KR20160125422A - 알로스테릭 단백질의 신생 설계 - Google Patents

알로스테릭 단백질의 신생 설계 Download PDF

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Abstract

1종 이상의 알로스테릭 이펙터에 결합하여 단백질에서의 입체형태 변화를 유도하는 알로스테릭 DNA 결합 단백질을 제조 및 단리하기 위한 방법 및 조성물이 제공된다.

Description

알로스테릭 단백질의 신생 설계 {DE NOVO DESIGN OF ALLOSTERIC PROTEINS}
관련 출원 데이터
본 출원은 2014년 2월 21일에 출원된 미국 특허 가출원 번호 61/942,755를 우선권 주장하고, 이는 모든 목적을 위해 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
정부 권리의 진술
본 발명은 미국 에너지부에 의해 수여된 DE-FG02-02ER63445 하에 정부 지원으로 이루어졌다. 미국 정부는 본 발명에 있어서 특정 권리를 갖는다.
분야
본 발명은 신규 알로스테릭 단백질을 설계하기 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다.
합리적인 단백질 설계에 있어서, 관심 단백질의 구조 및 기능의 상세한 지식은 단백질의 돌연변이체 형태를 조작하는데 사용된다. 그러나, 합리적인 돌연변이유발 방법은 일반적으로 복잡한 비-직관적 상호작용이 종종 단백질 구조 및 기능을 통제한다는 사실로 인해 비성공적이다. 따라서, 단백질 조작을 위한 신규 방법 및 조성물을 개발하는 것이 바람직하다.
개요
본 발명의 실시양태는 표적 소분자 또는 알로스테릭 이펙터에 결합하고 후속 입체형태적 변화를 거쳐 표적 소분자 또는 알로스테릭 이펙터에 반응하는 알로스테릭 단백질을 설계하기 위한 신규 방법 및 조성물에 기초한다. 본 발명의 특정 측면에서, 본원에 기재된 방법 및 조성물은, 예를 들면 발효-기반 분자 생산에 유용한 생합성 경로를 조작하는데 유용한 센서 단백질을 설계하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 다른 측면에서, 본원에 기재된 방법 및 조성물은 포유동물 세포 배양에 사용하기 위한 직교 유도성 유전자 발현 시스템을 설계하는데 사용될 수 있으며, 이는 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 현재 사용되는 방법, 예컨대 Tet-On 시스템 상에 비해 상당한 진전이다. 본 발명의 또 다른 측면에서, 본원에 기재된 방법 및 조성물은 또한, 예를 들면 대규모 발효에 유용한 유도성 유전자 발현 시스템을 설계하는데 사용될 수 있으며, 이는 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 현재 사용되는 방법, 예컨대 IPTG-기반 시스템 상에 비해 상당한 진전이다.
특정의 예시적인 실시양태에서, 알로스테릭 DNA 결합 단백질에서의 입체형태 변화를 유도하는 동반 알로스테릭 이펙터에 결합하는 알로스테릭 DNA 결합 단백질을 제조 및 단리하는 방법이 제공된다.
본원에 사용된 용어 "알로스테릭 단백질"은 이펙터 분자에 결합하고 입체형태적 변화를 거쳐, 단백질의 하나 이상의 활성의 증가 또는 감소를 일으키는 단백질을 지칭한다. 본 발명의 알로스테릭 단백질은 센서 및/또는 유도성 유전자 발현 시스템 (예를 들면, 직교 유전자 발현 시스템)의 부분일 수 있다 (검토를 위해 문헌 [Liang et al. (2013) Biotech. and Bioeng. 110:1419] 참조). 알로스테릭 단백질은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있고, 전사 인자, 리보스위치, 2-성분 신호전달 단백질, 핵 호르몬 수용체 등을 포함한다.
본원에 사용된 "이펙터 분자"는 알로스테릭 단백질에 선택적으로 결합하여 그의 생물학적 활성을 조절하는 분자, 예를 들면 소분자를 지칭한다. 이 방식으로, 이펙터 분자는 리간드로서 작용하여, 효소적 활성, 유전자 발현, 세포 신호전달 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는 활성 중 하나 이상을 증가시키거나 감소시킨다. 특정 측면에서, 이펙터 분자는 알로스테릭 단백질의 활성을 증가시킨다, 즉 이펙터 분자는 "알로스테릭 활성화인자"로서 기능한다. 다른 측면에서, 이펙터 분자는 알로스테릭 단백질의 활성을 감소시킨다, 즉 이펙터 분자는 "알로스테릭 억제인자"로서 기능한다.
특정의 예시적인 실시양태에서, 목적하는 동반 알로스테릭 이펙터를 위한 결합 포켓을 갖는 후보 알로스테릭 DNA 결합 단백질이 컴퓨터로 인 실리코 설계된다. 후보 알로스테릭 DNA 결합 단백질을 코딩하는 핵산 서열이 제공되고, 후속적으로 박테리아 숙주 세포 내로 도입되어, 후보 알로스테릭 DNA 결합 단백질을 발현시킨다.
특정의 예시적인 실시양태에서, 음성 선택을 사용함으로써 후보 알로스테릭 DNA 결합 단백질이 DNA에 결합하여 유전자의 발현을 억제하는지 여부를 결정하여, 후보 알로스테릭 DNA 결합 단백질이 DNA에 결합하여 유전자의 발현을 억제하는 제1 복수의 미생물 (예를 들면, 박테리아 숙주 세포 (예를 들면, 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) 또는 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis))을 확인한다. DNA 결합 단백질이 DNA에 결합하여 유전자의 발현을 억제하는 경우, 미생물 (예를 들면, 박테리아 숙주 세포)은 생존할 것이다. DNA에 결합하지 않은 후보 알로스테릭 DNA 결합 단백질은 유전자의 발현을 활성화시켜 알로스테릭 DNA 결합 단백질을 보유하는 박테리아 숙주 세포를 사멸시킨다.
특정의 예시적인 실시양태에서, 양성 선택을 사용하여 제1 복수의 박테리아 숙주 세포의 후보 알로스테릭 DNA 결합 단백질이 목적하는 동반 알로스테릭 이펙터에 결합하는지 여부를 결정하여, 후보 알로스테릭 DNA 결합 단백질이 동반 알로스테릭 이펙터에 결합한 제2 복수의 박테리아 숙주 세포를 확인한다. 제1 복수의 박테리아 숙주 세포로부터의 풀링된 후보 DNA 결합 단백질은 양성 선택에 의해 목적하는 알로스테릭 이펙터 분자에 의한 활성화에 대해 검정될 것이다. 양성 선택에서, 목적하는 알로스테릭 이펙터 분자에 반응하는 후보 DNA 결합 단백질을 보유하는 박테리아 숙주 세포만이 생존할 것이다.
미생물의 게놈은 독소에 대한 해독제를 코딩하는 DNA를 포함하도록 임의로 유전자 변형된다. 알로스테릭 단백질은, 발현되는 경우, 미생물 내의 해독제의 생산을 조절한다. 알로스테릭 단백질의 성질에 따라, 이는 해독제 생산을 알로스테릭 이펙터의 부재 하의 억제, 알로스테릭 이펙터의 존재 하의 활성화, 알로스테릭 이펙터의 부재 하의 리보솜 결합 부위의 폐색 등에 의해 조절할 수 있다. 미생물이 독소의 환경 내에 배치되고 어떠한 해독제도 생산되지 않거나 불충분한 해독제가 생산되는 경우, 미생물은 사멸할 것이다. 목적하는 알로스테릭 이펙터는 외인성으로 제공될 수 있다.
미생물은 해독제에 대한 독소 대응물의 환경 내에 임의로 배치된다. 이 방식에서, 해독제가 존재하는 알로스테릭 이펙터의 수준에 반응하여 세포를 사멸로부터 방지하기에 충분한 양으로 세포에 의해 생산되므로 해독제는 "셀렉터"로 본원에서 지칭된다. 알로스테릭 이펙터의 수준에 비례하는 해독제의 수준은 추가의 변형 및 최적화를 위해 후보 알로스테릭 DNA 결합 단백질을 함유하는 균주를 선택한다.
본 발명의 특정 측면에서, 음성 선택은 유전자를 발현하는 세포에 대해 독성인 독소와 박테리아 숙주 세포를 접촉시키는 것을 포함한다.
본 발명의 다른 측면에서, 음성 선택은 유전자의 발현이 억제되도록 후보 알로스테릭 DNA 결합 단백질이 DNA에 결합하지 않은 세포에 대해 독성인 독소와 박테리아 숙주 세포를 접촉시키는 것을 포함한다.
본 발명의 특정 측면에서, 양성 선택은 독소 및 동반 알로스테릭 이펙터와 제1 복수의 박테리아 숙주 세포를 접촉시키는 것을 포함하며, 여기서 독소는 유전자가 발현되지 않는 세포에 대해 독성이다.
본 발명의 특정 측면에서, 양성 선택은 독소 및 알로스테릭 이펙터 표적과 제1 복수의 박테리아 숙주 세포를 접촉시키는 것을 포함하며, 여기서 독소는 동반 알로스테릭 이펙터가 후보 알로스테릭 DNA 결합 단백질에 후보 알로스테릭 DNA 결합 단백질이 DNA로부터 방출되도록 하는 방식으로 결합하지 않은 세포에 대해 독성이다.
본 발명의 특정 측면에서, 양성 선택은 유전자가 발현되도록 후보 알로스테릭 DNA 결합 단백질이 DNA에 결합한 경우에 제1 복수의 박테리아 세포에서 발현되는 검출가능한 마커를 검출하는 것을 포함한다.
본 발명의 특정 측면에서, 검출가능한 마커는, 예를 들면 형광 활성화 세포 분류에 의해 검출될 수 있는 형광 단백질 (예를 들면, 녹색 형광 단백질 (GFP))이다.
본 발명의 특정 측면에서, 알로스테릭 DNA 결합 단백질은 알로스테릭 DNA 결합 단백질이 알로스테릭 이펙터 분자에 의해 활성화되는 경우에 형광 리포터가 발현되도록 형광 리포터 (예컨대 GFP)의 발현을 조절한다.
본 발명의 특정 측면에서, 음성 선택 후의 제1 복수의 세포는 형광 활성화 세포 분류 (FACS)를 통해 추가의 스크리닝에 적용된다. 본 발명의 특정 측면에서, 양성 스크리닝은 목적하는 알로스테릭 이펙터를 향한 후보 알로스테릭 DNA 결합 단백질의 활성화를 평가하는 것을 포함하며, 여기서 형광 리포터를 발현하는 것에 의한 활성화가 보고된 이들 후보 알로스테릭 DNA 결합 단백질만이 FACS를 통해 분류되고 수집된다.
본 발명의 특정 측면에서, 양성 선택은 동반 알로스테릭 이펙터가 후보 알로스테릭 DNA 결합 단백질에 후보 알로스테릭 DNA 결합 단백질이 DNA로부터 방출되도록 하는 방식으로 결합하지 않은 경우에 제1 복수의 박테리아 세포에서 발현되는 검출가능한 마커를 검출하는 것을 추가로 포함한다.
특정의 예시적인 실시양태에서, 알로스테릭 DNA 결합 단백질에서의 입체형태 변화를 유도하는 동반 알로스테릭 이펙터에 결합하는 알로스테릭 DNA 결합 단백질을 제조 및 단리하는 방법이 제공된다. 방법은 동반 알로스테릭 이펙터를 위한 결합 포켓을 갖는 후보 알로스테릭 DNA 결합 단백질을 컴퓨터로 인 실리코 설계하는 단계 및 후보 알로스테릭 DNA 결합 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 제공하는 단계를 포함한다. 방법은 핵산 서열을 에스케리키아 콜라이 숙주 세포 내로 도입하여 후보 알로스테릭 DNA 결합 단백질을 발현시키는 단계를 추가로 포함한다.
방법은 음성 선택을 사용함으로써 후보 알로스테릭 DNA 결합 단백질이 DNA에 결합하여 유전자의 발현을 억제하는지 여부를 결정하여, 후보 알로스테릭 DNA 결합 단백질이 DNA에 결합하여 유전자의 발현을 억제하는 제1 복수의 에스케리키아 콜라이 숙주 세포를 확인하는 단계를 포함한다.
방법은 또한 양성 선택을 사용하여 제1 복수의 에스케리키아 콜라이 숙주 세포의 후보 알로스테릭 DNA 결합 단백질이 동반 알로스테릭 이펙터에 결합하는지 여부를 결정하여, 후보 알로스테릭 DNA 결합 단백질이 동반 알로스테릭 이펙터에 결합한 제2 복수의 에스케리키아 콜라이 숙주 세포를 확인하는 단계를 포함한다.
본 발명의 특정 측면에서, 후보 알로스테릭 DNA 결합 단백질을 코딩하는 핵산 서열은 기재에 결합된 핵산 하위서열로부터 생성되고, 후보 알로스테릭 DNA 결합 단백질을 코딩하는 핵산 서열이 형성되도록 라이게이션된다.
본 발명의 다른 측면에서, 음성 선택은 유전자를 발현하는 세포에 대해 독성인 독소와 박테리아 숙주 세포를 접촉시키는 것을 포함하고/거나, 양성 선택은 독소 및 동반 알로스테릭 이펙터와 제1 복수의 박테리아 숙주 세포를 접촉시키는 것을 포함하며, 여기서 독소는 유전자가 발현되지 않는 세포에 대해 독성이다.
특정의 예시적인 실시양태에서, 알로스테릭 DNA 결합 단백질에서의 입체형태 변화를 유도하는 동반 알로스테릭 이펙터에 결합하는 알로스테릭 DNA 결합 단백질을 제조 및 단리하는 방법이 제공된다. 방법은 동반 알로스테릭 이펙터를 위한 결합 포켓을 갖는 후보 알로스테릭 DNA 결합 단백질을 컴퓨터로 인 실리코 설계하는 단계, 기재에 결합된 핵산 하위서열로부터 생성된 후보 알로스테릭 DNA 결합 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 제공하는 단계, 및 핵산 서열을 미생물 내로 도입하여 후보 알로스테릭 DNA 결합 단백질을 발현시키는 단계를 포함한다.
방법은 또한 음성 선택을 사용함으로써 후보 알로스테릭 DNA 결합 단백질이 DNA에 결합하여 유전자의 발현을 억제하는지 여부를 결정하여, 후보 알로스테릭 DNA 결합 단백질이 DNA에 결합하여 유전자의 발현을 억제하는 제1 복수의 미생물을 확인하는 단계를 포함한다.
방법은 양성 선택을 사용하여 제1 복수의 미생물의 후보 알로스테릭 DNA 결합 단백질이 동반 알로스테릭 이펙터에 결합하는지 여부를 결정하여, 후보 알로스테릭 DNA 결합 단백질이 동반 알로스테릭 이펙터에 결합한 제2 복수의 미생물을 확인하는 단계를 추가로 포함한다.
본 발명의 특정 측면에서, 기재는 마이크로어레이이다. 본 발명의 다른 측면에서, 기재로부터의 복수의 하위서열은 마이크로어레이 상의 서열로부터 증폭되고, 후보 알로스테릭 DNA 결합 단백질을 코딩하는 핵산 서열이 형성되도록 조합된다.
본 발명의 특정 측면에서, 후보 알로스테릭 DNA 결합 단백질을 코딩하는 핵산 서열은 (예를 들면, 오류-유발 PCR 또는 조합 PCR에 의해) 무작위로 생성된다.
본 발명의 특정 측면에서, 후보 알로스테릭 DNA 결합 단백질은 단백질 리딩 프레임을 그의 기능에 대해 무손상으로 남아있도록 하면서 항-독소 유전자에 융합된다. 리딩 프레임이 무손상이지 않은 후보 알로스테릭 DNA 결합 단백질은 항-독소 단백질의 발현을 허용하지 않고, 그들을 보유하는 숙주 세포는 세포를 독소에 노출시킴으로써 제거될 수 있다.
특허 또는 출원 파일은 컬러로 작성된 도면을 함유한다. 컬러 도면을 갖는 본 특허 또는 특허 출원 공개의 사본은 필요한 요금의 청구 및 납부시 특허청으로부터 제공될 것이다. 본 발명의 상기 및 다른 특색 및 이점은 첨부된 도면과 함께 예시적인 실시양태의 하기 상세한 설명으로부터 보다 완전히 이해될 것이다:
도 1은 알로스테릭 단백질의 신생 설계를 위한 발명의 예시적인 실시양태에 따른 방법을 개략적으로 도시한다. 방법은 높은 결합 친화도 및 알로스테릭 효과를 나타내는 신규 알로스테릭 단백질을 조작하기 위해 인 실리코, 시험관내 및 생체내 단계를 조합한다.
도 2는 본 발명의 특정 실시양태에 따른 센서 재설계 라이브러리 구축 방법을 개략적으로 도시한다.
본 발명의 실시양태는 단백질 조작을 위한 신규 방법 및 조성물을 제공한다. 특정의 예시적인 실시양태에서, 본 발명의 하나의 방법은 후보 단백질 서열을 컴퓨터로 설계하는 단계, 후보 단백질 서열을 코딩하는 핵산 서열을 합성하는 단계, 및 음성 선택 단계 및 양성 선택 단계가 각각 후보 단백질을 확인하도록 수행되는 선택 시스템을 사용하는 단계를 조합한다.
본 발명의 특정 측면에 따르면, 미생물은 알로스테릭 단백질을 코딩하는 1종 이상의 외인성 핵산을 포함하도록 유전자 변형된다. 알로스테릭 단백질 서열은 공개 문헌 검색에 기초하여 확인될 수 있다. 예를 들어, 이펙터 및 알로스테릭 단백질에 대한 생합성 경로는 하기 참고문헌에서 자세히 기재된다: cdaR (Monterrubio et al. 2000 J. Bacteriol. 182(9):2672-4), tetR (Lutz and Bujard Nucleic Acids Res. 1997 25(6):1203-10), alkS (Canosa et al. Mol. Micriobiol. 2000 35(4):791-9), ttgR (Teran, et al. Antimicrob. Agents Chemother. 47(10):3067-72 (2003)), btuB 리보스위치 (Nahvi, et al. Nucleic Acids Res. 32:143-150 (2004)); 글루카르산 (Moon, et al. Appl. Env. Microbiol. 75:589-595 (2009)), 나린게닌 (Santos, et al. Metabolic Engineering. 13:392-400 (2011)), 알칸 (Steen, et al. 463:559-562 (2009)), 코발라민 (Raux, et al. Cell Mol. Life Sci. 57:1880-1893. (2000)), 뮤콘산 (Niu, et al. Biotechnol Prog. 18:201-211. (2002)). 본 발명의 특정 측면에 따라 사용하기에 적합한 센서 유전자의 비-제한적 목록은 표 1에 제공된다. 본원에 기재된 방법은 핵산을 알로스테릭 단백질의 생산을 담당하는 미생물의 게놈에 삽입하는데 사용될 수 있다.
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표 1.
특정의 예시적인 실시양태에서, 이펙터 결합시 알로스테릭 입체형태적 변화를 거치지 않고/거나 부정확한 알로스테릭 입체형태적 변화를 거치는 돌연변이체 알로스테릭 단백질을 발현하는 미생물을 음성 선택하는 방법이 제공된다. 다른 예시적인 실시양태에서, 알로스테릭 입체형태적 변화를 거치고/거나 이펙터 분자에 결합하는 돌연변이체 알로스테릭 단백질을 발현하는 미생물을 양성 선택하는 방법이 제공된다.
본 발명의 특정 측면에 따르면, 미생물은 독소에 대한 해독제를 코딩하는 1종 이상의 외인성 핵산을 포함하도록 유전자 변형된다. 해독제 및 독소 쌍은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있고, SDS : tolC, 콜리신 : tolC (음성 선택), 카나마이신 : 카나마이신 뉴클레오티딜트랜스퍼라제, 클로람페니콜 : 클로람페니콜 아실 트랜스퍼라제, 암피실린 : 베타 락타마제, 테트라시클린 : 테트라시클린 유출 펌프 tetA, 염화니켈 : 테트라시클린 유출 펌프 tetA (음성 선택), 5-플루오로오로트산 : URA3 (음성 선택)을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 형질전환된 미생물은 적합한 조건 하에 해독제를 발현하도록 의도된다.
임의의 특정한 해독제의 생산을 위한 유전자는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있다. 예를 들어, 상기 해독제에 대한 유전자는 tetA (Postle et al. Nucleic Acid Research 1984 12(12)4849-4863) tolC (Fralick J. Bacteriol. 1996 178(19)5803-5805) 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제 (Shaw et al. J. Bacteriol. 1970 104(3):1095-1105)에서 자세히 기재된다. 본원에 기재된 방법은 핵산을 DNA 결합 단백질의 생산을 담당하는 미생물의 게놈에 삽입하는데 사용될 수 있다.
한 측면에 따르면, 형질전환된 재조합 미생물은 해독제의 생산을 조절하는 알로스테릭 단백질을 발현한다. 알로스테릭 단백질이 표적 알로스테릭 이펙터에 의해 결합되어 알로스테릭 단백질 기능을 변화시킴으로써 해독제 발현을 일으키지 않는 한, 알로스테릭 단백질은, 발현되는 경우, 해독제의 발현을 차단 (즉, 리프레서)하거나 발현을 활성화 (즉, 활성화인자)시키지 못함으로써 세포가 해독제 유전자를 발현하는 것을 방지한다. 여러 조절 메카니즘이 가능하다. 리프레서인 알로스테릭 전사 인자의 경우, 목적하는 알로스테릭 이펙터가 리프레서에 결합하지 않는 한, 리프레서 단백질은 해독제 유전자에 대해 5'의 DNA 영역에 결합함으로써 해독제 유전자의 전사를 차단한다. 활성화인자인 알로스테릭 전사 인자의 경우, 활성화인자는 목적하는 알로스테릭 이펙터가 활성화인자에 결합하는 경우에만 해독제 유전자에 대해 5'의 DNA 영역에 RNA 폴리머라제를 동원한다. 감쇠 알로스테릭 단백질의 경우, 알로스테릭 단백질은 해독제 유전자의 전사를 조절하는 리프레서의 5' 비번역 영역에서 코딩되고, 표적 알로스테릭 이펙터에 결합될 때 이 리프레서의 번역을 감쇠시킨다 (2013년 3월 14일에 출원된 USSN 61/781,373을 참조하며, 이는 모든 목적을 위해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨).
또 다른 측면에 따르면, 알로스테릭 단백질은 이펙터 결합 도메인 및 DNA 결합 도메인이 동일한 폴리펩티드 쇄에 있지 않는 경우, 예를 들어 2-성분 시스템 또는 핵 호르몬 수용체를 포함한다. 이펙터 결합시, 이펙터 결합 도메인은 1종 이상의 중간 단백질을 통해 신호를 전달하며, 이는 규정된 유전자좌에서의 전사 조절을 발생시킨다.
추가 측면에 따르면, 외인성으로 제공되는 형질전환된 알로스테릭 이펙터는 알로스테릭 단백질에 해독제의 생산이 촉진되도록 하는 방식으로 결합한다. 한 측면에 따르면, 해독제의 생산은 알로스테릭 단백질에 결합된 알로스테릭 이펙터의 양에 비례한다. 알로스테릭 이펙터의 부재 하에, 알로스테릭 단백질은 해독제의 생산을 방지한다.
본 발명의 특정 측면에서, 1종 이상의 알로스테릭 단백질은 미생물에서 1종 이상의 검출가능한 마커의 발현을 제어하는데 사용된다. 특정 측면에서, 1종 이상의 검출가능한 마커는 독소 선택과 함께 사용된다. 다른 측면에서, 1종 이상의 검출가능한 마커는 독립형 검출 기술로서 사용된다. 특정 측면에서, 알로스테릭 단백질 및/또는 알로스테릭 이펙터는 검출가능하게 표지될 수 있는 마커 (예를 들면, 검출가능한 마커) 또는 모이어티 (예를 들면, 아미노산 서열 또는 핵산 서열)의 발현을 제어한다.
검출가능한 마커의 예는 다양한 방사성 모이어티, 효소, 보결분자단, 형광 마커, 발광 마커, 생물발광 마커, 금속 입자, 단백질-단백질 결합 쌍, 단백질-항체 결합 쌍 등을 포함한다. 검출가능한 마커는 다양한 공급처로부터 상업적으로 입수가능하다.
본 발명의 특정 측면에서, 검출가능한 단백질 및/또는 단백질 태그가 제공된다. 검출가능한 형광 단백질의 예는 황색 형광 단백질 (YFP), 녹색 형광 단백질 (GFP), 시안 형광 단백질 (CFP), 움벨리페론, 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 디클로로트리아지닐아민 플루오레세인, 단실 클로라이드, 피코에리트린 등을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 검출가능한 생물발광 단백질의 예는 루시페라제 (예를 들면, 박테리아, 반딧불이, 방아벌레 등), 루시페린, 에쿼린 등을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 검출가능한 효소 시스템의 예는 갈락토시다제, 글루쿠로니다제, 포스파타제, 퍼옥시다제, 콜린에스테라제 등을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
비오틴 또는 그의 유도체는 또한 검출가능한 표지로서 사용되고, 후속적으로 검출가능하게 표지된 아비딘/스트렙타비딘 유도체 (예를 들면, 피코에리트린-접합된 스트렙타비딘) 또는 검출가능하게 표지된 항-비오틴 항체에 의해 결합될 수 있다. 디곡시게닌은 발현되고 후속적으로 검출가능하게 표지된 항-디곡시게닌 항체 (예를 들면, 플루오레세인화 항-디곡시게닌)에 의해 결합될 수 있다. 일반적으로, 접합체 쌍의 임의의 구성원은 검출가능하게 표지된 접합체 파트너가 검출을 허용하도록 결합될 수 있다면 검출 올리고뉴클레오티드에 혼입될 수 있다. 본원에 사용된 용어 항체는 임의의 부류의 항체 분자 또는 그의 임의의 하위단편, 예컨대 Fab를 지칭한다.
검출을 위한 다른 적합한 표지는 1종 이상의 단백질 태그를 포함한다. 본원에 사용된 용어 "단백질 태그"는 본 발명의 폴리머라제에 연결된 이종 폴리펩티드 서열을 지칭한다. 단백질 태그는 Avi 태그 (GLNDIFEAQKIEWHE) (서열식별번호: 1), 칼모듈린 태그 (KRRWKKNFIAVSAANRFKKISSSGAL) (서열식별번호: 2), FLAG 태그 (DYKDDDDK) (서열식별번호: 3), HA 태그 (YPYDVPDYA) (서열식별번호: 4), His 태그 (HHHHHH) (서열식별번호: 5), Myc 태그 (EQKLISEEDL) (서열식별번호: 6), S 태그 (KETAAAKFERQHMDS) (서열식별번호: 7), SBP 태그 (MDEKTTGWRGGHVVEGLAGELEQLRARLEHHPQGQREP) (서열식별번호: 8), 소프태그(Softag) 1 (SLAELLNAGLGGS) (서열식별번호: 9), 소프태그 3 (TQDPSRVG) (서열식별번호: 17), V5 태그 (GKPIPNPLLGLDST) (서열식별번호: 10), 엑스프레스(Xpress) 태그 (DLYDDDDK) (서열식별번호: 11), 이소펩태그(Isopeptag) (TDKDMTITFTNKKDAE) (서열식별번호: 12), 스피태그(SpyTag) (AHIVMVDAYKPTK) (서열식별번호: 13), 스트렙탁틴 태그 (스트렙-태그(Strep-tag) II: WSHPQFEK) (서열식별번호: 14) 등을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
사용되는 검출 방법(들)은 미생물에 사용되는 특정한 검출가능한 표지에 좌우될 것이다. 특정의 예시적인 실시양태에서, 미생물은 현미경, 분광광도계, 튜브 발광측정기 또는 플레이트 발광측정기, X선 필름, 자장, 신틸레이터, 형광 활성화 세포 분류 (FACS) 장치, 마이크로유체 장치, 비드-기반 장치 등을 사용하여 선택되고/거나 스크리닝될 수 있다.
특정의 예시적인 실시양태에서, 후보 단백질 서열을 코딩하는 1개 이상의 핵산 서열은 분자 생물학의 표준 기술을 사용하여 숙주 세포에서 발현된다. 본원에 사용된 표준 재조합 DNA 및 분자 클로닝 기술은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고 문헌 [Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed.; Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, N.Y., (1989) 및 Silhavy, T.J., Bennan, M.L. and Enquist, L.W., Experiments with Gene Fusions; Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, N.Y., (1984); 및 Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley-Interscience (1987)]에 기재되며, 각각은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 추가의 유용한 방법은 문헌 [Advanced Bacterial Genetics (Davis, Roth and Botstein, Cold Spring Harbor Laboratory, 1980), Experiments with Gene Fusions (Silhavy, Berman and Enquist, Cold Spring Harbor Laboratory, 1984), Experiments in Molecular Genetics (Miller, Cold Spring Harbor Laboratory, 1972) Experimental Techniques in Bacterial Genetics (Maloy, in Jones and Bartlett, 1990), 및 A Short Course in Bacterial Genetics (Miller, Cold Spring Harbor Laboratory 1992)]을 비롯한 매뉴얼에 기재되며, 각각은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
본원에 사용된 용어 "핵산"은 DNA 분자 (예를 들면, cDNA 또는 게놈 DNA) 및 RNA 분자 (예를 들면, mRNA) 및 뉴클레오티드 유사체를 사용하여 생성된 DNA 또는 RNA의 유사체를 포함하는 것으로 의도된다. 핵산 분자는 단일-가닥 또는 이중-가닥일 수 있다.
본원에 사용된 용어 "아미노산"은 염기성 아미노기 및 산성 카르복실기 둘 다를 함유하는 유기 화합물을 포함한다. 천연 아미노산 (예를 들면, L-아미노산), 변형된 및 비통상적인 아미노산 (예를 들면, D-아미노산 및 β-아미노산)뿐만 아니라 생물학적으로 유리되거나 조합된 형태로 발생하는 것으로 알려져 있지만 통상적으로 단백질에서 발생하지 않는 아미노산이 이 용어에 포함된다. 천연 단백질 발생 아미노산은 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루탐산, 글루타민, 글리신, 히스티딘, 이소류신, 류신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 세린, 트레오닌, 티로신, 트립토판, 프롤린, 및 발린을 포함한다. 천연 비-단백질 아미노산은 아르기노숙신산, 시트룰린, 시스테인 술핀산, 3,4-디히드록시페닐알라닌, 호모시스테인, 호모세린, 오르니틴, 3-모노아이오도티로신, 3,5-디아이오도티로신, 3,5,5-트리아이오도티로신, 및 3,3',5,5'-테트라아이오도티로닌을 포함한다. 변형된 또는 비통상적인 아미노산은 D-아미노산, 히드록시리신, 4-히드록시프롤린, N-Cbz-보호된 아미노산, 2,4-디아미노부티르산, 호모아르기닌, 노르류신, N-메틸아미노부티르산, 나프틸알라닌, 페닐글리신, .알파.-페닐프롤린, tert-류신, 4-아미노시클로헥실알라닌, N-메틸-노르류신, 3,4-데히드로프롤린, N,N-디메틸아미노글리신, N-메틸아미노글리신, 4-아미노피페리딘-4-카르복실산, 6-아미노카프로산, 트랜스-4-(아미노메틸)-시클로헥산카르복실산, 2-, 3-, 및 4-(아미노메틸)-벤조산, 1-아미노시클로펜탄카르복실산, 1-아미노시클로프로판카르복실산, 및 2-벤질-5-아미노펜탄산을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "펩티드"는 펩티드 결합에 의해 연결된 2개 이상의 아미노산으로 이루어진 화합물을 포함한다. 펩티드는 10,000 달톤 미만, 5,000 달톤 미만, 또는 2,500 달톤 미만의 분자량을 가질 수 있다. 용어 "펩티드"는 또한 펩티드 및 비-펩티드 성분, 예컨대 슈도펩티드 또는 펩티드모방체 잔기 또는 다른 비-아미노산 성분 둘 다를 함유하는 화합물을 포함한다. 펩티드 및 비-펩티드 성분 둘 다를 함유하는 이러한 화합물은 또한 "펩티드 유사체"로 지칭될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "단백질"은, 선형 쇄 내에 배열되고 인접한 아미노산 잔기의 카르복실기와 아미노기 사이의 펩티드 결합에 의해 함께 연결된 아미노산으로 이루어진 화합물을 포함한다.
미생물은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 방법에 의해 유전자를 결실되거나 유전자가 혼입되도록 유전자 변형될 수 있다. 다양한 숙주 세포의 형질전환에 유용한 벡터 및 플라스미드는 통상적이고, 인비트로젠 코포레이션(Invitrogen Corp.) (캘리포니아주 칼스배드), 스트라타진(Stratagene) (캘리포니아주 라 졸라), 뉴잉글랜드 바이오랩스, 인크.(New England Biolabs, Inc.) (매사추세츠주 비벌리) 및 애드진(Addgene) (매사추세츠주 캠브리지)과 같은 회사로부터 상업적으로 입수가능하다.
본 발명의 특정 측면은 벡터, 예컨대, 예를 들어 발현 벡터에 관한 것이다. 본원에 사용된 용어 "벡터"는 이와 연결된 또 다른 핵산을 수송할 수 있는 핵산 서열을 지칭한다. 한 유형의 벡터는 "플라스미드"이며, 이는 추가의 DNA 절편이 라이게이션될 수 있는 원형 이중 가닥 DNA 루프를 지칭한다. 또 다른 유형의 벡터는 바이러스 벡터이며, 여기서 추가의 DNA 절편은 바이러스 게놈으로 라이게이션될 수 있다. 비제한적으로 예를 들어, 본 발명의 벡터는 BAC (박테리아 인공 염색체), 포스미드, 코스미드, 플라스미드, 자살 플라스미드, 셔틀 벡터, P1 벡터, 에피솜, YAC (효모 인공 염색체), 박테리오파지 또는 바이러스 게놈, 또는 임의의 다른 적합한 벡터를 포함하나 이에 제한되지는 않는 단일-카피 또는 다중-카피 벡터일 수 있다. 숙주 세포는 벡터가 복제될 수 있는 임의의 세포 (원핵 또는 진핵 세포 포함)일 수 있다.
특정 벡터는 그들이 도입되는 숙주 세포에서 자율 복제될 수 있다 (예를 들면, 박테리아 복제 기점을 갖는 박테리아 벡터 및 에피솜 포유동물 벡터). 다른 벡터 (예를 들면, 비-에피솜 포유동물 벡터)는 숙주 세포에의 도입시 숙주 세포의 게놈 내로 통합되고, 그에 따라 숙주 게놈과 함께 복제된다. 더욱이, 특정 벡터는 그들이 작동가능하게 연결된 유전자의 발현을 지시할 수 있다. 이러한 벡터는 "발현 벡터"로 본원에서 지칭된다. 일반적으로, 재조합 DNA 기술에서 유용한 발현 벡터는 종종 플라스미드의 형태이다. 본 명세서에서, "플라스미드" 및 "벡터"는 상호교환가능하게 사용될 수 있다. 그러나, 본 발명은 동등한 기능을 하는 이러한 다른 형태의 발현 벡터, 예컨대 바이러스 벡터 (예를 들면, 복제 결함 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노-연관 바이러스)를 포함하는 것으로 의도된다.
특정의 예시적인 실시양태에서, 본원에 기재된 외인성 핵산은 박테리아 발현 벡터, 예컨대, 예를 들면 포스미드를 사용하여 박테리아 세포에서 발현된다. 포스미드는 박테리아 F-플라스미드에 기초한 클로닝 벡터이다. 유도성 높은-카피 ori가, 보다 높은 카피수가 수득될 수 있도록 포함될 수 있지만, 숙주 박테리아는 전형적으로 단지 하나의 포스미드 분자를 함유할 것이다 (예를 들면, pCC1FOS™, pCC2FOS™). 포스미드 라이브러리는 특히 복잡한 게놈으로부터 안정한 라이브러리를 구축하는데 유용하다. 포스미드 및 포스미드 라이브러리 생산 키트는 상업적으로 입수가능하다 (에피센터® 바이오테크놀로지스(EPICENTRE® Biotechnologies), 위스콘신주 매디슨). 원핵 및 진핵 세포 둘 다를 위한 다른 적합한 발현 시스템에 대해 문헌 [Sambrook, J., Fritsh, E. F., and Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989]의 챕터 16 및 17을 참조한다.
특정의 예시적인 실시양태에서, 재조합 발현 벡터는 핵산 서열을 숙주 세포에서의 핵산 서열의 발현에 적합한 형태로 포함하며, 이는 재조합 발현 벡터가, 발현을 위해 사용될 숙주 세포에 기초하여 선택된, 발현될 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 1개 이상의 조절 서열을 포함한다는 것을 의미한다. 재조합 발현 벡터 내에서, "작동가능하게 연결된"은 본원에 기재된 복수의 리보핵산 서열을 코딩하는 외래 핵산 서열이 조절 서열(들)에 핵산 서열의 발현을 허용하는 방식으로 연결된다는 것을 의미하도록 의도된다. 용어 "조절 서열"은 프로모터, 인핸서 및 다른 발현 제어 요소 (예를 들면, 폴리아데닐화 신호)를 포함하는 것으로 의도된다. 이러한 조절 서열은, 예를 들어 문헌 [Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990)]에 기재되어 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 발현 벡터의 설계가 형질전환될 숙주 세포의 선택, 목적하는 단백질의 발현 수준 등과 같은 인자에 좌우될 수 있음을 알 것이다.
본 발명의 또 다른 측면은 본 발명의 재조합 발현 벡터가 도입된 숙주 세포에 관한 것이다. 용어 "숙주 세포" 및 "재조합 숙주 세포"는 본원에서 상호교환가능하게 사용된다. 이러한 용어는 특정한 대상 세포뿐만 아니라 이러한 세포의 자손 또는 잠재적 자손을 지칭하는 것으로 이해된다. 특정 변형이 돌연변이 또는 환경적 영향으로 인해 다음 세대에서 발생할 수 있기 때문에, 사실상 이러한 자손은 모 세포와 동일하지 않을 수 있지만, 이는 여전히 본원에 사용된 용어의 범주 내에 포함된다.
본 개시내용에 따른 세포는 외래 핵산이 본원에 기재된 바와 같이 도입되고 발현될 수 있는 임의의 세포를 포함한다. 본원에 기재된 본 개시내용의 기본 개념은 세포 유형에 제한되지 않는 것으로 이해되어야 한다. 본 개시내용에 따른 세포는 진핵 세포, 원핵 세포, 동물 세포, 식물 세포, 곤충 세포, 진균 세포, 고세균 세포, 진정세균 세포, 비리온, 비로솜, 바이러스-유사 입자, 기생 미생물, 감염성 단백질 등을 포함한다. 세포는 진핵 세포, 예컨대 효모 세포, 식물 세포, 및 동물 세포를 포함한다. 특정한 세포는 박테리아 세포를 포함한다. 다른 적합한 세포는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있다.
외래 핵산 (즉, 세포의 천연 핵산 조성물의 부분이 아닌 것들)은 이러한 도입을 위해 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 임의의 방법을 사용하여 세포에 도입될 수 있다. 이러한 방법은 겔, 오일, 또는 크림에서의 핵산의 적용에 의한, 전기천공에 의한, 지질-기반 형질감염 시약을 사용하여, 또는 임의의 다른 적합한 형질감염 방법에 의한 형질감염, 형질도입, 감염 (예를 들면, 바이러스 형질도입), 주사, 미세주사, 유전자 총, 뉴클레오펙션, 나노입자 충돌, 형질전환, 접합을 포함한다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 용이하게 확인가능한 문헌 공급원을 사용하여 이러한 방법을 용이하게 이해하고 적응할 것이다.
본원에 사용된 용어 "형질전환" 및 "형질감염"은 외래 핵산을 숙주 세포에 도입시키기 위한 다양한 관련 기술분야-인식 기술 (인산칼슘 또는 염화칼슘 공-침전, DEAE-덱스트란-매개 형질감염, 리포펙션 (예를 들면, 상업적으로 입수가능한 시약, 예컨대, 예를 들어 리포펙틴(LIPOFECTIN)® (인비트로젠 코포레이션, 캘리포니아주 샌디에고), 리포펙타민(LIPOFECTAMINE)® (인비트로젠), 퓨진(FUGENE)® (로슈 어플라이드 사이언스(Roche Applied Science), 스위스 바젤), 제트페이(JETPEI)TM (폴리플러스-트랜스펙션 인크.(Polyplus-transfection Inc.), 뉴욕주 뉴욕), 이펙텐(EFFECTENE)® (퀴아젠(Qiagen), 캘리포니아주 발렌시아), 드림펙트(DREAMFECT)TM (오지 바이오사이언시스(OZ Biosciences), 프랑스) 등), 또는 전기천공 (예를 들면, 생체내 전기천공) 포함)을 지칭하는 것으로 의도된다. 숙주 세포를 형질전환시키거나 형질감염시키기 위한 적합한 방법은 문헌 [Sambrook, et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd, ed., Cold Spring harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989)] 및 다른 실험실 매뉴얼에서 찾아볼 수 있다.
전형적으로, 벡터 또는 플라스미드는 관련 유전자 또는 유전자들, 선택 마커, 및 자율 복제 또는 염색체 통합을 허용하는 서열의 전사 및 번역을 지시하는 서열을 함유한다. 적합한 벡터는 전사 개시 제어를 보유하는 유전자의 5' 영역 및 전사 종결을 제어하는 DNA 단편의 3' 영역을 포함한다. 제어 영역 둘 다는 형질전환된 숙주 세포와 상동인 유전자로부터 유래될 수 있지만, 이러한 제어 영역은 또한 생산 숙주로서 선택된 종에 대해 천연이 아닌 유전자로부터 유래될 수 있음이 이해되어야 한다.
목적하는 숙주 세포에서 관련 경로 코딩 영역의 발현을 유도하는데 유용한 개시 제어 영역 또는 프로모터는 많고, 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 친숙하다. 실질적으로, lac, ara, tet, trp, IPL, IPR, T7, tac, 및 trc (에스케리키아 콜라이 및 슈도모나스(Pseudomonas)에서의 발현에 유용함); 바실루스 서브틸리스 및 바실루스 리케니포르미스(Bacillus licheniformis)에서의 발현에 유용한 amy, apr, npr 프로모터 및 다양한 파지 프로모터; nisA (그람 양성 박테리아에서의 발현에 유용함, 문헌 [Eichenbaum et al. Appl. Environ. Microbiol. 64(8):2763-2769 (1998)]); 및 합성 P11 프로모터 (락토바실루스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)에서의 발현에 유용함, 문헌 [Rud et al., Microbiology 152:1011-1019 (2006)])를 포함하나 이에 제한되지는 않는, 이들 유전 요소를 유도할 수 있는 임의의 프로모터가 본 발명에 적합하다. 종결 제어 영역은 또한 바람직한 숙주에 대해 천연인 다양한 유전자로부터 유래될 수 있다.
특정 벡터는 광범위한 숙주 박테리아에서 복제될 수 있고, 접합에 의해 전달될 수 있다. pRK404 및 3종의 관련 벡터-pRK437, pRK442, 및 pRK442(H)의 완전 및 주석달린 서열이 이용가능하다. 이들 유도체는 그람 음성 박테리아에서 유전자 조작을 위한 가치 있는 도구인 것으로 입증되었다 (Scott et al., Plasmid 50(1):74-79 (2003)). 광범위한-숙주-범위 인크(Inc) P4 플라스미드 RSF1010의 여러 플라스미드 유도체는 또한 소정 범위의 그람 음성 박테리아에서 기능할 수 있는 프로모터와 함께 이용가능하다. 플라스미드 pAYC36 및 pAYC37은 다중 클로닝 부위와 함께 활성 프로모터를 가져, 그람 음성 박테리아에서 이종 유전자 발현을 허용한다.
염색체 유전자 대체 도구가 또한 광범위하게 이용가능하다. 예를 들어, 광범위한-숙주-범위 레플리콘 pWV101의 감열성 변이체는 소정 범위의 그람 양성 박테리아에서 유전자 대체를 발생시키는데 사용될 수 있는 플라스미드 pVE6002를 구축하도록 변형되었다 (Maguin et al., J. Bacteriol. 174(17):5633-5638 (1992)). 추가적으로, 시험관내 트랜스포좀은 상업적 공급원, 예컨대 에피센터® (위스콘신주 매디슨)로부터 다양한 게놈의 무작위 돌연변이를 생성하는데 이용가능하다.
이. 콜라이(E. coli)의 형질전환에 유용한 벡터는 통상적이고 상업적으로 입수가능하다. 예를 들어, 목적하는 유전자는 다양한 공급원으로부터 단리되고, 변형된 pUC19 벡터 상에 클로닝되고, 이. 콜라이 숙주 세포로 형질전환될 수 있다. 대안적으로, 목적하는 생합성 경로를 코딩하는 유전자는 다중 오페론으로 나뉘어지고, 발현 벡터로 클로닝되고, 다양한 이. 콜라이 균주로 형질전환될 수 있다.
락토바실루스(Lactobacillus) 속은 락토바실랄레스(Lactobacillales) 과에 속하고, 바실루스 서브틸리스 및 스트렙토코쿠스(Streptococcus)의 형질전환에 사용되는 다수의 플라스미드 및 벡터가 락토바실루스에 사용될 수 있다. 적합한 벡터의 비제한적 예는 pAM 1 및 그의 유도체 (Renault et al., Gene 183:175-182 (1996); 및 O'Sullivan et al., Gene 137:227-231 (1993)); pMBB1 및 pHW800, pMBB1의 유도체 (Wyckoff et al. Appl. Environ. Microbiol. 62:1481-1486 (1996)); pMG1, 접합 플라스미드 (Tanimoto et al., J. Bacteriol. 184:5800-5804 (2002)); pNZ9520 (Kleerebezem et al., Appl. Environ. Microbiol. 63:4581-4584 (1997)); pAM401 (Fujimoto et al., Appl. Environ. Microbiol. 67:1262-1267 (2001)); 및 pAT392 (Arthur et al., Antimicrob. Agents Chemother. 38:1899-1903 (1994))를 포함한다. 락토바실루스 플란타룸으로부터의 여러 플라스미드가 또한 보고되었으며 (van Kranenburg R, Golic N, Bongers R, Leer R J, de Vos W M, Siezen R J, Kleerebezem M. Appl. Environ. Microbiol. 2005 March; 71(3): 1223-1230), 이는 형질전환에 사용될 수 있다.
목적하는 락토바실루스 숙주 세포에서 관련 경로 코딩 영역의 발현을 유도하는데 유용한 개시 제어 영역 또는 프로모터는 락토바실루스 또는 다른 락트산 박테리아, 또는 다른 그람 양성 유기체로부터 수득될 수 있다. 비제한적 예는 락토코쿠스(Lactococcus)로부터의 nisA 프로모터이다. 종결 제어 영역은 또한 바람직한 숙주 또는 관련 박테리아에 천연인 다양한 유전자로부터 유래될 수 있다.
목적하는 생합성 또는 다른 목적하는 경로를 위한 다양한 유전자는 임의의 적합한 벡터, 예컨대 상기 기재된 것에 조립될 수 있다. 코돈은 숙주 균주, 예컨대 락토바실루스 플란타룸 또는 락토바실루스 아리조넨시스(Lactobacillus arizonensis)의 게놈 서열로부터 추론된 코돈 인덱스에 기초하여 발현에 대해 최적화될 수 있다. 플라스미드는 하기 참고문헌 중 어느 하나에 기재된 바와 같이 관련 기술분야에 공지된 방법, 예컨대 전기천공을 사용하여 숙주 세포에 도입될 수 있다: Cruz-Rodz et al. (Molecular Genetics and Genomics 224:1252-154 (1990)), Bringel and Hubert (Appl. Microbiol. Biotechnol. 33: 664-670 (1990)), 및 Teresa Alegre, Rodriguez and Mesas (FEMS Microbiology Letters 241:73-77 (2004)). 플라스미드는 또한 접합에 의해 락토바실루스 플란타룸에 도입될 수 있다 (Shrago, Chassy and Dobrogosz Appl. Environ. Micro. 52: 574-576 (1986)). 목적하는 생합성 경로 유전자는 또한 통합 벡터를 사용하여 락토바실루스의 염색체 내로 통합될 수 있다 (Hols et al. Appl. Environ. Micro. 60:1401-1403 (1990); Jang et al. Micro. Lett. 24:191-195 (2003)).
숙주 세포로서의 역할을 할 수 있고, 본원에 기재된 바와 같이 재조합 미생물을 생산하도록 유전자 변형될 수 있는 미생물은 그람 양성 박테리아, 그람 음성 박테리아, 항산성 박테리아 등을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
본원에 사용된 그람 양성 박테리아는 악티노마두라에(Actinomadurae), 악티노미세스 이스라엘리이(Actinomyces israelii), 바실루스 안트라시스(Bacillus anthracis), 바실루스 세레우스(Bacillus cereus), 클로스트리디움 보툴리눔(Clostridium botulinum), 클로스트리디움 디피실레(Clostridium difficile), 클로스트리디움 페르프린겐스(Clostridium perfringens), 클로스트리디움 테타니(Clostridium tetani), 코리네박테리움(Corynebacterium), 엔테로코쿠스 파에칼리스(Enterococcus faecalis), 리스테리아 모노시토게네스(Listeria monocytogenes), 노카르디아(Nocardia), 프로피오니박테리움 아크네스(Propionibacterium acnes), 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 스타필로코쿠스 에피덤(Staphylococcus epiderm), 스트렙토코쿠스 뮤탄스(Streptococcus mutans), 스트렙토코쿠스 뉴모니아에(Streptococcus pneumoniae) 등을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
본원에 사용된, 그람 음성 박테리아는 아피피아 펠리스(Afipia felis), 박테리오데스(Bacteriodes), 바르토넬라 바실리포르미스(Bartonella bacilliformis), 보르데텔라 페르투시스(Bordetella pertussis), 보렐리아 부르그도르페리(Borrelia burgdorferi), 보렐리아 레쿠렌티스(Borrelia recurrentis), 브루셀라(Brucella), 칼림마토박테리움 그라눌로마티스(Calymmatobacterium granulomatis), 캄필로박터(Campylobacter), 에스케리키아 콜라이, 프란시셀라 툴라렌시스(Francisella tularensis), 가르드네렐라 바기날리스(Gardnerella vaginalis), 헤모필루스 아에깁티우스(Haemophilus aegyptius), 헤모필루스 두크레이이(Haemophilus ducreyi), 헤모필루스 인플루엔자에(Haemophilus influenzae), 헬리오박터 필로리(Heliobacter pylori), 레지오넬라 뉴모필라(Legionella pneumophila), 렙토스피라 인테로간스(Leptospira interrogans), 네이세리아 메닌기티디아(Neisseria meningitidia), 포르피로모나스 긴기발리스(Porphyromonas gingivalis), 프로비덴시아 스투르티(Providencia sturti), 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 살모넬라 엔테리디스(Salmonella enteridis), 살모넬라 티피(Salmonella typhi), 세라티아 마르세센스(Serratia marcescens), 시겔라 보이디이(Shigella boydii), 스트렙토바실루스 모닐리포르미스(Streptobacillus moniliformis), 스트렙토코쿠스 피오게네스(Streptococcus pyogenes), 트레포네마 팔리둠(Treponema pallidum), 비브리오 콜레라에(Vibrio cholerae), 예르시니아 엔테로콜리티카(Yersinia enterocolitica), 예르시니아 페스티스(Yersinia pestis) 등을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
본원에 사용된 항산성 박테리아는 미오박테리움 아비움(Myobacterium avium), 미오박테리움 레프라에(Myobacterium leprae), 미오박테리움 투베르쿨로시스(Myobacterium tuberculosis) 등을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
본원에 사용된, 다른 3가지 카테고리에 속하지 않는 다른 박테리아는 바르토넬라 헨셀라에(Bartonella henselae), 클라미디아 프시타시(Chlamydia psittaci), 클라미디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis), 콕시엘라 부르네티이(Coxiella burnetii), 미코플라스마 뉴모니아에(Mycoplasma pneumoniae), 리케치아 아카리(Rickettsia akari), 리케치아 프로와제키이(Rickettsia prowazekii), 리케치아 리케치이(Rickettsia rickettsii), 리케치아 츠츠가무시(Rickettsia tsutsugamushi), 리케치아 티피(Rickettsia typhi), 우레아플라스마 우레아리티쿰(Ureaplasma urealyticum), 디플로코쿠스 뉴모니아에(Diplococcus pneumoniae), 에를리키아 샤펜시스(Ehrlichia chafensis), 엔테로코쿠스 파에시움(Enterococcus faecium), 메닝고코쿠스(Meningococcus) 등을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
특정 측면에서, 숙주 세포로서의 역할을 할 수 있고, 본원에 기재된 바와 같이 재조합 미생물을 생산하도록 유전자 변형될 수 있는 미생물은 클로스트리디움(Clostridium), 에스케리키아(Escherichia), 로도코쿠스(Rhodococcus), 슈도모나스, 바실루스(Bacillus), 락토바실루스(Lactobacillus), 사카로미세스(Saccharomyces), 및 엔테로코쿠스(Enterococcus) 속을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 특히 적합한 미생물은 에스케리키아 콜라이, 바실루스 서브틸리스 및 사카로미세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae)를 포함한다.
본 발명의 특정 측면에 따르면, 파지 및 그의 유전 물질이 제공된다. 본원에 사용된 용어 "파지" 및 "박테리오파지"는 상호교환가능하게 사용된다. 파지는 그들의 유전자 조성 및/또는 그들의 비리온 형태학에 기초하여 서로 구별될 수 있다. 코르티코비리다에(corticoviridae), 리포트릭스비리다에(lipothrixviridae), 플라스마비리다에(plasmaviridae), 미오비리다에(myoviridae), 시포비리다에(siphoviridae), 술폴로부스 시베이트(sulfolobus shibate), 포도비리다에(podoviridae), 텍티비리다에(tectiviridae) 및 푸셀로비리다에(fuselloviridae) 과의 파지를 비롯한 일부 파지는 이중 가닥 DNA 게놈을 갖는다. 미크로비리다에(microviridae) 및 이노비리다에(inoviridae) 과의 파지를 비롯한 다른 파지는 단일 가닥 DNA 게놈을 갖는다. 레비비리다에(leviviridae) 및 시스토비리다에(cystoviridae) 과의 파지를 비롯한 다른 파지는 RNA 게놈을 갖는다. 예시적인 박테리오파지는 Wphi, Mu, T1, T2, T3, T4, T5, T6, T7, P1, P2, P4, P22, fd, phi6, phi29, phiC31, phi80, phiX174, SP01, M13, MS2, PM2, SSV-1, L5, PRD1, Q베타, 람다, UC-1, HK97, HK022 등을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
특정의 예시적인 실시양태에 따르면, 본원에 기재된 하나 또는 복수의 알로스테릭 단백질을 코딩하는 핵산이 부착된 마이크로어레이가 제공된다. 본원에 사용된 "마이크로어레이"는 한 실시양태에서, 고정화된 혼성화 프로브를 각각 함유하는 공간상 규정된 비-중첩 영역 또는 부위의 어레이가 있는 실질적으로 편평한 표면을 갖는 고체 상 지지체를 포함하는 멀티플렉스 검정 제품의 유형을 지칭한다. "실질적으로 편평한"은 표면 상의 관심 특색 또는 대상, 예컨대 프로브 부위가, 표면 위 또는 아래로 연장되고 그의 치수가 표면의 치수와 비교해서 작은 부피를 차지할 수 있다는 것을 의미한다. 예를 들어, 광섬유 다발의 겉면 상에 배치된 비드는 프로브 부위의 실질적으로 편평한 표면을 생성하거나, 다공성 평면 기재 상에 배치된 또는 이 상에서 합성된 올리고뉴클레오티드는 실질적으로 편평한 표면을 생성한다. 공간상 규정된 부위는 그의 위치 및 그 위치에서의 고정화 프로브의 정체가 공지되어 있거나 결정가능하다는 점에서 추가적으로 "어드레스가능"할 수 있다. 마이크로어레이 상에 고정화된 프로브는 검정 반응에서 또는 검정 반응으로부터 생성되는 핵산, 예컨대 올리고뉴클레오티드 바코드를 포함한다. 전형적으로, 마이크로어레이 상의 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드는 단일 가닥이고, 통상적으로 5'-말단 또는 3'-말단에 의해 고체 상 지지체에 공유 부착된다. 마이크로어레이 중 핵산을 함유하는 비-중첩 영역의 밀도는 전형적으로 100/㎠ 초과, 보다 바람직하게는 1000/㎠ 초과이다. 핵산 프로브와 관련된 마이크로어레이 기술은 하기 예시적인 참고문헌에서 검토된다: Schena, Editor, Microarrays: A Practical Approach (IRL Press, Oxford, 2000); Southern, Current Opin. Chem. Biol., 2: 404-410 (1998); Nature Genetics Supplement, 21:1-60 (1999); 및 미국 특허 번호 5,424,186; 5,445,934; 및 5,744,305 (Fodor et al.). 마이크로어레이는 단독으로, 또는 평면 표면 상에 또는 웰 또는 비드를 분리하는데 사용될 수 있는 다른 물리적 구성성분 내에 배치된 마이크로비드 또는 다른 마이크로입자의 어레이를 포함할 수 있다. 하기 예시적인 참고문헌에 개시된 바와 같이, 이러한 마이크로어레이는 다양한 방법으로 형성될 수 있다: 문헌 [Brenner et al. (2000) Nat. Biotechnol. 18:630]; 미국 특허 번호 6,133,043 (Tulley et al.); 미국 특허 번호 6,396,995 (Stuelpnagel et al.); 미국 특허 번호 6,544,732 (Chee et al.) 등. 하나의 포맷에서, 마이크로어레이는, 예를 들면 미국 특허 공개 번호 2003/0096239 (Gunderson et al.)에 의해 개시된 바와 같이, 표면 상에 부착된 올리고뉴클레오티드를 갖는 마이크로비드를 무작위로 배치한 후 어떤 마이크로비드가 어떤 올리고뉴클레오티드를 보유하는지 디코딩 절차에 의해 결정함으로써 형성된다.
"마이크로어레이" 또는 "어레이"는 또한 지지체 매트릭스 상에 분포되어 있는 핵산 분자의 불균질 풀을 지칭할 수 있다. 핵산은 지지체에 공유 또는 비-공유 부착된다. 바람직하게는, 핵산 분자는 서로 어레이의 개별 특색의 확인을 허용하기에 충분한 거리로 이격된다. 어레이 상의 핵산은 비-중첩 또는 부분적으로 중첩일 수 있다. 핵산 풀을 지지체 매질로 전달하는 방법은 미국 특허 번호 6,432,360에 기재된다. 본원에 기재된 방법에 유용한 비드 기반 방법은 PCT US05/04373에 개시된다.
"증폭"은 어레이의 핵산 분자 또는 프라이밍된 효소적 합성의 반복 라운드를 통해 비드에 결합된 핵산 분자의 카피의 생산을 포함한다. "제자리" 증폭은 증폭이 용액 중에서 보다는 지지체 또는 비드 상에 위치한 주형 핵산 분자를 사용하여 일어남을 나타냈다. 제자리 증폭 방법은 미국 특허 번호 6,432,360에 기재된다.
"지지체"는 핵산 어레이의 핵산 분자가 배치된 매트릭스를 지칭할 수 있다. 지지체는 고체 또는 반-고체 또는 겔일 수 있다. "반-고체"는 고체 및 액체 성분 둘 다를 갖는 압축성 매트릭스를 지칭하며, 여기서 액체는 고체 매트릭스 요소 사이의 세공, 공간 또는 다른 간극을 차지한다. 반-고체 지지체는 폴리아크릴아미드, 셀룰로스, 폴리아미드 (나일론) 및 교차 연결된 아가로스, 덱스트란 및 폴리에틸렌 글리콜로부터 선택될 수 있다.
"무작위로-패턴화된" 또는 "무작위"는 지지체 상의 핵산 분자의 비-규칙적, 비-데카르트(Cartesian) 분포 (다시 말해서, 그리드의 x- 또는 y- 축을 따라서 미리-결정된 지점에 또는 규정된 "클락 포지션(clock position)" (방사 패턴의 중심으로부터의 각도 또는 반경)에 배열되지 않음)를 지칭하며, 이는 의도적인 설계 (또는 이러한 설계가 달성될 수 있는 프로그램)를 통해 또는 개별적 핵산 특색부의 배치에 의해 달성되지 않는다. 핵산의 이러한 "무작위로-패턴화된" 또는 "무작위" 어레이는 지지체 상에 핵산 분자의 풀을 포함하는 용액, 에멀젼, 에어로졸, 증기 또는 건조 제제를 적하, 분무, 플레이팅 또는 확산시키고, 핵산 분자가 지지체 상의 특정 부위로 향하도록 하는 임의의 방식으로 개입 없이 지지체 상에 핵산이 놓이도록 함으로써 달성될 수 있다. 본 발명의 어레이는 무작위로 패턴화되거나 무작위일 수 있다.
본원에 사용된 용어 "부착하다"는 공유 상호작용 및 비공유 상호작용 둘 다를 지칭한다. 공유 상호작용은 한 쌍의 전자 (즉, 단일 결합), 두 쌍의 전자 (즉, 이중 결합) 또는 세 쌍의 전자 (즉, 삼중 결합)를 공유함으로써 형성된 2개의 원자 또는 라디칼 사이의 화학적 연결이다. 공유 상호작용은 또한, 전자 쌍 상호작용 또는 전자 쌍 결합으로서 관련 기술분야에 공지되어 있다. 비공유 상호작용은 반 데르 발스(van der Waals) 상호작용, 수소 결합, 약한 화학적 결합 (즉, 단거리 비공유결합력을 통함), 소수성 상호작용, 이온 결합 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 비공유 상호작용의 검토는 문헌 [Alberts et al., in Molecular Biology of the Cell, 3d edition, Garland Publishing, 1994]에서 찾아볼 수 있다.
본 발명의 특정 측면에서, 알로스테릭 단백질을 함께 코딩하도록 1개 이상의 핵산 서열을 "스티칭"하기 위한 방법 및 조성물이 제공된다. 본원에 사용된 용어 "스티칭"은, 예를 들어 증폭 반응, 예컨대 바코드 교차 PCR, 또는 연장 반응을 통한 복수의 핵산 서열의 연결을 지칭한다.
특정 측면에서, 핵산 서열을 증폭시키는 방법이 제공된다. 핵산을 증폭시키는 예시적인 방법은 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR) (예를 들면, 문헌 [Mullis et al. (1986) Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 51 Pt 1:263 및 Cleary et al. (2004) Nature Methods 1:241]; 및 미국 특허 번호 4,683,195 및 4,683,202 참조), 앵커 PCR, RACE PCR, 라이게이션 연쇄 반응 (LCR) (예를 들면, 문헌 [Landegran et al. (1988) Science 241:1077-1080; 및 Nakazawa et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91:360-364] 참조), 자기-지속 서열 복제 (Guatelli et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87:1874), 전사 증폭 시스템 (Kwoh et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86:1173), Q-베타 레플리카제 (Lizardi et al. (1988) BioTechnology 6:1197), 순환반복 PCR (Jaffe et al. (2000) J. Biol. Chem. 275:2619; 및 Williams et al. (2002) J. Biol. Chem. 277:7790), 미국 특허 번호 6,391,544, 6,365,375, 6,294,323, 6,261,797, 6,124,090 및 5,612,199에 기재된 증폭 방법, 등온 증폭 (예를 들면, 롤링 서클 증폭 (RCA), 과분지형 롤링 서클 증폭 (HRCA), 가닥 치환 증폭 (SDA), 헬리카제-의존성 증폭 (HDA), PWGA) 또는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지된 기술을 사용하는 임의의 다른 핵산 증폭 방법, 폴리머라제 및/또는 리가제 연쇄 반응 - 열 사이클링 (PCR) 또는 등온 (예를 들면, RCA, hRCA, SDA, HDA, PWGA (www:biohelix.com/technology.asp))을 포함한다.
PCR은 DNA의 상보적 가닥의 동시 프라이머 연장에 의한 특정한 DNA 서열의 시험관내 증폭을 위한 반응을 지칭한다. 다시 말해서, PCR은 프라이머 결합 부위에 의해 플랭킹된 표적 핵산의 다중 카피 또는 복제물을 만들기 위한 반응이며, 이러한 반응은 하기 단계 중 하나 이상의 반복을 포함한다: (i) 표적 핵산을 변성시키는 단계, (ii) 프라이머를 프라이머 결합 부위에 어닐링시키는 단계, 및 (iii) 프라이머를 뉴클레오시드 트리포스페이트의 존재 하에 핵산 폴리머라제에 의해 연장시키는 단계. 통상적으로, 반응은 열 사이클러 기기에서 각 단계에 대해 최적화된 상이한 온도를 통해 사이클링된다. 특정한 온도, 각 단계에서의 지속시간, 및 단계들 간의 변화 속도는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지된 다수의 인자에 좌우되며, 예를 들면 다음 참고문헌에 예시되어 있다: McPherson et al., editors, PCR: A Practical Approach and PCR2: A Practical Approach (IRL Press, Oxford, 각각 1991 및 1995). 예를 들어, Taq DNA 폴리머라제를 사용하는 통상적인 PCR에서는, 이중 가닥 표적 핵산은 90℃ 초과의 온도에서 변성될 수 있고, 프라이머는 50-75℃ 범위의 온도에서 어닐링될 수 있고, 프라이머는 72-78℃ 범위의 온도에서 연장될 수 있다.
용어 "PCR"은 반응의 파생 형태를 포괄하며, 이는 RT-PCR, 실시간 PCR, 네스티드 PCR, 정량적 PCR, 멀티플렉스화 PCR 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 반응 부피는 수백 나노리터, 예를 들면 200 nL 내지 수백 마이크로리터, 예를 들면 200 μL의 범위이다. "역전사 PCR" 또는 "RT-PCR"은 먼저 표적 RNA를 상보적 단일 가닥 DNA로 전환시키는 역전사 반응 후에 증폭시키는 PCR을 의미한다 (예를 들면, 미국 특허 번호 5,168,038 (Tecott et al.)). "실시간 PCR"은 반응이 진행됨에 따라 반응 생성물, 즉 앰플리콘의 양이 모니터링되는 PCR을 의미한다. 주로 반응 생성물을 모니터링하는데 사용되는 검출 화학이 상이한 다수의 형태의 실시간 PCR이 존재한다 (예를 들면, 미국 특허 번호 5,210,015 (Gelfand et al.) ("택맨(Taqman)"); 미국 특허 번호 6,174,670 및 6,569,627 (Wittwer et al.) (삽입 염료); 미국 특허 번호 5,925,517 (Tyagi et al.) (분자 비콘)). 실시간 PCR을 위한 검출 화학은 문헌 [Mackay et al., Nucleic Acids Research, 30:1292-1305 (2002)]에서 검토된다. "네스티드 PCR"은 2-단계 PCR을 의미하며, 여기서 제1 PCR의 앰플리콘이 새로운 프라이머 세트 (이들 중 적어도 하나는 제1 앰플리콘의 내부 위치에 결합됨)를 사용하여 제2 PCR을 위한 샘플이 된다. 네스티드 증폭 반응과 관련하여 본원에 사용된 "초기 프라이머"는 제1 앰플리콘을 생성시키는데 사용된 프라이머를 의미하고, "2차 프라이머"는 제2 앰플리콘 또는 네스티드 앰플리콘을 생성시키는데 사용된 1개 이상의 프라이머를 의미한다. "멀티플렉스화 PCR"은 다중 표적 서열 (또는 단일 표적 서열 및 1개 이상의 참조 서열)이 동일한 반응 혼합물에서 동시에 수행되는 PCR을 의미한다 (예를 들면, 문헌 [Bernard et al. (1999) Anal. Biochem., 273:221-228] (2-색 실시간 PCR)). 통상적으로, 증폭되는 각 서열에 별개의 프라이머 세트가 사용된다. "정량적 PCR"은 샘플 또는 표본 중의 1개 이상의 특정한 표적 서열의 존재량을 측정하도록 설계된 PCR을 의미한다. 정량적 PCR은 이러한 표적 서열의 절대적 정량화 및 상대적 정량화 둘 다를 포함한다. 정량적 PCR을 위한 기술은 하기 참고문헌에 예시된 바와 같이 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다: Freeman et al., Biotechniques, 26:112-126 (1999); Becker-Andre et al., Nucleic Acids Research, 17:9437-9447 (1989); Zimmerman et al., Biotechniques, 21:268-279 (1996); Diviacco et al., Gene, 122:3013-3020 (1992); Becker-Andre et al., Nucleic Acids Research, 17:9437-9446 (1989) 등.
기재된 본 발명의 실시양태는 본 발명의 원리의 적용 중 일부를 단지 예시한 것으로 이해되어야 한다. 수많은 변형이 본 발명의 진정한 취지 및 범주에서 벗어나지 않으면서 본원에 제시된 교시내용에 기초하여 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 만들어질 수 있다. 본 출원 전반에 걸쳐 인용된 모든 참고문헌, 특허 및 공개 특허 출원의 내용은 모든 목적을 위해 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
하기 실시예는 본 발명의 대표적인 것으로서 제시된다. 이들 및 다른 등가의 실시양태가 본 개시내용, 도면 및 첨부 청구범위에 비추어 명백할 것이기 때문에, 이들 실시예는 본 발명의 범주를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
실시예 I
컴퓨터 단백질 설계
본 발명의 특정 실시양태에서, 구조-기반 단백질 설계를 최신 기술 소프트웨어 (예를 들면, 로제타(Rosetta) 소프트웨어)와 조합하여, 소분자-단백질 상호작용을 설계한다. 알로스테릭 단백질의 결합 포켓을 소분자를 표적화하도록 설계한다. 잠재적으로 소분자에 결합할 수 있는 수천개의 인 실리코 필터링된 단백질 설계물을 생성한다.
실시예 II
칩-기반 DNA 합성 및 설계물의 어셈블리
특정 실시양태에서, 실시예 I에서 설계된 알로스테릭 단백질을 기재 상에 (예를 들면, DNA 칩 상에) 고정화된 DNA에 의해 코딩한다. 특정 측면에서, 다중 소분자 표적 (예를 들면, 소분자-결합 단백질, 예를 들면 알로스테릭 단백질)을 단일 칩 상에 코딩한다. 주어진 알로스테릭 단백질에 대하여, 단백질을 코딩하는 상응하는 DNA 서열을 선택적으로 증폭시키고 정제한다. 특정 측면에서, 칩 상의 각각의 DNA 서열은 대략 100개 염기 길이이다. 증폭된 DNA 서열을 스티칭하여, 알로스테릭 단백질을 코딩하는 서열을 조립한다. 계층적 어셈블리 기술이, 다중 알로스테릭 단백질을 코딩하는 전체 설계 라이브러리를 구축하기 위해 개발되었다. 계층적 어셈블리의 방법은 2009년 7월 31일에 출원된 USSN 12/533,141에 기재되며, 이는 모든 목적을 위해 그 전문이 본원에 참조로서 포함된다.
어셈블리
컴퓨터 결합 예측 또는 다른 방법으로부터 생성된 설계물을 멀티플렉스화 어셈블리 전략을 사용하여 조립한다. 라이브러리 단편을, 예를 들면 마이크로칩상 프린팅, 표준 모세관 합성에 의해, 야생형 서열로부터, 또는 이전 라이브러리 버전으로부터 생성된 올리고로부터 증폭시킨다. 증폭 서열을, 예를 들어 유형 II 제한 엔도뉴클레아제에 의해 분리한다. 단편을 리가제 또는 다른 수단을 사용하여 멀티플렉스화 반응에서 하위-유전자 단편 또는 전체 유전자로 조립한다. 하위-유전자 단편을, 예를 들면 중첩 PCR, 라이게이션, 또는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 다른 적합한 방법을 사용하여 멀티플렉스에서 전장 설계물 및 그의 조합물로 조립한다. 전체 유전자를, 예를 들면 라이게이션, 깁슨(Gibson) 어셈블리 또는 멀티플렉스 반응에 있어서 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 다른 적합한 방법에 의해 발현 플라스미드에 삽입한다. 발현 플라스미드 라이브러리를 높은 클로닝 효율을 허용하는 균주로, 또는 센서 단백질의 결합 및/또는 활성화 부위에 적격인 균주로 직접적으로 형질전환시킨다. 기능적 센서 단백질을 선택, 스크리닝 또는 그의 조합을 사용하여 확인한다.
실시예 III
유전자 선택 시스템
최고의 알로스테릭 단백질 설계물을 확인하기 위한 신규 유전자 선택 시스템을 개발하였다. 출원 시점에서 관련 기술분야의 다른 사람들에게 공지된 전형적인 선택 시스템은 목적하는 단일 기능을 최적화한다. 대조적으로, 본 발명의 실시양태는 2가지의 기능을 최적화한다: 1) 알로스테릭 단백질에 대한 표적 소분자의 결합 친화도; 및 2) 알로스테릭 단백질에서의 알로스테릭 효과 보존. 특정 측면에서, 본 발명의 선택 시스템은 2개의 단계에서 임의로 활성화되는 이중 선택 마커를 사용한다. 제1 선택 단계에서, 비-알로스테릭 설계된 단백질을 음성 선택에 의해 제거한다. 제2 선택 단계에서, 제1 선택 단계에서 제거되지 않았던 설계된 단백질을 양성 선택에 의해 표적 소분자에의 결합에 대해 평가한다. 본 발명의 선택 시스템은 거의 십억개의 단백질 설계물을 평가하는 것을 가능하게 한다. 선택 단계 둘 다에서 생존한 단백질 설계물을 활성에 대해 개별적으로 검정한다.
SEQUENCE LISTING <110> PRESIDENT AND FELLOWS OF HARVARD COLLEGE <120> DE NOVO DESIGN OF ALLOSTERIC PROTEINS <130> 010498_00581 <140> PCT/US15/16868 <141> 2015-02-20 <150> US 61/942755 <151> 2014-02-21 <160> 15 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Avi Tag <400> 1 Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp His Glu 1 5 10 15 <210> 2 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> calmodulin tag <400> 2 Lys Arg Arg Trp Lys Lys Asn Phe Ile Ala Val Ser Ala Ala Asn Arg 1 5 10 15 Phe Lys Lys Ile Ser Ser Ser Gly Ala Leu 20 25 <210> 3 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> FLAG tag <400> 3 Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys 1 5 <210> 4 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> HA tag <400> 4 Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala 1 5 <210> 5 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> His tag <400> 5 His His His His His His 1 5 <210> 6 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Myc tag <400> 6 Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu 1 5 10 <210> 7 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> S tag <400> 7 Lys Glu Thr Ala Ala Ala Lys Phe Glu Arg Gln His Met Asp Ser 1 5 10 15 <210> 8 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> SBP tag <400> 8 Met Asp Glu Lys Thr Thr Gly Trp Arg Gly Gly His Val Val Glu Gly 1 5 10 15 Leu Ala Gly Glu Leu Glu Gln Leu Arg Ala Arg Leu Glu His His Pro 20 25 30 Gln Gly Gln Arg Glu Pro 35 <210> 9 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Softag 1 <400> 9 Ser Leu Ala Glu Leu Leu Asn Ala Gly Leu Gly Gly Ser 1 5 10 <210> 10 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> V5 tag <400> 10 Gly Lys Pro Ile Pro Asn Pro Leu Leu Gly Leu Asp Ser Thr 1 5 10 <210> 11 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Xpress tag <400> 11 Asp Leu Tyr Asp Asp Asp Asp Lys 1 5 <210> 12 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Isopeptag <400> 12 Thr Asp Lys Asp Met Thr Ile Thr Phe Thr Asn Lys Lys Asp Ala Glu 1 5 10 15 <210> 13 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> SpyTag <400> 13 Ala His Ile Val Met Val Asp Ala Tyr Lys Pro Thr Lys 1 5 10 <210> 14 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Strep-tag II <400> 14 Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys 1 5 <210> 15 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Softag 3 <400> 15 Thr Gln Asp Pro Ser Arg Val Gly 1 5

Claims (38)

  1. 동반 알로스테릭 이펙터를 위한 결합 포켓을 갖는 후보 알로스테릭 DNA 결합 단백질을 컴퓨터로 인 실리코 설계하는 단계,
    후보 알로스테릭 DNA 결합 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 제공하는 단계,
    핵산 서열을 박테리아 숙주 세포 내로 도입하여 후보 알로스테릭 DNA 결합 단백질을 발현시키는 단계,
    음성 선택을 사용함으로써 후보 알로스테릭 DNA 결합 단백질이 DNA에 결합하여 유전자의 발현을 억제하는지 여부를 결정하여, 후보 알로스테릭 DNA 결합 단백질이 DNA에 결합하여 유전자의 발현을 억제하는 제1 복수의 박테리아 숙주 세포를 확인하는 단계, 및
    양성 선택을 사용하여 제1 복수의 박테리아 숙주 세포의 후보 알로스테릭 DNA 결합 단백질이 동반 알로스테릭 이펙터에 결합하는지 여부를 결정하여, 후보 알로스테릭 DNA 결합 단백질이 동반 알로스테릭 이펙터에 결합한 제2 복수의 박테리아 숙주 세포를 확인하는 단계
    를 포함하는, 입체형태 변화를 유도하는 동반 알로스테릭 이펙터에 결합하는 알로스테릭 DNA 결합 단백질을 제조 및 단리하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 후보 알로스테릭 DNA 결합 단백질을 코딩하는 핵산 서열이 기재에 결합된 핵산 하위서열로부터 생성되는 것인 방법.
  3. 제2항에 있어서, 기재로부터의 복수의 하위서열이 후보 알로스테릭 DNA 결합 단백질을 코딩하는 핵산 서열이 형성되도록 라이게이션되는 것인 방법.
  4. 제1항에 있어서, 음성 선택이 유전자를 발현하는 세포에 대해 독성인 독소와 박테리아 숙주 세포를 접촉시키는 것을 포함하는 것인 방법.
  5. 제1항에 있어서, 음성 선택이 유전자의 발현이 억제되도록 후보 알로스테릭 DNA 결합 단백질이 DNA에 결합하지 않은 세포에 대해 독성인 독소와 박테리아 숙주 세포를 접촉시키는 것을 포함하는 것인 방법.
  6. 제1항에 있어서, 양성 선택이 독소 및 동반 알로스테릭 이펙터와 제1 복수의 박테리아 숙주 세포를 접촉시키는 것을 포함하며, 여기서 독소는 유전자가 발현되지 않는 세포에 대해 독성인 방법.
  7. 제1항에 있어서, 양성 선택이 독소 및 알로스테릭 이펙터 표적과 제1 복수의 박테리아 숙주 세포를 접촉시키는 것을 포함하며, 여기서 독소는 동반 알로스테릭 이펙터가 후보 알로스테릭 DNA 결합 단백질에 후보 알로스테릭 DNA 결합 단백질이 DNA로부터 방출되도록 하는 방식으로 결합하지 않은 세포에 대해 독성인 방법.
  8. 제1항에 있어서, 양성 선택이 유전자가 발현되도록 후보 알로스테릭 DNA 결합 단백질이 DNA에 결합한 경우에 제1 복수의 박테리아 세포에서 발현되는 검출가능한 마커를 검출하는 것을 포함하는 것인 방법.
  9. 제8항에 있어서, 검출가능한 마커가 형광 단백질인 방법.
  10. 제9항에 있어서, 형광 단백질이 형광 활성화 세포 분류에 의해 검출되는 것인 방법.
  11. 제7항에 있어서, 양성 선택이 동반 알로스테릭 이펙터가 후보 알로스테릭 DNA 결합 단백질에 후보 알로스테릭 DNA 결합 단백질이 DNA로부터 방출되도록 하는 방식으로 결합하지 않는 경우에 제1 복수의 박테리아 세포에서 발현되는 검출가능한 마커를 검출하는 것을 추가로 포함하는 것인 방법.
  12. 제1항에 있어서, DNA 결합 단백질이 화학적 센서인 방법.
  13. 제1항에 있어서, 박테리아 숙주 세포가 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) 또는 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis)인 방법.
  14. 동반 알로스테릭 이펙터를 위한 결합 포켓을 갖는 후보 알로스테릭 DNA 결합 단백질을 컴퓨터로 인 실리코 설계하는 단계,
    후보 알로스테릭 DNA 결합 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 제공하는 단계,
    핵산 서열을 사카로미세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae) 숙주 세포 내로 도입하여 후보 알로스테릭 DNA 결합 단백질을 발현시키는 단계,
    음성 선택을 사용함으로써 후보 알로스테릭 DNA 결합 단백질이 DNA에 결합하여 유전자의 발현을 억제하는지 여부를 결정하여, 후보 알로스테릭 DNA 결합 단백질이 DNA에 결합하여 유전자의 발현을 억제하는 제1 복수의 사카로미세스 세레비지아에 숙주 세포를 확인하는 단계, 및
    양성 선택을 사용하여 제1 복수의 사카로미세스 세레비지아에 숙주 세포의 후보 알로스테릭 DNA 결합 단백질이 동반 알로스테릭 이펙터에 결합하는지 여부를 결정하여, 후보 알로스테릭 DNA 결합 단백질이 동반 알로스테릭 이펙터에 결합한 제2 복수의 사카로미세스 세레비지아에 숙주 세포를 확인하는 단계
    를 포함하는, 입체형태 변화를 유도하는 동반 알로스테릭 이펙터에 결합하는 알로스테릭 DNA 결합 단백질을 제조 및 단리하는 방법.
  15. 제14항에 있어서, 후보 알로스테릭 DNA 결합 단백질을 코딩하는 핵산 서열이 기재에 결합된 핵산 하위서열로부터 생성되고, 후보 알로스테릭 DNA 결합 단백질을 코딩하는 핵산 서열이 형성되도록 라이게이션되는 것인 방법.
  16. 제14항에 있어서, 음성 선택이 유전자를 발현하는 세포에 대해 독성인 독소와 박테리아 숙주 세포를 접촉시키는 것을 포함하는 것인 방법.
  17. 제14항에 있어서, 양성 선택이 독소 및 동반 알로스테릭 이펙터와 제1 복수의 박테리아 숙주 세포를 접촉시키는 것을 포함하며, 여기서 독소는 유전자가 발현되지 않는 세포에 대해 독성인 방법.
  18. 동반 알로스테릭 이펙터를 위한 결합 포켓을 갖는 후보 알로스테릭 DNA 결합 단백질을 컴퓨터로 인 실리코 설계하는 단계,
    기재에 결합된 핵산 하위서열로부터 생성된 후보 알로스테릭 DNA 결합 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 제공하는 단계,
    핵산 서열을 미생물 내로 도입하여 후보 알로스테릭 DNA 결합 단백질을 발현시키는 단계,
    음성 선택을 사용함으로써 후보 알로스테릭 DNA 결합 단백질이 DNA에 결합하여 유전자의 발현을 억제하는지 여부를 결정하여, 후보 알로스테릭 DNA 결합 단백질이 DNA에 결합하여 유전자의 발현을 억제하는 제1 복수의 미생물을 확인하는 단계, 및
    양성 선택을 사용하여 제1 복수의 미생물의 후보 알로스테릭 DNA 결합 단백질이 동반 알로스테릭 이펙터에 결합하는지 여부를 결정하여, 후보 알로스테릭 DNA 결합 단백질이 동반 알로스테릭 이펙터에 결합한 제2 복수의 미생물을 확인하는 단계
    를 포함하는, 입체형태 변화를 유도하는 동반 알로스테릭 이펙터에 결합하는 알로스테릭 DNA 결합 단백질을 제조 및 단리하는 방법.
  19. 제18항에 있어서, 기재가 마이크로어레이인 방법.
  20. 제19항에 있어서, 기재로부터의 복수의 하위서열이 마이크로어레이 상의 서열로부터 증폭되고, 후보 알로스테릭 DNA 결합 단백질을 코딩하는 핵산 서열이 형성되도록 라이게이션되는 것인 방법.
  21. 제18항에 있어서, 후보 알로스테릭 DNA 결합 단백질을 코딩하는 핵산 서열이 무작위로 생성되는 것인 방법.
  22. 제21항에 있어서, 후보 알로스테릭 DNA 결합 단백질이 오류-유발 PCR 또는 조합 PCR에 의해 생성되는 것인 방법.
  23. 제18항에 있어서, 후보 알로스테릭 DNA 결합 단백질이 단백질 리딩 프레임을 그의 기능에 대해 무손상으로 남아있도록 하면서 항-독소 유전자에 융합되는 것인 방법.
  24. 제23항에 있어서, 프레임을 벗어나거나 말단절단된 후보 알로스테릭 DNA 결합 단백질이 독소에 대해 특이적인 항-독소 단백질의 발현을 허용하지 않는 것인 방법.
  25. 제24항에 있어서, 프레임을 벗어나거나 말단절단된 후보 알로스테릭 DNA 결합 단백질을 발현하는 숙주 세포가 숙주 세포를 독소에 노출시킴으로써 제거되는 것인 방법.
  26. 이펙터 분자를 위한 결합 포켓을 갖는 컴퓨터로 인 실리코 설계된 알로스테릭 DNA 결합 단백질.
  27. 이펙터 분자를 위한 결합 포켓을 갖는 컴퓨터로 인 실리코 설계된 알로스테릭 DNA 결합 단백질을 코딩하는 핵산 서열.
  28. 컴퓨터로 인 실리코 설계된 알로스테릭 DNA 결합 단백질의 결합 포켓에 선택적으로 결합하는 구조를 갖는 이펙터 분자.
  29. 컴퓨터로 인 실리코 설계된 알로스테릭 DNA 결합 단백질의 결합 포켓에 선택적으로 결합하는 구조를 갖는 이펙터 분자를 코딩하는 핵산 서열.
  30. 이펙터 분자를 위한 결합 포켓을 갖는 컴퓨터로 인 실리코 설계된 알로스테릭 DNA 결합 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 세포.
  31. 제30항에 있어서, 알로스테릭 DNA 결합 단백질에 의해 조절되는 외인성 유전자를 추가로 포함하는 세포.
  32. 컴퓨터로 인 실리코 설계된 알로스테릭 DNA 결합 단백질의 결합 포켓에 선택적으로 결합하는 구조를 갖는 이펙터 분자를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 세포.
  33. 이펙터 분자를 위한 결합 포켓을 갖는 컴퓨터로 인 실리코 설계된 알로스테릭 DNA 결합 단백질을 코딩하는 핵산 서열 및 컴퓨터로 인 실리코 설계된 알로스테릭 DNA 결합 단백질의 결합 포켓에 선택적으로 결합하는 구조를 갖는 이펙터 분자를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 세포.
  34. 제33항에 있어서, 알로스테릭 DNA 결합 단백질에 의해 조절되는 외인성 유전자를 추가로 포함하는 세포.
  35. 제33항에 있어서, 알로스테릭 DNA 결합 단백질 및 이펙터 분자에 의해 조절되는 외인성 유전자를 추가로 포함하는 세포.
  36. 제33항에 있어서, 외인성 유전자가 독소에 대한 해독제를 코딩하는 것인 세포.
  37. 제33항에 있어서, 외인성 유전자가 검출가능한 단백질 또는 검출가능한 단백질 태그를 코딩하는 것인 세포.
  38. 제33항에 있어서, 알로스테릭 DNA 결합 단백질이 해독제 유전자에 융합되고 무손상 단백질 리딩 프레임을 갖는 것인 세포.
KR1020167025300A 2014-02-21 2015-02-20 알로스테릭 단백질의 신생 설계 KR102328069B1 (ko)

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