TW201802244A - 建構環狀模板和檢測dna分子的方法 - Google Patents

建構環狀模板和檢測dna分子的方法 Download PDF

Info

Publication number
TW201802244A
TW201802244A TW106121937A TW106121937A TW201802244A TW 201802244 A TW201802244 A TW 201802244A TW 106121937 A TW106121937 A TW 106121937A TW 106121937 A TW106121937 A TW 106121937A TW 201802244 A TW201802244 A TW 201802244A
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
dna molecule
double
stranded
linear dna
probe
Prior art date
Application number
TW106121937A
Other languages
English (en)
Other versions
TWI699435B (zh
Inventor
夢楚 吳
田孟崇
Original Assignee
體學生物科技股份有限公司
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 體學生物科技股份有限公司 filed Critical 體學生物科技股份有限公司
Publication of TW201802244A publication Critical patent/TW201802244A/zh
Application granted granted Critical
Publication of TWI699435B publication Critical patent/TWI699435B/zh

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
    • C12P19/28—N-glycosides
    • C12P19/30—Nucleotides
    • C12P19/34—Polynucleotides, e.g. nucleic acids, oligoribonucleotides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6853—Nucleic acid amplification reactions using modified primers or templates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6853—Nucleic acid amplification reactions using modified primers or templates
    • C12Q1/6855—Ligating adaptors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6869—Methods for sequencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2521/00—Reaction characterised by the enzymatic activity
    • C12Q2521/50—Other enzymatic activities
    • C12Q2521/501—Ligase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2525/00—Reactions involving modified oligonucleotides, nucleic acids, or nucleotides
    • C12Q2525/30—Oligonucleotides characterised by their secondary structure
    • C12Q2525/307—Circular oligonucleotides

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

一種建構環狀模板的方法，其包括製備部分雙股線性DNA分子，且將部分雙股線性DNA分子與能夠分子內連接單股DNA分子的連接酶反應，以產生部分雙股環狀DNA分子。檢測DNA分子的方法包括以下步驟。用探針分離標的DNA分子以形成部分雙股線性DNA分子；將部分雙股線性DNA分子與能夠分子內連接單股DNA分子的連接酶反應，以產生部分雙股環狀DNA分子；以及使用探針作為引子來進行部分雙股環狀DNA分子的環狀定序。

Description

建構環狀模板和檢測DNA分子的方法
本發明是有關於一種建構DNA的方法和檢測DNA的方法，且特別是有關於一種建構環狀模板的方法和檢測DNA分子的方法，其中DNA分子優選為片段化DNA分子，如游離DNA分子。
隨著精準醫學的發展和個體化醫學的重要性，基因定序技術將被廣泛地使用。利用比較和分析個體和數據庫的基因信息以檢測個體的基因序列是否具有有害的基因突變，如罕見的腫瘤衍生突變。因此，可預防或在早期治療疾病。
然而，當前基因庫的建構和定序方法為勞動密集型和高成本的且可能產生偏差，如擴增偏差。因此，研發新的基因定序方法以實現較高準確度、快速反應或較低成本的目的為當前急待解決的問題。
本發明提供一種建構環狀模板的方法，以產生用於環狀擴增或環狀定序的部分雙股環狀DNA分子。
本發明提供一種檢測DNA分子的方法，其中DNA分子優選為片段化DNA分子，如游離DNA分子。本發明所提供的方法具有較高準確度、快速反應、較低成本和較小偏差的優點。本發明所提供的方法可檢測一個樣品中的單股和雙股DNA兩者。
本發明提供一種建構環狀模板的方法且方法包括以下步驟。製備部分雙股線性DNA分子，且部分雙股線性DNA分子在相同股上的兩端包括單股突出部分。部分雙股線性DNA分子與能夠分子內連接單股DNA分子的連接酶反應，以產生部分雙股環狀DNA分子。
在本發明的一個實施例中，製備部分雙股線性DNA分子的方法包括提供單股線性DNA分子，且使探針與單股線性DNA分子雜交。
在本發明的一個實施例中，單股線性DNA分子的長度包括40個核苷酸至500個核苷酸。
在本發明的一個實施例中，探針的長度包括20個核苷酸至120個核苷酸。
在本發明的一個實施例中，探針包括生物素探針。
在本發明的一個實施例中，在使探針與單股線性DNA分子雜交之後，利用鏈霉親和素珠粒提取部分雙股線性DNA分子。
在本發明的一個實施例中，製備部分雙股線性DNA分子的方法包括以下步驟。提供雙股線性DNA分子。提供第一轉接子和第二轉接子，其中第一轉接子和第二轉接子具有雙股部分和位在一端的單股突出部分。第一轉接子連接到雙股線性DNA分子的一端且第二轉接子連接到雙股線性DNA分子的另一端以形成部分雙股線性DNA分子。第一轉接子的單股突出部分和第二轉接子的單股突出部分在部分雙股線性DNA分子的相同股上。
在本發明的一個實施例中，第一轉接子和第二轉接子的一端包括至少20個核苷酸的單股突出部分。
在本發明的一個實施例中，使第一轉接子或第二轉接子與生物素標記結合，且利用鏈霉親和素珠粒提取部分雙股線性DNA分子。
在本發明的一個實施例中，更包括去除未與探針雜交的單股DNA分子的步驟。
在本發明的一個實施例中，部分雙股線性DNA分子的兩端包括至少10個核苷酸的單股突出部分。
在本發明的一個實施例中，連接酶為單股DNA連接酶。
本發明另提供一種檢測DNA分子的方法且方法包括以下步驟。用探針分離標的DNA分子以形成部分雙股線性DNA分子。部分雙股線性DNA分子與能夠分子內連接單股DNA分子的連接酶反應，以產生部分雙股環狀DNA分子。利用使用探針作為引子來進行部分雙股環狀DNA分子的環狀定序。
在本發明的一個實施例中，探針為生物素探針，且以探針分離標的DNA分子的方法包括以下步驟。提供多種寡核苷酸。使寡核苷酸連接到標的DNA分子，其中標的DNA分子為單股線性DNA分子。使標的DNA分子擴增。使生物素探針與標的DNA分子雜交。
在本發明的一個實施例中，標的DNA分子從包括液態生物檢體或糞便的臨床中提取。
在本發明的一個實施例中，液態生物檢體包括血漿、唾液或尿液。
基於上述，本發明提供一種建構環狀模板的方法以用於定序，其包括提供部分雙股線性DNA分子且使用單股DNA連接酶，以產生部分雙股環狀DNA分子。本發明還提供一種檢測DNA分子的方法，其包括使探針與各DNA分子的感興趣區域雜交，利用使用連接酶，尤其是單股DNA連接酶，以產生部分雙股環狀DNA分子，以進行環狀定序。本發明中所提供的建構環狀模板的方法和檢測DNA分子的方法具有較高準確度、快速反應或較低成本的優點。
為讓本發明的上述特徵和優點能更明顯易懂，下文特舉實施例，並配合所附圖式作詳細說明如下。
本發明提供一種用於建構環狀模板的方法和一種用於檢測DNA分子的方法。為了有助於理解本發明的實施方式，提供以下定義。
“環狀定序”是使用環狀模板的定序反應。環狀定序例如包括由BGI採用的DNA納米球定序，或由Pacific Biosciences採用的SMRT定序。
“連接（ligation）”為在如寡核苷酸或聚核苷酸的兩個核酸的末端之間形成磷酸二酯鍵或鍵聯的作用。可利用酶，如DNA連接酶進行連接。
“雜交（hybridization/hybridizing）”為使如DNA或RNA的寡核苷酸或聚核苷酸黏著到與其互補的寡核苷酸或聚核苷酸的反應。
“引子”為具有約10-100個核苷酸長度的短聚核苷酸。引子利用與標的雜交結合到標的聚核苷酸或“模板”。引子優選地提供用於與標的互補的聚核苷酸的DNA合成的起始點，其可在DNA聚合酶存在下進行。典型地添加DNA聚合酶且在引子的3′端延伸新的核苷酸。引子的3′端還作為DNA連接酶的受質。
“DNA定序”為測定DNA的核苷酸的反應。舉例來說，反應典型地包括黏著、延伸和檢測的一組循環；序列特異性引子用於黏著；經DNA聚合酶和螢光信號標記的核苷酸用於延伸；且作為指示物的螢光信號用作檢測。
“生物素-鏈霉親和素相互作用”用於多種核酸和蛋白質純化方法中。生物素較小且對經生物素標記的分子的干擾極少。鏈霉親和素展現較高特異性和親和性以結合生物素，使得鏈霉親和素結合的珠粒用於從混合物中分離和純化經生物素標記的分子。
圖1A-1D是依照本發明一實施例中的建構環狀模板的方法。
參看圖1A，提供單股線性DNA 110和探針120。單股線性DNA分子110的長度例如包括40個核苷酸至500個核苷酸。在一些實施例中，單股線性DNA分子110的長度例如包括40個核苷酸至200個核苷酸。探針120的長度例如包括20個核苷酸至120個核苷酸。在一些實施例中，探針120包括20、40、60、80、100或120個核苷酸。在一些實施例中，單股線性DNA分子的長度為100個核苷酸，且探針的長度為20、40、60、80、100或120個核苷酸。
參看圖1B，使探針120與單股線性DNA分子110雜交以形成部分雙股線性DNA分子200a。在一些實施例中，部分雙股線性DNA分子200a在相同股上的兩端包括單股突出部分202。換句話說，雙股線性DNA在一個股的兩端具有突起的單股突出部分202。在一些實施例中，每一個單股突出部分202包括至少5個核苷酸，或是包括至少10個核苷酸，例如優選至少15個或20個核苷酸。部分雙股線性DNA分子200a的長度等於或小於500個核苷酸。在一些實施例中，部分雙股線性DNA分子200a的長度等於或小於200個核苷酸。在一些實施例中，在雜交反應之後，存在未與探針120雜交的一些殘餘的單股線性DNA分子110。換句話說，部分雙股線性DNA分子200a和殘餘的單股線性DNA分子110可在雜交反應之後共同存在。在其它實施例中，如果需要，可在雜交之後去除殘餘的單股線性DNA分子110。
參看圖1C，將部分雙股線性DNA分子200a與連接酶反應。在一些實施例中，殘餘的單股線性DNA分子110還會與連接酶反應。連接酶能夠進行分子內連接以連接單股DNA分子，即，單股DNA分子為連接酶的受質。在一些實施例中，連接酶為單股DNA連接酶，如環化連接酶（CircLigase）（例如環化連接酶I和II）。連接酶用於連接部分雙股線性DNA分子200a的單股突出部分以產生部分雙股環狀DNA分子210a。在一些實施例中，部分雙股環狀DNA分子210a包括由單股線性DNA分子110形成的單股環狀DNA分子110a和作為探針120的單股線性DNA分子。在一些實施例中，部分雙股環狀DNA分子210a等於或小於500個核苷酸。在一些實施例中，部分雙股環狀DNA分子210a等於或小於200個核苷酸。應注意，連接酶還會連接殘餘的單股線性DNA分子110以產生單股環狀DNA分子114。然而，如圖1C中所示，可能仍存在未連接和殘餘的一些單股線性DNA分子110，但本發明不限於此。
參看圖1D，對部分雙股環狀DNA分子210a進行定序。在一些實施例中，探針120直接用作定序引子。在一些實施例中，如果需要，使用核酸外切酶去除未連接的單股線性DNA分子110。
在一些實施例中，利用形成包括單股線性DNA分子110和探針120的部分雙股環狀DNA分子210a且對部分雙股環狀DNA分子210a進行定序以測定單股線性DNA分子110的序列。因為探針120可直接充當引子，不需要額外引發步驟。因此，本發明提供具有較低反應時間和成本的一種建構和定序環狀模板的方法。
圖2A-2E是依照本發明另一實施例中的建構環狀模板的方法。圖2A-2E的方法類似於圖1A-1D的方法，且因此利用相同參考標號標記相同組分。圖2A-2E的方法與圖1A-1D的方法之間的主要差異為圖2A-2E的方法使用生物素探針和鏈霉親和素珠粒，且使用核酸外切酶的步驟是可選的。
參看圖2A，提供單股線性DNA分子110和生物素探針122。生物素探針122為用生物素標記的探針。
參看圖2B，使生物素探針122與單股線性DNA分子110雜交以形成部分雙股線性DNA分子200b。部分雙股線性DNA分子200b在兩端包括單股突出部分202。在一些實施例中，在雜交反應之後，存在未與生物素探針122雜交的一些殘餘的單股線性DNA分子110。換句話說，部分雙股線性DNA分子200b和殘餘的單股線性DNA分子110可在雜交反應之後共同存在。在其它實施例中，如果需要，可在雜交之後去除殘餘的單股線性DNA分子110。
參看圖2C，鏈霉親和素珠粒130用於提取包括生物素探針122的部分雙股線性DNA分子200b。在一些實施例中，鏈霉親和素珠粒130為與鏈霉親和素134結合的珠粒132，且鏈霉親和素珠粒130例如為鏈霉親和素磁珠。在提取期間，部分雙股線性DNA分子200b利用生物素探針122與鏈霉親和素珠粒130相互作用，且去除未與鏈霉親和素珠粒130相互作用的殘餘的單股線性DNA分子110。殘餘的單股線性DNA分子110的去除方法包括緩衝液洗滌。
參看圖2D，在提取之後，部分雙股線性DNA分子200b從鏈霉親和素珠粒130分離。在一些實施例中，分離方法例如為加熱過程。
參看圖2E，連接酶用於連接部分雙股線性DNA分子200b的單股突出部分202以產生部分雙股環狀DNA分子210b。在一些實施例中，部分雙股環狀DNA分子210b包括由單股線性DNA分子110形成的單股環狀DNA分子110a和作為生物素探針122的單股線性DNA分子。因為殘餘的單股線性DNA分子110在前一步驟中已去除，所以使用核酸外切酶去除單股DNA分子110是可選的步驟。
隨後，對部分雙股環狀DNA分子210b進行定序。在一些實施例中，生物素探針122直接用作定序引子。
在一些實施例中，利用形成包括單股線性DNA分子110和生物素探針122的部分雙股環狀DNA分子210b，且對部分雙股環狀DNA分子210b進行定序，以測定單股線性DNA分子110的序列。因為生物素探針122可直接充當引子，故不需要額外的引發步驟。因此，建構環狀模板的方法具有較低反應時間和成本。應注意，在一些實施例中，雖然生物素用作標記標的分子，但本發明不限於此。
圖3A-3C是依照本發明另一實施例中的建構環狀模板的方法。
參看圖3A，提供雙股線性DNA 300和轉接子（400、420）。在一些實施例中，分別將A尾添加到雙股線性DNA的兩端以產生具有A尾的雙股線性DNA 300。即，分別將至少一種腺嘌呤核苷酸添加到雙股線性DNA的兩個3'端以形成A尾。轉接子（400、420）具有雙股部分和在一端的單股突出部分。在一些實施例中，每一個轉接子（400、420）例如為在一端具有T尾的雙股DNA和在另一端的單股突出部分。在一些實施例中，可將至少一種胸腺嘧啶核苷酸添加到轉接子（400、420）的兩個3'端中的一個以形成T尾。轉接子（400、420）的單股突出部分可包括至少10個核苷酸，優選至少20個核苷酸。
在一些實施例中，轉接子400例如為在雙股DNA的相同股中具有5'單股突出部分和3' T尾。轉接子420例如為在雙股DNA的一個股中具有3'單股突出部分和在雙股DNA的另一股中具有3' T尾。然而，本發明不限於此。
參看圖3B，將轉接子（400、420）連接到雙股線性DNA 300的兩端以形成部分雙股線性DNA分子（200c、200d、200e）。在一些實施例中，一個轉接子（400、420）連接到雙股線性DNA 300的一端，且另一轉接子（400、420）連接到雙股線性DNA 300的另一端。在一些實施例中，部分雙股線性DNA分子（200c、200d、200e）的兩端包括單股突出部分202。在一些實施例中，每一個單股突出部分202包括至少5個核苷酸，或是包括至少10個核苷酸，優選至少20個核苷酸。在一些實施例中，部分雙股線性DNA分子（200c、200d、200e）的長度等於或小於500個核苷酸。在一些實施例中，部分雙股線性DNA分子（200c、200d、200e）的長度等於或小於200個核苷酸。
在一些實施例中，形成不同部分雙股線性DNA分子（200c、200d、200e）。詳細地說，將轉接子400連接到雙股線性DNA 300的一端且將轉接子420連接到雙股線性DNA 300的另一端以形成部分雙股線性DNA分子200c。將第一轉接子400連接到雙股線性DNA 300的兩端以形成部分雙股線性DNA分子200d。將第二轉接子420連接到雙股線性DNA 300的兩端以形成部分雙股線性DNA分子200e。
在部分雙股線性DNA分子（200c、200d、200e）中，部分雙股線性DNA分子200c在相同股上的兩端包括單股突出部分202，即，部分雙股線性DNA分子200c在兩端具有長於另一股的一個股。因此，部分雙股線性DNA分子200c可為單股DNA連接酶的受質，所述連接酶如環化連接酶，其能夠進行分子內連接以連接單股DNA。
參看圖3C，連接酶用於連接部分雙股線性DNA分子200c的單股突出部分202以產生部分雙股環狀DNA分子210c。在一些實施例中，部分雙股環狀DNA分子210c包括單股環狀DNA和單股線性DNA，其由雙股線性DNA 300和轉接子（400、420）形成。在一些實施例中，部分雙股環狀DNA分子210c的長度等於或小於500個核苷酸。在一些實施例中，部分雙股環狀DNA分子210c的長度等於或小於200個核苷酸。
隨後，對部分雙股環狀DNA分子210c進行定序。在一些實施例中，部分雙股環狀DNA分子210c的較短股直接用作定序引子。
在一些實施例中，利用形成包括雙股線性DNA 300和轉接子（400、420）的部分雙股環狀DNA分子210c，且對部分雙股環狀DNA分子210c進行定序，以測定雙股線性DNA 300的序列。因為部分雙股環狀DNA分子210c的較短股DNA可直接充當引子，所以不需要額外的引發步驟。因此，降低反應時間和成本。
圖4A-4E是依照本發明另一實施例中的建構環狀模板的方法。圖4A-4E的方法類似於圖3A-3C的方法，且因此利用相同參考標號標記相同組分。圖4A-4E的方法與圖3A-3C的方法之間的主要差異為圖4A-4E的方法使用生物素轉接子和鏈霉親和素珠粒。
參看圖4A，提供雙股線性DNA 300和轉接子440。在一些實施例中，轉接子440為具有單股突出部分的部分雙股DNA。詳細地說，轉接子440例如為具有在3'端的T尾和在5'端的單股突出部分的生物素標記，且生物素標記連接到鏈霉親和素珠粒130。
參看圖4B，轉接子440連接到雙股線性DNA 300的一端。在一些實施例中，轉接子440的T尾與雙股線性DNA 300的A尾配對以使得轉接子440和雙股線性DNA 300連接。
隨後，提供另一轉接子420。在一些實施例中，轉接子420與圖3A中相同，且因此省略其描述。
參看圖4C，轉接子420連接到已連接轉接子440的雙股線性DNA 300的另一端，以形成部分雙股線性DNA分子200f。在一些實施例中，轉接子420的T尾與雙股線性DNA 300中曝露的A尾配對，以使得轉接子420和雙股線性DNA 300連接。換句話說，雙股線性DNA 300的一端用轉接子420連接，且雙股線性DNA 300的另一端用連接到鏈霉親和素珠粒130的轉接子440連接。因此，產生與鏈霉親和素珠粒130結合的部分雙股線性DNA分子200f，且利用緩衝液去除未連接的轉接子420和未連接的轉接子440以提取部分雙股線性DNA分子200f 。
在一些實施例中（未示出），不具有生物素標記的轉接子400用於替換具有生物素標記的轉接子440以連接雙股線性DNA 300的一端。生物素標記連接到例如鏈霉親和素珠粒130。在單股突出部分的3'端具有生物素標記的轉接子420用於替換不具有生物素標記的轉接子420以連接雙股線性DNA 300的另一端。
參看圖4D，部分雙股線性DNA分子200f從鏈霉親和素珠粒130分離。在一些實施例中，從鏈霉親和素珠粒130分離部分雙股線性DNA分子200f的方法包括加熱過程。部分雙股線性DNA分子200f在兩端包括單股突出部分202。
參看圖4E，連接酶用於連接部分雙股線性DNA分子200f的單股突出部分202以產生部分雙股環狀DNA分子210d。在一些實施例中，部分雙股環狀DNA分子210d包括單股環狀DNA分子和單股線性DNA分子，其由雙股線性DNA分子300和轉接子（420、440）形成。
隨後，對部分雙股環狀DNA分子210d進行定序。在一些實施例中，部分雙股環狀DNA分子210d的線性股直接用作定序引子，因此可省略額外引發步驟。
圖5A-5E是依照本發明另一實施例中的檢測DNA分子的方法。
參看圖5A，提供DNA分子，優選片段化DNA，如游離DNA分子（140、142）和寡核苷酸150。在一些實施例中，游離DNA分子（140、142）為從臨床樣本中提取的雙股DNA分子的單股線性DNA分子。臨床樣本可為液態生物檢體或糞便，且液態生物檢體例如包括血漿、唾液或尿液。
在一些實施例中，游離DNA分子（140、142）為利用管柱或利用珠粒的核酸提取方法所提取的核酸樣品，如齊安普（QIAamp）循環NA、AccuBioMed、NextPrep-Mag cfDNA分離套組（Bioo scientific（必歐科學公司））或Zinext。在一些實施例中，寡核苷酸150為腺苷酸化的。
參看圖5B，寡核苷酸150連接到游離DNA分子（140、142），且隨後使連接的產物擴增以形成擴增子（140'、142'）。在一些實施例中，寡核苷酸150連接到游離DNA分子（140、142）的3'端。在一些實施例中，例如使用與寡核苷酸150配對的引子且利用單向線性擴增方法以形成擴增子（140'、142'）。擴增子（140'、142'）例如包括n個拷貝的游離DNA分子（140、142）。
參看圖5C，利用序列特異性探針122捕獲擴增子140'的標的DNA分子141，以形成部分雙股線性DNA分子200g。部分雙股線性DNA分子200g的兩端包括單股突出部分202。在一些實施例中，標的DNA分子141包括感興趣區域。在一些實施例中，序列特異性探針122例如為生物素探針。詳細地說，序列特異性探針122與擴增子140'的標的DNA分子141雜交以形成部分雙股線性DNA分子200g。優選地，擴增子140'為具有40個核苷酸至500個核苷酸長度的單股DNA分子，且序列特異性探針122為具有20個核苷酸至120個核苷酸長度的單股DNA分子。在一些實施例中，擴增子140'為約100個核苷酸長度的單股DNA，且序列特異性探針122為具有20、40或60個核苷酸長度的單股DNA分子。
參看圖5D，鏈霉親和素珠粒（未示出）用於提取與生物素探針122雜交的部分雙股線性DNA分子200g。未與序列特異性探針122雜交的擴增子142'利用緩衝液洗滌去除。在提取之後，利用如加熱過程的分離方法，從鏈霉親和素珠粒130分離部分雙股線性DNA分子200g。
參看圖5E，連接酶用於連接部分雙股線性DNA分子200g的單股突出部分202以產生部分雙股環狀DNA分子210f。在一些實施例中，可進一步擴增和/或分析部分雙股環狀DNA分子210f。在一些實施例中，部分雙股環狀DNA分子210f涉及環狀定序分析。
隨後，對部分雙股環狀DNA分子210f進行定序。在一些實施例中，序列特異性探針122可充當定序引子，因此不需要額外添加引子。
綜上所述，本發明提供一種建構環狀模板的方法以用於定序和一種檢測DNA分子的方法以檢測部分雙股環狀DNA分子。部分雙股環狀DNA分子可涉及環狀擴增或環狀定序。在一些實施例中，較短股DNA可直接充當引子，使得此方法具有較高準確度、快速反應和較低成本的優點。
雖然本發明已以實施例揭露如上，然其並非用以限定本發明，任何所屬技術領域中具有通常知識者，在不脫離本發明的精神和範圍內，當可作些許的更動與潤飾，故本發明的保護範圍當視後附的申請專利範圍所界定者為準。
110‧‧‧單股線性DNA分子
110a、114‧‧‧單股環狀DNA分子
120‧‧‧探針
122‧‧‧生物素探針
130‧‧‧股霉親和素珠粒
132‧‧‧珠粒
134‧‧‧股霉親和素
140、142‧‧‧游離DNA分子
140'、142'‧‧‧擴增子
141‧‧‧標的DNA分子
150‧‧‧寡核苷酸
200a、200b、200c、200d、200e、200f、200g‧‧‧部分雙股線性DNA分子；
202‧‧‧單股突出部分；
210a、210b、210c、210d、210e、210f‧‧‧部分雙股環狀DNA分子；
300‧‧‧雙股線性DNA
400、420、440‧‧‧轉接子
圖1A-1D是依照本發明一實施例中的建構環狀模板的方法。 圖2A-2E是依照本發明另一實施例中的建構環狀模板的方法。 圖3A-3C是依照本發明另一實施例中的建構環狀模板的方法。 圖4A-4E是依照本發明另一實施例中的建構環狀模板的方法。 圖5A-5E是依照本發明另一實施例中的檢測DNA分子的方法。
110a‧‧‧單股環狀DNA分子
120‧‧‧探針
210a‧‧‧部分雙股環狀DNA分子

Claims (16)

  1. 一種建構環狀模板的方法，包括： 製備一部分雙股線性DNA分子，其中所述部分雙股線性DNA分子在一相同股上的兩端包括一單股突出部分；以及 將所述部分雙股線性DNA分子與能夠分子內連接一單股DNA分子的一連接酶反應，以產生一部分雙股環狀DNA分子。
  2. 如申請專利範圍第1項所述的建構環狀模板的方法，其中製備所述部分雙股線性DNA分子的步驟包括： 提供一單股線性DNA分子；以及 使一探針與所述單股線性DNA分子雜交。
  3. 如申請專利範圍第2項所述的建構環狀模板的方法，其中所述單股線性DNA分子的長度包括40個核苷酸至500個核苷酸。
  4. 如申請專利範圍第2項所述的建構環狀模板的方法，其中所述探針的長度包括20個核苷酸至120個核苷酸。
  5. 如申請專利範圍第2項所述的建構環狀模板的方法，其中所述探針包括一生物素探針。
  6. 如申請專利範圍第5項所述的建構環狀模板的方法，在使所述探針與所述單股線性DNA分子雜交之後，更包括利用一鏈霉親和素珠粒提取所述部分雙股線性DNA分子。
  7. 如申請專利範圍第1項所述的建構環狀模板的方法，其中製備所述部分雙股線性DNA分子的步驟包括： 提供一雙股線性DNA分子； 提供一第一轉接子以及一第二轉接子，其中所述第一轉接子以及所述第二轉接子具有一雙股部分以及位在一端的所述單股突出部分；以及 將所述第一轉接子連接到所述雙股線性DNA分子的一端以及將所述第二轉接子連接到所述雙股線性DNA分子的另一端，以形成所述部分雙股線性DNA分子，其中所述第一轉接子的所述單股突出部分以及所述第二轉接子的所述單股突出部分在所述部分雙股線性DNA分子的所述相同股上。
  8. 如申請專利範圍第7項所述的建構環狀模板的方法，其中所述第一轉接子以及所述第二轉接子的一端包括至少20個核苷酸的所述單股突出部分。
  9. 如申請專利範圍第7項所述的建構環狀模板的方法，其中所述第一轉接子或所述第二轉接子與一生物素標記結合，以及利用一鏈霉親和素珠粒提取所述部分雙股線性DNA分子。
  10. 如申請專利範圍第2項所述的建構環狀模板的方法，更包括去除未與所述探針雜交的所述單股DNA分子的步驟。
  11. 如申請專利範圍第1項所述的建構環狀模板的方法，所述部分雙股線性DNA分子的兩端包括至少10個核苷酸的所述單股突出部分。
  12. 如申請專利範圍第1項所述的建構環狀模板的方法，所述連接酶為一單股DNA連接酶。
  13. 一種檢測DNA分子的方法，包括： 用一探針分離一標的DNA分子以形成一部分雙股線性DNA分子； 將所述部分雙股線性DNA分子與能夠分子內連接一單股DNA分子的一連接酶反應，以產生一部分雙股環狀DNA分子；以及 使用所述探針作為一引子來進行所述部分雙股環狀DNA分子的環狀定序。
  14. 如申請專利範圍第13項所述的檢測DNA分子的方法，其中所述探針為一生物素探針，且以所述探針分離所述標的DNA分子的方法包括： 提供多種寡核苷酸； 將所述寡核苷酸連接到所述標的DNA分子，其中所述標的DNA分子為一單股線性DNA分子； 使所述標的DNA分子擴增；以及 使所述生物素探針與所述標的DNA分子雜交。
  15. 如申請專利範圍第13項所述的檢測DNA分子的方法，其中所述標的DNA分子從包括一液態生物檢體或糞便的臨床樣本中提取。
  16. 如申請專利範圍第15項所述的檢測DNA分子的方法，其中所述液態生物檢體包括血漿、唾液或尿液。
TW106121937A 2016-07-01 2017-06-30 建構環狀模板和檢測dna分子的方法 TWI699435B (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201662357382P 2016-07-01 2016-07-01
US62/357,382 2016-07-01

Publications (2)

Publication Number Publication Date
TW201802244A true TW201802244A (zh) 2018-01-16
TWI699435B TWI699435B (zh) 2020-07-21

Family

ID=60806569

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW106121937A TWI699435B (zh) 2016-07-01 2017-06-30 建構環狀模板和檢測dna分子的方法

Country Status (3)

Country Link
US (1) US10590451B2 (zh)
CN (1) CN107557355A (zh)
TW (1) TWI699435B (zh)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109563543B (zh) 2016-07-15 2022-08-30 加利福尼亚大学董事会 产生核酸库的方法
JP7296969B2 (ja) 2018-01-12 2023-06-23 クラレット バイオサイエンス， エルエルシー 核酸を解析するための方法および組成物
CA3100983A1 (en) 2018-06-06 2019-12-12 The Regents Of The University Of California Methods of producing nucleic acid libraries and compositions and kits for practicing same

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5714320A (en) 1993-04-15 1998-02-03 University Of Rochester Rolling circle synthesis of oligonucleotides and amplification of select randomized circular oligonucleotides
GB9618544D0 (en) * 1996-09-05 1996-10-16 Brax Genomics Ltd Characterising DNA
EP1546313B1 (en) 2002-09-20 2008-04-02 Prokaria ehf. Thermostable rna ligase from thermus phage
GB2413796B (en) * 2004-03-25 2006-03-29 Global Genomics Ab Methods and means for nucleic acid sequencing
US20090075343A1 (en) 2006-11-09 2009-03-19 Complete Genomics, Inc. Selection of dna adaptor orientation by nicking
WO2009120372A2 (en) 2008-03-28 2009-10-01 Pacific Biosciences Of California, Inc. Compositions and methods for nucleic acid sequencing
AU2010213510B2 (en) 2009-02-16 2014-05-01 Epicentre Technologies Corporation Template-independent ligation of single-stranded DNA
CN103890245B (zh) * 2011-05-20 2020-11-17 富鲁达公司 核酸编码反应
WO2014093186A1 (en) 2012-12-12 2014-06-19 Garvin Alex M Non-invasive detection of colorectal neoplasia using circular consensus sequencing
US9217167B2 (en) 2013-07-26 2015-12-22 General Electric Company Ligase-assisted nucleic acid circularization and amplification
AU2014362227B2 (en) 2013-12-11 2021-05-13 Accuragen Holdings Limited Compositions and methods for detecting rare sequence variants

Also Published As

Publication number Publication date
CN107557355A (zh) 2018-01-09
US20180002731A1 (en) 2018-01-04
TWI699435B (zh) 2020-07-21
US10590451B2 (en) 2020-03-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6571895B1 (ja) 核酸プローブ及びゲノム断片検出方法
JP3514630B2 (ja) 核酸配列の増幅および検出
EP3252174B1 (en) Compositions, methods, systems and kits for target nucleic acid enrichment
KR102592367B1 (ko) 게놈 및 치료학적 적용을 위한 핵산 분자의 클론 복제 및 증폭을 위한 시스템 및 방법
US6482592B1 (en) Methods and kits for isolating primer extension products using modular oligonucleotides
WO2012002541A1 (ja) 標的分子の検出法
JP2015516814A (ja) 標的化されたｄｎａの濃縮および配列決定
TWI699435B (zh) 建構環狀模板和檢測dna分子的方法
JP5258289B2 (ja) 小さな生物学的サンプルにおけるｍＲＮＡ発現レベルの定量及び／又は比較評価を行うための方法
JP2022145606A (ja) 核酸の正確な並行定量のための高感度な方法
JPH08500725A (ja) ループ構造
WO2012083845A1 (zh) 用于除去测序文库中载体片段的方法及其用途
EP4060049B1 (en) Methods for accurate parallel quantification of nucleic acids in dilute or non-purified samples
JP4755974B2 (ja) 核酸の選択的断片化によるｄｎａ断片の作製方法およびその適用
US20090142767A1 (en) Method for nucleic acid quantitation
JP6976567B2 (ja) Ｄｎａメチル化解析のための試料調製方法
TW202411431A (zh) 準確地平行定量變體核酸的高靈敏度方法
TW202411430A (zh) 準確地平行檢測和定量核酸的方法
JP2024521530A (ja) 損傷誘導性ｄｎａ増幅（ｌｉｄａ）によるｓａｒｓ－ｃｏｖ－２についてのアッセイ
CN117625768A (zh) 一种通用数字pcr检测体系及其应用
CN117626451A (zh) 一种高效rna多重靶向建库方法及试剂盒