JP5258289B2 - 小さな生物学的サンプルにおけるmRNA発現レベルの定量及び/又は比較評価を行うための方法 - Google Patents
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Description
本発明は、1つ又は複数の遺伝子に対する配列修飾プライマーを用いてサンプルに含まれるmRNAの逆転写を1回の反応で行い、配列修飾cDNA分子のプールを得ることを特徴とする方法を提供する。cDNA分子は、続いて行う増幅反応に用いるプライマーのための結合部位を変えることなく、1つ又は複数の位置のヌクレオチドを修飾する。逆転写反応の終了後に、余った配列修飾プライマーを除去又は不活性化する、即ち、続いて行う増幅反応に関与できないようにする。分析対象とした遺伝子について個別に増幅反応を行うが、各反応においては、同じ遺伝子特異的プライマーを用いて、配列修飾cDNAからなるテンプレート及び参照DNAテンプレートを競合的に共増幅する。参照DNAテンプレートは、サンプルに存在しているか又は増幅反応を行う前にサンプルに添加したゲノムDNAを含んでいる。参照DNAテンプレートは、また、合成又はクローニングしたDNAを含んでいてもよい。逆転写反応によって生じた配列修飾は、cDNA由来の増幅産物に組み込まれ、それぞれの増幅反応において得られる、cDNAテンプレート由来の増幅産物と参照DNAテンプレート由来の増幅産物とを個別に検出し、それらの比を決定するために用いられる。それぞれの増幅反応において得られた、DNAに対する遺伝子特異的cDNAの比を組み合わせて、サンプルに元々存在するmRNA転写産物の相対量を反映する、該比のサンプル特異的プロファイルを得る。
サンプル及び参照テンプレート
本発明は、細胞又は組織のサンプルに存在するmRNA転写産物の相対量について、定量および比較評価の少なくとも一方を行うための方法を提供する。サンプルには、細胞又は組織の溶解物又はホモジェネートが含まれる。参照DNAテンプレートには、サンプルに存在するか又は別の原料から単離したゲノムDNA、あるいはクローニング又は合成したDNAオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドが含まれる。サンプルに存在するゲノムDNAを参照DNAテンプレートとして用いる場合には、RNAとゲノムDNAを逆転写反応の前にサンプルから単離してもよい。一方、サンプルに存在するゲノムDNAを参照DNAテンプレートとして用いない場合には、RNAを逆転写反応の前にサンプルから単離する。増幅反応開始前のサンプルに、参照DNAテンプレートは存在しているか添加される。逆転写反応の間、参照DNAテンプレートはサンプル中に存在してもよいが、この場合は二本鎖でなければならない。参照DNAテンプレートがサンプルに存在するゲノムDNA以外のものである場合には、各サンプルに等量の参照DNAテンプレートを、逆転写反応の終了後で増幅反応の開始前に添加することが好ましい。
サンプルに含まれるmRNAの逆転写反応は、1つ又は複数の遺伝子に対する配列修飾プライマーを用いて1回の反応で行い、配列修飾cDNA分子のプールを得る。参照DNAテンプレートが逆転写反応の際に反応混合物中に存在する場合には、サンプルに含まれるDNAが主として二本鎖の状態を維持し、cDNA合成用のテンプレートとしては機能しない、非変性条件下で逆転写反応を行う。
特定の遺伝子のセンス鎖DNA配列のみならずmRNA配列に相補的なヌクレオチド配列であって、続いて行う増幅反応に用いる下流側のプライマーのための結合部位に対する相補的ヌクレオチド配列を含有するヌクレオチド配列を含む、5’−末端セグメント、
該遺伝子のセンス鎖DNA配列のみならずmRNA配列に非相補的である1つ又は複数のヌクレオチドを含むヌクレオチド配列からなる、中央セグメント、及び
該遺伝子のセンス鎖DNA配列のみならずmRNA配列に相補的なヌクレオチド配列を含む、3’−末端セグメント。
逆転写反応の終了後に、続いて行う遺伝子特異的増幅反応のプライマーとして余った配列修飾プライマーが機能することを防止する必要がある。逆転写反応工程から増幅反応工程へ移動した完全な配列修飾プライマーは、参照DNAテンプレートを増幅するためのプライミングを行うことができるので、参照DNAテンプレート由来の増幅産物の一部にヌクレオチド配列の修飾を導入してしまう。このような修飾は、逆転写反応の際にcDNA転写産物に導入した配列修飾と同じなので、結果として参照DNAテンプレート由来の増幅産物の中に配列修飾cDNAテンプレート由来の増幅産物と同一であって、配列修飾cDNAテンプレート由来増幅産物と区別できないものが含まれることとなる。よって、cDNA由来の増幅産物とDNA由来の増幅産物のそれぞれの相対量を測定しても、増幅反応の前にサンプルに存在する配列修飾cDNAテンプレートと参照DNAテンプレートのそれぞれの真の量を反映しなくなってしまう。
逆転写反応及び余った配列修飾プライマーの除去又は不活性化の後に、等量の反応混合物を個別に行う増幅反応系に移す。個別の増幅反応は、分析対象としたそれぞれの遺伝子についてそれぞれ物理的に隔離された反応容器で行うが、各反応においては、遺伝子特異的プライマーを用いて配列修飾cDNAからなるテンプレートと、全ての反応に共通する参照DNAテンプレートとを共増幅して、測定可能な量の増幅産物を生成する。それぞれの増幅反応において、cDNAテンプレートと参照DNAテンプレートは、同じプライマーを用いて競合的に共増幅する。増幅は、1回の反応で行うこともできるし、ネステッドプライマー(nested primer)を用いて2つの連続した反応で行うこともできる。同一又はほぼ同じ長さのcDNAテンプレート由来増幅産物と参照DNAテンプレート由来増幅産物とを得るために、増幅反応用プライマーのための結合部位は、同じエクソンに存在することが好ましい。増幅反応用プライマーの結合部位は、cDNAテンプレートに導入した配列修飾がcDNAテンプレート由来の増幅産物に組み込まれる位置とする。配列修飾cDNAテンプレートと参照DNAテンプレートの共増幅を同じプライマーを用いて同じ反応で行うと、増幅反応を定常期に達するまで行っても、2つのテンプレートについての増幅反応効率は、ほぼ等しくなる。その結果、個別に行った遺伝子特異的増幅反応から得られた、配列修飾cDNAテンプレート由来の増幅産物と参照DNAテンプレート由来の増幅産物のそれぞれの相対レベルは、増幅反応を実施する前の増幅反応系に元々存在した配列修飾cDNAテンプレートと参照DNAテンプレートのそれぞれの相対量を反映する。増幅反応は、ポリメラーゼ連鎖反応、リガーゼ連鎖反応、転写媒介性増幅反応や、2つの類似したテンプレートを同じ反応で競合的に共増幅することのできるその他の酵素反応などによって行うことができ、これにより、逆転写反応によってcDNAテンプレートに導入した配列修飾は、cDNAテンプレート由来の増幅産物に組み込まれる。
本発明においては、cDNA分子のヌクレオチド配列中の修飾は、逆転写反応によって導入する。この配列修飾は、cDNAテンプレート由来の増幅産物に組み込まれ、cDNA由来の増幅産物を、同じ増幅反応系に存在する参照DNAテンプレート由来の増幅産物から区別するために用いられる。
配列修飾cDNAテンプレートと参照DNAテンプレートの共増幅を同じプライマーを用いて同じ反応で行うと、増幅反応を定常期に達するまで行っても、2つのテンプレートについての増幅反応効率はほぼ等しくなる。その結果、個別に行った遺伝子特異的増幅反応から得られた、配列修飾cDNAテンプレート由来の増幅産物と参照DNAテンプレート由来の増幅産物のそれぞれの相対的なレベルは、増幅反応の間一定であり、増幅反応を実施する前の増幅反応系に元々存在した配列修飾cDNAテンプレートと参照DNAテンプレートのそれぞれの相対的な量を反映する。配列修飾cDNAテンプレート由来増幅産物と参照DNAテンプレート由来増幅産物のそれぞれの量を測定し、相対的レベルを決定することによって、それぞれの増幅反応における、DNAに対する遺伝子特異的cDNAの比が得られる。分析対象としたそれぞれの遺伝子について個別に行った増幅反応から得られた、DNAに対する遺伝子特異的cDNAの比を組み合わせることによって、サンプル特異的プロファイルが得られる。サンプル特異的プロファイルにおける、DNAに対する遺伝子特異的cDNAの比は、サンプルに元々存在するmRNA転写産物の相対量を反映し、分析の対象とする遺伝子のmRNAレベルのサンプル間の変動の比較分析に用いることができる。サンプルに存在するゲノムDNAを参照DNAテンプレートとして用いる場合には、サンプル中の細胞由来のゲノムに存在する分析対象遺伝子のコピー数の潜在的な変動を考慮する必要がある。
「配列修飾プライマー」とは、特定の標的遺伝子の野生型ヌクレオチド配列と比較して、cDNA配列にヌクレオチド配列の修飾を誘導するために、逆転写反応に用いるオリゴヌクレオチドプライマーを意味する。複数の遺伝子に対する配列修飾プライマーを1回の逆転写反応に用いて、配列修飾cDNA分子のプールを得ることができる。
この実験は、cDNA/DNA比の範囲について、アッセイの測定範囲を決めるために行った。この実験においては、単一遺伝子のcRNAから逆転写した配列修飾cDNAの希釈系列を、A)同じ遺伝子から得た、一定量のクローニングしたDNAコピー、又は、B)ゲノムDNAのいずれかである参照DNAテンプレートと関連づけて分析することによって、本発明の原理を実証した。
トリプシノーゲン−1 cDNA配列の46番〜714番塩基を含むトリプシノーゲン−1 DNAクローンを、膵臓cDNA(Clontech 社製)からPCRによって得た。得られたDNAクローンの塩基配列は、ABI Prism ダイターミネーターサイクルシークエンシングコアキット(dye terminator cycle sequencing core kit)と AmpliTaq DNAポリメラーゼを用いて、ABI Prism 310 遺伝子分析装置(ABI Prism 310 genetic analyzer)(Applied Biosystems 社製)によって、両端からシークエンシングすることで調べた。トリプシノーゲン−1 cRNAは、トリプシノーゲン−1 DNAクローンをテンプレート(Epicentre Technologies 社)として用いた in vitro の転写によって生成し、RNeasy ミニキット(RNeasy Mini Kit)(Qiagen 社製)によって精製した。腫瘍細胞は、5%のCO2を含む高湿度雰囲気下において37℃で培養した。腫瘍細胞は、10%の熱不活化胎児ウシ血清、2mMのL−グルタミン、100単位/mlのペニシリン及び100μg/mlのストレプトマイシンを添加したRPMI 1640培地の中で維持した。腫瘍細胞のゲノムDNAは、RNA/DNAミニキット(RNA/DNA Mini Kit)(Qiagen 社製)によって抽出した。
逆転写
逆転写反応は、製造元の説明書に従って ThermoScript Rnase H- 逆転写酵素(Invitrogen 社製)を用い、反応容積を20μlとし、cDNA合成用緩衝液[50mMのトリスアセテート(pH8.4)、75mMの酢酸カリウム、40mMの酢酸マグネシウム]、50mMのDTT、1mMのdNTP、20pmolの配列修飾アンチセンスプライマーであって、得られるcDNAにCからGへの一塩基置換をもたらすもの(5'-CAC ATA GTT GTA GAC CTT GGT GTA GAC TCG AGG C)、7.5Uの ThermoScript RT及び5×109コピーのトリプシノーゲン−1 cRNAを用いて行った。この反応系を、65℃で50分間インキュベートし、さらに85℃で5分間インキュベートした。
逆転写反応の終了後、未結合の配列修飾逆転写プライマーをエキソヌクレアーゼI(New England Biolabs 社製)で開裂させた。エキソヌクレアーゼによる処理は、反応容積を25μlとし、1×制限緩衝液(67mMのグリシン−KOH、6.7mMのMgCl2、10mMの2−メルカプトエタノール、pH9.5)中で、20UのエキソヌクレアーゼIを用いて、37℃で60分間行い、さらに80℃で20分間処理した。エキソヌクレアーゼIで処理したcDNAは、増幅反応を行う前に、10倍に段階希釈した。
各5μlの希釈した逆転写産物を、A)103コピーのトリプシノーゲン−1 DNAクローン、又は、B)500個の腫瘍細胞から得たゲノムDNAと共に増幅した。1回目のPCRは、反応容積を45μlとし、0.2mMの各dNTP、20pmolのセンスプライマー(5'-TGA TTC TGG TGG CCC TGT-3')とアンチセンスプライマー(CAC ATA GTT GTA GAC CTT GGT G)及び2Uの Dynazyme II DNAポリメラーゼ(Finnzymes 社製)を含む1×PCR緩衝液[10mMのトリス−HCl(pH8.8)、1.5mMのMgCl2、50mMのKCl、0.1%の Triton X-100;Finnzymes 社製]中で、初めにテンプレートを95℃で5分間変性し、続いて95℃で1分間と55℃で1分間の条件でテンプレートを増幅するサイクルを35回行った。このようにして得た1回目のPCR産物の3μlを、反応容積を75μlとし、7.6pmolのビオチン化ネステッドセンスプライマー(BIO-5'-CTG GTG GCC CTG TGG TCT-3')と、76pmolのネステッドアンチセンスプライマー(5'-AGA CCT TGG TGT AGA CTC-3')とを用い、1回目のPCRと同じプログラムで2回目のPCRを行った。この実験には、3種の対照、具体的には、103コピーのトリプシノーゲン−1 DNAクローン、500個の細胞から得たゲノムDNA、及び109コピーのトリプシノーゲン−1 cRNAから逆転写した配列修飾cDNAも含めた。非特異的増幅による産物を排除するために、最終的に得られたPCR産物の15μl等量を1.5%のアガロースゲル中で分離し、臭化エチジウムで染色した。
配列修飾cDNAテンプレート由来の増幅産物と参照DNAテンプレート由来の増幅産物を、3H−標識ヌクレオチドを用いた固相ミニシークエンシング反応[Syvanen et al., Genomics (1990) 8:684-692; Ihalainen et al., Biotechniques (1994) 16:938-943; Suomalainen and Syvanen, Methods Mol. Biol. (1998) 86:121-131]の変法によって検出した。PCR増幅反応に続いて、10μlのPCR産物を、40μlの緩衝液[0.15MのNaCl、20mMのリン酸ナトリウム(pH7.4)と0.1%の Tween-20]の入った、ストレプトアビジンで被覆したシンチレーションミクロタイタープレート(streptavidin-coated scintillating microtitration plate)(Perkin-Elmer Wallac 社製)のウェルに捕捉した。このために、サンプルを室温で1時間、穏やかな振とう下でインキュベートし、その後プレートを、40mMのトリス−HCl(pH8.8)、1mMのEDTA、50mMのNaCl、0.1%の Tween-20 を含む緩衝液を用いて、自動マイクロプレート洗浄器(Tecan 96 PW)で4回洗浄した。プレートに結合したPCR産物を、50mMのNaOHを1μl用いて室温で5分間変性した。その後、各ウェルを、洗浄緩衝液を用いて4回洗浄した。
アッセイの測定範囲を決定するために、109コピーのトリプシノーゲン−1 cRNAから逆転写したcDNAと参照DNAテンプレート(103コピーのクローニングしたトリプシノーゲン−1 DNA、又は500個の細胞から得たゲノムDNA)の10倍希釈系列を共増幅した。すべてのネステッドPCR増幅反応を定常期に達するまで行った。アッセイの測定範囲は2桁を超える範囲、即ち、DNAに対するcDNAの理論比が1:1よりも小さい値(103コピーのクローニングしたDNA又は500個の細胞から得たゲノムDNAに対して、103コピーのcDNA)から100:1を超える値(103コピーのクローニングしたDNA又は500個の細胞から得たゲノムDNAに対して、105コピーのcDNA)にまで及んでいた。cDNAテンプレートの理論上のコピー数は、逆転写反応の効率が100%であると仮定して算出した(図3参照)。
この実験は、細胞系における遺伝子発現プロファイルを分析するためのアッセイの再現性を調べるために行った。この実験においては、5つの遺伝子[マトリックスメタロプロテイナーゼ−2(MMP−2)、マトリックスメタロプロテイナーゼ−9(MMP−9)、ウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベーター(uPA)、ウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベーター受容体、及びp53]のCOLO 205ヒト結腸腺癌細胞における発現プロファイルの分析を、次のように行った。まず、COLO 205細胞から抽出したmRNAの多重的な逆転写(multiplexed reverse transcription)を、上記の5つの遺伝子のそれぞれに対する配列修飾プライマーを用いて行った。次に、遺伝子特異的増幅反応を個別に行った。それぞれの増幅反応においては、配列修飾cDNAと参照DNAテンプレートとして機能するゲノムDNAとを、同じ遺伝子特異的プライマーを用いて競合的に共増幅した。配列修飾cDNA由来の増幅産物と、ゲノムDNA由来の増幅産物とを、サイクリックミニシークエンシング法[Jarvelainen et al., Hepatology (2001), 33:1148-1153]によって検出して定量した。個別に行った増幅反応で得られた、DNAに対する遺伝子特異的cDNAの比を組み合わせて、サンプルに元々存在するmRNA転写産物の相対量を反映する、上記の比のプロファイルを得た。
COLO 205細胞(米国、メリーランド州、ロックビル、アメリカンタイプカルチャーコレクション)は、5%のCO2を含む高湿度雰囲気下において37℃で培養した。細胞は、10%の熱不活化胎児ウシ血清、2mMのL−グルタミン、100単位/mlのペニシリン及び100μg/mlのストレプトマイシンを添加したRPMI 1640培地の中で維持した。それぞれの実験において、Oligotex Direct mRNAキット(Oligotex Direct mRNA Kit)(Qiagen 社製)によってCOLO 205細胞から抽出した同じmRNAサンプルを用いた。ヒトゲノムDNAは、Roche Diagnostic 社(ドイツ国、マンハイム)から購入した。
逆転写
逆転写反応は、製造元の説明書に従って SuperScript II 逆転写酵素(Invitrogen 社製)を用いて行った。反応容積を12μlとし、初めに、得られるcDNAにAからGへの一塩基置換(下線部分)[5'-GGG AAT GGT TGA AGG GAG GGG CGG GGA G-3'(MMP−2)、5'-AAA GGT TAG AGA ATC CAA GTT TGT TAG A-3'(MMP−9)、5'-ATT CAG TGT AAG GAG TGG TCC TCG CCC CA-3'(uPA)、5'-CAA CAC AAC AGC GGC AAC AAT ATT GAT AAT(uPAR)、5'-AAG GGT GGG GTG AAA ATG CGG ATG T-3'(p53)]をもたらす、2pmolの各配列修飾アンチセンスプライマーを、0.5mMのdNTP、及び105個のCOLO 205細胞から抽出したmRNAと混合し、65℃で5分間インキュベートした。この後、反応容積を20μlとし、10mMのDTT及び200Uの SuperScript RT を含むファーストストランド緩衝液(first-strand buffer)[50mMのトリスアセテート(pH8.3)、75mMの酢酸カリウム、3mMの塩化マグネシウム]を用いて、42℃で50分間、逆転写反応を継続した。この後、70℃で15分間加熱することにより、逆転写反応を不活化した。
逆転写反応の終了後、未結合の配列修飾逆転写プライマーをエキソヌクレアーゼI(New England Biolabs 社製)で分解した。エキソヌクレアーゼIによる処理は、反応容積を25μlとし、1×制限緩衝液(67mMのグリシン−KOH、6.7mMのMgCl2、10mMの2−メルカプトエタノール、pH9.5)中で、20UのエキソヌクレアーゼIを用いて、37℃で60分間行い、さらに80℃で20分間処理した。
2.5μlの逆転写産物を2ngのヒトゲノムDNAと共に、個別の遺伝子特異的増幅反応によって増幅した。それぞれの増幅反応においては、反応容積を25μlとし、0.2mMの各dNTP、20pmolのセンスプライマー[5'-CTG GAT GGA GGA AAA CCA AG-3'(MMP−2)、5'-TGG GCC CTC TCT TCT CA-3'(MMP−9)、5'-TTG GCC AGT TAT CCC TTC-3'(uPA)、5'-GAA GAG AAA AGC TGG AGG AAG G-3'(uPAR)、又は 5'-TGG AGC TGG AAG GGT CAA-3'(p53)]及び20pmolのアンチセンスプライマー[5'-GGG AAT GGT TGA AGG GAG-3'(MMP−2)、5'-AAA GGT TAG AGA ATC CAA GTT-3'(MMP−9)、5'-ATT CAG TGT AAG GAG TGG TC-3'(uPA)、5'-CAA CAC AAC AGC GGC AAC AA-3'(uPAR)、又は 5'-AAG GGT GGG GTG AAA ATG-3'(p53)]及び2Uの Dynazyme II DNAポリメラーゼ(Finnzymes 社製)を含む1×PCR緩衝液[10mMのトリス−HCl(pH8.8)、1.5mMのMgCl2、50mMのKCl、0.1%の Triton X-100;Finnzymes 社製]中で、初めにテンプレートを95℃で5分間変性し、続いて95℃で1分間と55℃で1分間の条件でテンプレートを増幅するサイクルを35回行った。mRNAサンプルのcDNAによるコンタミネーションは、各々のサンプルに対して逆転写酵素を用いない対照反応を行うことによって排除した。非特異的増幅による産物を排除するために、得られたPCR産物の15μl等量を2%のアガロースゲル中で分離し、臭化エチジウムで染色した。
配列修飾cDNAテンプレート由来の増幅産物とゲノムDNAテンプレート由来の増幅産物を、Jarvelainen et al.(Hepatology, 2001, 33:1148-1153)のサイクリックミニシークエンシング法、即ち、3H−標識ヌクレオチドを用いた固相ミニシークエンシング法[Syvanen et al., Genomics (1990), 8:684-692; Ihalainen et al., Biotechniques (1994), 16:938-943; Suomalainen and Syvanen, Methods Mol. Biol. (1998), 86:121-131]に少し変更を加えた変法によって検出した。PCR増幅反応に続いて、PCR反応系に1Uのエビアルカリホスファターゼ(Roche 社製)と5UのエキソヌクレアーゼIを直接添加することによって、未反応の各dNTPとプライマーを除去した。dNTPとプライマーの分解は37℃で30分間行い、その後で、80℃で15分間のインキュベーションによって酵素を失活させた。酵素処理したPCR産物を、220μlの水とともに、YM-30 フィルターユニット(二本鎖DNAのカットオフ値:50bp)を備えた Microcon-96 YM フィルターアッセンブリー(Microcon-96 YM filtrate assembly)を用いて濾過し、続いて250μlの水で2回洗浄した。保持液(retentate)を遠心分離によって回収し、その量を50μlに調整した。濾過したPCR産物の4等量(各5μl)を、サイクリックミニシークエンシング反応用試薬の入った、96穴PCRプレート(Thermo-Fast 96)(英国、サリー州、エプソム、Abgene 社製)に移した。プレートのウェルには、3pmolのビオチン化サイクリックミニシークエンシングプライマー[5'Biotin-TTC CCG CTC AGC CCT CCC-3'(MMP−2)、5'Biotin-TTG TTT TTT GTT GGA GTG TTT CTA A-3'(MMP−9)、5'Biotin-CCA ATC CTC ACT GGG TGG GG-3'(uPA)、5'Biotin-ATG GGA GAG CTC TTG TTA TTA T-3'(uPAR)、又は 5'Biotin-TTT TAC ATT CTG CAA GCA CAT C-3'(p53)]、2pmolの3H−標識ヌクレオチドであるdCTP又はdTTP、及び0.5Uの Dynazyme DNAポリメラーゼを含む、15μlの Dynazyme 緩衝液が入っていた。
図5及び図6に示すように、アッセイは再現可能である。平均値及び標準誤差は、MMP−2についてはそれぞれ13.5及び2.4であり、MMP−9についてはそれぞれ1.7及び0.8であり、uPAについてはそれぞれ8.5及び0.7であり、uPARについてはそれぞれ31.2及び2.5であり、p53についてはそれぞれ48.1及び2.9であった(図6参照)。
この実験は、cDNA/DNA比の範囲について、アッセイの測定範囲を決めるために行った。この実験においては、単一遺伝子のcRNAから逆転写した配列修飾cDNAの希釈系列を、20ngのヒトゲノムDNA(約104コピーの各遺伝子に相当する)である参照DNAテンプレートと関連づけて分析することによって、本発明の原理を実証した。PCRは LightCycler 装置(LightCycler instrument)(Roche Applied Science 社製)を用いて行い、配列修飾cDNAテンプレート由来の増幅産物とゲノムDNAテンプレート由来の増幅産物を、LightCycler 装置を用いた解離曲線解析によって検出し定量した。
全長トリプシノーゲン−2 cDNAクローンと全長MMP−2 cDNAクローンは、アメリカンタイプカルチャーコレクションから入手した。cDNAクローンの塩基配列は、ABI Prism ダイターミネーターサイクルシークエンシングコアキットと AmpliTaq DNAポリメラーゼを用いて、ABI Prism 310 遺伝子分析装置(Applied Biosystems 社製)によって、両端からシークエンシングすることで調べた。トリプシノーゲン−2 cRNAとMMP−2 cRNAは、それぞれトリプシノーゲン−2 cDNAクローンとMMP−2 cDNAクローンをテンプレート(Epicentre Technologies 社)として用いた in vitro の転写によって生成し、RNeasy ミニキット(Qiagen 社製)によって精製した。
逆転写
逆転写反応は、製造元の説明書に従って DyNAmo Capillary SYBR Green 2-step qRT−PCRキット(DyNAmo Capillary SYBR Green 2-step qRT-PCR Kit)(Finnzymes 社製)を用いて行い、配列修飾アンチセンスプライマーとしては、得られるcDNAにAからG又はTからCへの5個(トリプシノーゲン−2)又は6個(MMP−2)の塩基置換(下線部分)をもたらすもの[5'-CCA CAC AGA ACA TGT TGC TGG CGG CCC TTC CA-3'(トリプシノーゲン−2)、及び 5'-GAA GAG ACT CGG TAG GGA CAC GCC GGG CGG AGT GA-3'(MMP−2)]を使用し、テンプレートとしては、5×109コピーのトリプシノーゲン−2 cRNA又はMMP−2 cRNAを使用した。
逆転写反応の終了後、未結合の配列修飾逆転写プライマーをエキソヌクレアーゼI(New England Biolabs 社製)で分解した。エキソヌクレアーゼIによる処理は、反応容積を25μlとし、1×制限緩衝液(67mMのグリシン−KOH、6.7mMのMgCl2、10mMの2−メルカプトエタノール、pH:9.5)中で、20UのエキソヌクレアーゼIを用いて、37℃で60分間行い、さらに80℃で20分間処理した。エキソヌクレアーゼIで処理したcDNAは、増幅反応を行う前に、10倍に段階希釈した。
各2.5μlの希釈した、エキソヌクレアーゼI処理済の逆転写産物を、20ngのヒトゲノムDNAと共に、個別の遺伝子特異的増幅反応によって増幅した。それぞれの増幅反応においては、製造元の説明書に従って DyNAmo Capillary SYBR Green 2-step qRT−PCRキット(Finnzymes 社製)を用い、プライマーとしては、5'-GCC AGG CTA AGT GTG AAG-3'(トリプシノーゲン−2のセンスプライマー)、5'-CCA CAC AGA ACA TGT TGC T-3'(トリプシノーゲン−2のアンチセンスプライマー)、5'-CTG GAT GGA GGA AAA CCA AG-3'(MMP−2のセンスプライマー)、及び 5'-GGG AAT GGT TGA AGG GAG-3'(MMP−2のアンチセンスプライマー)を用いて、30サイクル行った。PCRの各サイクルにおいて、LightCycler 装置(Roche Applied Science 社製)を用い、95℃(15秒間保持)で変性し、57℃(1分間保持)でアニーリングした。温度変化速度は20℃/sであり、アニーリングの終了時に蛍光を測定した。mRNAサンプルのcDNAによるコンタミネーションは、各々のサンプルに対して逆転写酵素を用いない対照反応を行うことによって排除した。非特異的増幅による産物を排除するために、得られたPCR産物の15μl等量を2%のアガロースゲル中で分離し、臭化エチジウムで染色した。
配列修飾cDNAテンプレート由来の増幅産物とゲノムDNAテンプレート由来の増幅産物を、増幅反応の直後に、LightCycler 装置を用いた解離曲線解析によって検出し定量した。具体的には、増幅反応の次にさらに95℃(0秒保持)の変性反応を行い、20℃/sの冷却速度で57℃まで温度を下げ、0.1℃/sの加温速度で98℃まで温度を上げることによって解離曲線を連続的に作成した。微分解離曲線用のプロットを得るためには、LightCycler のソフトウェアの初期設定を使用した。
得られるcDNAにAからG又はTからCへの5個又は6個の塩基置換をもたらす配列修飾プライマーを用いることによって、解離温度に約4℃の違いがある、cDNA由来の増幅産物とゲノムDNA由来の増幅産物を解離曲線解析によって検出し定量することができた。アッセイの測定範囲を決定するために、109コピーのトリプシノーゲン−2 cRNA又はMMP−2 cRNAから逆転写したcDNAの10倍希釈系列を、20ngのヒトゲノムDNAと共に増幅した。トリプシノーゲン−2のアッセイの測定範囲は2桁を超える範囲、即ち、DNAに対するcDNAの理論比が10:1よりも小さい値[20ngのヒトゲノムDNA(約104コピーの遺伝子に相当)に対して、105コピーのcDNA]から1000:1を超える値[20ngのヒトゲノムDNA(約104コピーの遺伝子に相当)に対して、107コピーのcDNA]にまで及んでいた。また、MMP−2のアッセイの測定範囲は2桁を超える範囲、即ち、DNAに対するcDNAの理論比が1:10よりも小さい値[20ngのヒトゲノムDNA(約104コピーの遺伝子に相当)に対して、103コピーのcDNA]から10:1を超える値[20ngのヒトゲノムDNA(約104コピーの遺伝子に相当)に対して、105コピーのcDNA]にまで及んでいた。cDNAテンプレートの理論上のコピー数は、逆転写反応の効率が100%であると仮定して算出した(図7参照)。
配列番号2:センスプライマー
配列番号3:アンチセンスプライマー
配列番号4:ネステッドセンスプライマー
配列番号5:ネステッドアンチセンスプライマー
配列番号6:検出用プライマー
配列番号7:MMP−2に対する配列修飾アンチセンスプライマー
配列番号8:MMP−9に対する配列修飾アンチセンスプライマー
配列番号9:uPAに対する配列修飾アンチセンスプライマー
配列番号10:uPARに対する配列修飾アンチセンスプライマー
配列番号11:p53に対する配列修飾アンチセンスプライマー
配列番号12:MMP−2に対するセンスプライマー
配列番号13:MMP−9に対するセンスプライマー
配列番号14:uPAに対するセンスプライマー
配列番号15:uPARに対するセンスプライマー
配列番号16:p53に対するセンスプライマー
配列番号18:MMP−9に対するアンチセンスプライマー
配列番号19:uPAに対するアンチセンスプライマー
配列番号20:uPARに対するアンチセンスプライマー
配列番号21:p53に対するアンチセンスプライマー
配列番号22:MMP−2に対するビオチン化サイクリックミニシークエンシング
プライマー
配列番号23:MMP−9に対するビオチン化サイクリックミニシークエンシング
プライマー
配列番号24:uPAに対するビオチン化サイクリックミニシークエンシングプライマー
配列番号25:uPARに対するビオチン化サイクリックミニシークエンシング
プライマー
配列番号26:p53に対するビオチン化サイクリックミニシークエンシングプライマー
配列番号27:トリプシノーゲン−2に対する配列修飾アンチセンスプライマー
配列番号28:MMP−2に対する配列修飾アンチセンスプライマー
配列番号29:トリプシノーゲン−2に対するセンスプライマー
配列番号30:トリプシノーゲン−2に対するアンチセンスプライマー
配列番号31:MMP−2に対するセンスプライマー
配列番号32:MMP−2に対するアンチセンスプライマー
Claims (18)
- 細胞又は組織のサンプルに存在するmRNA転写産物の相対量について、定量および比較評価の少なくとも一方を行うための方法であって、
(a)複数の遺伝子に対する配列修飾プライマーを用いて、サンプルに含まれるmRNAの逆転写を1回の反応で行い、配列修飾cDNA分子のプールを得、ただし、該配列修飾プライマーは、次の3つの機能的セグメント(i)、(ii)及び(iii):
(i)特定の遺伝子のセンス鎖DNA配列のみならずmRNA配列に相補的なヌクレオチド配列であって、続いて行う増幅反応に用いる下流側のプライマーのための結合部位に対する相補的ヌクレオチド配列を含有するDNA配列を含む、5'−末端セグメント、
(ii)該遺伝子のセンス鎖DNA配列のみならずmRNA配列に非相補的である1つ又は複数のヌクレオチドを含むDNA配列からなる、中央セグメント、及び
(iii)該遺伝子のセンス鎖DNA配列のみならずmRNA配列に相補的なDNA配列を含む、3'−末端セグメント
を含有するDNAオリゴヌクレオチドであり、
(b)逆転写反応の終了後に、余った配列修飾プライマーを除去又は不活化し、
(c)分析対象としたそれぞれの遺伝子について個別に増幅反応を行うが、各反応においては、同じ遺伝子特異的プライマーを用いて配列修飾cDNAからなるテンプレートと参照DNAテンプレートを競合的に共増幅して、測定可能な量の増幅産物を生成し、
(d)配列修飾cDNAテンプレートから誘導した増幅産物と参照DNAテンプレートから誘導した増幅産物のそれぞれの量を測定し、相対レベルを決定して、個別に行った増幅反応における、DNAに対する遺伝子特異的cDNAの比を得、そして
(e)個別に行った増幅反応から得られた、DNAに対する遺伝子特異的cDNAの比を組み合わせて、サンプルに元々存在するmRNA転写産物の相対量を反映する、該比のサンプル特異的プロファイルを得る
ことを包含する方法。 - サンプルが、細胞又は組織の溶解物又はホモジェネートを含むことを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 逆転写反応の前に、サンプルからRNA、又はRNAとDNAを単離することを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 逆転写反応を、サンプルに含まれるDNAが二本鎖の状態を維持する条件下で行うことを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 逆転写反応の終了後に行う余った配列修飾プライマーの除去又は不活性化を、酵素分解によって行うことを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 酵素分解を、一本鎖DNA特異的エキソヌクレアーゼを用いて行うことを特徴とする、請求項5に記載の方法。
- 個々の増幅反応をそれぞれ物理的に隔離された反応容器において行うことを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 参照DNAテンプレートが、サンプルに存在しているか又は別の原料から単離したゲノムDNAを含むことを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 参照DNAテンプレートが、クローニング又は合成したDNAオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドを含むことを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 逆転写反応によって生成されるcDNA分子のヌクレオチド配列を修飾し、cDNA由来の増幅産物を、同じ増幅反応によって得られる参照DNAテンプレート由来の増幅産物から区別するために、該配列の修飾を用いることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 増幅産物の定量を、増幅反応の間に行うことを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 増幅産物の定量を、増幅反応の終了後に行うことを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 個別の遺伝子特異的増幅反応において、配列修飾cDNAテンプレートと参照DNAテンプレートから誘導する増幅産物の相対レベルが、増幅反応を実施する前の増幅反応系に元々存在した配列修飾cDNAテンプレートと参照DNAテンプレートの相対量を反映することを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- cDNAテンプレートと参照DNAテンプレートを増幅するために、ポリメラーゼ連鎖反応、リガーゼ連鎖反応又は転写媒介性増幅を用いることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 増幅産物の定量に、解離曲線解析、差別化部位におけるプライマー伸長法、配列特異的なハイブリダイゼーションプローブ、質量分析法、又は直接的又は間接的な蛍光共鳴エネルギー移動に基づく解析を用いることを特徴とする、請求項1又は10に記載の方法。
- 差別化部位におけるプライマー伸長法が、ミニシークエンシング法、サイクリックミニシークエンシング法、ピロシークエンシング法(登録商標)及び対立遺伝子特異的プライマー伸長法からなる群より選ばれることを特徴とする、請求項15に記載の方法。
- 配列特異的なハイブリダイゼーションプローブが、二重に標識した加水分解プローブ及びモレキュラービーコン(登録商標)プローブからなる群より選ばれることを特徴とする、請求項15に記載の方法。
- 請求項1〜17のいずれかに記載の方法に用いるためのキットであって、請求項1に記載の配列修飾プライマーを含むことを特徴とするキット。
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