JP2012065672A - 高親和性tcrタンパク質および方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】これら高親和性TCRは、T細胞レセプターコード配列を変異誘発して、T細胞レセプタータンパク質コード配列の変異体の種々の集団を作製する工程;このT細胞レセプター変異体コード配列を酵母細胞に形質変換する工程;この酵母細胞の表面上にこのT細胞レセプター変異体コード配列の発現を誘導する工程;および野生型T細胞レセプタータンパク質よりもペプチド/MHCリガンドに対してより高い親和性を有するT細胞レセプター変異物を発現する細胞を選択する工程によって取得された。この高親和性TCRは、抗体または単鎖抗体の代わりに使用され得る。
【選択図】なし
Description
本願は、米国特許第09/009,388号(1998年1月20日出願)の一部継続である。本願は、米国予備出願第60/169,179号(1999年12月6日出願)の利益を主張する。
本発明は、少なくとも一部分、国立衛生研究所からの財政的支援でなされた。従って、米国政府は、本発明に特定の権利を有する。
本発明の分野は、分子生物学であり、詳細には、組換え宿主細胞の細胞表面上に提示された免疫細胞レセプターのコンビナトリアルライブラリーの場合に関する。より詳細には、本発明は、組換え酵母細胞の表面上に提示された高い親和性のT細胞レセプタータンパク質のライブラリー、可溶性の高い親和性のTCRレセプタータンパク質、特定のペプチド/MHC対への高い親和性の結合に関して選択された高い親和性のTCRタンパク質、MHC決定基の非存在下における特定の抗原への結合に関して選択された高い親和性のTCRタンパク質、ならびに数ある適用の中で診断方法および画像化アッセイにおける選択された高い親和性のTCR誘導体の使用に関する。
本発明は、組換え宿主細胞、例えば、酵母細胞(望ましくはSaccharomyces cerevisiae)の表面上に提示された免疫T細胞レセプターポリペプチドのコンビナトリアルライブラリーを提供する。このようなライブラリーから、高い親和性のTCRポリペプチド(同族のリガンド:主要組織適合遺伝子複合体のタンパク質(pMHC)に結合するペプチドの複合体に関して、野生型よりも高い親和性を示すもの)が単離され得る。望ましくは、pMHCに対するTCRペプチドの親和性は、例えば、当該分野で公知の方法によって測定される場合、約107〜約1010の解離定数に反映される。可溶性の高い親和性のTCRをコードする核酸を含むDNAライブラリーが提供され、ここで、このTCRは、変異体TCRコード配列を作製するためのTCRを変異誘発すること;変異体TCRの変異体TCRコード配列を含むDNAを酵母細胞に形質転換すること;この変異体TCRが酵母細胞の表面上に提示されるようにこの変異体TCRコード配列の発現を誘導すること;この酵母細胞を、ペプチド/MHCリガンドを結合する蛍光標識と接触して、選択された酵母細胞を産生すること;および、最も高い蛍光を示す酵母細胞を単離する、方法によって作製される。野生型T細胞レセプタータンパク質よりもペプチド/MHCリガンドに対して高い親和性を有する、酵母細胞の表面上に提示されたT細胞レセプタータンパク質のライブラリーがまた、提供され、ここで、このライブラリーは、T細胞レセプタータンパク質コード配列を変異誘発して変化に富むT細胞レセプタータンパク質コード配列変異体の集団を作製すること;このT細胞レセプター変異体コード配列を、酵母細胞に形質転換すること;酵母細胞の表面上でこのT細胞レセプター変異体コード配列の発現を誘導すること;そして、野生型T細胞レセプタータンパク質よりもペプチド/MHCリガンドに対して高い親和性を有する、T細胞レセプター変異体を発現する細胞が選択することによって形成される。
本願発明は、例えば、以下を提供する:
(項目1) リガンドを同定するために高親和性TCRを使用するための方法であって、以下:
高親和性TCRを標識化する工程;
該標識化TCRをリガンドと接触させる工程;
該標識化TCRと結合する該リガンドを同定する工程、
を包含する、方法。
(項目2) 前記標識が、蛍光化合物、化学発光化合物、放射性同位元素および発色団からなる群より選択される、項目1に記載の方法。
(項目3) 前記リガンドが、ペプチド/MHCリガンドである、項目1に記載の方法。(項目4) 選択されたペプチド/MHCリガンドに結合するために高親和性TCRを使用するための方法であって、以下:
該高親和性TCRを、該選択されたペプチド/MHCリガンドに結合する標識で標識化する工程;
該標識化高親和性TCRを、MHC分子を含む細胞と接触させる工程、
を包含する、方法。
(項目5) 前記標識が、蛍光化合物、化学発光化合物、放射性同位元素および発色団からなる群より選択される、項目4に記載の方法。
(項目6) 細胞の表面上の特定のペプチド/MHC分子に対する診断用プローブとして高親和性TCRを使用するための方法であって、以下:
高親和性TCRを、特定のペプチド/MHCリガンドに結合する標識で標識化する工程;
該TCRを細胞と接触させる工程;
該標識を検出する工程、
を包含する、方法。
(項目7) 診断試験のためにpMHCに結合する高親和性TCRを使用するための方法であって、以下:
該高親和性TCRを検出可能な標識で標識化する工程;
該高親和性TCRを細胞と接触させる工程;
該標識を検出する工程、
を包含する、方法。
(項目8) 前記存在する標識の数が検出される、項目7に記載の方法。
(項目9) 前記標識の位置が、生物体において検出される、項目7に記載の方法。
(項目10) 前記標識が、特定のペプチド/MHCリガンドに結合し、それによって、特定のペプチド/MHCリガンドを発現する細胞が標的化される、項目7に記載の方法。(項目11) 細胞の自己免疫破壊をブロックするための方法であって、標的細胞の表面上のTリンパ球によって認識される部位に対して高い親和性を有するTCRを、細胞と接触させる工程であって、それによって、細胞の自己免疫破壊がブロックされる、工程、
を包含する、方法。
(項目12) 疾患を処置するために高親和性TCRを使用するための方法であって、以下:
新生物細胞表面マーカーに対する高い親和性を有するTCRを、治療化合物と結合させる工程;および、
該TCRを細胞と接触させる工程、
を包含する、方法。
(項目13) 病原体を不活性化するために高親和性TCRを使用する方法であって、以下:
病原体に対して毒性のある分子を、高親和性TCRに結合する工程;および、
該TCRを、該病原体を発現する細胞と接触させる工程、
を包含する、方法。
(項目14) 前記病原体が、ウイルス、細菌および原生動物からなる群より選択される、項目13に記載の方法。
(項目15) 野生型TCRよりもリガンドに対して高い親和性を有する、可溶性T細胞レセプター(TCR)。
(項目16) 前記リガンドが、ペプチド/MHCリガンドである、項目15に記載の可溶性高親和性TCR。
(項目17) 項目15に記載の可溶性高親和性TCRであって、該高親和性TCRが、以下:
TCRを変異誘発して、変異体TCRコード配列を作製する工程;
変異体TCRについての該変異体TCRコード配列を含むDNAを、酵母細胞に形質転換する工程;
該変異体TCRコード配列の発現を誘導する工程であって、その結果、該変異体TCRが、該酵母細胞の表面上に提示される、工程;
該酵母細胞を、蛍光標識と接触させる工程であって、該蛍光標識は、ペプチド/MHCリガンドに結合して、選択された酵母細胞を産生する、工程;および
最も高い蛍光を示す酵母細胞を単離する工程、
を包含する方法によって作製される、可溶性高親和性TCR。
(項目18) 酵母ディスプレイによって単離された、項目15に記載の可溶性高親和性TCR。
(項目19) 可溶性高親和性TCRをコードする核酸を含む、DNAライブラリーであって、該TCRが、以下:
TCRを変異誘発して、変異体TCRコード配列を作製する工程;
変異体TCRについての該変異体TCRコード配列を含むDNAを、酵母細胞に形質転換する工程;
該変異体TCRコード配列の発現を誘導する工程であって、その結果、該変異体TCRが、該酵母細胞の表面上に提示される工程;
該酵母細胞を、蛍光標識と接触させる工程であって、該蛍光標識は、ペプチド/MHCリガンドに結合して、選択された酵母細胞を産生する、工程;および
最も高い蛍光を示す酵母細胞を単離する工程、
を包含する方法によって作製される、
DNAライブラリー。
(項目20) 野生型T細胞レセプタータンパク質よりもペプチド/MHCリガンドに対して高い親和性を有する、酵母細胞の表面上に提示されたT細胞レセプタータンパク質のライブラリーであって、ここで、該ライブラリーは、
T細胞レセプタータンパク質コード配列を変異誘発して、T細胞レセプタータンパク質コード配列の変異体の多様な集団を生成する工程;
該T細胞レセプター変異体コード配列を、酵母細胞に形質転換する工程;
酵母細胞の表面上での該T細胞レセプター変異体コード配列の発現を誘導する工程;および、
野生型T細胞レセプタータンパク質よりもペプチド/MHCリガンドに対して高い親和性を有するT細胞レセプター変異体を発現する細胞を選択する工程、
によって形成される、
ライブラリー。
(項目21) T細胞の表面上に高親和性TCR変異体の発現を可能にする系に、該高親和性TCR変異体についての遺伝子をクローニングする方法であって、以下:
TCRを変異誘発して、高親和性TCR変異体を作製する工程;
該TCR変異体を、ベクターにクローニングする工程;
該ベクターを、T細胞にトランスフェクトする工程;
該T細胞の表面上に該高親和性TCR変異体を発現させる工程、
を包含する、方法。
(項目22) 野生型よりもペプチド/MHCリガンドによって活性化されるT細胞を選択する工程をさらに包含する、項目21に記載の方法。
(項目23) 前記トランスフェクト/感染されたT細胞が、選択されたペプチド保有MHC細胞の認識のために使用される、項目21に記載の方法。
(項目24) 項目21の方法によって作製された、T細胞。
明細書および特許請求の範囲(このような用語に対して与えられる範囲を含む)の明瞭なそして一貫した理解を提供するために、以下の定義が提供される。
呼ばれる)[Shustaら(1999)J. Mol.Biol.292:949−956]を、本研究において使用した。CTLクローン2Cは、酵素2−オキソグルタレートデヒドロゲナーゼ由来の[Udakaら(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:11272−11276]、p2Caと呼ばれる結合した八量体ペプチドを有する同種異系抗原Ldを認識する。九量体改変体QL9はまた、CTL 2Cにより認識されるが、2C TCRによる10倍高い親和性を有する[Sykulevら(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:11487−11491]。構造的研究は、2C TCRのCDR3αがペプチドに近く、そしてpMHC複合体に付随するためにコンホメーション変化を受けることが示されたが[Garcia(1998)Science 279: 1166−1172]、アラニンスキャニング変異誘発は、CDR3αループが、結合相互作用に対して最少エネルギーの寄与をすることを示す[Manning(1998)前出]。従って、本発明者らは、変異誘発の試みを、CDR3αの先端を形成する5つの残基に集中させた。
ortoら(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6671−6675]。4回の選別および増殖の後、15個の異なる酵母コロニーを、リガンドに結合する能力について、scTCR改変体T7(これは、wt CRD3α配列を保有する)に比較して試験した(図1)。抗Vβ8.2抗体F23.2(これは、タンパク質のCDR1領域およびCDR2領域における残基を認識する)を、コントロールとして使用して、wt scTCR−T7変異体およびscTCR変異体(図1におけるqL2およびqL7ならびにその他)が、各々scTCRのほぼ等しい表面レベルを有することが示された(図1)。対照的に、可溶性QL9/Ldリガンドは、各変異体酵母クローンに非常によく結合するが、wt scTCR−T7には結合しなかった。MCMV(配列番号1)/Ld複合体(これは、CTLクローン2Cにより認識されない)は、scTCR変異体にも、wt scTCR−T7にも結合せず、このことは、scTCR変異体がペプチド特異性を保持していることを示した。変異体TCRの相対的親和性はまた、一定の濃度でQL9/Ldリガンドで観察されるシグナルにおける差異に基づいて、クローンによって変化するようであった。
標識化されたTCRタンパク質は、使用される標識に適切なモニタリングデバイスまたは方法を用いて検出され得る。蛍光顕微鏡または蛍光活性化セルソーティングは、標識が蛍光部分である場合に使用され得、そして標識が、放射性核種である場合、γカウンティング、オートラジオグラフィまたは液体シンチレーションカウンティングが、例えば、その方法が分析されているサンプルおよび使用される放射性核種に適切であるという条件で使用され得る。さらに、本明細書中に述べられるMHC成分の非存在下で同族pHMCリガ
ンドまたは他のリガンドに対する結合部位の一部でないTCRタンパク質の部分を認識する検出可能な分子または粒子がある場合、第2の検出分子または粒子が利用され得る。当業者は、インサイチュでの診断画像処理に有用な化合物を知っている;例えば、米国特許第5,101,827号、同第5,059,413号を参照のこと。インビボの治療および/または画像処理に有用な放射性核種はとしては、111インジウム、97ルビジウム、125ヨウ素、131ヨウ素、123ヨウ素、67ガリウム、99テクネチウムが挙げられる。毒素としては、一旦、TCR−毒素複合体が細胞に結合される場合、毒性部分が内部移行し、その結果、その細胞傷害性効果を及ぼし得るという条件では、とりわけ、ジフテリア毒素、リシンおよびトウゴマ毒素が挙げられる。免疫毒性テクノロジーは、当該分野において周知であり、そして適切な毒性分子としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない;化学療法薬剤(例えば、ビンデシン)、葉酸代謝拮抗財(例えば、メトトレキセート、シスプラチン、マイトマイシン)、アンスロサイクリン(anthrocyclines)(例えば、ダウノマイシン、ダウノルビシンまたはアドリアマイシン)およびリボソーム不活性化タンパク質のような細胞傷害性タンパク質(例えば、ジフテリア毒素、ヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、アブリン、リシン、シュードモナス属体外毒素Aまたはこれらの組換え誘導体)。一般的に、例えば、OlsnesおよびPihl(1982)Pharmac.Ther.25:355−381およびMonoclonal Antibodies for
Cancer Detection and Therapy、BaldwinおよびByers編、159頁−179頁、Academic Press、1985を参照のこと。
Genetics,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,New York;Old and Primrose(1981)Principles of Gene
Manipulation,University of California Press,Berkeley;SchleifおよびWensink(1982)Practical Methods in Molecular Biology;Glover(編)(1985)DNA Cloning第IおよびII号、IRL Press,Oxford,UK;Hames and
Higgins(編)(1985)Nucleic Acid Hybridization,IRL Press,Oxford,UK;ならびにSetlowおよびHollaender(1979)Genetic Engineering:Principles and Methods、1〜4号、Plenum Press,New York。ここで使用した略号および命名法は、この分野で標準的とみなされ、そしてここで引用される文献のような専門の文献中に通常用いられている。
高い親和性のTCRを作成するための一般的方法は、1998年1月20日出願、米国特許出願番号09/009,388号、および1999年1月20日出願WO99/36569(これらは、本明細書の開示と矛盾しない程度まで、参考として援用される)に与えられる。
指向性進化のための足場として用いた2C scTCR(T7)は、TCRの安定性を増大させるがpMHC結合を可能にすることが示されている、6つの変異体(βG17E、βG42E βL81S,αL43P、αW82R、およびαI118N)を含んだ[例えば、Shusta,E.V.ら(1999)J.Mol.Biol.292,949〜956]。
下線を付した塩基(配列番号4の最初から11番目のG、終わりから13番目のG)は、特有のBamHIおよびEagI制限部位を誘導するサイレント変異の位置を示す。精製したPCR産物を、NdeIおよびBamHIを用いて消化し、そしてNdeI−BamHIで消化したT7/pCT302に連結した[BoderおよびWittrup(1997)前出;Kiekeら(1999)前出;Shustaら(1999)前出]。連結混合物をDH10Bエレクトロ−コンピテントなE.coli(Gibco BRI,Gaithersburg,MD)中に形質転換し、そして形質転換体を、アンピシリン100μg/ml補充した250mLのLB中にプールし、そして37℃で一晩増殖した。プラスミドDNAを、GietzおよびSchiestl[Geitzら(1995)Yeast 11:355〜360]の方法によって、酵母(Saccharomyces
cerevisiae)株EBY100中に形質転換した。
酵母ライブラリー[Shustaら(1999)Curr.Opin.Biotechnol.10:117〜122]を、SD−CAA(2%デキストロース、0.67%酵母窒素ベース、1%カザミノ酸(Difco、Livonia,MI))中で、30℃で、OD600=4.0まで増殖した。表面scTCR発現を誘導するため、酵母を遠心分離によってペレット化し、SG−CAA(2%ガラクトース、0.67%酵母窒素ベース、1%カザミノ酸)中で、OD600=1.0まで再懸濁し、そして20℃で24時間インキュベートした。一般に、約107細胞/チューブを、50μlのQL9/Ld/IgGダイマー[Dal Portoら(1993)前出](これは0.5mg/mlBSA(PBS−BSA)を補充したリン酸緩衝化生理食塩水(pH7.4)中で希釈してある)とともに、1時間氷上でインキュベートした。インキュベーション後、細胞を洗浄し、そしてFITC結合体化ヤギ抗マウスIgG F(ab7)2(Kirkegaard&Perry,Gaithersburg,MD)含有PBS−BSAを用いて30分間標識した。次いで、ソーティングの直前に、PBS−BSA中で酵母を洗浄し、そして再懸濁した。コールター753ベンチを用いたFACSソーティングによって最高の蛍光を示す細胞を、単離した。単離後、ソーティングした細胞をSD−CAA中で増殖し、そして以降の回の選択のためにSG−CAA中で誘導した。引き続く4回の総ソーティングを実施した。染色に用いたQL9/Ld/IgGダイマーの濃度は、ソート1〜3については50μg/mlであり、そして最終のソートについては0.5μg/mlであった。各ソートから単離した総細胞のパーセンテージは、それぞれ5.55%、2.68%、2.56%および0.58%であった。ソート3および4のアリコートをSD−CAA上にプレートし、個々のクローンを単離した。クローンは、コールターEpicsXL装置を用いたフローサイトメトリーにより分析した。
T7およびqL2のオープンリーディングフレームを、pCT302 NheI−XhoIから切り出し、そしてNheI−XhoIで消化したpRSGALT(酵母発現プラスミド)に連結した[Shustaら(1999)前出]。ライゲーション(連結)したプラスミドをDH10Bエレクトロ−コンピテントなE.coli(Gibco BRL)中に形質転換した。プラスミドDNAを細菌培養物から単離し、そしてSaccharomyces cerevisiae BJ5464(α ura3−52 trp1 leu2 1 his3 200 pep4::HIS3 prb1 1.6R can1GAL)中に形質転換した[Shustaら(1999)前出]。酵母クローンを30℃で48時間1リットルのSD−CAA/Trp(20mg/mL トリプトファン)中で増殖した。scTCR分泌を誘導するため、細胞を4000×gでの遠心分離によってペレット化し、1mg/mlBSAを補充した1リットルのSG−CAA/Trp中に再懸濁し、そして20℃で72時間インキュベートした。培養上清を4000×gでの遠心分離によって回収し、約50mlに濃縮し、そしてPBS、pH8.0に対して透析した。6His−タグ化scTCRを、ネイティブなニッケルアフィニティークロマトグラフィー(Ni−NTA Superflow,Qiagen,Valencia,CA;5mMおよび20mM イミダゾール、pH8.0洗浄;250mMイミダゾール溶出)によって精製した[Shustaら(1999)前出]。
QL9/Ldに対する可溶性scTCRの結合を、以前に記載した競合様式でモニターした[Manningら(1998)前出;Sykulevら(1994)前出]。ペプチド−上方制御(アップレギュレート)T2−Ld細胞(3×105/ウェル)を、125I標識化抗LdFabs(30−5−7)および種々の濃度のscTCRの存在下で、氷上で1時間インキュベートした。結合および未結合の125I30−5−7Fabをオリーブオイル/ジブチルフタラートによる遠心分離によって分離した。阻害曲線を作成し、最大阻害の50%を生じるインヒビター濃度を決定した。解離定数をChengおよびPursoffの式を用いて算出した[Cheng(1973)Biochem.Pharm.22:3099〜3108]。細胞結合pMHCに対するscTCRの直接結合をモニターするため、ペプチド−アップレギュレートT2−Ld細胞(5×105/チューブ)を、ビオチン化可溶性scTCRとともに、氷上で40分間インキュベートし、続いてストレプトアビジン−フィコエリトリン(PharMingen,San
Diego,CA)を用いて30分間染色した。フローサイトメトリーによって細胞蛍光を検出した。
TCRのCDR3α領域の酵母ディスプレイ変異体の同じライブラリーを用いて、異なるMHC分子に対して結合した異なるペプチドになお特異的である、より親和性の高いTCRについて選択することが可能であった。この場合、SIYRと呼ばれるペプチド(SIYRYYGL(配列番号5))を、Kbと呼ばれるMHC分子に結合し、そしてこのリガンド複合体を、蛍光形態中で用いて、フローサイトメトリーにより選択した。高い親和性のTCRを発現する16のクローンを、配列決定した。各々のクローンは、CDR3α領域において異なる配列を示した(表2)。
同じTCR足場が、同じMHCに対して結合した異なるペプチドに対しても、より高い親和性の形態を単離するために用いられ得るか否かを決定するため、本発明者らは、Kbに結合した、dEV8(EQYKFYSV(配列番号6))と呼ばれるペプチドを用いてTCR CDR3αライブラリーをスクリーニングした。ビオチン化dEV8/Kbリガンド(その後、フィコエリトリン−ストレプトビアジン,PE−SA)を用いたフローサイトメトリーによるいくつかのソート後、dEV8/Kbに結合した酵母細胞の有意な富化が存在した(図7においてPEレベルによって示されるように)。
タグ 抗体、および抗His タグ抗体)、およびdEV8/Kb抗原とは反応するが、他の抗原、OVA/Kbとは反応しない。野生型TCRは、ペプチドKb複合体のいずれ
とも結合しない(データ示さず)。このように、高い親和性のTCRは、選択された抗原に特異的であった。
上記の本実施例は、CDR3と呼ばれるα鎖の領域内で変異したTCRのライブラリーを用いた。TCRの他の領域がまた、より高い親和性のTCRを生成するように変異され得ることを示すため、β鎖のCDR3領域の5連続アミノ酸残基内のランダム変異のライブラリーを、出発物質としてqL2 TCR変異体を用いて、生成した。次いで、このライブラリーを、qL2変異体で検出した濃度以下のQL9/Ldリガンドで選択した。5つの酵母クローン(フローサイトメトリーによって選択した)を配列決定したところ、各々は、異なるヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示した(図8)。変異された5つのアミノ酸領域内には配列の顕著な保存が存在しており、このことは、この配列モチーフが高い親和性について最適であったことを示唆していた。本発明者らは、特定のpMHCに対して、より高い親和性を有する誘導体を生じるためにTCRの異なる領域を変異することが可能であると結論付ける。
(配列表)
SEQUENCE LISTING
<110> BOARD OF TRUSTEES OF THE UNIVERSITY OF ILLINOIS
<120> HIGH AFFINITY TCR PROTEINS AND METHODS
<130> F111502CDU
<150> US 60/169,179
<151> 1999-12-06
<160> 53
<170> PatentIn version 3.0
<210> 1
<211> 4
<212> PRT
<213> ARTIFICIAL SEQUENCE
<400> 1
Met Cys Met Val
1
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1
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Cys Ala Cys AlaGly Thr Ala Thr
20
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<212> PRT
<213> ARTIFICIAL SEQUENCE
<400> 4
Cys Thr ThrThrThr Gly Thr Gly CysCys Gly GlyAla Thr Cys Cys
1 5 10 15
Ala Ala Ala ThrGly Thr CysAla Gly Ser Asn Asn Ser Asn AsnSer
20 25 30
Asn Asn Ser AsnAsn Ser Asn Asn Gly CysThr Cys Ala Cys Ala Gly
35 40 45
Cys Ala Cys AlaGly Ala Ala Gly Thr Ala CysAla Cys Gly Gly Cys
50 55 60
Cys Gly Ala GlyThr Cys GlyCys Thr Cys
65 70
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1 5
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1 5
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Ser Arg Arg GlyHis Ala Leu
1 5
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Ser Ser Arg Gly Thr Ala Leu
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1 5
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1 5
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<211> 7
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Ser Lys His GlyIle His Leu
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Ser Ile Pro ThrPro Ser Leu
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Ser Asn Pro ProPro Leu Leu
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Ser Asp Pro ProPro Leu Leu
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Ser Ser Pro ProPro Arg Leu
1 5
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Ser Ala Pro ProPro Ile Leu
1 5
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<211> 7
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Ser Gly Thr HisPro Phe Leu
1 5
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<211> 7
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1 5
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<211> 7
<212> PRT
<213> ARTIFICIAL SEQUENCE
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Ser Asp Ser LysPro Phe Leu
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<212> PRT
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<211> 7
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<212> PRT
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Ser Leu His ArgPro Ala Leu
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Ser Leu His ArgPro Ala Leu
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<212> PRT
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1 5
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<211> 7
<212> PRT
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<400> 33
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1 5
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<211> 7
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<213> ARTIFICIAL SEQUENCE
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1 5
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<211> 7
<212> PRT
<213> ARTIFICIAL SEQUENCE
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<211> 7
<212> PRT
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1 5
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<211> 7
<212> PRT
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Ser Ala Ser TyrPro Ser Leu
1 5
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<211> 7
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<211> 7
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<211> 7
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1 5
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<211> 7
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<211> 7
<212> PRT
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1 5
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<211> 7
<212> PRT
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1 5
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<211> 7
<212> PRT
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1 5
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<211> 7
<212> PRT
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Ser Leu His ArgPro Ala Leu
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<211> 7
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<212> PRT
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Gly Gly GlyGlyThr Leu Tyr
1 5
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<211> 7
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Gly Gly GlyGlyVal Leu Tyr
1 5
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<211> 7
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Gly Leu GlyGlyIle Leu Tyr
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<212> PRT
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Gly Gln GlyGlyVal Leu Tyr
1 5
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<400> 52
Gly Ser Gly GlyIle Ile Tyr
1 5
<210> 53
<211> 7
<212> PRT
<213> ARTIFICIAL SEQUENCE
<400> 53
Gly Gly GlyGlyIle Leu Tyr
1 5
Claims (38)
- リガンドに対して高い親和性を有し、該リガンドに対して10 7 M −1 より大きい解離定数を示す、可溶性T細胞レセプター(TCR)であって、ここで、該可溶性TCRがCDR中に1つ以上の変異を含む、可溶性TCR。
- 前記TCRが前記リガンドに対して10 7 M −1 〜10 10 M −1 の解離定数を示す、請求項1に記載の可溶性TCR。
- 前記リガンドがペプチド/MHCリガンドである、請求項1に記載の可溶性TCR。
- 前記リガンドがスーパー抗原である、請求項1に記載の可溶性TCR。
- 前記1つ以上の変異がCDR3αまたはCDR3βにおいて存在する、請求項1に記載の可溶性TCR。
- 選択されたリガンドに対して10 7 M −1 より大きい解離定数を示す高親和性TCRをT細胞表面上で発現する、T細胞であって、ここで、該高親和性TCRがCDR中に1つ以上の変異を含む、T細胞。
- 前記TCRが前記リガンドに対して10 7 M −1 〜10 10 M −1 の解離定数を示す、請求項6に記載のT細胞。
- 前記リガンドがペプチド/MHCリガンドである、請求項6に記載のT細胞。
- 前記リガンドがスーパー抗原である、請求項6に記載のT細胞。
- 前記高親和性TCRがCDR3αまたはCDR3βにおいて1つ以上の変異を有する変異体である、請求項6に記載のT細胞。
- 標的細胞の自己免疫破壊をブロックする方法であって、該方法が、該標的細胞の表面上のTリンパ球によって認識される部位に対して高い親和性を有する可溶性変異体TCRと、該標的細胞とを接触させ、それにより該標的細胞の自己免疫破壊がブロックされ、ここで該可溶性、高親和性変異体TCRが該標的細胞の表面上のTリンパ球によって認識される部位に対して10 7 M −1 より大きい解離定数を示す、工程を包含する、方法。
- 前記高親和性変異体TCRが前記該標的細胞の表面上のTリンパ球によって認識される部位に対して10 7 M −1 〜10 10 M −1 の解離定数を示す、請求項11に記載の方法。
- 前記高親和性TCRがCDRにおいて1つ以上の変異を有する変異体である、請求項11に記載の方法。
- 前記高親和性TCRがCDR3αまたはCDR3βにおいて1つ以上の変異を有する変異体である、請求項13に記載の方法。
- 所望でない細胞を殺傷するための薬学的組成物であって、該組成物が高親和性TCRを含み、ここで該TCRが該細胞の細胞表面マーカーに対して高い親和性を有し、そして治療化合物と結合されて、治療TCR誘導体を形成し、ここで該高親和性TCRが該所望でない細胞の細胞表面マーカーに対して10 7 M −1 より大きい解離定数を示し、ここで、該高親和性TCRがCDR中に1つ以上の変異を含む、組成物。
- 前記高親和性TCRが前記所望でない細胞の細胞表面マーカーに対して10 7 M −1 〜10 10 M −1 の解離定数を示す、請求項15に記載の組成物。
- 前記高親和性TCRがCDR3αまたはCDR3βにおいて1つ以上の変異を有する変異体である、請求項15に記載の組成物。
- 高親和性TCRを細胞表面上の選択されたペプチド/MHCリガンドを有する該細胞に結合する方法であって、該方法が、以下:
該選択されたペプチド/MHCリガンドに対して10 7 M −1 より大きい解離定数を示す変異体TCRを提供する工程;
該高親和性TCRを標識化する工程;および、
該標識化高親和性TCRを細胞表面上に1つ以上のペプチド/MHCリガンドを有する該細胞を含むサンプルと接触させ、該高親和性TCRを該サンプル中に存在する選択されたペプチド/MHCリガンドに結合する工程、
を包含する、方法。 - 前記変異体TCRが前記選択されたペプチド/MHCリガンドに対して10 7 M −1 〜10 10 M −1 の解離定数を示す、請求項18に記載の方法。
- 前記変異体TCRがCDRにおいて1つ以上の変異を有する、請求項18に記載の方法。
- 前記変異体TCRがCDR3αまたはCDR3βにおいて1つ以上の変異を有する、請求項20に記載の方法。
- T細胞の表面上に高親和性TCR変異体の発現を可能にする系に、該高親和性TCR変異体についての遺伝子をクローニングする方法であって、以下:
TCRを変異させて、TCRの同族リガンドに対して少なくとも10 7 M −1 の解離定数を示す高親和性TCR変異体を作製する工程;
該TCR変異体をベクターにクローニングする工程;
該ベクターをT細胞にトランスフェクトする工程;および
該T細胞の表面上に該高親和性TCR変異体を発現する工程、
を包含する、方法。 - 前記トランスフェクトされたT細胞が選択されたペプチド保有MHC細胞の認識のために使用される、請求項22に記載の方法。
- 前記高親和性TCR変異体がCDRにおいて1つ以上の変異を有する、請求項22に記載の方法。
- 前記高親和性TCR変異体がCDR3αまたはCDR3βにおいて1つ以上の変異を有する、請求項24に記載の方法。
- 請求項22の方法によって作製される、T細胞。
- 変異体高親和性TCRの同族リガンドに対して10 7 M −1 より大きい解離定数を示す該変異体高親和性TCRをコードする、DNA配列であって、ここで、該変異体高親和性TCRがCDR中に1つ以上の変異を含む、DNA配列。
- 前記TCR変異体が該TCR変異体同族リガンドに対して10 7 M −1 〜10 10 M −1 の解離定数を示す、請求項27に記載のDNA配列。
- 前記TCR変異体がCDR3αまたはCDR3βにおいて1つ以上の変異を有する、請求項27に記載のDNA配列。
- 治療化合物に結合された可溶性の高親和性単鎖TCRを含む、治療TCR誘導体であって、ここで、該可溶性の高親和性単鎖TCRが、その同族のリガンドに対して10 7 M −1 より大きい解離定数を示し、ここで、該可溶性の高親和性TCRがCDR中に1つ以上の変異を含む、治療TCR誘導体。
- 前記治療化合物が抗癌剤、治療放射性核種または細胞傷害性タンパク質である、請求項30に記載の治療TCR誘導体。
- 前記可溶性の高親和性TCRが病原体に感染した細胞に特異的に結合する、請求項30に記載の治療TCR誘導体。
- 前記治療化合物が、病原体に対して有毒である分子である、請求項32に記載の治療TCR誘導体。
- 高親和性TCR変異体を発現するベクターで形質転換されたT細胞であって、ここで該形質転換されたT細胞が野生型T細胞よりもより大きな程度で活性化され得、ここで、該高親和性TCR変異体が選択されたリガンドに対して10 7 M −1 より大きい解離定数を示し、ここで、該高親和性TCR変異体がCDR中に1つ以上の変異を含む、T細胞。
- 細胞の表面上の特異的ペプチド/MHCリガンドを検出する診断プローブであって、該プローブが該特異的ペプチド/MHCリガンドに結合する検出可能に標識化された高親和性TCRを含み、ここで、該検出可能に標識化された高親和性TCRが特異的ペプチド/MHCリガンドに対して10 7 M −1 より大きい解離定数を示し、ここで、該検出可能に標識化された高親和性TCRがCDR中に1つ以上の変異を含む、プローブ。
- 病原体を不活化するための高親和性TCRを含む薬学的組成物であって、該高親和性TCRが該病原体に対して有毒である分子に結合され、ここで、該高親和性TCRが該分子に対して10 7 M −1 より大きい解離定数を示し、ここで、該高親和性TCRがCDR中に1つ以上の変異を含む、薬学的組成物。
- 前記病原体が、以下:
ウイルス、細菌および原生生物
からなる群より選択される、請求項36に記載の組成物。 - 薬学的キャリア中に高親和性TCRを含む、薬学的組成物であって、ここで、該高親和性TCRがリガンドに対して10 7 M −1 より大きい解離定数を示し、ここで、該高親和性TCRがCDR中に1つ以上の変異を含む、薬学的組成物。
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