JP2011101649A - 高親和性tcrタンパク質および方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 これら高親和性TCRは、T細胞レセプターコード配列を変異誘発して、T細胞レセプタータンパク質コード配列の変異体の種々の集団を作製する工程;このT細胞レセプター変異体コード配列を酵母細胞に形質変換する工程;この酵母細胞の表面上にこのT細胞レセプター変異体コード配列の発現を誘導する工程;および野生型T細胞レセプタータンパク質よりもペプチド/MHCリガンドに対してより高い親和性を有するT細胞レセプター変異物を発現する細胞を選択する工程によって取得された。この高親和性TCRは、抗体または単鎖抗体の代わりに使用され得る。
【選択図】なし
Description
本願は、米国特許第09/009,388号(1998年1月20日出願)の一部継続である。本願は、米国予備出願第60/169,179号(1999年12月6日出願)の利益を主張する。
本発明は、少なくとも一部分、国立衛生研究所からの財政的支援でなされた。従って、米国政府は、本発明に特定の権利を有する。
本発明の分野は、分子生物学であり、詳細には、組換え宿主細胞の細胞表面上に提示された免疫細胞レセプターのコンビナトリアルライブラリーの場合に関する。より詳細には、本発明は、組換え酵母細胞の表面上に提示された高い親和性のT細胞レセプタータンパク質のライブラリー、可溶性の高い親和性のTCRレセプタータンパク質、特定のペプチド/MHC対への高い親和性の結合に関して選択された高い親和性のTCRタンパク質、MHC決定基の非存在下における特定の抗原への結合に関して選択された高い親和性のTCRタンパク質、ならびに数ある適用の中で診断方法および画像化アッセイにおける選択された高い親和性のTCR誘導体の使用に関する。
本発明は、組換え宿主細胞、例えば、酵母細胞(望ましくはSaccharomyces cerevisiae)の表面上に提示された免疫T細胞レセプターポリペプチドのコンビナトリアルライブラリーを提供する。このようなライブラリーから、高い親和性のTCRポリペプチド(同族のリガンド:主要組織適合遺伝子複合体のタンパク質(pMHC)に結合するペプチドの複合体に関して、野生型よりも高い親和性を示すもの)が単離され得る。望ましくは、pMHCに対するTCRペプチドの親和性は、例えば、当該分野で公知の方法によって測定される場合、約107〜約1010の解離定数に反映される。可溶性の高い親和性のTCRをコードする核酸を含むDNAライブラリーが提供され、ここで、このTCRは、変異体TCRコード配列を作製するためのTCRを変異誘発すること;変異体TCRの変異体TCRコード配列を含むDNAを酵母細胞に形質転換すること;この変異体TCRが酵母細胞の表面上に提示されるようにこの変異体TCRコード配列の発現を誘導すること;この酵母細胞を、ペプチド/MHCリガンドを結合する蛍光標識と接触して、選択された酵母細胞を産生すること;および、最も高い蛍光を示す酵母細胞を単離する、方法によって作製される。野生型T細胞レセプタータンパク質よりもペプチド/MHCリガンドに対して高い親和性を有する、酵母細胞の表面上に提示されたT細胞レセプタータンパク質のライブラリーがまた、提供され、ここで、このライブラリーは、T細胞レセプタータンパク質コード配列を変異誘発して変化に富むT細胞レセプタータンパク質コード配列変異体の集団を作製すること;このT細胞レセプター変異体コード配列を、酵母細胞に形質転換すること;酵母細胞の表面上でこのT細胞レセプター変異体コード配列の発現を誘導すること;そして、野生型T細胞レセプタータンパク質よりもペプチド/MHCリガンドに対して高い親和性を有する、T細胞レセプター変異体を発現する細胞が選択することによって形成される。
本発明は、例えば、以下を提供する:
(項目1) リガンドを同定するために高親和性TCRを使用するための方法であって、以下:
高親和性TCRを標識化する工程;
該標識化TCRをリガンドと接触させる工程;
該標識化TCRと結合する該リガンドを同定する工程、
を包含する、方法。
(項目2) 前記標識が、蛍光化合物、化学発光化合物、放射性同位元素および発色団からなる群より選択される、項目1に記載の方法。
(項目3) 前記リガンドが、ペプチド/MHCリガンドである、項目1に記載の方法。
(項目4) 選択されたペプチド/MHCリガンドに結合するために高親和性TCRを使用するための方法であって、以下:
該高親和性TCRを、該選択されたペプチド/MHCリガンドに結合する標識で標識化する工程;
該標識化高親和性TCRを、MHC分子を含む細胞と接触させる工程、
を包含する、方法。
(項目5) 前記標識が、蛍光化合物、化学発光化合物、放射性同位元素および発色団からなる群より選択される、項目4に記載の方法。
(項目6) 細胞の表面上の特定のペプチド/MHC分子に対する診断用プローブとして高親和性TCRを使用するための方法であって、以下:
高親和性TCRを、特定のペプチド/MHCリガンドに結合する標識で標識化する工程;
該TCRを細胞と接触させる工程;
該標識を検出する工程、
を包含する、方法。
(項目7) 診断試験のためにpMHCに結合する高親和性TCRを使用するための方法であって、以下:
該高親和性TCRを検出可能な標識で標識化する工程;
該高親和性TCRを細胞と接触させる工程;
該標識を検出する工程、
を包含する、方法。
(項目8) 前記存在する標識の数が検出される、項目7に記載の方法。
(項目9) 前記標識の位置が、生物体において検出される、項目7に記載の方法。
(項目10) 前記標識が、特定のペプチド/MHCリガンドに結合し、それによって、特定のペプチド/MHCリガンドを発現する細胞が標的化される、項目7に記載の方法。
(項目11) 細胞の自己免疫破壊をブロックするための方法であって、標的細胞の表面上のTリンパ球によって認識される部位に対して高い親和性を有するTCRを、細胞と接触させる工程であって、それによって、細胞の自己免疫破壊がブロックされる、工程、
を包含する、方法。
(項目12) 疾患を処置するために高親和性TCRを使用するための方法であって、以下:
新生物細胞表面マーカーに対する高い親和性を有するTCRを、治療化合物と結合させる工程;および、
該TCRを細胞と接触させる工程、
を包含する、方法。
(項目13) 病原体を不活性化するために高親和性TCRを使用する方法であって、以下:
病原体に対して毒性のある分子を、高親和性TCRに結合する工程;および、
該TCRを、該病原体を発現する細胞と接触させる工程、
を包含する、方法。
(項目14) 前記病原体が、ウイルス、細菌および原生動物からなる群より選択される、項目13に記載の方法。
(項目15) 野生型TCRよりもリガンドに対して高い親和性を有する、可溶性T細胞レセプター(TCR)。
(項目16) 前記リガンドが、ペプチド/MHCリガンドである、項目15に記載の可溶性高親和性TCR。
(項目17) 項目15に記載の可溶性高親和性TCRであって、該高親和性TCRが、以下:
TCRを変異誘発して、変異体TCRコード配列を作製する工程;
変異体TCRについての該変異体TCRコード配列を含むDNAを、酵母細胞に形質転換する工程;
該変異体TCRコード配列の発現を誘導する工程であって、その結果、該変異体TCRが、該酵母細胞の表面上に提示される、工程;
該酵母細胞を、蛍光標識と接触させる工程であって、該蛍光標識は、ペプチド/MHCリガンドに結合して、選択された酵母細胞を産生する、工程;および
最も高い蛍光を示す酵母細胞を単離する工程、
を包含する方法によって作製される、可溶性高親和性TCR。
(項目18) 酵母ディスプレイによって単離された、項目15に記載の可溶性高親和性TCR。
(項目19) 可溶性高親和性TCRをコードする核酸を含む、DNAライブラリーであって、該TCRが、以下:
TCRを変異誘発して、変異体TCRコード配列を作製する工程;
変異体TCRについての該変異体TCRコード配列を含むDNAを、酵母細胞に形質転換する工程;
該変異体TCRコード配列の発現を誘導する工程であって、その結果、該変異体TCRが、該酵母細胞の表面上に提示される工程;
該酵母細胞を、蛍光標識と接触させる工程であって、該蛍光標識は、ペプチド/MHCリガンドに結合して、選択された酵母細胞を産生する、工程;および
最も高い蛍光を示す酵母細胞を単離する工程、
を包含する方法によって作製される、
DNAライブラリー。
(項目20) 野生型T細胞レセプタータンパク質よりもペプチド/MHCリガンドに対して高い親和性を有する、酵母細胞の表面上に提示されたT細胞レセプタータンパク質のライブラリーであって、ここで、該ライブラリーは、
T細胞レセプタータンパク質コード配列を変異誘発して、T細胞レセプタータンパク質コード配列の変異体の多様な集団を生成する工程;
該T細胞レセプター変異体コード配列を、酵母細胞に形質転換する工程;
酵母細胞の表面上での該T細胞レセプター変異体コード配列の発現を誘導する工程;および、
野生型T細胞レセプタータンパク質よりもペプチド/MHCリガンドに対して高い親和性を有するT細胞レセプター変異体を発現する細胞を選択する工程、
によって形成される、
ライブラリー。
(項目21) T細胞の表面上に高親和性TCR変異体の発現を可能にする系に、該高親和性TCR変異体についての遺伝子をクローニングする方法であって、以下:
TCRを変異誘発して、高親和性TCR変異体を作製する工程;
該TCR変異体を、ベクターにクローニングする工程;
該ベクターを、T細胞にトランスフェクトする工程;
該T細胞の表面上に該高親和性TCR変異体を発現させる工程、
を包含する、方法。
(項目22) 野生型よりもペプチド/MHCリガンドによって活性化されるT細胞を選択する工程をさらに包含する、項目21に記載の方法。
(項目23) 前記トランスフェクト/感染されたT細胞が、選択されたペプチド保有MHC細胞の認識のために使用される、項目21に記載の方法。
(項目24) 項目21の方法によって作製された、T細胞。
Cancer Detection and Therapy、BaldwinおよびByers編、159頁−179頁、Academic Press、1985を参照のこと。
Genetics,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,New York;Old and Primrose(1981)Principles of Gene
Manipulation,University of California Press,Berkeley;SchleifおよびWensink(1982)Practical Methods in Molecular Biology;Glover(編)(1985)DNA Cloning第IおよびII号、IRL Press,Oxford,UK;Hames and
Higgins(編)(1985)Nucleic Acid Hybridization,IRL Press,Oxford,UK;ならびにSetlowおよびHollaender(1979)Genetic Engineering:Principles and Methods、1〜4号、Plenum Press,New York。ここで使用した略号および命名法は、この分野で標準的とみなされ、そしてここで引用される文献のような専門の文献中に通常用いられている。
指向性進化のための足場として用いた2C scTCR(T7)は、TCRの安定性を増大させるがpMHC結合を可能にすることが示されている、6つの変異体(βG17E、βG42E βL81S,αL43P、αW82R、およびαI118N)を含んだ[例えば、Shusta,E.V.ら(1999)J.Mol.Biol.292,949〜956]。
下線を付した塩基(配列番号4の最初から11番目のG、終わりから13番目のG)は、特有のBamHIおよびEagI制限部位を誘導するサイレント変異の位置を示す。精製したPCR産物を、NdeIおよびBamHIを用いて消化し、そしてNdeI−BamHIで消化したT7/pCT302に連結した[BoderおよびWittrup(1997)前出;Kiekeら(1999)前出;Shustaら(1999)前出]。連結混合物をDH10Bエレクトロ−コンピテントなE.coli(Gibco BRI,Gaithersburg,MD)中に形質転換し、そして形質転換体を、アンピシリン100μg/ml補充した250mLのLB中にプールし、そして37℃で一晩増殖した。プラスミドDNAを、GietzおよびSchiestl[Geitzら(1995)Yeast 11:355〜360]の方法によって、酵母(Saccharomyces cerevisiae)株EBY100中に形質転換した。
酵母ライブラリー[Shustaら(1999)Curr.Opin.Biotechnol.10:117〜122]を、SD−CAA(2%デキストロース、0.67%酵母窒素ベース、1%カザミノ酸(Difco、Livonia,MI))中で、30℃で、OD600=4.0まで増殖した。表面scTCR発現を誘導するため、酵母を遠心分離によってペレット化し、SG−CAA(2%ガラクトース、0.67%酵母窒素ベース、1%カザミノ酸)中で、OD600=1.0まで再懸濁し、そして20℃で24時間インキュベートした。一般に、約107細胞/チューブを、50μlのQL9/Ld/IgGダイマー[Dal Portoら(1993)前出](これは0.5mg/mlBSA(PBS−BSA)を補充したリン酸緩衝化生理食塩水(pH7.4)中で希釈してある)とともに、1時間氷上でインキュベートした。インキュベーション後、細胞を洗浄し、そしてFITC結合体化ヤギ抗マウスIgG F(ab7)2(Kirkegaard&Perry,Gaithersburg,MD)含有PBS−BSAを用いて30分間標識した。次いで、ソーティングの直前に、PBS−BSA中で酵母を洗浄し、そして再懸濁した。コールター753ベンチを用いたFACSソーティングによって最高の蛍光を示す細胞を、単離した。単離後、ソーティングした細胞をSD−CAA中で増殖し、そして以降の回の選択のためにSG−CAA中で誘導した。引き続く4回の総ソーティングを実施した。染色に用いたQL9/Ld/IgGダイマーの濃度は、ソート1〜3については50μg/mlであり、そして最終のソートについては0.5μg/mlであった。各ソートから単離した総細胞のパーセンテージは、それぞれ5.55%、2.68%、2.56%および0.58%であった。ソート3および4のアリコートをSD−CAA上にプレートし、個々のクローンを単離した。クローンは、コールターEpicsXL装置を用いたフローサイトメトリーにより分析した。
T7およびqL2のオープンリーディングフレームを、pCT302 NheI−XhoIから切り出し、そしてNheI−XhoIで消化したpRSGALT(酵母発現プラスミド)に連結した[Shustaら(1999)前出]。ライゲーション(連結)したプラスミドをDH10Bエレクトロ−コンピテントなE.coli(Gibco BRL)中に形質転換した。プラスミドDNAを細菌培養物から単離し、そしてSaccharomyces cerevisiae BJ5464(α ura3−52 trp1 leu2 1 his3 200 pep4::HIS3 prb1 1.6R can1GAL)中に形質転換した[Shustaら(1999)前出]。酵母クローンを30℃で48時間1リットルのSD−CAA/Trp(20mg/mL トリプトファン)中で増殖した。scTCR分泌を誘導するため、細胞を4000×gでの遠心分離によってペレット化し、1mg/mlBSAを補充した1リットルのSG−CAA/Trp中に再懸濁し、そして20℃で72時間インキュベートした。培養上清を4000×gでの遠心分離によって回収し、約50mlに濃縮し、そしてPBS、pH8.0に対して透析した。6His−タグ化scTCRを、ネイティブなニッケルアフィニティークロマトグラフィー(Ni−NTA Superflow,Qiagen,Valencia,CA;5mMおよび20mM イミダゾール、pH8.0洗浄;250mMイミダゾール溶出)によって精製した[Shustaら(1999)前出]。
QL9/Ldに対する可溶性scTCRの結合を、以前に記載した競合様式でモニターした[Manningら(1998)前出;Sykulevら(1994)前出]。ペプチド−上方制御(アップレギュレート)T2−Ld細胞(3×105/ウェル)を、125I標識化抗LdFabs(30−5−7)および種々の濃度のscTCRの存在下で、氷上で1時間インキュベートした。結合および未結合の125I30−5−7Fabをオリーブオイル/ジブチルフタラートによる遠心分離によって分離した。阻害曲線を作成し、最大阻害の50%を生じるインヒビター濃度を決定した。解離定数をChengおよびPursoffの式を用いて算出した[Cheng(1973)Biochem.Pharm.22:3099〜3108]。細胞結合pMHCに対するscTCRの直接結合をモニターするため、ペプチド−アップレギュレートT2−Ld細胞(5×105/チューブ)を、ビオチン化可溶性scTCRとともに、氷上で40分間インキュベートし、続いてストレプトアビジン−フィコエリトリン(PharMingen,San
Diego,CA)を用いて30分間染色した。フローサイトメトリーによって細胞蛍光を検出した。
TCRのCDR3α領域の酵母ディスプレイ変異体の同じライブラリーを用いて、異なるMHC分子に対して結合した異なるペプチドになお特異的である、より親和性の高いTCRについて選択することが可能であった。この場合、SIYRと呼ばれるペプチド(SIYRYYGL(配列番号5))を、Kbと呼ばれるMHC分子に結合し、そしてこのリガンド複合体を、蛍光形態中で用いて、フローサイトメトリーにより選択した。高い親和性のTCRを発現する16のクローンを、配列決定した。各々のクローンは、CDR3α領域において異なる配列を示した(表2)。
同じTCR足場が、同じMHCに対して結合した異なるペプチドに対しても、より高い親和性の形態を単離するために用いられ得るか否かを決定するため、本発明者らは、Kbに結合した、dEV8(EQYKFYSV(配列番号6))と呼ばれるペプチドを用いてTCR CDR3αライブラリーをスクリーニングした。ビオチン化dEV8/Kbリガンド(その後、フィコエリトリン−ストレプトビアジン,PE−SA)を用いたフローサイトメトリーによるいくつかのソート後、dEV8/Kbに結合した酵母細胞の有意な富化が存在した(図7においてPEレベルによって示されるように)。
上記の本実施例は、CDR3と呼ばれるα鎖の領域内で変異したTCRのライブラリーを用いた。TCRの他の領域がまた、より高い親和性のTCRを生成するように変異され得ることを示すため、β鎖のCDR3領域の5連続アミノ酸残基内のランダム変異のライブラリーを、出発物質としてqL2 TCR変異体を用いて、生成した。次いで、このライブラリーを、qL2変異体で検出した濃度以下のQL9/Ldリガンドで選択した。5つの酵母クローン(フローサイトメトリーによって選択した)を配列決定したところ、各々は、異なるヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示した(図8)。変異された5つのアミノ酸領域内には配列の顕著な保存が存在しており、このことは、この配列モチーフが高い親和性について最適であったことを示唆していた。本発明者らは、特定のpMHCに対して、より高い親和性を有する誘導体を生じるためにTCRの異なる領域を変異することが可能であると結論付ける。
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