CN1317576A

CN1317576A - 核酸网状分枝扩增技术

Info

Publication number: CN1317576A
Application number: CN 01104108
Authority: CN
Inventors: 张永
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2001-02-20
Filing date: 2001-02-20
Publication date: 2001-10-17

Abstract

一种核酸网状分枝扩增技术，利用DNA多聚梅引物的延伸及分离特性，使同一种酶能完成引物延伸，及网状分枝扩增。因此，百万倍扩增可在同一温度下短时间内顺利完成。网状杂交扩增可在无酶参与情况下完成，由于靶核酸捕获，环状扩增反应，以及检测三步骤，都可在同一固体支持物上完成。从而，简化了检测方法，使其可在一般诊所，临床化验室，甚至露天中操作。网状杂交扩增技术，可用于核酸检测，以及蛋白质检测。

Description

核酸网状分枝扩增技术

技术范围：本发明是一项全新的核酸扩增技术，具有多项特性。适用于快速检测传染性病原体，和正常或异常基因；以及基因组的表达；抗原、抗体检测，及蛋白质的定性、定量检查。实用于血液病、肿瘤、传染病、法医学、血库以及遗传性疾病的诊断，以及新药的研究与开发。

发明背景：目前，有许多用于快速准确检测异常基因或病原体的方法。例如，聚合酶链反应(PCR)；连接酶链反应(LCR)；链取代扩增(SDA)；以及转录扩增(TBA)等技术均为检测微量病原体核酸序列的有效方法。然而，上述所有技术都有不足之处，PCR需要昂贵的设备，而且扩增温度须随靶核酸的不同而不同。为此，给临床的实际检测工作带来了诸多不便，这些困难在对于定量PCR和多个靶核酸的DNA/RNA检测时，显得尤为突出。至于其他的原位扩增和检测，由于加热所造成的形态学的改变，小扩增产物的扩散及重复性差等问题的存在，使其技术难度甚高，难以应用于临床检测，此外，蛋白质检测，由于敏感度低，临床应用受到限制。

优异性：1、本发明方法，利用DNA多聚酶引物的延伸及分离特性，使同一种酶能完成引物延伸，及网状分枝扩增。因此，百万倍扩增可在同一温度下短时间内顺利完成。此外，网状杂交扩增可在无酶参与情况下完成，因而更为简单而方便。

2、网状分枝扩增使用通用引物，在同一反应试管中可同时检测多个靶核酸。

3、由于靶核酸捕获，环状扩增反应，以及检测三步骤，都可在同一固体支持物上完成。从而，简化了检测方法，使其可在一般诊所，临床化验室，甚至露天中操作，具有很强的实用，应用价值。

4、本发明方法，使分离、扩增、检测靶核三步骤可在同一反应试管中完成；并运用连接反应，即结合靶核酸的环状探针，能特异地与引物连接区相结合。因此，这一特性可被用于检测单一碱基突变，如廉刀细胞性贫血，或K-ras癌基因。

5、网状杂交扩增技术，可用于核酸检测，以及蛋白质检测。包括抗原、抗体、氨基酸和固体支持物，此方法检测快速，简洁，无需任何酶学反应参与。

图1是环状扩增探针图，图2是网状分枝扩增图，图3是网状杂交扩增图，图4是延伸网状扩增图，图5是环状扩增图，图6是网状杂交扩增图，图7是荧光探针图。

Claims

权力要求：一种用于检测样品中靶核酸的技术方法，即核酸网状分枝扩增技术。

1、A．这种检测靶核酸方法，是利用寡聚核甘酸的探针，通过其本身的互补序列与样品中的核酸进行杂交。这种寡聚核甘酸探针是由一个或多个捕获探针、扩增探针组成。此捕获探针的3’端不与靶核酸相互补，而5’端则能与靶核酸互补和杂交。反之，如3’端与靶核酸互补和杂交，则5’端不能为之。此捕获探针具有与配体相结合的分子，而这个分子安固于支持物上。(见图1)

扩增探针的3’端和5’端能与靶核酸互补及杂交，而3’端和5’端之间的核酸序列不能与靶核酸结合，由靶核酸，捕获探针，扩增探针所组成的复合体，通过其捕获探针的配体与支持物结合。

此复合物可反复冲洗，以去除样品杂质。

B、将扩增探针3’端和5’端首尾相互连接形成一个环形分子。

C、网状分枝扩增由以下步骤实现：

引物与环状扩增探针上的连接区相结合，并由DNA聚合酶沿环状扩增探针延伸，产生多个重复性单位，多个反向引物与单链DNA相结合，并可被DNA多聚酶延伸引物延伸后，使其下游的引物及其延伸的DNA与模板DNA分离。而分离的单链可作为正向引物的模板，此过程为网状分枝扩增。

D、此过程循环往复，直至所有单链DNA都变成双链DNA。

E、检测扩增产物时，如有产物DNA的出现，表明样品中有靶核酸存在。(见图2)
2、在权力要求1所述的方法中，配体是由生物素、抗原、半抗原、抗体以及重金属衍生物和多聚核甘酸组成。这个配体的连接部分是由链霉抗生物素蛋白，生物素蛋白，抗体、抗原，以及硫基物和多聚核甘酸组成。
3、在权力要求1中，引物数量可多于2个以上。
4、检测单一细胞中靶核酸的技术方法：网状杂交扩增技术。

A、将细胞包藏于细胞基质中。

B、环形探针的3’端和5’端可与细胞内靶核酸相互补并杂交。3’端和5’端之间的被标记的非互补区域有配体连结，如此形成一个复合物。(见图3)

C、当环形探针的3’端和5’端首尾相连，则构成一个环形分子。

D、加入一个与配体相连接的分子后，此分子与环状分子上的配体相结合，同时加入信号探针，与连结分子相结合，形成一个带有信号标记的复合物。

E、冲洗带有信号标记的复合物。如在细胞检测中发现信号标记，即证明细胞内存在有靶核酸。
5、A、检测样品中的核酸方法。网状分枝扩增技术，是由寡聚核甘酸探针通过其本身的互补序列与样品中的核酸进行杂交。寡聚核甘酸探针是由一个或多个捕获探针组成，在此反应中过程中，靶核酸能与捕获探针的3’或5’端中任一端相互补杂交。

B、扩增环形探针的3’游离端与5’游离端之间的间隔存在，使得靶核酸能被整合其中，而进一步拷贝，扩增样品核酸。(见图4)

C、加入DNA聚合酶，此酶由3’端向5’端引伸，加入连结物，使3’和5’末端首尾相连。
6、检测样品中靶核酸的技术方法：环状扩增技术。

A、在检测试管中，有一个或多个捕获探针存在，其捕获探针的3’端不与靶核酸互补，但5’端能与靶核酸顺序互补和杂交。反之，当捕获探针的3’端与靶核酸顺序互补和杂交时，则5’端不与其互补。

B、分离靶核酸，环状扩增探针和捕获探针的复合物。

C、把扩增探针3’端和5’端首尾相连接成一个环形分子。

D、环状扩增探针由以下步骤实现：

正向引物与环状探针区域相结合，并经由DNA多聚酶沿环状探针延长，产生多个可重复的单链DNA，这一过程即环状扩增。(见图5)

E、检测到单链DNA存在，则表明样品中有靶核酸存在。
7、一种检测样品中蛋白的技术方法——网状杂交扩增技术：

A、一种蛋白(抗原或抗体)有配体附着，通过连接物与信号探针相连接，形成一个带有信号标记的复合物。

B、冲洗带有信号标记的复合物。

C、检测到信号标记，即表明有被检测蛋白的存在。被检测蛋白可是抗原、抗体或者为氨基酸(见图6)
8、检测样品中核酸的技术方法；莹光探针技术。

A、在检测试管中，加入莹光探针，此莹光探针是由两个单链寡聚核酸探针组成，并通过其本身的互补序列相互杂交。长链探针的3’端，通过其互补序列与扩增环形探针上的连接区相结合。长链探针的5’端携带有一个莹光分子(如FITC)，而短链探针的3’端具有一个莹光吸收分子(如DABCYL)。长短两链相互杂交形成双链的莹光探针，5’端莹光分子的能量可传递给3’端的吸收分子，因此没有莹光显示。

B、在网状分枝扩增或环状扩增反应中加入此莹光探针。长链探针与环形探针的连接区相互补杂交。DNA聚合酶由3’端延伸并尽而形成多个重复单链DNA。

C、反向引物与此重复的单链DNA相互补杂交后，在DNA多聚酶作用下，由3’端向5’端延伸，并使其与之结合的短链探针被分离掉，而长链探针上的莹光能量因没有被短链探针上的吸收分子所吸收，因此，有莹光发出。

D、检测到样品中莹光信号，即表明样品中有靶核酸存在。(见图7)