗涤膜5min。
把链霉抗生物素蛋白-辣根过氧化酶附着于膜。在PBS/0.1％Tween中(根据ECL Advance Western印迹检测试剂盒：GE RPN2135)配制2％封闭缓冲液(50mls中1g)，并于4℃保存直到需要。除去PBS/0.1％Tween，替换为每个Petri培养皿25ml封闭缓冲液。然后振荡皿1小时。把5μl ECL链霉抗生物素蛋白辣根过氧化酶缀合物(来自GE：RPN1231)添加到另外25ml封闭缓冲液中，然后除去旧的封闭缓冲液，添加25ml包含链霉抗生物素蛋白的封闭缓冲液。在振荡器上使膜在链霉抗生物素蛋白-HRP溶液中孵育1hr。然后丢弃溶液，在25ml PBS/0.1％Tween中在滚动混合器上洗涤膜15分钟。然后丢弃PBS/0.1％Tween，替换为新鲜的PBS/0.1％Tween，在滚动混合器上再洗涤膜15min。现在膜可用于化学发光检测。
用ECL Advance进行化学发光检测。在开启以前使检测试剂平衡到室温。把1ml检测溶液A与1ml检测溶液B混合(来自ECL AdvanceWestern印迹检测试剂盒：GE RPN2135)。除去膜上多余的洗涤缓冲液，将膜平放在一块Saran包装膜上，寡核苷酸面向上。每张润湿的膜施用100μl混合检测溶液，然后在室温下孵育膜5min。通过用钳子夹住膜并使边缘接触薄纸，去除多余的检测溶液。然后，寡核苷酸面向下，把膜置于塑料片上，折叠并密封该塑料，使膜完全平展并封入塑料之中。在密封以前小心消除任何气泡。
使用Biomax XAR胶片(film)进行检测。把密封的膜放置到半边片匣上，寡核苷酸面向上。把该片匣拿到暗室，并把一张胶片放置在7张膜之上，曝光10秒后除去。把该胶片放入显影液(来自SIGMA，500mls，用水1∶5稀释)中1min，然后在水中漂洗5-10s。把胶片放入定影液(来自SIGMA，500mls，用水1∶5稀释)1min。然后移开胶片并在水中彻底洗涤，通过悬挂干燥过夜。对于5秒和30秒曝光时间重复该处理。
结果和结论
10秒曝光的结果显示于图23B。5秒和30秒曝光时间的结果基本上相同。这些结果暗示，在硝酸纤维素和GVHP上使用AMV逆转录酶的逆转录进行良好，而使用稳定素-P和稳定素-FL的进行程度较低。因此，这些结果证实可以在膜上原位逆转录RNA分子，这应该使灵敏检测方法能够和可渗透支持物结合使用。该结果还证实了实施例11中的发现，当用可渗透材料来构建支持物时，特定支持物材料的选择可影响应该使用的检测方法。这些实验进一步证实，可以通过化学发光方法检测与固定在可渗透支持物上的分析组分杂交的目标分析物，同时维持目标分析物的空间排列。
实施例13：转移基底的使用
如上所述，在发明人设想的一些实施方案中，样品首先施于转移基底以产生样品的空间排列，然后目标分析物从该转移基底转移到支持物。为了进一步研究转移基底的使用，进行了实验以研究在转移基底上细菌的细胞裂解，和随后目标分析物从该基底转移到支持物。
材料和方法
在这些实验中，支持物是载玻片，用于来自大肠杆菌菌株K12的16S rRNA的杂交和逆转录，和随后CY3 cDNA的检测。支持物的设计如图24A所示，具有一块C1探针和一块HPRT探针。这些实验使用与实施例12中相同的探针，但此时C1探针作为阳性对照，而HPRT探针作为阴性对照。
从冰箱中取出NHS衍生的载玻片(Schott)，在从盒中移动前将其加热到室温。在90μl 1∶1 0.2M K磷酸缓冲液(pH9)：DMSO中稀释10μl C1寡核苷酸(100uM)，产生10uM的最终寡核苷酸浓度。在90μl 1∶1 0.2M K磷酸缓冲液(pH9)：DMSO中稀释10μl HPRT寡核苷酸(100uM)，产生10uM的最终寡核苷酸浓度。把加边盖玻片(lifter slip)一分为二置于载玻片之上，以盖玻片作为NHS衍生的载玻片和该加边盖玻片之间的隔离物。把100μl的10μM C1寡核苷酸施于左侧加边盖玻片下。把100μl的10μM HPRT寡核苷酸施于右侧加边盖玻片下。在室温下放置载玻片30分钟，使寡核苷酸偶联到载玻片。在偶联的结尾，把载玻片放入Petri培养皿的水中，钝化其余的表面。把载玻片放入有水的Falcon管中，在滚动混合器上洗涤30min。
SDS/聚丙烯酰胺凝胶制备如下。用两块大的显微镜载玻片和两块小的显微镜载玻片制备浇注模具，使用大铁夹把它们维持在一起。制备凝胶混合物(1ml水，625μl丙稀酰胺，500μl 10％SDS，375μl 10×SSC缓冲液，30μl 10％AMPS和5μl TEMED)，然后施加到浇铸单位，保证没有气泡。使凝胶凝固大约30分钟。在使用前从浇铸单位移出凝胶。
如下制备大肠杆菌细胞用于RNA杂交。把3ml细胞添加到7ml LB培养基中，然后放入37℃培养箱中～2小时。把1ml制备的培养物收进1.5ml Eppendorf管，添加125μl冷的5％酚的乙醇溶液。翻转混合管中的内含物杀死大肠杆菌，然后于8.8rpm旋转2min。除去上清液，添加1ml 1×PBS。通过抽吸重新悬浮细胞，然后于8.8rpm旋转2min。除去上清液，并添加1ml 1×PBS。再次通过抽吸重悬浮大肠杆菌。于8.8rpm旋转重悬浮的细胞2min，再次除去上清液。这些步骤除去了任何微量酚。
添加200μl 0.5mg/ml溶菌酶(10μl的10mg/ml存储液+190μl 1×PBS缓冲液)，然后通过抽吸重悬浮大肠杆菌细胞。混合物在室温下放置3-5分钟，使细胞壁消化。现在细胞可以向膜上施用。把两片硝酸纤维素膜切到适合载玻片的大小。把膜放入热PBS中5-10分钟(PBS水浴加热到90℃)。从热PBS中移走膜，并放在PBS浸透的薄纸片上。以显示于图24B的模式把4×1μl的细胞施于每张膜上。把2μl10mg/ml链霉蛋白酶溶液施加在膜上的每种样品之上。
载玻片置于45℃热封闭。制备的膜面朝下施加到载玻片上，使细胞直接位于探针块上。用浇铸的聚丙烯酰胺凝胶覆盖膜，并且把空白的显微镜载玻片置于凝胶顶部，如图24C所示。装配放置30分钟以允许杂交。然后从热封闭中移走载玻片，移走凝胶垫和膜。把载玻片放入包含洗涤缓冲液(参考文献22)的50ml falcon管中，置于滚动混合器上，洗涤5分钟。然后把载玻片转移入50ml的第二洗涤缓冲液(参考文献22)中，置于滚动混合器上，再洗涤5分钟。使用AxonGenePix 4000B扫描仪扫描载玻片(参见图25A)。
使用CY3-dCTP逆转录捕获的16S rRNA。配制250μl RT混合物(水159μl，5×FS缓冲液50μl，RNasin 2.5μl，0.1MDTT 25μl，25mMdNTP混合物1μl，CY3-dCTP 2.5μl，Superscript III酶10μl)。把载玻片置于45℃热封闭，并把HybriWell室置于顶部。把250μl RT混合物施加到载玻片上，然后把HybriWell的顶部放在载玻片上。45℃孵育载玻片30分钟。把HybriWell室从载玻片处移走，并把载玻片放入Falcon管中。添加50ml洗涤缓冲液(参考文献22)，在滚动混合器上混合5分钟。把载玻片转移入新的Falcon管中，添加50ml第二洗涤缓冲液(参考文献22)，然后在滚动混合器上混合5分钟。然后使用Axon扫描仪再次扫描该载玻片(参见图25B)。在滚动混合器上把载玻片放入1％SDS溶液中过夜，然后使用Axon GenePix 4000B扫描仪再次扫描(参见图25C)。
结果和结论
从图25A-C明显可见，只有在相应于硝酸纤维素膜上大肠杆菌细胞施用的区域的支持物区域，才观察到来自CY3 cDNA的荧光信号。荧光信号模式(图25A-C)反映了细胞施于转移基底的模式(图24B)。此外，只有在存在C1探针的支持物区域才观察到来自CY3 cDNA的荧光信号，证实所述信号确实来自大肠杆菌16S RNA的逆转录。换言之，荧光信号模式(图25A-C)也反映了探针施于转移基底的模式(图24A)。
因此这些实验证实，样品可施于转移基底以产生样品的空间排列，然后目标分析物从转移基底转移到支持物，同时维持目标分析物的空间排列。这些实验还证实本发明的方法和装置可以用于真核和原核细胞。
实施例14：膜化学发光的进一步研究
进行进一步的实验，研究化学发光检测与可渗透的支持物材料的组合使用。
材料和方法
把两张尼龙膜切到适合显微镜载玻片的大小。把膜放入Petri培养皿中，用TE缓冲液润湿。把膜放在湿润的薄纸上，保持湿润用于寡核苷酸施用。
把100μM HPRT-末端(如实施例12和13中)1∶20稀释到TE缓冲液中，产生5μM的终浓度(10μl在200μl TE中)。
准备杀菌灯管(UV灯)罩。在使用前，打开杀菌灯管10分钟进行预热。把100μl HPRT-末端寡核苷酸施加到每种膜，用探针覆盖整张膜。把膜放在湿润的薄纸上，然后移入杀菌灯管罩内，允许探针交联2分钟。关掉杀菌灯管，从罩内移出膜，放入用辐射表面照射过的50ml Falcon管中。添加25ml 5×SSPE/0.5％SDS，于55℃在旋转培养箱中洗涤膜30分钟。然后丢弃5×SSPE/0.5％SDS。
如实施例12中制备用于杂交的HPRT IVT RNA，除了在这些实验中通过在转录期间掺入生物素酰化核苷酸使IVT生物素酰化。利用无RNA酶的水，使用生物素酰化的IVT用于制备下列浓度的RNA：0.7ug/ul，0.6ug/ul，0.5ug/ul，0.4ug/ul，0.3ug/ul，0.2ug/ul，0.1ug/ul，和0.05ug/ul。
制备10mls杂交缓冲液(参考文献22)。把膜放入50ml Falcon管中，加入10ml杂交缓冲液。在45℃孵育膜30min或直到需要。把膜放在Petri培养皿中的薄纸上，所述薄纸已经在热的杂交缓冲液中浸透。把3×0.5μl的每种浓度成行点样至膜上(参见图26)。
把盖子放在Petri培养皿上，皿置于培养箱中45℃ 30分钟。移开膜并放入Falcon管中。添加50ml洗涤缓冲液(参考文献22).并把Falcon管放在滚动混合器上洗涤5分钟。把膜转移入50mls第二洗涤缓冲液中(参考文献22)，并在滚动混合器上再洗涤5分钟。把膜放入50ml Falcon管中，面朝上。添加50ml PBS/0.1％Tween。把Falcon管放在滚动混合器上，允许洗涤15分钟。把PBS/0.1％Tween换成新鲜的PBS/0.1％Tween，再洗涤膜15分钟。
基本上如实施例12所述进行化学发光检测，除了把1ml混合的ECL Advance检测溶液施加到每张润湿的尼龙膜。
结果和结论
使用HRP作为底物，可以通过化学发光检测所有的测试浓度的生物素酰化的IVT(参见图27)。这些实验进一步证实，可以通过化学发光方法检测与固定在可渗透支持物上的分析组分杂交的目标分析物。这些实验允许计算化学发光检测的极限。预期通过利用优化的系统，可以提高化学发光检测的极限。总之，这些实验显示，即使使用次优检测系统，通过化学发光也可以检测高表达基因。具有高外部量子产率的可选的检测方法，例如背照CCD摄像机上的近感探测(proximity detection)，应该提供甚至更低的检测极限，使即使低水平表达的基因也可以通过化学发光检测。
可以理解，仅仅通过示例的方式描述了本发明，在不背离本发明的精神和范围的情况下，可以进行细节的改变。
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Claims (36)
1、用于分析复数的不同样品的方法，包括步骤：
a)把样品施于固定了分析组分的支持物；和
b)使样品与分析组分相互作用，从而允许样品分析，
其中，在步骤a)中，各个样品施于支持物的不同区域，在支持物上产生样品的空间排列，并且其中在步骤b)中维持空间排列，从而允许分析结果与单个样品匹配。
2、根据权利要求1的方法，还包括匹配分析结果与单个样品。
3、用于分析复数的不同单个细胞的方法，包括步骤：
a)把来源于单个细胞的材料施于支持物，所述支持物上固定了特异性结合试剂；和
b)使材料与特异性结合试剂相互作用，从而允许材料的分析，
其中，在步骤a)中，来源于不同单个细胞的材料施于支持物的不同区域，在支持物上产生材料的空间排列，并且其中在步骤b)中维持空间排列，从而允许匹配分析结果与单个细胞。
4、根据权利要求3的方法，还包括匹配分析结果与单个细胞。
5、根据权利要求3的方法，其中步骤a)包括：
(i)把细胞施于支持物；然后
(ii)从细胞释放材料。
6、根据权利要求3的方法，其中步骤a)包括：
(i)从细胞中释放材料；然后
(ii)把释放的材料施于支持物。
7、根据权利要求6的方法，其中，步骤(i)包括把材料从细胞释放到基底的不同区域，在基底上产生材料的空间排列，和步骤(ii)包括把目标分析物从基底转移到支持物，同时维持步骤(i)中产生的空间排列。
8、根据权利要求7的方法，其中基底对细胞或细胞组分是不可渗透的，而对目标分析物和转移试剂是可渗透的。
9、用于分析复数的不同单个细胞的装置，包括支持物，所述支持物上固定了特异性结合试剂，并且在所述支持物上以空间排列的方式设置了来源于复数的不同单个细胞的材料，所述空间排列允许使用分析组分的分析结果与单个细胞匹配。
10、用于分析复数的不同单个细胞的装置，包括：
(i)支持物，其上固定了特异性结合试剂；和
(ii)转移基底，所述转移基底对裂解试剂和目标分析物是可渗透的，对细胞或细胞组分是不可渗透的，
其中，转移基底相对或紧靠着支持物放置。
11、用于分析复数的不同单个细胞的试剂盒，包括：
(i)支持物，其上固定了特异性结合试剂；和
(ii)材料施用器，用于将来源于复数的不同单个细胞的材料以空间排列的方式施于支持物，所述空间排列允许使用分析组分的分析结果与单个细胞匹配。
12、权利要求11的试剂盒，其中材料施用器是用于把细胞施于支持物，然后从细胞释放材料的施用器。
13、权利要求11的试剂盒，其中材料施用器是用于从细胞释放材料，然后把释放的材料施于支持物的施用器。
14、权利要求13的试剂盒，其中材料施用器包括对裂解试剂和目标分析物是可渗透的，而对细胞或细胞组分是不可渗透的基底。
15、用于分析复数的不同样品的方法，包括步骤：
a)把样品施于转移基底的不同区域，在转移基底上产生样品的空间排列；然后
b)把目标分析物从转移基底转移到支持物上，所述支持物上固定了特异性结合试剂；以及
c)允许目标分析物与特异性结合试剂相互作用，从而允许样品的分析，
其中在步骤b)和c)中维持目标分析物的空间排列，从而允许分析结果与单个样品匹配。
16、根据权利要求15的方法，还包括匹配分析结果与单个样品。
17、根据权利要求15的方法，其中转移基底对目标分析物和转移试剂是可渗透的。
18、根据权利要求17的方法，其中在步骤b)将转移试剂施于转移基底，从而允许目标分析物从转移基底转移到支持物。
19、根据权利要求15至18任一项的方法，其中在步骤b)中，转移基底相对或紧靠着支持物放置，以便于目标分析物从转移基底转移到支持物。
20、用于分析复数的不同样品的装置，包括：
(i)支持物，其上固定了特异性结合试剂；和
(ii)对目标分析物和转移试剂是可渗透的转移基底，其相对或紧靠着支持物放置。
21、根据权利要求20的装置，其中支持物上以空间排列的方式设置了复数的不同样品，所述空间排列允许使用分析组分的分析结果与单个样品匹配。
22、用于分析复数的不同样品的试剂盒，包括：
(i)支持物，其上固定了特异性结合试剂；
(ii)对目标分析物和转移试剂是可渗透的转移基底；
(iii)用于把目标分析物从基底转移到支持物上的材料转移器，向支持物转移目标分析物的同时，所述材料转移器允许维持基底上的样品空间排列。
23、权利要求22的试剂盒，其中材料转移器是转移试剂。
24、根据前述任一项权利要求的方法、装置或试剂盒，其中支持物对在装置使用期间施于装置的试剂是不可渗透的。
25、根据权利要求1-23中任一项的方法、装置或试剂盒，其中支持物对在装置使用期间施加到装置的试剂是可渗透的。
26、根据前述任一权利要求的方法、装置或试剂盒，其中特异性结合试剂是核酸。
27、根据权利要求1-25中任一项的方法、装置或试剂盒，其中特异性结合试剂是抗体或抗体片段。
28、根据权利要求1-25中任一项的方法、装置或试剂盒，其中特异性结合试剂是适配体。
29、根据权利要求1-25中任一项的方法、装置或试剂盒，其中特异性结合试剂是小分子。
30、根据权利要求29的方法、装置或试剂盒，其中小分子是具有小于2000道尔顿的分子量的有机分子。
31、根据权利要求29的方法、装置或试剂盒，其中小分子是包括至少5个氨基酸残基的肽或肽类似物。
32、根据权利要求1-25中任一项的方法、装置或试剂盒，其中不同的特异性结合试剂固定在支持物上的块中。
33、根据权利要求32的方法、装置或试剂盒，其中单个细胞施于特异性结合试剂的块上。
34、根据权利要求32的方法、装置或试剂盒，其中各块的大小允许至少2种样品的平行分析。
35、根据权利要求34的方法、装置或试剂盒，其中至少2个细胞施于特异性结合试剂的块上。
36、根据权利要求1-25中任一项的方法、装置或试剂盒，其中各单个样品包括单个细胞。
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