JP2005218451A - ミニ細胞ディスプレイを用いるペプチドディスプレイライブラリーをスクリーニングする方法 - Google Patents
ミニ細胞ディスプレイを用いるペプチドディスプレイライブラリーをスクリーニングする方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2005218451A JP2005218451A JP2005059665A JP2005059665A JP2005218451A JP 2005218451 A JP2005218451 A JP 2005218451A JP 2005059665 A JP2005059665 A JP 2005059665A JP 2005059665 A JP2005059665 A JP 2005059665A JP 2005218451 A JP2005218451 A JP 2005218451A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- peptide
- minicell
- cell
- item
- cells
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
- C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
- C40B40/00—Libraries per se, e.g. arrays, mixtures
- C40B40/02—Libraries contained in or displayed by microorganisms, e.g. bacteria or animal cells; Libraries contained in or displayed by vectors, e.g. plasmids; Libraries containing only microorganisms or vectors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
- C12N15/1037—Screening libraries presented on the surface of microorganisms, e.g. phage display, E. coli display
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
Abstract
結合し得、そして特定の生物学的プロセスを効果的に調節し得る候補についてのペプチドライブラリーをスクリーニングすることについて有意な利点を有するミニ細胞ディスプレイ方法を、提供すること。
【解決手段】 スクリーニングされるべき独特の配列を作製する際の多様性を増加し、そしてスクリーニングされるべきペプチドのサイズを増加させる、小さな無核のミニ細胞に基づく方法。インビトロ変異誘発(タンパク質合成のレベルにおける)、ならびにDNA複製は、スクリーニングされるべきライブラリーの多様性を増加し、従って、特定の生物学的応答または機構を調節し得る潜在的なペプチドの数を実質的に増加させる。
【選択図】 なし
Description
優先権主張が米国仮出願番号第60/274,039号(2001年3月7日出願)、および米国仮出願番号第60/306,946号(2001年7月20日出願)に対してなされる。
本発明は、概してハイスループットペプチドスクリーニングに関し、特に、ランダムペプチドの生成およびスクリーニングのためのミニ細胞ディスプレイ技術に関する。
レセプター−リガンド複合体、酵素基質反応および抗体−抗原結合反応における同族タンパク質の間の相互作用は、広汎な範囲のプロセスにおける応答を行なうために必要な分子相互作用の理解を促進してきた。選択された標的に結合し得、そして特定の生物学的プロセスを有効に調節し得る新たなペプチド分子についての検索は、農学、生物学および医学の研究の最先端にある。
目的のオリゴヌクレオチドおよびペプチドを選択するための方法、ならびに所望の機能的特性および結合特性を有するペプチドについての大きなミニ細胞ディスプレイライブラリーを作製し、スクリーニングするための方法が開発された。これらの方法は、Rickettsia rickettsiiの17K抗原のようなタンパク質に対する遺伝子融合体として表されるランダムオリゴヌクレオチドのミニ細胞ディスプレイライブラリーから、新規かつ独特の標的相互作用ペプチドを選択する工程を包含する。
(i)細菌外膜タンパク質の少なくとも一部をコードする第1の遺伝子;および
(ii)標的分子と相互作用する潜在的な「基質」ペプチドをコードする第2の遺伝子またはオリゴヌクレオチド、
を含む。
上記に加えて、本発明は、以下を提供する:
項目1.
結合パートナーに結合されたミニ細胞パートナーを同定するための方法であって、以下の工程:
(a)外膜を含むミニ細胞中の融合タンパク質を発現する工程であって、ここで、該融合タンパク質が、キメラ遺伝子によってコードされ、該キメラ遺伝子が、以下:
該外膜への該融合タンパク質の結合を媒介する第1ペプチドをコードするDNAフラグメント、および
第2ペプチドをコードするDNAフラグメント、
を含む、工程;
(b)該工程(a)のミニ細胞宿主を、結合パートナーに接触する工程;および
(c)該結合パートナーに結合される該ミニ細胞宿主を同定する工程、
を包含する、方法。
項目2.
項目1に記載の方法であって、以下の工程:
(d)前記結合したミニ細胞宿主または結合していないミニ細胞宿主を単離する工程、をさらに包含する、方法。
項目3.
項目1に記載の方法であって、ここで、前記外膜への融合タンパク質の結合を媒介する第1ペプチドをコードDNAフラグメントが、シグナルアミノ酸配列を含む、方法。
項目4.
項目3に記載の方法であって、ここで、前記シグナル配列が、Rickettsia
rickettsii由来のompAシグナル配列、ompTシグナル配列、ompFシグナル配列、traAシグナル配列、phoAシグナル配列、βラクタマーゼシグナル配列、および17K抗原シグナル配列からなる群から選択される、方法。
項目5.
項目1に記載の方法であって、ここで、前記第2ペプチドをコードするDNAフラグメントが、DNAライブラリー由来である、方法。
項目6.
項目1に記載の方法であって、ここで、前記結合パートナーが、炭水化物、糖、核酸分子、ペプチド、タンパク質、金属、無機分子および合成薬物からなる群より選択される方法。
項目7.
項目1に記載の方法であって、ここで、前記結合パートナーが、レセプター、リガンド、抗体、ビタミン、補因子、酵素、およびニューロメディエーターからなる群より選択される、方法。
項目8.
項目1に記載の方法であって、ここで、前記ミニ細胞株が、グラム陰性細菌である、方法。
項目9.
項目7に記載の方法であって、ここで、前記グラム陰性細菌が、E.coli、Salmonella typhimurium、S.anatum、S.enteritidis、S.pullorum、S.senftenberg、S.worthington、Vibrio cholera、Erwinia amylovora、およびHaemophilus influenzaeを含む群から選択される、方法。
項目10.
項目1に記載の方法であって、ここで、前記ミニ細胞株が、グラム陽性細胞である、方法。
項目11.
項目9に記載の方法であって、ここで、前記グラム陽性細菌が、Bacillus subtilisである、方法。
項目12.
項目1に記載の方法であって、以下の工程:
(d)前記融合タンパク質をコードするDNAフラグメントを単離する工程;ならびに
(e)該単離されたDNAを、分析方法に供する工程であって、該分析方法が、DNA塩基組成の決定、DNA塩基配列の決定、分子量の決定、および該配列内の2次構造の決定を含む群より選択される、工程、
を、さらに包含する、方法。
項目13.
項目3に記載の方法であって、ここで、シグナルアミノ酸配列を含む前記DNAフラグメントが、Rickettsia rickettsiiの17K抗原のオープンリーディングフレームの最初の213ヌクレオチドを含む、方法。
項目14.
項目1に記載の方法であって、前記融合タンパク質の発現が、誘導性プロモーターエレメントによって制御される、方法。
項目15.
項目14に記載の方法であって、ここで、前記誘導性プロモーターエレメントが、lac、tac、およびtrpからなる群より選択される、方法。
項目16.
項目1に記載の方法であって、以下の工程:
(d)前記ミニ細胞宿主から前記第2ペプチドを切断する工程、
をさらに包含する、方法。
項目17.
項目2に記載の方法であって、以下の工程:
(e)前記ミニ細胞宿主から前記第2ペプチドを切断する工程、
をさらに包含する、方法。
項目18.
項目17に記載の方法であって、以下の工程:
(f)前記ミニ細胞宿主から切断された前記ペプチドを単離する工程;ならびに
(g)該単離されたペプチドを、アミノ酸組成の決定、アミノ酸配列の決定、等電点の決定、および分子量の決定からなる群より選択される方法に供する工程、
を、さらに包含する、方法。
項目19.
項目18に記載の方法であって、ここで、前記単離されたペプチドが、配列番号40、配列番号45、配列番号46、配列番号47、配列番号48、配列番号52、および配列番号53からなる群より選択される、方法。
項目20.
項目18に記載の方法であって、ここで、前記単離されたペプチドが、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号33、配列番号34、配列番号37、配列番号38、配列番号39、配列番号41、配列番号42、配列番号49、配列番号50、および配列番号51からなる群より選択される、方法。
項目21.
項目18に記載の方法であって、ここで、前記単離されたペプチドが、配列番号17、配列番号18、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29、配列番号31、および配列番号32からなる群より選択される、方法。
項目22.
項目18に記載の方法であって、ここで、前記単離されたペプチドが、配列番号7、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号19、配列番号35、および配列
番号36からなる群より選択される、方法。
項目23.
項目5に記載の方法であって、ここで、前記第2ペプチドをコードするDNAフラグメントが、少なくとも3アミノ酸長である、方法。
項目24.
ミニ細胞DNAライブラリーの多様性を増加させるための方法であって、該ミニ細胞DNA中の細胞を変異させて、次いで、結合についてスクリーニングする工程を包含する、方法。
項目25.
項目24に記載の方法であって、ここで、前記変異誘発が、インビボである、方法。
項目26.
項目25に記載の方法であって、ここで、前記インビボでの変異誘発が、以下の工程:
(a)誘導性遺伝子融合を含む発現ベクターを、mut遺伝子中に変異を有するミニ細胞株中に形質転換する工程;および
(b)発現ベクターの複製を誘導するために、該ミニ細胞株にヌクレオチドを加える工程、
を包含する、方法。
項目27.
項目26に記載の方法であって、ここで、前記mut遺伝子内の変異によって、ミニ細胞株において、正常な速度より速い速度の自然変異誘発が与えられる、方法。
項目28.
項目25に記載の方法であって、ここで、前記インビボ変異誘発が、以下の工程:
(a)誘導性遺伝子融合を含む発現ベクターを、アミノアシル−tRNAシンテターゼ遺伝子中に変異を有するミニ細胞株中に形質転換する工程;ならびに
(b)タンパク質合成を誘導するために、該ミニ細胞株に、L−アミノ酸およびアミノ酸アナログを補充する工程、
を包含する、方法。
項目29.
項目28に記載の方法であって、ここで、前記アミノアシル−tRNAシンテターゼ遺伝子中の変異によって、tRNAがアミノ酸アナログを認識し、結合し、そして転移させる能力が、与えられる、方法。
項目30.
項目28に記載の方法であって、前記アミノ酸アナログが、ヒドロキシアミノ酸、またはその誘導体、オルニチン、アジトリプトファン、およびD−アミノ酸からなる群より選択される、方法。
項目31.
ミニ細胞DNAライブラリーをスクリーニングするための方法であって、以下の工程:
(a)ミニ細胞ライブラリーを標的に接触させる工程であって、ここで、前記標的が、固体支持体上に固定される、工程;および
(b)ミニ細胞ライブラリーの結合したメンバーを結合していないメンバーから分離し、それによって、該標的に結合するペプチドをコードするDNAが豊富なライブラリーを作製する、工程、
を包含する、方法。
項目32.
項目31に記載の方法であって、以下の工程:
(c)発現ベクターDNAを、結合したミニ細胞または結合していないミニ細胞から単離する工程;
(d)該単離されたDNAをインビトロで変異誘発させる工程;
(e)変異誘発されたDNAをミニ細胞株に形質転換する工程;
(f)タンパク質融合の発現を誘導する工程;
(g)該工程(c)のミニ細胞宿主を標的に接触させる工程;および
(h)該標的に結合したライブラリーにおけるミニ細胞を、該標的に結合しなかったミニ細胞から分離する工程、
を包含する、方法。
項目33.
項目31に記載の方法であって、ここで、前記固体支持体マトリクスが、アガロース、アガロースビーズ、アクリルアミドビーズ、セルロース、中性キャリアおよびイオン性キャリア、ならびにアクリルポリマーからなる群より選択される、方法。
項目34.
項目31に記載の方法であって、ここで、前記結合パートナーが、炭水化物、糖、ペプチド、タンパク質、核酸分子、無機分子および合成薬物からなる群より選択される方法。
項目35.
項目31に記載の方法であって、ここで、前記結合パートナーが、レセプター、リガンド、抗体、ビタミン、補因子、酵素、金属およびニューロメディエーターからなる群より選択される、方法。
項目36.
組換え発現ベクターであって、Rickettsia rickettsiiの17K抗原のオープンリーディングフレームに遺伝的に融合された誘導性プロモーターエレメントを含む、ベクター。
項目37.
項目36に記載のベクターであって、ここで、前記Rickettsia rickettsiiの17K抗原のオープンリーディングフレームが、シグナル配列を含む、ベクター。
項目38.
項目37に記載のベクターであって、ここで、前記シグナル配列が、17K抗原のオープンリーディングフレームの最初の213ヌクレオチド内でコードされる、ベクター。
項目39.
項目38に記載のベクターであって、ここで、前記213ヌクレオチドフラグメントが、第2ペプチドをコードするDNAに遺伝的に融合される、ベクター。
項目40.
項目39に記載のベクターであって、ここで、前記遺伝的融合の発現が、キメラタンパク質を生成する、ベクター。
項目41.
項目36に記載のベクターであって、ここで、前記誘導性プロモーターエレメントが、lac、lacUV5、tac、およびtrpからなる群より選択される、ベクター。
項目42.
ミニ細胞DNAライブラリーを作製するための方法であって、以下の工程:
(a)ランダム化1本鎖プライマーを合成する工程;
(b)プライマーの相補的領域をアニーリングしてコンカテマーを形成する工程;および
(c)コンカテマーの1本鎖領域を2本鎖に変換し、それによって、オリゴヌクレオチドライブラリーを形成する工程、
を包含する、方法。
項目43.
項目42に記載の方法を使用して得られるライブラリーであって、ここで、前記ライブラリーのオリゴヌクレオチドが、少なくとも9ヌクレオチドを含む、ライブラリー。
項目44.
ミニ細胞を精製するための方法であって、密度勾配超遠心分離によって、細胞全体からミニ細胞を分離する工程を包含し、ここで、該勾配が、線状スクロース勾配から作製される、方法。
(I.ミニ細胞の構築および組成)
ミニ細胞は、ライブラリーDNAをパッケージし、ペプチドをディスプレイするための代替の方法を提供する。本明細書中において使用されるように、用語「ペプチド」および「タンパク質」は、他で注記しない限り、交換可能に使用される。ミニ細胞は、細菌の極性末端において異常細胞画分から生じる、小さな無核細胞である。しかし、このミニ細胞は、幾つかのプラスミドを収容するのに十分な大きさであり、そしてミニ細胞は、細菌性染色体DNAを含まず、組み合わされた転写および翻訳、ならびにタンパク質改変に必要な機構の全てを含むため、クローン化されたタンパク質発現を分析するために大規模に使用される。グラム陽性株およびグラム陰性株を表す多くの変異体細菌株は、それらの個々の細胞周期にわたってミニ細胞を産生し得る。例として、E.coli,S.typhimurium,S.anatum,S.enteritidis,S.pullorum,S.senftenberg,S.worthington,B.subtilis,V.cholera,E.amylovora,およびH.influenzaeが挙げられる。
細菌の細胞は、細胞分裂を制御する洗練された系と供に提供されている。このmin遺伝子は、解剖学的に細胞分裂が起こる部分を制御する能力を細菌に提供する。細菌が正常に分裂する場合、minタンパク質(MinC、MinD、およびMinE)は、各細胞の2極の末端に蓄積する。このminタンパク質は、細胞分裂装置が各細胞の末端に蓄積することを妨げ、そして極の細胞分裂インヒビターと考えられ得る。MinEは、細胞の極に対するMinCタンパク質およびMinDタンパク質の正確な配置のために要求される位相の特異性を提供する。de Boerら、Proc.Nat.Acad.Sci.,(87)1129〜1133(1990)またはde Boerら、Cell,(56)641〜649(1989)を参照のこと。分裂装置アセンブリから遮断された各細胞の極の末端で、分裂のために要求されるタンパク質は、細胞の中間(細胞中期(midcell))に蓄積する。minCまたはminD遺伝子のいずれも欠損しているか、あるいはMinEタンパク質を過剰発現する細胞は、増加した頻度で極の末端で異常に分裂し、染色体DNAが不完全なミニ細胞を形成する。この形成されたミニ細胞は、分裂し得ないが、ヌクレオチドを複製プラスミドDNA中に組み込み得、そしてプラスミドの配列によってコードされるタンパク質を合成し得る。ミニ細胞を形成し得る任意の細菌株が、ペプチドディスプレイ(display peptide)の発現のための細菌宿主として使用され得る。
別の実施形態において、種々のオリゴヌクレオチドおよびこれらによってコードされるペプチドのライブラリーをさらにランダム化するインビボの方法が、使用される。コードタンパク質を非機能的とするmutS遺伝子中の変異はまた、この変異を宿している細胞がDNA合成/複製の間に作製されたミスを正し得なくする。mutS株は、変異因子の表現型を付与する。
目的のペプチド中に組み込まれるべきアミノ酸アナログをミニ細胞のディスプレイに提供することは、ライブラリーのさらなる多様化のために使用され得る。アミノ酸アナログがペプチド中に組み込まれるために、mRNAからペプチドを合成することに関与するtRNA分子が、改変されなければならない。tRNA分子は、特定のアミノ酸にそれ自体を化学結合させ、次いで、ペプチド鎖中に組み込むために、mRNA中の正しい配列に対応するアミノ酸を提示するように働く。20個の天然に存在するL−アミノ酸の1つにそれぞれ対応する20個のアミノアシルtRNAシンテターゼ酵素は、受容するtRNA分子にアミノ酸に添加する。変異は、アミノ酸のアナログを認識し、そしてこのアナログを対応するtRNA分子に移すことを可能にする、MsMc株のアミノアシルtRNAシンテターゼをコードする遺伝子の任意の1つ、いくつかまたは全てに組み込まれ得る。次いで、生じたtRNA分子は、アミノ酸アナログを、伸長しているペプチド鎖に組み込む能力を有する。あるいは、tRNAは、アミノ酸アナログとアミノアシル化するシンテターゼによってのみ認識され、そしてナンセンスコドン(サプレッサーtRNA)または4つの塩基コドンを認識するように指向されるように遺伝的に構築され得る。Maglieryら、J.Mol.Biol.,March 2001,307(3):755〜769を参照のこと。このような組み合わせは、アミノ酸アナログの特異的なインビボ組み込みを提供する(Wangら、Science,April 2001,292:498〜500;LiuおよびSchultz,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,April 1999,96:4780〜4785)。アミノ酸アナログ(例えば、任意のヒドロキシアミノ酸またはその誘導体、オルニチン、アジトリプトファン、またはD−アミノ酸)は、ペプチド鎖に組み込まれる細胞に対して外因的に供給され得る。あるいは、任意のミニ細胞株が、tRNA分子をコードする遺伝子中の変異を収容し得る。
一般に、使用されたプラスミドは、所望の宿主株における複製に適切なクローニングベクターとして作用し得る。複製配列および制御配列の起点は、ディスプレイのために使用される宿主ミニ細胞と適合性である。例えば、競合的プラスミドpUC19もしくはpBR322、またはその誘導体は、E.coliが、ミニ細胞が由来する株(親株)である場合、使用され得る。プラスミドは、好ましくは、親宿主で選択され得る1つまたは複数の選択可能なマーカー遺伝子を含む。選択可能なマーカー遺伝子としては、選択的に増殖される親細胞に表現型を付与する任意の遺伝子が挙げられる。選択可能なマーカー遺伝子の例としては、テトラサイクリン遺伝子、カナマイシン遺伝子、アンピシリン遺伝子およびゲンタマイシン遺伝子が挙げられるが、これらに限定されない。プラスミドは、目的の配列の制御された発現のために誘導可能な調節エレメントを含むことが、好ましい。このプラスミドはまた、例えば、9塩基対〜3000塩基対の長さの範囲でDNAオリゴヌクレオチドをクローニングするのに適しており、そしてオリゴヌクレオチド融合タンパク質の発現のためのテンプレートとして作用し得るものである。プラスミドはまた、代表的に1細胞あたり2〜100コピーの範囲で宿主細胞内に複数のコピーが存在する。
標的分子に結合し得るペプチドは、ランダムミニ細胞ライブラリーから得られ、ここで、ミニ細胞が、ミニ細胞の外側表面に暴露されたタンパク質に結合された少なくとも1つのランダムペプチド配列を含む融合タンパク質を発現する。この融合は、リンカー配列を介して直接か、または間接的にされ得る。間接的な連結は、外膜タンパク質と基質ペプチドとの間の直接的な化学カップリングによって表され得る。例えば、当業者は、市販、および代替的にデノボ構築によって利用可能な核酸リンカーが過度に存在することを認識する(このようなリンカーが、細胞の表面上に通常見出されるアミノ酸の配列を表す必要はない)。
第二遺伝子産物をミニ細胞表面へと指向させるために用いられるべきペプチドが通常選択される。なぜなら、これは、ミニ細胞の外表面への融合タンパク質またはキメラタンパク質の正確な局在を媒介し得るシグナルアミノ酸配列をコードするからである。シグナル配列としては例えば、ompAシグナル配列、ompTシグナル配列、ompFシグナル配列、ompCシグナル配列、βラクタマーゼ、traAシグナル配列、phoAシグナル配列およびRickettsia rickettsiiの17K抗原シグナル配列が挙げられる。さらに、外膜に通常は会合しないシグナル配列を保有するペプチドは、脂質改変コンセンサス配列を用いて改変されて、外膜への結合が確実にされ得る。
標的化されるべきランダム化ペプチドをコードするオリゴヌクレオチドライブラリーは、PCRまたは当該分野で充分に確立された他の増幅方法を用いてインビトロで合成され得る。好ましい実施形態では、このライブラリーは、このペプチドをコードする少なくとも約1010個のオリゴヌクレオチドを含む。一般に、このオリゴヌクレオチドライブラリーは、このライブラリーに対して多様性を付与する、独特の配列領域または可変配列領域を含む。このライブラリーの多様化は代表的に、多数の可能なアミノ酸が特定の位置に取り込まれ得るように、このペプチドの配列を特定するコード配列を変更することによって達成される。このライブラリーの作製の中心には、縮重プライマーの構築がある。縮重プライマーは、入手可能な自動化ポリヌクレオチド合成機(例えば、Nucleic Acid Synthesis Instrument Systems(Applied
Biosystems)のうちの1つ)を用いて構築され得る。
(A)ミニ細胞精製)
好ましい実施形態では、所望の非対称細胞分裂(極細胞分裂)を経た、1以上の小さな変異を保有する細胞は、非対称細胞分裂を経ていない細胞から分離される。ミニ細胞は、それらのサイズおよび密度の相違に基づいて、全体の細菌細胞から分離される。密度勾配遠心を用いて、ミニ細胞を、培養物中に存在する「全体」細胞の集団から分離して単離する。単離されたミニ細胞は、室温にて48時間また−70℃で6週間にわたって、安定なままであり、かつ活性なままである。室温安定性は、細胞全体およびファージを、当該分野で公知のディスプレイ方法を通して最適条件で増殖させ続けるために必要とされる時間のかかるプロトコルの必要性を除去する。ミニ細胞は、生理学的に、細胞分裂できない。
好ましい実施形態では、形質転換されたミニ細胞を、成長中のDNA鎖中への取込みが必要とされるヌクレオチドを外因的に添加することによって誘導して、プラスミドDNAを複製させる。プラスミドDNAの複製は、細胞内のプラスミドコピー数を増大させる。形質転換細胞が、ミューテーター表現型を保有する場合、外表面にディスプレイされるべきペプチドの多様性は増大する。ミューテーター表現型は、別の多様化技術(ペプチド合成のレベルでのアミノ酸アナログの取込み)と比較して、DNA合成のヌクレオチドレベルでその効果を示す。
ディスプレイされるべきペプチドの発現は、誘導性プロモーターの制御下にある。多くの誘導性プロモーターが、遺伝子発現を制御するために当該分野で入手可能であり、そして本明細書中で使用され得る。誘導性プロモーターは、他の場合には通常の分裂性細菌細胞に毒性であるペプチドの発現に理想的である。分裂細菌を通常殺傷する毒性ペプチドは、ミニ細胞内でそれらの致死効果を発揮できない。ミニ細胞は、増殖も分裂もせず、そして染色体DNAを欠く。ミニ細胞は、単離され、続いて、キメラペプチドの発現が誘導される。誘導は通常、アミノ酸およびタンパク質発現を活性化するインデューサーを外部からミニ細胞に供給することによって実施される。例えば、インデューサーであるイソプロピルチオガラクトシド(IPTG)の添加は、lacプロモーター、tacプロモーターまたはlacUV5プロモーターの制御下にある遺伝子の抑制を解放する。IPTGの添加が省略された場合、これらのプロモーターは、lacIリプレッサータンパク質によって負に制御されている。外部から添加されたアミノ酸は、ペプチド鎖の成長に必要なサブユニットを提供する。必要に応じて、アミノ酸アナログが、L−アミノ酸と同時またはL−アミノ酸の代わりに添加されて、ディスプレイされるべきペプチドライブラリーをさらに多様化させ得る。
ディスプレイされたペプチドおよび相互作用する分子または標的は、相互作用についてスクリーニングされる。この相互作用は、第二遺伝子によってコードされるペプチドと標的分子との間での結合を必要とする。ペプチドは、基質、補因子、リガンドまたはエフェクターであり得る。標的分子は、ペプチドもしくはタンパク質、核酸分子、糖質もしくは糖、ビタミン補因子、金属または合成薬物であり得る。標的分子は、酵素についての基質、機能的複合体の一部を形成する補因子、第二遺伝子によってコードされるペプチド上で作用する酵素、または第二遺伝子によってコードされるペプチドと相互作用する、リガンドもしくはレセプターであり得る。このような標的分子の例としては、抗原−抗体、ビオチン−アビジン、ホルモン−ホルモンレセプター、レセプター−リガンド、酵素−基質、IgG−プロテインAが挙げられる、ペプチド相互作用対が挙げられる。ディスプレイされたペプチドと相互作用する標的分子はあるいは、ランダムペプチドライブラリーの一部であり得る。好ましくは、結合反応の強度は、相互作用対が、標的とランダムペプチドとの間での物理的反応に基づいて単離されるのを可能にするに十分である。予め選択された「標的」分子は、薬物、ビタミン神経メディエーター、細胞レセプターもしくは細胞レセプター複合体、ステロイドホルモン、金属、糖質、無機化合物もしくは有機化合物、予め選択した分子に対する天然のアクセプター結合部位を模倣するペプチドもしくはそのアナログ、またはレセプター複合体の個々のタンパク質であり得る。
アフィニティークロマトグラフィーに類似する方法において、予め選択した標的分子、またはランダムペプチドのライブラリー、(結合パートナー)を、適切な固相支持体マトリクス(例えば、アガロースビーズ、アクリルアミドビーズ、セルロース、中性またはイオン性のキャリア、または種々のアクリルポリマー)にそれらを付着させることによって固定化し得る。予め選択された分子またはライブラリーを、特定のマトリクスに付着する
ために使用される方法は、当該分野において十分に確立されており、そして、例えば、Methods in Enzymology、44(1976)に記載されている。分子またはペプチドをマトリクスに付着した後、単離されたディスプレイミニ細胞を、そのマトリクスとインキュベートして、そのミニ細胞と結合パートナーとの間に形成される接触を可能にする。未結合の細胞を、洗浄して取り除き、そして予め選択された標的に結合したミニ細胞を、種々の方法(pH条件、イオン条件の調整を含む)、または過剰の遊離の抗原との競合によって溶出し得る。そうでなければ細菌増殖および活力にとって有害であり得る溶出条件を、ディスプレイミニ細胞の溶出時に組み込み得る。増殖および活力は、ミニ細胞にとって問題ではない。比較的大きなサイズの細菌細胞はまた、この技術において使用されるカラムを詰まらせるため、アフィニティークロマトグラフィーにおいて使用されないかもしれない。より小さなサイズのミニ細胞は、アフィニティークロマトグラフィーを受け入れやすい。
ディスプレイされたペプチドライブラリーを分析して、組み込まれたアミノ酸の多様性および/または組成を決定し得る。ミニ細胞は、特定のペプチド残基の間を特異的に切断することが公知の酵素または酸に供されて、ディスプレイシャペロンタンパク質から目的のペプチドを放出し得る(例えば、ギ酸は、プロリン残基とグリシン残基との間のペプチド結合を切断する)。次に、ペプチドは、加水分解され、そして自動アミノ酸分析器を使用して、アミノ酸含量について分析される。
ミニ細胞は、細菌遺伝学の複雑でない性質を受け入れやすいので、当業者にとって公知の方法によって、ミニ細胞からプラスミド発現ベクターを単離し、もし所望であれば、さらにプラスミドを適切な宿主中で増殖させることは、比較的容易である。あるいは、単離された発現ベクター内に含まれる第2の遺伝子配列を、17K抗原(第1の遺伝子)および/または親発現ベクター内の公知の配列に対するプライマーを用いて、PCRによって直接増幅し、配列決定し得る。
ペプチドは、好ましくは、結合に基づいて単離、または同定される。ペプチドはさらに(またはそのかわりに)、生物活性についてスクリーニングされ得る。生物活性は、ペプチドまたはタンパク質が有し得る任意の生物学的な効果または機能であり得る。例えば、生物活性としては、生物分子(例えば、レセプターのリガンド)に対する特異的結合、ホルモン活性、サイトカイン活性、および生物学的活性の阻害、または他の生物分子(例えば、レセプター結合のアゴニストおよびアンタゴニスト)の相互作用、酵素活性、抗癌活性(抗増殖、細胞傷害性、抗転移)、免疫調節(免疫抑制活性、免疫刺激活性)、抗感染活性、抗生物質活性、抗ウイルス活性、抗寄生生物活性、抗真菌活性、および栄養活性が挙げられる。生物活性は、当該分野において公知の適切な技術およびアッセイを使用して、測定および検出され得る。抗体反応性およびT細胞活性化は、生物活性であると考慮され得る。生物活性はまた、適切な場合、インビボにおいて評価され得る。このことは、目的の生物活性の有用なレベルの存在の最も正確な評価であり得る。酵素活性を、当該分野において公知の適切な技術およびアッセイを使用して、測定および検出し得る。
する。フローサイトメトリーおよび/または蛍光細胞分析分離装置(FACS分析)を、目的の細胞を分離するために蛍光色素を使用するプロトコルに組み込み得る。フローサイトメトリーは、サンプルから目的の粒子を、仕分けするか、または物理的に分離し得る。従って、FACS分析(フローサイトメトリーの1つのタイプ)は、目的の細胞または粒子の、不均一な集団からの物理的な分離として規定され得る。
1つの系を構築して、一般に、Rickettsia rickettsiiの17K抗原に融合されるオリゴヌクレオチドライブラリーの制御された発現を可能にする。R.rickettsiiの17K抗原は、E.coli内にクローニングする場合、外膜に提示される。脂質改変部位を含むN末端フラグメントを、唯一のHindIII部位の上流にtacプロモーターを挿入することによって、以下のプライマーから構築し、pZHA1.3(pUC19から誘導されたプラスミド)内にクローニングした。
プライマーを、Applied Biosystemsシンセサイザー(Forest
City,CA)によって合成した。
プラスミドpDIP1.0を、E.coli DS410に形質転換した。形質転換した細胞を、250mlの培養において、定常期まで増殖させた(この培養を一晩増殖させ得るが、良好な通気がなければならない)。濃厚な培地中で細胞を増殖させることにより、全細胞によるミニ細胞の汚染が最小になる。この培養物を8200×g(Sorvall GSAローターで7500rpm)で20分間、4℃でスピンダウンした。細胞ペレットを、5mlの上清中に再懸濁させた。再懸濁を極めて徹底的に行い、スクロース勾配工程の間の、細胞ペレット中のミニ細胞の損失を防止した。磁気撹拌子を遠心チューブの底部に配置し、そして10分間4℃で強く攪拌することによって、ペレットを完全に再懸濁させた。この懸濁物を、30mlのスクロース勾配(10〜30%)上に注意深く層にした。この勾配を硝酸セルロース超遠心分離機で、4000×g(例えば、SW27ローターで5500rpm)で20分間、4℃で遠心分離した。遠心分離後、厚い、いくらか拡散した、ミニ細胞の白色のバンドを、チューブの中央付近で可視化した。ミニ細胞(バンド)を、側面から20ccのシリンジで収集した。ミニ細胞を、20,000×g(Sorvall SS−34で13,000rpm)での、10分間、4℃での遠心分離によって、スクロール溶液から取り出した。ミニ細胞のペレットを、1mlのメチオニンアッセイ培地(Difco)中に再懸濁させた。この懸濁物を、10mlまたは30mlのスクロール勾配(10〜30%勾配)の上に、層にした。このスクロース勾配を、4000×g(例えば、10ml勾配に対しては、SW40ローターにおいて5700rpmで)で20分間、4℃で遠心分離した。ミニ細胞のバンドを、上記のように取り出した。ミニ細胞を、汚染について顕微鏡で検査した。いくらかの全細胞が顕微鏡の視野において観察される場合、ミニ細胞は、さらなるスクロース勾配によって精製されなければならない。汚染が観察されず、そしてミニ細胞が、上記のようにスピンダウンされた。ペレットを、1mlのメチオニンアッセイ培地中に再懸濁させた。光学密度を、600nmにおいて読み取った。ミニ細胞をすぐに使用する場合、アッセイ培地を添加して、A600 2.0/mlの濃度を与える。そうでない場合、ミニ細胞をマイクロ遠心において1〜2分スピンさせ、そしてペレットを、30%のグリセロールを含む十分なアッセイ培地に再懸濁させ、O.D.600=2を与える。−70℃で保存する。ミニ細胞は、一般に、少なくとも6週間活性である。
標識されるべきミニ細胞が新たに調製された場合、これらのミニ細胞を直接使用し得る(O.D.600=2の濃度で)。予め凍結させたミニ細胞は、最初にグリセロールを除去される必要がある。この場合には、ミニ細胞を、マイクロ遠心分離機での遠心分離によって、1〜2分間ペレット化する。ミニ細胞ペレットを、十分なメチオニンアッセイ培地に溶解させて、O.D.600=2を与える。標識されるべき各サンプルに対して、250μlをマイクロ遠心チューブに入れた。5〜10μCiの35S−メチオニン(あるい
は、非放射性メチオニンが使用され得る)を、1〜2μlの容量まで添加し、次いで0.1mM IPTGを添加して、ライブラリーを誘導した。細胞を、37℃で90分間インキュベートした。細胞を氷上で冷却し、そして1〜1.5分間、マイクロ遠心機においてスピンさせた。上清を除去し、そして放射能廃棄物中に処分した。ペレットを、50〜100μlの0.12M Tris(pH7.1)中に再懸濁させた。工程5および6をさらに2回繰り返して、合計で3回の洗浄を行った。最後の洗浄の後に、ペレットを、20μlの0.12M Tris(pH7.1)中に再懸濁させた。
いくつかのスクリーニング方法を利用した。これらの方法の大部分は、以下に概説する類似のプロトコルに従う。
b.このレセプターを免疫プレートに固定する
c.このプレートを、新たに単離したミニ細胞と共にインキュベートする
d.結合していないミニ細胞を洗浄除去する
e.ミニ細胞をこのプレートから溶出し、そして2回目のスクリーニングのために、単離したプラスミドを、新たなミニ細胞株DS410に形質転換する。次いで、選択された「陽性」クローンを、二次ライブラリーに構築する。
ミニ細胞(2A600/ml)を1mlの0.5Mギ酸(これは、プロリンとグリシンとの間を切断し、そしてディスプレイタンパク質からライブラリーを放出する)中に再懸濁させ、次いで1KDカットオフのフィルトロン(filtron)NANOSEPTMフィルタを通して濾過して、1000ダルトンのMWより大きいペプチドを単離した。サンプルを、減圧下6N HCl中で、104℃で18時間加水分解した。この加水分解したサンプルを減圧下で乾燥させ、次いでアミノ酸分析緩衝剤中に0.5mlに再懸濁させた。これらのサンプルを、Beckman自動アミノ酸分析器で、0.2Mクエン酸ナトリウム(pH1.5)を溶出緩衝液として使用して、アミノ酸含有量について分析した。その結果(表1、以下に示される)は、予測どおりに、アミノ酸がこのサンプル全体に均一に分布していたことを示す(ser、thr、trpおよびmetは、これらの条件下では不安定であり、そして過度の分解を受ける)。
FACS緩衝液(1% BSAまたは5% FBSのいずれかで補充され、そして0.05%のNaN3を含むPBS)を用いる回数。ペレットを、約50μl(または1回より多い分析が、単一のサンプルについて行われる場合、それ以上)のFACS緩衝液での最終洗浄から懸濁する。約50μlの細胞懸濁物を、10μlの抗体溶液に添加し、そして穏やかに懸濁する。使用に適切な抗体濃度を、この工程の前に決定する。この懸濁物を約30分間にわたって氷上に置く。次いで、細胞をFACS緩衝液で2〜3回洗浄し、そして200〜300μlのFACS緩衝液中に懸濁する。細胞を、(約1:100の細胞:ミニ細胞(minicell)の比で)FITC標識ミニ細胞(PBS中、2O.D./mlで)と共に、室温で15分間インキュベートする(生/死の識別のために、約10μlのヨウ化プロピジウム(PI)溶液(ストック溶液、10μg/ml)を添加する)。細胞が固定されている場合、PIは添加しなかった。
低い角度、細胞内の顆粒構造の量にほぼ比例する直角(90度)の散乱強度、およびいくつかの波長での蛍光強度)を同時に測定する。
マウスの大腿および脛骨由来の骨髄を、当業者に公知の方法によって調製する。この骨髄を、フラッシュし、そして23ゲージ針を使用して、5mlの染色培地に懸濁し、そしてナイロンメッシュを通して、5mlのチューブに濾過する。この細胞を、遠心分離(300×g)によりペレット化し、そしてACK低浸透圧性溶解溶液(赤血球溶解緩衝液−0.15M NH4Cl、1mM KHCO3、0.1mM Na2EDTA、pH7.3−100μl/マウス)に再懸濁し、約5分間氷上に置き、そして5mlのHBSS(またはPBS+2%FCS)で洗浄し、そしてスピンする。次いで、この溶液を、滴定により決定される適切な抗体希釈物および緩衝液の「系統カクテル」に再懸濁する。次いで、この混合物を、4℃で、回転プラットホームで、30分間インキュベートする。系統抗体の非特異的結合を最小にするために、この混合物を、最初に血清クッション(FCS)を通して、2回洗浄およびスピンする。得られたペレットを、約3mlのHBSSに再懸濁する。DYNABEADSTMを、1:1のビーズ/細胞比に添加し(1ml)、そして回転プラットホームで、30分間4℃でインキュベートする。
以下は、上記のように単離および特徴付けされた生体活性ペプチドの表(表2)である。
Claims (1)
- 結合パートナーに結合されたミニ細胞パートナーを同定するための方法であって、以下の工程:
(a)外膜を含むミニ細胞中の融合タンパク質を発現する工程であって、ここで、該融合タンパク質が、キメラ遺伝子によってコードされ、該キメラ遺伝子が、以下:
該外膜への該融合タンパク質の結合を媒介する第1ペプチドをコードするDNAフラグメント、および
第2ペプチドをコードするDNAフラグメント、
を含む、工程;
(b)該工程(a)のミニ細胞宿主を、結合パートナーに接触する工程;および
(c)該結合パートナーに結合される該ミニ細胞宿主を同定する工程、
を包含する、方法。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US27403901P | 2001-03-07 | 2001-03-07 | |
US30694601P | 2001-07-20 | 2001-07-20 |
Related Parent Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2002571815A Division JP4295513B2 (ja) | 2001-03-07 | 2002-03-06 | ミニ細胞ディスプレイを用いるペプチドディスプレイライブラリーをスクリーニングする方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2005218451A true JP2005218451A (ja) | 2005-08-18 |
Family
ID=26956571
Family Applications (3)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2002571815A Expired - Fee Related JP4295513B2 (ja) | 2001-03-07 | 2002-03-06 | ミニ細胞ディスプレイを用いるペプチドディスプレイライブラリーをスクリーニングする方法 |
JP2005059665A Pending JP2005218451A (ja) | 2001-03-07 | 2005-03-03 | ミニ細胞ディスプレイを用いるペプチドディスプレイライブラリーをスクリーニングする方法 |
JP2008243424A Pending JP2009017887A (ja) | 2001-03-07 | 2008-09-22 | ミニ細胞ディスプレイを用いるペプチドディスプレイライブラリーをスクリーニングする方法 |
Family Applications Before (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2002571815A Expired - Fee Related JP4295513B2 (ja) | 2001-03-07 | 2002-03-06 | ミニ細胞ディスプレイを用いるペプチドディスプレイライブラリーをスクリーニングする方法 |
Family Applications After (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2008243424A Pending JP2009017887A (ja) | 2001-03-07 | 2008-09-22 | ミニ細胞ディスプレイを用いるペプチドディスプレイライブラリーをスクリーニングする方法 |
Country Status (9)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US7125679B2 (ja) |
EP (1) | EP1372721A4 (ja) |
JP (3) | JP4295513B2 (ja) |
AU (2) | AU2002254134B2 (ja) |
BR (1) | BR0208051A (ja) |
CA (1) | CA2440649A1 (ja) |
IL (1) | IL157794A0 (ja) |
NZ (1) | NZ528250A (ja) |
WO (1) | WO2002072759A2 (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2004537975A (ja) * | 2001-03-07 | 2004-12-24 | チルドレンズ メディカル センター コーポレーション | ミニ細胞ディスプレイを用いるペプチドディスプレイライブラリーをスクリーニングする方法 |
Families Citing this family (37)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US7396822B2 (en) | 2001-05-24 | 2008-07-08 | Vaxiion Therapeutics, Inc. | Immunogenic minicells and methods of use |
US20030194798A1 (en) * | 2001-05-24 | 2003-10-16 | Surber Mark W. | Minicell compositions and methods |
US20030203411A1 (en) * | 2001-06-05 | 2003-10-30 | Sabbadini Roger A. | Methods of minicell-based delivery |
US20030211086A1 (en) * | 2001-06-05 | 2003-11-13 | Neil Berkley | Minicell-based selective absorption |
US20030199089A1 (en) * | 2001-06-05 | 2003-10-23 | Surber Mark W. | Membrane to membrane delivery |
US20030202937A1 (en) * | 2001-06-05 | 2003-10-30 | Sabbadini Roger A. | Minicell-based diagnostics |
US20030194714A1 (en) * | 2001-06-05 | 2003-10-16 | Sabbadini Roger A. | Minicell-based transformation |
US20030166099A1 (en) * | 2001-06-05 | 2003-09-04 | Sabbadini Roger A. | Minicells comprising membrane proteins |
PT2302063T (pt) * | 2001-10-15 | 2016-07-28 | Engeneic Molecular Delivery Pty Ltd | Minicélulas intactas, como vetores para a transferência de adn e terapêutica genética in vitro e in vivo |
US20030203481A1 (en) * | 2002-02-25 | 2003-10-30 | Surber Mark W. | Conjugated minicells |
AU2008201082C1 (en) * | 2002-02-25 | 2014-06-26 | Vaxiion Therapeutics, Llc | Minicell compositions and methods |
WO2003072014A2 (en) * | 2002-02-25 | 2003-09-04 | Mpex Bioscience, Inc. | Minicell compositions and methods |
US20030232335A1 (en) * | 2002-02-25 | 2003-12-18 | Surber Mark W. | Minicell-based screening for compounds and proteins that modulate the activity of signalling proteins |
US20030207833A1 (en) * | 2002-02-25 | 2003-11-06 | Neil Berkley | Pharmaceutical compositions with minicells |
US20030224369A1 (en) * | 2002-02-25 | 2003-12-04 | Surber Mark W. | Reverse screening and target identification with minicells |
US20030224444A1 (en) * | 2002-02-25 | 2003-12-04 | Sabbadini Roger A. | Antibodies to native conformations of membrane proteins |
US20040005700A1 (en) * | 2002-05-28 | 2004-01-08 | Surber Mark W. | Poroplasts |
WO2004013311A2 (en) * | 2002-08-06 | 2004-02-12 | Diadexus, Inc. | Compositions and methods relating to ovarian specific genes and proteins |
EP1460088A1 (en) * | 2003-03-21 | 2004-09-22 | Biotest AG | Humanized anti-CD4 antibody with immunosuppressive properties |
WO2004098627A1 (en) * | 2003-05-06 | 2004-11-18 | Royal College Of Surgeons In Ireland | Inhibition of platelet aggregation through acyclovir and two peptide antagonists |
US20040248109A1 (en) * | 2003-06-09 | 2004-12-09 | Lawrence Greenfield | Methods for selecting protein binding moieties |
US7611885B2 (en) * | 2003-06-24 | 2009-11-03 | Engeneic Molecular Delivery Pty, Ltd. | Pharmaceutically compatible method for purifying intact bacterial minicells |
PL1694361T3 (pl) | 2003-12-09 | 2011-08-31 | Engeneic Molecular Delivery Pty Ltd | Ukierunkowane dostarczanie genów do niefagocytujących komórek ssaczych z zastosowaniem nienaruszonych minikomórek pochodzących od bakterii |
US8772013B2 (en) | 2004-02-02 | 2014-07-08 | Engeneic Molecular Delivery Pty Ltd | Methods for targeted in vitro and in vivo drug delivery to mammalian cells via bacterially derived intact minicells |
ME02251B (me) | 2004-02-02 | 2015-12-31 | Engeneic Molecular Delivery Pty Ltd | Kompozicije i postupci in vitro i in vivo, ciljanog oslobađanja leka u ćelijama sisara, preko intaktnih minićelija izvedenih iz bakterija |
US20060002956A1 (en) * | 2004-04-05 | 2006-01-05 | Surber Mark W | Minicells as vaccines |
NZ553910A (en) | 2004-08-26 | 2009-05-31 | Engeneic Molecular Delivery Pty | Delivering functional nucleic acids to mammalian cells via bacterially derived, intact minicells |
PT2712618T (pt) | 2006-06-23 | 2017-01-26 | Engeneic Molecular Delivery Pty Ltd | Entrega localizada de fármacos, ácidos nucleicos terapêuticos e ácidos nucleicos funcionais a células de mamíferos por meio de células bacterianas exterminadas intactas |
US8642046B2 (en) * | 2007-10-09 | 2014-02-04 | Tufts University | Cholera vaccines |
WO2009121690A1 (en) * | 2008-03-13 | 2009-10-08 | Biotest Ag | Agent for treating disease |
RU2540018C2 (ru) * | 2008-03-13 | 2015-01-27 | Биотест Аг | Средство для лечения заболевания |
CN102027016A (zh) * | 2008-03-13 | 2011-04-20 | 生物测试股份公司 | 一种治疗疾病的试剂 |
KR20110061630A (ko) * | 2008-09-29 | 2011-06-09 | 바이오테스트 아게 | 질병 치료용 조성물 |
GB0920944D0 (en) | 2009-11-30 | 2010-01-13 | Biotest Ag | Agents for treating disease |
EP2547359B1 (en) | 2010-03-15 | 2016-03-09 | The Board of Trustees of the University of Illionis | Inhibitors of beta integrin-g protein alpha subunit binding interactions |
JP6199746B2 (ja) | 2011-02-15 | 2017-09-20 | バキシオン セラピューティクス,リミテッド ライアビリティ カンパニー | 抗体およびFc含有標的化分子に基づく生理活性分子の標的送達のための細菌ミニ細胞による治療用組成物および方法 |
JP6759109B2 (ja) * | 2014-05-21 | 2020-09-23 | プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ | Ras抑制性ペプチドおよびその使用 |
Family Cites Families (23)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5223409A (en) | 1988-09-02 | 1993-06-29 | Protein Engineering Corp. | Directed evolution of novel binding proteins |
US5427908A (en) | 1990-05-01 | 1995-06-27 | Affymax Technologies N.V. | Recombinant library screening methods |
WO1992020791A1 (en) | 1990-07-10 | 1992-11-26 | Cambridge Antibody Technology Limited | Methods for producing members of specific binding pairs |
US5780279A (en) | 1990-12-03 | 1998-07-14 | Genentech, Inc. | Method of selection of proteolytic cleavage sites by directed evolution and phagemid display |
US5436228A (en) | 1990-12-12 | 1995-07-25 | Postlethwaite; Arnold E. | Chemotactic wound healing peptides |
EP0625052A4 (en) * | 1991-10-21 | 1995-07-19 | Medimmune Inc | SECRETION SIGNAL OF LIPOPROTEIN-ENCODING DNA CONTAINING BACTERIAL EXPRESSION VECTOR. |
US5866344A (en) * | 1991-11-15 | 1999-02-02 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Antibody selection methods using cell surface expressed libraries |
US5348867A (en) * | 1991-11-15 | 1994-09-20 | George Georgiou | Expression of proteins on bacterial surface |
US5587471A (en) | 1994-01-11 | 1996-12-24 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Method of making oligonucleotide libraries |
US5516637A (en) | 1994-06-10 | 1996-05-14 | Dade International Inc. | Method involving display of protein binding pairs on the surface of bacterial pili and bacteriophage |
US6017719A (en) | 1994-06-14 | 2000-01-25 | Nexell Therapeutics, Inc. | Positive and positive/negative cell selection mediated by peptide release |
US6040431A (en) * | 1995-06-07 | 2000-03-21 | Stryker Corporation | Single chain analogs of the TGF-β superfamily (morphons) |
WO1997008553A1 (en) | 1995-08-22 | 1997-03-06 | The Regents Of The University Of California | Targeting of proteins to the cell wall of gram-positive bacteria |
US5925354A (en) * | 1995-11-30 | 1999-07-20 | Michigan State University | Riboflavin mutants as vaccines against Actinobacillus pleuropneumoniae |
US6031071A (en) | 1996-01-24 | 2000-02-29 | Biophage, Inc. | Methods of generating novel peptides |
US6245331B1 (en) * | 1997-01-02 | 2001-06-12 | New York Univ. Medical Center | Early detection of mycobacterial disease |
GB9703369D0 (en) | 1997-02-18 | 1997-04-09 | Lindqvist Bjorn H | Process |
US6057098A (en) | 1997-04-04 | 2000-05-02 | Biosite Diagnostics, Inc. | Polyvalent display libraries |
PT985032E (pt) | 1997-05-28 | 2004-02-27 | Discerna Ltd | Complexos ribossomicos como particulas de seleccao para apresentacao in vitro e evolucao de proteinas |
US6054312A (en) | 1997-08-29 | 2000-04-25 | Selective Genetics, Inc. | Receptor-mediated gene delivery using bacteriophage vectors |
GB9722131D0 (en) | 1997-10-20 | 1997-12-17 | Medical Res Council | Method |
EP0916726A1 (en) | 1997-11-13 | 1999-05-19 | Rijksuniversiteit te Groningen | Attaching substances to micro-organisms |
WO2002072759A2 (en) * | 2001-03-07 | 2002-09-19 | Children's Medical Center Corporation | Method to screen peptide display libraries using minicell display |
-
2002
- 2002-03-06 WO PCT/US2002/006921 patent/WO2002072759A2/en active Application Filing
- 2002-03-06 IL IL15779402A patent/IL157794A0/xx unknown
- 2002-03-06 BR BRPI0208051-6A patent/BR0208051A/pt unknown
- 2002-03-06 US US10/091,724 patent/US7125679B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2002-03-06 NZ NZ528250A patent/NZ528250A/en unknown
- 2002-03-06 AU AU2002254134A patent/AU2002254134B2/en not_active Ceased
- 2002-03-06 JP JP2002571815A patent/JP4295513B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2002-03-06 CA CA002440649A patent/CA2440649A1/en not_active Abandoned
- 2002-03-06 EP EP02723350A patent/EP1372721A4/en not_active Withdrawn
-
2005
- 2005-03-03 JP JP2005059665A patent/JP2005218451A/ja active Pending
-
2006
- 2006-03-07 AU AU2006200976A patent/AU2006200976B2/en not_active Ceased
- 2006-09-18 US US11/522,510 patent/US20070072221A1/en not_active Abandoned
-
2008
- 2008-09-22 JP JP2008243424A patent/JP2009017887A/ja active Pending
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2004537975A (ja) * | 2001-03-07 | 2004-12-24 | チルドレンズ メディカル センター コーポレーション | ミニ細胞ディスプレイを用いるペプチドディスプレイライブラリーをスクリーニングする方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
AU2006200976A1 (en) | 2006-03-23 |
BR0208051A (pt) | 2006-02-21 |
JP4295513B2 (ja) | 2009-07-15 |
IL157794A0 (en) | 2004-03-28 |
US7125679B2 (en) | 2006-10-24 |
EP1372721A4 (en) | 2008-04-02 |
JP2004537975A (ja) | 2004-12-24 |
AU2006200976B2 (en) | 2007-11-29 |
US20070072221A1 (en) | 2007-03-29 |
US20030105310A1 (en) | 2003-06-05 |
AU2002254134B2 (en) | 2006-06-01 |
WO2002072759A2 (en) | 2002-09-19 |
NZ528250A (en) | 2006-09-29 |
EP1372721A2 (en) | 2004-01-02 |
WO2002072759A3 (en) | 2003-10-23 |
CA2440649A1 (en) | 2002-09-19 |
JP2009017887A (ja) | 2009-01-29 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP4295513B2 (ja) | ミニ細胞ディスプレイを用いるペプチドディスプレイライブラリーをスクリーニングする方法 | |
AU2002254134A1 (en) | Method to screen peptide display libraries using minicell display | |
US5733731A (en) | Peptide library and screening method | |
US7393318B2 (en) | Methods and compositions for interaction trap assays | |
EP1800133B1 (en) | Methods for antibody library screening | |
JP2002508977A (ja) | タンパク質の酵母細胞表面ディスプレイおよびその使用 | |
JP2011101649A (ja) | 高親和性tcrタンパク質および方法 | |
US6420110B1 (en) | Methods and reagents for isolating biologically active peptides | |
US20090215640A1 (en) | Methods for identifying ligands for stem cells and cells derived therefrom | |
US7297491B2 (en) | Methods and compositions for interaction trap assays | |
US20020106783A1 (en) | Bacterial multi-hybrid system and applications | |
WO2010030425A1 (en) | Open-reading-frame (orf) phage display | |
US20040010116A1 (en) | Minicell display and products therefrom | |
JP2009131266A (ja) | タンパク質結合部分を選択するための方法 | |
AU774332B2 (en) | Methods and reagents for identifying synthetic genetic elements | |
WO1999050462A1 (en) | Aptamer based bacterial inhibition systems (abbis) | |
WO2002046213A2 (en) | Methods and reagents for isolating angiogenic modulators | |
WO2003061596A2 (en) | Methods and reagents for generating chimeric serum peptide carri ers |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20071016 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20080115 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20080118 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20080204 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20080207 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20080416 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20080625 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20090106 |