JPH1057064A

JPH1057064A - 微量遺伝子産物の特異的増幅方法

Info

Publication number: JPH1057064A
Application number: JP8216506A
Authority: JP
Inventors: Eiji Sakamoto; 英二阪本; Fumio Hanaoka; 文雄花岡
Original assignee: RIKEN Institute of Physical and Chemical Research
Current assignee: RIKEN Institute of Physical and Chemical Research
Priority date: 1996-08-16
Filing date: 1996-08-16
Publication date: 1998-03-03
Also published as: US6280931B1; EP0825265A1

Abstract

(57)【要約】【課題】微量にしか発現していない遺伝子産物の特異
的増幅方法の提供。【解決手段】標的ｍＲＮＡの３’側非翻訳領域の少な
くとも一部と相補的なオリゴヌクレオチドプライマーを
用いてｃＤＮＡを合成し、得られるｃＤＮＡを、５’側
プライマーと、前記オリゴヌクレオチドプライマーより
も上流に配置させた３’側プライマーとを用いて増幅す
ることを特徴とする微量遺伝子産物の特異的増幅方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、遺伝子産物の特異
的増幅方法、特に、微量にしか発現していない遺伝子産
物の特異的増幅方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】遺伝性疾患や癌、さらにいくつかの早老
症や痴呆症は、特定の遺伝子に変異が生ずることにより
発症する。そのためこれら疾患は、遺伝子病と総称され
ることが多い。このような遺伝子病として異常な形質が
現れるのは、その遺伝子が発現する臓器ないし組織に限
られるが、遺伝子自体の変異は全身のどの組織でも存在
する。したがって、遺伝子病を診断するための手法とし
て、サンプリングが最も容易な末梢血液中の白血球から
ゲノムＤＮＡを抽出し、該ゲノムＤＮＡを増幅する手法
が挙げられる。

【０００３】ゲノムＤＮＡの増幅手法としては、第一
に、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）による方法が挙げ
られる。そして、得られるＤＮＡの塩基配列の変異を探
索することにより遺伝子病を診断する。しかし、一つの
ゲノムＤＮＡ全体を一回のＰＣＲで増幅することは、一
般に、ゲノムＤＮＡの大きさが大きすぎるため困難であ
る。

【０００４】そのゲノムＤＮＡを増幅する手法として、
第二に、病気と関係する塩基変異はタンパク質をコード
する「エクソン」の領域で起こるので、エクソンのみを
増幅する方法が挙げられる。そのためにはゲノムＤＮＡ
のどの領域がエクソンであるか、という遺伝子構造に関
する情報が必要とされる。しかし、その情報が分かって
いる場合は極めて少ない。

【０００５】これらのことから、遺伝子診断を行うに
は、多くの場合、サンプルとして末梢血液を用いるので
はなく、症状のある組織からバイオプシーを行なって得
られたものを用いる必要がある。そして、得られる組織
からタンパク質の前駆体であるｍＲＮＡを抽出し、ｃＤ
ＮＡを合成した後に、ＰＣＲを行うという方法が一般的
である（この方法はＲＴ−ＰＣＲと呼ばれている）。し
かし、バイオプシーは患者に多大な苦痛を与える上、脳
に代表されるように、バイオプシーが極めて困難な組織
もある。

【０００６】以上の理由により、サンプリングが容易な
血液を用いて遺伝子診断を行うにはゲノムＤＮＡの増幅
において多くの制約が伴う一方、バイオプシーによって
得られる組織から前記遺伝性疾患等の原因となる候補遺
伝子の特定の塩基について、そのタンパク質翻訳領域の
どの位置に塩基の変異が存在するかを探索する場合にお
いても、依然多くの制約が存在するのが現状である。

【０００７】ところで、特定の組織（脳や心臓等）にし
か発現が認められない遺伝子が、末梢血の白血球や皮膚
の線維芽細胞などでも極微量に発現していることが、Ｒ
Ｔ−ＰＣＲなどによって最近明らかにされてきた（Chel
ly,J. et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA.86, 2617-2621
(1989)) 。この「極微量に発現している」ことは、生理
的な遺伝子発現というよりは、生体内における遺伝子発
現の抑制は100 ％ではなく、若干の「漏れ」があると解
釈するのが妥当である。すなわち、「極微量に発現して
いる」ことは、微量ではあるがある特定の遺伝子が本来
的に発現していることを意味するものではなく、ある特
定の組織（例えば脳）において発現しているｍＲＮＡ
が、本来その組織のみで発現すべきであるはずのところ
を中にはその組織だけでなく組織外に漏れ出る場合もあ
り、そのようなｍＲＮＡが漏れ出ることを完全に抑制す
ることはできない（100 ％ではない）ために、極微量に
漏れたｍＲＮＡが当該組織以外（例えば血液中）にも存
在すると解釈することが妥当である。

【０００８】この漏れたＲＮＡは、「Leaky RNA」ある
いは「Illegitimate Transcription」と呼ばれる。この
「漏れた」ｍＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲ法により標的遺伝
子産物を特異的に増幅することができれば、原理的にい
かなる遺伝子病でも、末梢血液による遺伝子診断が可能
になると考えられる。

【０００９】従来のＲＴ−ＰＣＲ法では、まず組織から
total ＲＮＡを抽出し、さらにｍＲＮＡを精製し、オリ
ゴ(dT)プライマー又はランダムプライマーを用いて、そ
の組織で発現しているｃＤＮＡのプールを作成した（PC
R PROTOCOLS: A Guide to Methods and Applications,
Michael A.Innis et al.,Academic Press Inc.1990）。
次に、標的ｃＤＮＡに特異的なオリゴＤＮＡプライマー
セットでＰＣＲを行った。

【００１０】しかし、ＰＣＲの鋳型は組織全体のｃＤＮ
Ａであるため、ＰＣＲに用いるｃＤＮＡの量を増やした
り、ＰＣＲのサイクル数を増やすと、多数の非特異的な
増幅産物のコンタミネーション（混入）が生じることが
あった。そのため、この方法を前述の「Illegitimate T
ranscription」に適用することは困難であった。

【００１１】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、遺伝子産物
の特異的増幅方法、特に、微量にしか発現していない遺
伝子産物を特異的に増幅し得る方法を提供することを目
的とする。

【００１２】

【課題を解決するための手段】本発明者は、上記課題に
基づいて鋭意研究を行った結果、ｃＤＮＡを増幅する際
の３’側プライマーの位置を、ｍＲＮＡからｃＤＮＡを
合成する際のプライマーの位置とは異なる位置に配置す
ることにより、微量にしか発現していない遺伝子産物を
特異的に増幅し得ることを見出し、本発明を完成するに
至った。

【００１３】すなわち、本発明は、標的ｍＲＮＡの３’
側に存在する非翻訳領域の少なくとも一部と相補的なオ
リゴヌクレオチドプライマーを用いてｃＤＮＡを合成
し、得られるｃＤＮＡを、５’側プライマーと、前記オ
リゴヌクレオチドプライマーよりも上流に位置する３’
側プライマーとを用いて増幅することを特徴とする微量
遺伝子産物の特異的増幅方法である。

【００１４】微量遺伝子産物としては、ジストログリカ
ン、α−サルコグリカン又はエンドセリンＢ受容体をコ
ードするｃＤＮＡが挙げられる。ここで、ｃＤＮＡの合
成用プライマーとｃＤＮＡ増幅用３’側プライマーとの
距離は１ｋｂ以内が好ましいが、１〜300ｂｐの範囲が
さらに好ましい。また、ｃＤＮＡ増幅用５’側プライマ
ー及び３’側プライマーとしては、標的ｍＲＮＡの翻訳
領域のそれぞれ上流、下流に隣接しているものが挙げら
れる。以下、本発明を詳細に説明する。

【００１５】

【発明の実施の形態】本発明の微量遺伝子産物の増幅方
法は、対象（標的）となるｍＲＮＡの３’側に逆転写用
プライマーをハイブリダイズさせて逆転写酵素によりｃ
ＤＮＡを合成し、得られるｃＤＮＡを、５’側プライマ
ーと、前記逆転写用プライマーの位置とは異なる位置に
配置させた３’側プライマーとを用いてｃＤＮＡを増幅
することを特徴とする。

【００１６】ここで、本発明において「微量遺伝子」と
は、発現量が微量な遺伝子を意味し、「遺伝子産物」と
は、ゲノムＤＮＡの転写産物からスプライシングを受け
て得られたｍＲＮＡから、逆転写酵素により合成された
ｃＤＮＡをいう（以下、遺伝子産物をｃＤＮＡと呼ぶこ
ともある）。

【００１７】まず、増幅の標的となるｍＲＮＡを各組織
から調製する。組織としては、特に限定されず、血液、
脳、心臓、筋肉等が挙げられるが、サンプリングが容易
である点で血液が好ましい。また、市販のｍＲＮＡ（Cl
onetech 社製) を用いることもできる。

【００１８】本発明においては、特に、組織特異的に発
現をする遺伝子産物であってバイオプシー等により当該
組織から単離することが困難なものを増幅の対象となる
遺伝子産物として挙げることができる。例えば、進行性
筋ジストロフィー症のジストログリカン（hDG）をコー
ドするｃＤＮＡ、α−サルコグリカン(hα-SG)をコード
するｃＤＮＡ、そしてヒルシュスプリング病のエンドセ
リンＢ受容体（hET_B)をコードするｃＤＮＡ等が挙げら
れる。これらの遺伝子産物は、例えばhDG及びhET_Bにつ
いては脳や心臓に発現するものであるため、血中に漏れ
出る量は極微量である。従って、本発明の増幅方法はこ
れらの遺伝子産物を増幅するために特に有用である。但
し、本発明では、上記遺伝子産物に限定されることはな
い。

【００１９】ｍＲＮＡの調製は、公知のいずれの手法を
も用いることができる。例えば、Guanidinium 法（Chir
gwin,J.J.et al.,Biochemistry 18:5294,1979)、AGPC法
（Chomoczynski,P. and Sacchi,N.,Anal.Biochem.,162:
156-159,1987) 等が挙げられる。

【００２０】例えば、本発明においては、ニッポンジー
ン社のキット「ISOGEN-LS 」を用いてｍＲＮＡを調製す
る。なお、このキットを用いた場合、ｍＲＮＡはtotal
ＲＮＡの一部として得られるが、ｍＲＮＡのみを精製す
る必要はない。なお、市販のｍＲＮＡ（例えばClonetec
h 社のPoly(A)⁺RNA)を用いて直接ｃＤＮＡ合成を行う
こともできる。

【００２１】次に、前記調製されたｍＲＮＡからｃＤＮ
Ａを合成する（図１(b))。ｃＤＮＡの合成に用いるプラ
イマーとしては、標的ｍＲＮＡ分子の３’側の非翻訳領
域の少なくとも一部と相補的なオリゴヌクレオチドＤＮ
Ａが挙げられる（図１(a))。プライマーは、ｍＲＮＡの
塩基配列に基づいて合成する。本発明においては、配列
が公知のｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成し、増幅すること
を目的とするため、得られるｍＲＮＡの任意の領域の配
列を選択することが可能である。そして、例えば、ＡＢ
Ｉ社（Applied Biosystems Inc.)のＤＮＡ合成装置を用
いた化学合成により目的のプライマーを得ることができ
る。プライマーの長さは、通常20〜30塩基、好ましくは
24〜26塩基である。

【００２２】ｃＤＮＡ合成反応は、逆転写酵素（例え
ば、GIBCO BRL 社のSuper Script IIRNaseH^-Reverse T
ranscriptase ）を用いて行う。従来のように、オリゴ
ｄＴプライマーを用いてｃＤＮＡを合成すると、目的と
しないｃＤＮＡも合成されてしまうが、本発明のよう
に、目的のｍＲＮＡに特異的なプライマーを用いてｃＤ
ＮＡを合成することにより、その後に行う増幅に用いら
れるｃＤＮＡをあらかじめ標的分子に極めて特異的なも
のにすることができる。

【００２３】次に、前記のようにして得られたｃＤＮＡ
を増幅する（図１(c))。増幅は、公知のいずれかの手法
により行うことができる。例えば、増幅手法としては、
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）が挙げられる。ＰＣＲ
用のプライマーの合成法についても、前記ｃＤＮＡ合成
用のプライマーを合成する場合と同様である。なお、Ｐ
ＣＲ用のプライマーの長さは、通常20〜40塩基、好まし
くは25〜35塩基である。

【００２４】ＰＣＲに用いる３’側プライマーは、ｃＤ
ＮＡ合成用プライマーよりも上流に位置させる。すなわ
ち、増幅の対象となるｃＤＮＡにおいて、翻訳領域（オ
ープンリーディングフレーム）の３’末端とｃＤＮＡ合
成用プライマーの位置との間に、ＰＣＲに用いる３’側
のプライマーを位置させる（図１(a) 及び(b))。ＰＣＲ
用３’側プライマーの位置とｃＤＮＡ合成に用いたプラ
イマーの位置との距離（図１(b) の“ｄ”）は、両プラ
イマーが一部でも重なり合わない限り特に限定されない
が、通常１kb以内が好ましく、１〜300bpの範囲がさら
に好ましい。

【００２５】また、本発明では、ＰＣＲ用プライマーの
位置は特に限定されないが、可能な限りタンパク質翻訳
領域のすぐ外側に隣接するようにデザインすることが好
ましい（図１(b))。ここで、「隣接する」とは、５’側
プライマー及び３’側プライマーが、それぞれ翻訳領域
のすぐ上流（１塩基上流）、すぐ下流（１塩基下流）に
位置することはもちろん、300 塩基程度まで離れてもよ
いことを意味する。例えば、あるｃＤＮＡ断片が300 個
の塩基配列を有し、このうち翻訳領域が101 〜200 番目
にあるとすると、５’側プライマーは、例えば、76〜10
0 番目（翻訳領域の５’末端からみて１塩基上流）、あ
るいは41〜75番目（翻訳領域の５’末端からみて25塩基
上流）に位置するようにし、そして３’側用プライマー
は、201〜220 番目（翻訳領域の３’末端からみて１塩
基下流）、あるいは211 〜235 番目（翻訳領域の３’末
端からみて10塩基下流）に位置するようにすることがで
きる。そして、LA Taq (Takara）等を用いたいわゆる
“Long PCR”を行うことにより、一回のＰＣＲで標的遺
伝子産物の全タンパク質翻訳領域の増幅が可能となる。

【００２６】ここで、増幅用の３’側プライマーをｃＤ
ＮＡ合成用プライマーと同じものを用いると、以下の点
で不都合がある。すなわち、標的ｍＲＮＡに特異的なｃ
ＤＮＡを合成しても、非特異的なｃＤＮＡの混入によ
り、その混入したｃＤＮＡが増幅されてしまう恐れがあ
る。

【００２７】例えば、図２に示すように、３’側プライ
マーとして逆転写用及びＰＣＲ用ともに同一のもの（図
２(1)(a)のプライマー１）を用いた場合において、仮
に、逆転写用プライマーと偶然ハイブリダイズすること
ができる対象外のｍＲＮＡ（混入ＲＮＡ２）が逆転写の
段階で混入しているとすると、逆転写により、混入ｍＲ
ＮＡ２についても混入ｃＤＮＡ３の合成が行われてしま
う（図２(1)(b)) 。従って、その後に行う増幅において
も、混入ｃＤＮＡ３の逆転写プライマーの位置に３’側
プライマー１’がハイブリダイズすることができるた
め、混入ｃＤＮＡ３がたとえ増幅用５’側プライマー４
とハイブリダイズしなくても、混入ｃＤＮＡ３の一次関
数的な増幅が行われてしまう（図２(1) の(c) 及び
(d₂)) 。

【００２８】これに対し、図２(2) に示すように、増幅
用の３’側プライマー５を逆転写用プライマー１とは異
なる位置に配置させた場合（図２(2) の(a) 及び(b))
は、仮に逆転写の際にプライマー１が混入ｍＲＮＡ２に
偶然ハイブリダイズすることができ、混入ｃＤＮＡ３の
合成が行われたとしても（図２(2)(b) )、その後の増幅
の段階で３’側プライマー５が混入ｃＤＮＡ３とハイブ
リダイズする確率は極めて少なくなる。すなわち、ＰＣ
Ｒで増幅される遺伝子産物は、ｃＤＮＡ合成用プライマ
ー１、ＰＣＲの３’側プライマー５、そしてＰＣＲの
５’側プライマー４のいずれとも偶然ハイブリダイズし
なければならず、その確率は極めて希と考えられる。

【００２９】その結果、鋳型ｃＤＮＡの量を増やした
り、ＰＣＲのサイクル数を上げても非特異的な増幅産物
が生じることなく（図２(2)(d₄))、目的の遺伝子産物を
特異的に増幅することが期待される（図２(2)(d₃))。こ
のことは、特に、極微量にしか発現していない遺伝子産
物を特異的に増幅するための極めて有効な方法であるこ
とを意味する。

【００３０】さらに、目的とするｍＲＮＡに特異的なプ
ライマーを用いることにより、ｒＲＮＡ及びｔＲＮＡが
混在してもｍＲＮＡのみと特異的にハイブリダイズして
ｃＤＮＡを合成することができることから、ｍＲＮＡの
みを精製する必要はなく、鋳型ＲＮＡとして使用するサ
ンプルは、上記各ＲＮＡが混在するtotal ＲＮＡで足り
る。

【００３１】ＰＣＲは、所定の反応液を94℃で２分間イ
ンキュベート後、LA Taq (Takara)を添加し、適当なＰ
ＣＲ反応器（例えばThermal Cycler 480 (Perkin Elmer
Cetus））を用いて行う。反応条件は、例えば以下の通
り設定することができる。94℃で１分、Ｘ℃で１分及び
72℃でＹ分の反応を１サイクルとしてこれをＺサイクル
行い、最後に72℃で10分反応させる。ここで、Ｘ、Ｙ及
びＺは、増幅の対象となる標的遺伝子により異なり、適
宜変えることができる。Ｙは、増幅の対象となる断片の
長さが１kb当たり１分を目安にする。Ｘは45℃〜70℃、
Ｚは35〜40サイクルの範囲で条件を最適化する。

【００３２】ＰＣＲの反応終了後、アガロースゲル電気
泳動等により増幅産物を確認する。必要に応じ、増幅産
物をゲルから回収し、塩基配列のシークエンスを行う。
このようにして増幅された遺伝子産物を解析することに
より、疾患を検出することができる。すなわち、増幅さ
れた遺伝子産物について配列決定等を行うことにより遺
伝子の変異（例えば欠失、置換、挿入等）を見い出すこ
とができ、そして変異があった遺伝子を有していた場合
は、その疾患を有するものと判断される。

【００３３】

【実施例】以下、実施例により本発明をさらに具体的に
説明する。但し、本発明はこれら実施例にその技術的範
囲を限定するものではない。〔実施例１〕進行性筋ジストロフィー症の原因候補遺伝
子の一つであるヒト・ジストログリカン（hDG）をコー
ドするｃＤＮＡの増幅本実施例では、進行性筋ジストロフィー症の原因候補遺
伝子の一つであるヒト・ジストログリカン（hDG）をコ
ードするｃＤＮＡの増幅を目的として、末梢血からのｃ
ＤＮＡの増幅を行った。

【００３４】(1) 末梢血からのＲＮＡの分離ヘパリン採血した末梢血１mlに、ISOGEN-LS（ニッポン
ジーン）３mlを加え、指示（説明書）に従いtotal ＲＮ
Ａを調製し、10μl のRNase-free H₂Oに懸濁した。この
方法では、末梢血から白血球を分離することなく、直接
total ＲＮＡを抽出することができる。末梢血１mlから
60〜90μgのtotal ＲＮＡが抽出された。

【００３５】(2) ｃＤＮＡ合成ｃＤＮＡ合成用の反応液は以下の通りである。ＲＮＡ水溶液 10 μl ｃＤＮＡ合成用プライマー（ hDGP: 配列番号１）(10mM) 1 μl 合計 11 μl ｃＤＮＡ合成用プライマーhDGP（配列番号１）は、進行
性筋ジストロフィー症のジストログリカン（hDG）をコ
ードするｃＤＮＡ（配列番号10）のうち、第3202〜3226
番目の配列（タンパク質翻訳領域の３’末端からみて12
3 塩基下流に位置する）に対応する。上記反応液を70℃
で10分間インキュベート後、直ちに氷水中に移し、２分
間静置し、ＲＮＡの変性を行った。反応液を軽く遠心
し、上記混合物に以下の試薬を加え、室温（22℃）に10
分間静置し、プライマーのpoly(A)⁺RNAへのアニーリン
グを行った。

【００３６】上記混合物（１９μl)に１μl の逆転写酵素SuperScrip
tII (BRL) を加え、全量を20μl とし、37℃で１時間イ
ンキュベートした。0.5M EDTAを１μl 加え反応を停止
させ、エタノール沈殿の後、ペレットを9.5 μl の純水
に懸濁した。

【００３７】(3) 標的遺伝子産物の増幅増幅用の各プライマーは以下の通りである。５’側プライマーhDGU: 配列番号２３’側プライマーhDGL: 配列番号３５’側プライマーは、進行性筋ジストロフィー症のジス
トログリカン（hDG）をコードするｃＤＮＡ（配列番号1
0）の第294〜324番目（タンパク質翻訳領域の５’末端
からみて71塩基上流に位置する）に対応し、３’側プラ
イマーは第3164〜3194番目（タンパク質翻訳領域の３’
末端からみて85塩基下流に位置する）に対応する。ＰＣ
Ｒ用の反応溶液を以下の通り調製した。

【００３８】

【００３９】上記反応液を94℃で２分間インキュベート
後、LA Taqポリメラーゼ (Takara)を0.125μl 添加し
（計12.5μl)、Thermal Cycler 480 (Perkin Elmer Cet
us)を用いてＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲは、94℃で１
分、65℃で１分及び72℃で３分の反応を１サイクルとし
てこれを35サイクル行った。さらに、反応後72℃で10分
の反応を行った。

【００４０】増幅産物についてアガロースゲル電気泳動
を行った結果、hDGをコードするｃＤＮＡ（配列番号10
で表される塩基配列の第294 〜3194番目の配列に対応す
る2901bpのｃＤＮＡ) が増幅されていることがわかった
（図３，右側のレーン）。なお、図３において左側のレ
ーン（Ｍ）は分子量マーカーである。

【００４１】本実施例では約３kbのｃＤＮＡの増幅が可
能であったことから、本発明の方法は、極微量な遺伝子
産物を増幅するだけでなく、さらに標的遺伝子産物の大
きさによる制限を受けないことがわかった。

【００４２】〔実施例２〕進行性筋ジストロフィー症の
原因候補遺伝子産物の一つであるヒト・α−サルコグリ
カン(hα-SG)をコードするｃＤＮＡの増幅標的遺伝子産物をα−サルコグリカンをコードするｃＤ
ＮＡとして、実施例１と同様に末梢血液からtotal ＲＮ
Ａを調製し、ｃＤＮＡの合成及びＰＣＲを行った。

【００４３】ｃＤＮＡ合成用プライマー hα-SGP：配列
番号４ＰＣＲ用５’側プライマー hα-SGU: 配列番号５ＰＣＲ用３’側プライマー hα-SGL: 配列番号６

【００４４】配列番号４、５及び６で表される配列は、
hα-SG をコードするｃＤＮＡ（配列番号11で表され
る）のうち、それぞれ配列番号４については第1325〜13
49番目（タンパク質領域の３’末端からみて121 塩基下
流に位置する）、配列番号５については第１〜21番目
（タンパク質領域の５’末端からみて23塩基上流に位置
する）、配列番号６については第1216〜1236番目（タン
パク質領域の３’末端からみて12塩基下流に位置する）
に対応する。

【００４５】ＰＣＲは、94℃で１分、55℃で１分及び72
℃で1.5 分の反応を１サイクルとしてこれを35サイクル
行った。さらに、反応後72℃で10分の反応を行った。増
幅産物についてアガロースゲル電気泳動を行った結果、
この増幅されたｃＤＮＡは、配列番号11において１〜12
36番目の配列に対応する1236bpの塩基配列を有するも
の、及び配列番号12において１〜864 番目の配列に対応
する864 bpの塩基配列を有するものであった（図４，右
側のレーン）。

【００４６】ところで、α−SGをコードするゲノムＤＮ
Ａは、転写の過程でいわゆる「選択的スプライシング
（alternative splicing）」を受け、２つの遺伝子産物
を生じることが知られている（E.M.McNally et al., Pr
oc.Natl.Acad.Sci.USA.91,9690-9694 (1994)）。選択的
スプライシングとは、一つの遺伝子から多数のイソ型ｍ
ＲＮＡを生じる機構をいい、遺伝子転写産物を加工する
過程において、あるエクソンを欠いた成熟転写産物が生
じることをいう。上記1236bp及び864bp の二種類のｃＤ
ＮＡが生じたのは、この選択的スプライシングが起こっ
たためである。なお、配列番号12で表される塩基配列
は、配列番号11で表される塩基配列の623 〜994 番目の
配列が選択的スプライシングを受けることにより短くな
った配列である。

【００４７】本発明では、２つの遺伝子産物の双方を単
離・同定することができた。すなわち、本発明は極微量
な遺伝子産物を増幅するだけでなく、選択的スプライシ
ングを受ける遺伝子産物も検出することができた。

【００４８】〔実施例３〕ヒルシュスプリング病の原因
候補遺伝子の一つであるヒト・エンドセリンＢ受容体
（hET_B) をコードするｃＤＮＡの増幅エンドセリンＢ受容体をコードするｃＤＮＡを増幅の標
的遺伝子として、実施例１と同様に末梢血液からtotal
ＲＮＡを調製し、ｃＤＮＡの合成及びＰＣＲを行った。

【００４９】ｃＤＮＡ合成用プライマーhETBP:配列番号
７ＰＣＲ用５’側プライマーhETBU:配列番号８ＰＣＲ用３’側プライマーhETBL:配列番号９

【００５０】配列番号７、８及び９で表される配列は、
hET_BをコードするｃＤＮＡ（配列番号13で表される）
のうち、それぞれ配列番号７については第1715〜1739番
目（タンパク質領域の３’末端からみて159 塩基下流に
位置する）、配列番号８については第170〜191番目（タ
ンパク質領域の５’末端からみて40塩基上流に位置す
る）、配列番号９については第1594〜1615番目（タンパ
ク質領域の３’末端からみて38塩基下流に位置する）に
対応する。

【００５１】ＰＣＲは、94℃で１分、45℃で１分及び72
℃で1.5 分の反応を１サイクルとしてこれを40サイクル
行った。さらに、反応後72℃で10分の反応を行った。な
お、ＰＣＲに用いるｃＤＮＡについては、ＲＮＡをアル
カリ分解後、ｃＤＮＡをガラスビーズで吸着精製したも
のを用いた。増幅産物についてアガロースゲル電気泳動
を行った結果、hET_BをコードするｃＤＮＡ（配列番号1
3で表される塩基配列のうち第170 〜1615番目に対応す
る1445 bpのｃＤＮＡ）が増幅されていることがわかっ
た（図５，右側のレーン）。

【００５２】標的ｃＤＮＡを増幅するには、少量の血液
（通常は１mlの末梢血）があれば十分に足りるが、本実
施例では、血液量を３mlに増量することにより（それで
もわずか３mlで足りる) ｃＤＮＡの増幅を確実なものと
した。このことは、末梢に「漏れ出る」遺伝子発現の量
が極端に少ない場合でも、血液サンプルの量を増やした
り、鋳型のｃＤＮＡを精製することにより、ＰＣＲのサ
イクル数を上げても非特異的な遺伝子産物の増幅が行わ
れることなく検出することが可能であった。

【００５３】本発明により、極微量にしか発現しない標
的遺伝子産物のタンパク質全体をコードするｃＤＮＡを
一回のＰＣＲで増幅することができる。したがって、様
々な遺伝性疾患や癌の微量な原因候補遺伝子を迅速スク
リーニングすることができる。

【００５４】本発明の方法は、これからの老齢化社会で
大きな問題となる痴呆症の場合のように、バイオプシー
が倫理的に極めて困難な脳にしか発現しない遺伝子産物
の塩基変異の検索を行う上で特に有用である。さらに、
本発明により組織特異的遺伝子産物を増幅させるのに必
要な末梢血液は、わずか数mlであるから、病院でルーチ
ンに行われている血液検査の目的で採血した血液又はそ
の残りの血液で十分足りる。したがって、患者に特別な
苦痛を与えることはない。

【００５５】

【発明の効果】本発明により、微量にしか発現していな
い遺伝子産物の特異的増幅方法が提供される。

【００５６】

【配列表】

配列番号：１配列の長さ：２５配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）配列： TTGTCCAGGC CCCTGTGTCA GTGTG

【００５７】配列番号：２配列の長さ：３１配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）配列：ＧＧＡＴＧＧＡＧＣＡＧＧＴＧＴＧＣＡＧＡＧＧＧＴＧＡＧＡＡＣＣ

【００５８】配列番号：３配列の長さ：３１配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）配列：ＴＣＡＧＧＴＧＴＣＧＧＣＴＣＣＣＧＧＴＧＧＧＣＡＡＴＧＧＴＣＴ

【００５９】配列番号：４配列の長さ：２５配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）配列： CCACCCCCTC TCCCTGCTTG TTTAG

【００６０】配列番号：５配列の長さ：２１配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）配列： CCCCTGTCTC TGTCACTCAC C

【００６１】配列番号：６配列の長さ：２１配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）配列： GGCTGGACCT GGAACCACTG G

【００６２】配列番号：７配列の長さ：２５配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）配列： CCGTAAACAG CTCATAAAAT GTCAT

【００６３】配列番号：８配列の長さ：２２配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）配列： TTGTCTCTAG GCTCTGAAAC TG

【００６４】配列番号：９配列の長さ：２２配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）配列： TTTTAATGAC TTCGGTCCAA TA

【００６５】配列番号：１０配列の長さ：５４９４配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：cDNA to mRNA 配列： GGGCCAGTCG GCGCCGCGCG GAGCTGGCCG CTGGATTGGC TGCAACACTC GCGTGTCAGG 60 CGGTTGCTAG GCTCCGGCCG CGCGCCCCGC CCTTGCGCTC AGCGCCCTCT CACCGCCCGG 120 TACGTGCTCG CGCGAAGGCT GCGGCGCGGC GCTCGCGCCT CTTAGGCTTG GCGGTGGCGG 180 CGGCGGCAGC TTCGCGCCGA ATCCCCGGGG AGCGGCGGTG GCGGCGTCCT GGGGCCAGGA 240 GGAGCGAACA CCTGCCGCGG TCCTCCCGCC GGCGCTGGGC TCTGTGTGCT CCGGGATGGA 300 GCAGGTGTGC AGAGGGTGAG AACCCAGCTC TGGGACCAAG TCACTTGCTT CCTTACTTAG 360 CAAGACTATC GACTTGAGCA AACTTGGACC TGGG 394 ATG AGG ATG TCT GTG GGC CTC TCG CTG CTG CTG CCC CTC TGG GGG AGG 442 Met Arg Met Ser Val Gly Leu Ser Leu Leu Leu Pro Leu Trp Gly Arg 1 5 10 15 ACC TTT CTC CTC CTG CTC TCT GTG GTT ATG GCT CAG TCC CAC TGG CCC 490 Thr Phe Leu Leu Leu Leu Ser Val Val Met Ala Gln Ser His Trp Pro 20 25 30 AGT GAA CCC TCA GAG GCT GTC AGG GAC TGG GAA AAC CAG CTT GAG GCA 538 Ser Glu Pro Ser Glu Ala Val Arg Asp Trp Glu Asn Gln Leu Glu Ala 35 40 45 TCC ATG CAC TCA GTG CTC TCA GAC CTC CAC GAG GCT GTT CCC ACA GTG 586 Ser Met His Ser Val Leu Ser Asp Leu His Glu Ala Val Pro Thr Val 50 55 60 GTT GGC ATT CCT GAT GGC ACG GCT GTC GTC GGG CGC TCA TTT CGA GTG 634 Val Gly Ile Pro Asp Gly Thr Ala Val Val Gly Arg Ser Phe Arg Val 65 70 75 80 ACC ATT CCA ACA GAT TTG ATT GCC TCC AGT GGA GAT ATC ATC AAG GTA 682 Thr Ile Pro Thr Asp Leu Ile Ala Ser Ser Gly Asp Ile Ile Lys Val 85 90 95 TCA GCG GCA GGG AAG GAG GCT TTG CCA TCT TGG CTG CAC TGG GAC TCA 730 Ser Ala Ala Gly Lys Glu Ala Leu Pro Ser Trp Leu His Trp Asp Ser 100 105 110 CAG AGC CAC ACC CTG GAG GGC CTC CCC CTT GAC ACT GAT AAG GGT GTG 778 Gln Ser His Thr Leu Glu Gly Leu Pro Leu Asp Thr Asp Lys Gly Val 115 120 125 CAT TAC ATT TCA GTG AGC GCT ACA CGG CTG GGG GCC AAC GGG AGC CAC 826 His Tyr Ile Ser Val Ser Ala Thr Arg Leu Gly Ala Asn Gly Ser His 130 135 140 ATC CCC CAG ACC TCC AGT GTG TTC TCC ATC GAG GTC TAC CCT GAA GAC 874 Ile Pro Gln Thr Ser Ser Val Phe Ser Ile Glu Val Tyr Pro Glu Asp 145 150 155 160 CAC AGT GAT CTG CAG TCG GTG AGG ACA GCC TCC CCA GAC CCT GGT GAG 922 His Ser Asp Leu Gln Ser Val Arg Thr Ala Ser Pro Asp Pro Gly Glu 165 170 175 GTG GTA TCA TCT GCC TGT GCT GCG GAT GAA CCT GTG ACT GTT TTG ACG 970 Val Val Ser Ser Ala Cys Ala Ala Asp Glu Pro Val Thr Val Leu Thr 180 185 190 GTG ATT TTG GAT GCC GAC CTC ACC AAG ATG ACC CCA AAG CAA AGG ATT 1018 Val Ile Leu Asp Ala Asp Leu Thr Lys Met Thr Pro Lys Gln Arg Ile 195 200 205 GAC CTC CTG CAC AGG ATG CGG AGC TTC TCA GAA GTA GAG CTT CAC AAC 1066 Asp Leu Leu His Arg Met Arg Ser Phe Ser Glu Val Glu Leu His Asn 210 215 220 ATG AAA TTA GTG CCG GTG GTG AAT AAC AGA CTA TTT GAC ATG TCG GCC 1114 Met Lys Leu Val Pro Val Val Asn Asn Arg Leu Phe Asp Met Ser Ala 225 230 235 240 TTC ATG GCT GGC CCG GGA AAT CCA AAA AAG GTG GTG GAG AAT GGG GCC 1162 Phe Met Ala Gly Pro Gly Asn Pro Lys Lys Val Val Glu Asn Gly Ala 245 250 255 CTT CTC TCC TGG AAG CTG GGC TGC TCC CTG AAC CAG AAC AGT GTG CCT 1210 Leu Leu Ser Trp Lys Leu Gly Cys Ser Leu Asn Gln Asn Ser Val Pro 260 265 270 GAC ATT CAT GGT GTA GAG GCC CCT GCC AGG GAG GGC GCA ATG TCT GCT 1258 Asp Ile His Gly Val Glu Ala Pro Ala Arg Glu Gly Ala Met Ser Ala 275 280 285 CAG CTT GGC TAC CCT GTG GTG GGT TGG CAC ATC GCC AAT AAG AAG CCC 1306 Gln Leu Gly Tyr Pro Val Val Gly Trp His Ile Ala Asn Lys Lys Pro 290 295 300 CCT CTT CCC AAA CGC GTC CGG AGG CAG ATC CAT GCT ACA CCC ACA CCT 1354 Pro Leu Pro Lys Arg Val Arg Arg Gln Ile His Ala Thr Pro Thr Pro 305 310 315 320 GTC ACT GCC ATT GGG CCC CCA ACC ACG GCT ATC CAG GAG CCC CCA TCC 1402 Val Thr Ala Ile Gly Pro Pro Thr Thr Ala Ile Gln Glu Pro Pro Ser 325 330 335 AGG ATC GTG CCA ACC CCC ACA TCT CCA GCC ATT GCT CCT CCA ACA GAG 1450 Arg Ile Val Pro Thr Pro Thr Ser Pro Ala Ile Ala Pro Pro Thr Glu 340 345 350 ACC ATG GCT CCT CCA GTC AGG GAT CCT GTT CCT GGG AAA CCC ACG GTC 1498 Thr Met Ala Pro Pro Val Arg Asp Pro Val Pro Gly Lys Pro Thr Val 355 360 365 ACC ATC CGG ACT CGA GGC GCC ATT ATT CAA ACC CCA ACC CTA GGC CCC 1546 Thr Ile Arg Thr Arg Gly Ala Ile Ile Gln Thr Pro Thr Leu Gly Pro 370 375 380 ATC CAG CCT ACT CGG GTG TCA GAA GCT GGC ACC ACA GTT CCT GGC CAG 1594 Ile Gln Pro Thr Arg Val Ser Glu Ala Gly Thr Thr Val Pro Gly Gln 385 390 395 400 ATT CGC CCA ACG ATG ACC ATT CCT GGC TAT GTG GAG CCT ACT GCA GTT 1642 Ile Arg Pro Thr Met Thr Ile Pro Gly Tyr Val Glu Pro Thr Ala Val 405 410 415 GCT ACC CCT CCC ACA ACC ACC ACC AAG AAG CCA CGA GTA TCC ACA CCA 1690 Ala Thr Pro Pro Thr Thr Thr Thr Lys Lys Pro Arg Val Ser Thr Pro 420 425 430 AAA CCA GCA ACG CCT TCA ACT GAC TCC ACC ACC ACC ACG ACT CGC AGG 1738 Lys Pro Ala Thr Pro Ser Thr Asp Ser Thr Thr Thr Thr Thr Arg Arg 435 440 445 CCA ACC AAG AAA CCA CGG ACA CCC CGG CCA GTG CCC CGG GTC ACC ACC 1786 Pro Thr Lys Lys Pro Arg Thr Pro Arg Pro Val Pro Arg Val Thr Thr 450 455 460 AAA GTT TCC ATC ACC AGA TTG GAA ACT GCC TCA CCG CCT ACT CGT ATT 1834 Lys Val Ser Ile Thr Arg Leu Glu Thr Ala Ser Pro Pro Thr Arg Ile 465 470 475 480 CGC ACC ACC ACC AGT GGA GTG CCC CGT GGC GGA GAA CCC AAC CAG CGC 1882 Arg Thr Thr Thr Ser Gly Val Pro Arg Gly Gly Glu Pro Asn Gln Arg 485 490 495 CCA GAG CTC AAG AAC CAT ATT GAC AGG GTA GAT GCC TGG GTT GGC ACC 1930 Pro Glu Leu Lys Asn His Ile Asp Arg Val Asp Ala Trp Val Gly Thr 500 505 510 TAC TTT GAG GTG AAG ATC CCG TCA GAC ACT TTC TAT GAC CAT GAG GAC 1978 Tyr Phe Glu Val Lys Ile Pro Ser Asp Thr Phe Tyr Asp His Glu Asp 515 520 525 ACC ACC ACT GAC AAG CTG AAG CTG ACC CTG AAA CTG CGG GAG CAG CAG 2026 Thr Thr Thr Asp Lys Leu Lys Leu Thr Leu Lys Leu Arg Glu Gln Gln 530 535 540 CTG GTG GGC GAG AAG TCC TGG GTA CAG TTC AAC AGC AAC AGC CAG CTC 2074 Leu Val Gly Glu Lys Ser Trp Val Gln Phe Asn Ser Asn Ser Gln Leu 545 550 555 560 ATG TAT GGC CTT CCC GAC AGC AGC CAC GTG GGC AAA CAC GAG TAT TTC 2122 Met Tyr Gly Leu Pro Asp Ser Ser His Val Gly Lys His Glu Tyr Phe 565 570 575 ATG CAT GCC ACA GAC AAG GGG GGC CTG TCG GCT GTG GAT GCC TTC GAG 2170 Met His Ala Thr Asp Lys Gly Gly Leu Ser Ala Val Asp Ala Phe Glu 580 585 590 ATC CAC GTC CAC AGG CGC CCC CAA GGG GAT AGG GCT CCT GCA AGG TTC 2218 Ile His Val His Arg Arg Pro Gln Gly Asp Arg Ala Pro Ala Arg Phe 595 600 605 AAG GCC AAG TTT GTG GGT GAC CCG GCA CTG GTG TTG AAT GAC ATC CAC 2266 Lys Ala Lys Phe Val Gly Asp Pro Ala Leu Val Leu Asn Asp Ile His 610 615 620 AAG AAG ATT GCC TTG GTA AAG AAA CTG GCC TTC GCC TTT GGA GAC CGA 2314 Lys Lys Ile Ala Leu Val Lys Lys Leu Ala Phe Ala Phe Gly Asp Arg 625 630 635 640 AAC TGT AGC ACC ATC ACC CTG CAG AAT ATC ACC CGG GGC TCC ATC GTG 2362 Asn Cys Ser Thr Ile Thr Leu Gln Asn Ile Thr Arg Gly Ser Ile Val 645 650 655 GTG GAA TGG ACC AAC AAC ACA CTG CCC TTG GAG CCC TGC CCC AAG GAG 2410 Val Glu Trp Thr Asn Asn Thr Leu Pro Leu Glu Pro Cys Pro Lys Glu 660 665 670 CAG ATC GCT GGG CTG AGC CGC CGG ATC GCT GAG GAT GAT GGA AAA CCT 2458 Gln Ile Ala Gly Leu Ser Arg Arg Ile Ala Glu Asp Asp Gly Lys Pro 675 680 685 CGG CCT GCC TTC TCC AAC GCC CTA GAG CCT GAC TTT AAG GCC ACA AGC 2506 Arg Pro Ala Phe Ser Asn Ala Leu Glu Pro Asp Phe Lys Ala Thr Ser 690 695 700 ATC ACT GTG ACG GGC TCT GGC AGT TGT CGG CAC CTA CAG TTT ATC CCT 2554 Ile Thr Val Thr Gly Ser Gly Ser Cys Arg His Leu Gln Phe Ile Pro 705 710 715 720 GTG GTA CCA CCC AGG AGA GTG CCC TCA GAG GCG CCG CCC ACA GAA GTG 2602 Val Val Pro Pro Arg Arg Val Pro Ser Glu Ala Pro Pro Thr Glu Val 725 730 735 CCT GAC AGG GAC CCT GAG AAG AGC AGT GAG GAT GAT GTC TAC CTG CAC 2650 Pro Asp Arg Asp Pro Glu Lys Ser Ser Glu Asp Asp Val Tyr Leu His 740 745 750 ACA GTC ATT CCG GCC GTG GTG GTC GCA GCC ATC CTG CTC ATT GCT GGC 2698 Thr Val Ile Pro Ala Val Val Val Ala Ala Ile Leu Leu Ile Ala Gly 755 760 765 ATC ATT GCC ATG ATC TGC TAC CGC AAG AAG CGG AAG GGC AAG CTT ACC 2746 Ile Ile Ala Met Ile Cys Tyr Arg Lys Lys Arg Lys Gly Lys Leu Thr 770 775 780 CTT GAG GAC CAG GCC ACC TTC ATC AAG AAG GGG GTG CCT ATC ATC TTT 2794 Leu Glu Asp Gln Ala Thr Phe Ile Lys Lys Gly Val Pro Ile Ile Phe 785 790 795 800 GCA GAC GAA CTG GAC GAC TCC AAG CCC CCA CCC TCC TCC AGC ATG CCA 2842 Ala Asp Glu Leu Asp Asp Ser Lys Pro Pro Pro Ser Ser Ser Met Pro 805 810 815 CTC ATT CTG CAG GAG GAG AAG GCT CCC CTA CCC CCT CCT GAG TAC CCC 2890 Leu Ile Leu Gln Glu Glu Lys Ala Pro Leu Pro Pro Pro Glu Tyr Pro 820 825 830 AAC CAG AGT GTG CCC GAG ACC ACT CCT CTG AAC CAG GAC ACC ATG GGA 2938 Asn Gln Ser Val Pro Glu Thr Thr Pro Leu Asn Gln Asp Thr Met Gly 835 840 845 GAG TAC ACG CCC CTG CGG GAT GAG GAT CCC AAT GCG CCT CCC TAC CAG 2986 Glu Tyr Thr Pro Leu Arg Asp Glu Asp Pro Asn Ala Pro Pro Tyr Gln 850 855 860 CCC CCA CCG CCC TTC ACA GTA CCC ATG GAG GGC AAG GGC TCC CGT CCC 3034 Pro Pro Pro Pro Phe Thr Val Pro Met Glu Gly Lys Gly Ser Arg Pro 865 870 875 880 AAG AAC ATG ACC CCA TAC CGG TCA CCT CCT CCC TAT GTC CCA CCT TAA 3082 Lys Asn Met Thr Pro Tyr Arg Ser Pro Pro Pro Tyr Val Pro Pro 885 890 895 CCCGCAAGCG CCTGGGTGGA GGCAGGGTAG GGCAGGGCCC TGGAGACGAC ATGGTGTTGT 3142 CTGTGGAGAC CGGTGGCCTG CAGACCATTG CCCACCGGGA GCCGACACCT GACCTAGCAC 3202 ACACTGACAC AGGGGCCTGG ACAAGCCCGC CCTCTCTGGT CCTCCCAAAC CCCAAAGCAG 3262 CTGGAGAGAC TTTGGGGACT TTTTTATTTT TATTTTTTGC CTAACAGCTT TTGGTTTGTT 3322 CATAGAGAAC TCTTCGCTTC ATTTTTGATG GCTGGCTCTG AAAGCACCAT GTGGAGTGGA 3382 GGTGGAGGGA CCGAGGAACC ATGAATGAAC TCGCAGGCAG TGCCGGGCGG CCCCCTGGCT 3442 CTCTGCGTTT TGCCTTTAAC ACTAACTGTA CTGTTTTTTC TATTCACGTG TGTCTAGCTG 3502 CAGGATGTAA CATGGAAAAC AGTAACTAAA GATTAAATTC AAAGGACTTT CAGAAGTTAA 3562 GGTTAAGTTT TTACGTTTAA TCTGCTGTTT ACCTAAACTT GTATGTATAA TTTTTGGGTG 3622 GGTATGGGGA ATTGCTTTGC TAAAAATAAG CTCCCAGGGT GTTTCAAACT TAGAGAAGAC 3682 CAAGGGACAG TATTTTTTAT CAAAGGAATA CTATTTTTTC ACACTACGTC AACTTGGTTG 3742 CTCTGATACC CCAGAGCCTG ATTGGGGGCC TCCCGGCCCT GGCTCACGCC AAGTCCCTGG 3802 TGCTGGGTTT GCTCTCCCGC TGTTGCCAGG GGCTGGAAGC TGGAGGGGTC TCTTGGGCCA 3862 TGGACATCCC CACTTCCAGC CCATGTACAC TAGTGGCCCA CGACCAAGGG GTCTTCATTT 3922 CCATGAAAAA GGGACTCCAA GAGGCAGTGG TGGCTGTGGC CCCCAACTTT GGTGCTCCAG 3982 GGTGGGCCAA CTGCTTGTGG GGGCACCTGG GAGGTCAAAG GTCTCCACCA CATCAACCTA 4042 TTTTGTTTTA CCCTTTTTCT GTGCATTGTT TTTTTTTTTC CTCCTAAAAG GAATATCACG 4102 GTTTTTTGAA ACACTCAGTG GGGGACATTT TGGTGAAGAT GCAATATTTT TATGTCATGT 4162 GATGCTCTTT CCTCACTTGA CCTTGGCCGC TTTGTCCTAA CAGTCCACAG TCCTGCCCCG 4222 ACCCACCCCA TCCCTTTTCT CTGGCACTCC AGTCCAGCTT GGGCCTGAAC TACTGGAAAA 4282 GGTCTGGCGG CTGGGGAGGA GTGCCAGCAA TAGTTCATAA TAAAAATCTG TTAGCTCTCA 4342 AAGCTAATTT TTTACTAAAG TTTTTATACA GCCTCAAATT GTTTTATTAA AAAAAAGATT 4402 TAAAATGGTG ATGCTTACAG CAGTTTGTAC GAGCTCTTAA GTGTTGATTC CATGGAACTG 4462 ACGGCTTTGC TTGTTTTGAT TCTTTTCCCC CTACTTTTCC TAATGGTTTA AATTCTGGAA 4522 TTACACTGGG GTTCTTTTGC CTTTTTTAGC AGAACATCCG TCCGTCCATC TGCATCTCTG 4582 TCCCATGACT CAGGGGCGCC CACTCTGCTT CGATTCTCCT CCTGTGGAAG AAACCATTTT 4642 GAGCATGACT TTTCTTGATG TCTGAAGCGT TATTTTGGGT ACTTTTTAGG GAGGAATGCC 4702 TTTCGCAATA ATGTATCCAT TCCCCTGATT GAGGGTGGGT GGGTGGACCC AGGCTCCCTT 4762 TGCACACAGA GCAGCTACTT CTAAGCCATA TCGACTGTTT TGCAGAGGAT TTGTGTGTCC 4822 TCCCTCAGGA GGGGAGGCCT GGTAGGAGGG GGGGAGAGTT CTCTGTCCTA CTGCTCTCAA 4882 GAGGGCATTT CCCCTTGCGC CTTCTCCCAC AGGGCCCAGC CCCTCTCCCC TGCCCAAGTC 4942 CCCAGGGGGT ACTCTGGAGT GAGCAGTCCC CCTGTGGGGG AGCCTGTAAA TGCGGGCTCA 5002 GTGGACCACT GGTGACTGGG CTCATGCCTC CAAGTCAGAG TTTCCCCTGG TGCCCCAGAG 5062 ACAGGAGCAC AAGTGGGATC TGACCTGGTG AGATTATTTC TGATGACCTC ATCAAAAAAT 5122 AAACAATTCC CAATGTTCCA GGTGAGGGCT TTGAAAGGCC TTCCAAACAG CTCCGTCGCC 5182 CCTAGCAACT CCACCATTGG GCACTGCCAT GCAGAGACGT GGCTGGCCCA GAATGGCCTG 5242 TTGCCATAGC AACTGGAGGC GATGGGGCAG TGAACAGAAT AACAACAGCA ACAATGCCTT 5302 TGCAGGCAGC CTGCTCCCCT GAGCGCTGGG CTGGTGATGG CCGTTGGACT CTGTGAGATG 5362 GAGAGCCAAT CTCACATTCA AGTGTTCACC AACCACTGAT GTGTTTTTAT TTCCTTCTAT 5422 ATGATTTTAA GATGTGTTTT CTGCATTCTG TAAAGAAACA TATCAAACTA AATAAAAGCA 5482 GTGTCTTTAT TC 5494

【００６６】配列番号：１１配列の長さ：１４３６配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：cDNA to mRNA 配列： CCCCTGTCTC TGTCACTCAC CGGGCGGGCC AGGCCGGGCA GCC ATG GCT GAG ACA 55 Met Ala Glu Thr 1 CTC TTC TGG ACT CCT CTC CTC GTG GTT CTC CTG GCA GGG CTG GGG GAC 103 Leu Phe Trp Thr Pro Leu Leu Val Val Leu Leu Ala Gly Leu Gly Asp 5 10 15 20 ACC GAG GCC CAG CAG ACC ACG CTA CAC CCA CTT GTG GGC CGT GTC TTT 151 Thr Glu Ala Gln Gln Thr Thr Leu His Pro Leu Val Gly Arg Val Phe 25 30 35 GTG CAC ACC TTG GAC CAT GAG ACG TTT CTG AGC CTT CCT GAG CAT GTC 199 Val His Thr Leu Asp His Glu Thr Phe Leu Ser Leu Pro Glu His Val 40 45 50 GCT GTC CCA CCC GCT GTC CAC ATC ACC TAC CAC GCC CAC CTC CAG GGA 247 Ala Val Pro Pro Ala Val His Ile Thr Tyr His Ala His Leu Gln Gly 55 60 65 CAC CCA GAC CTG CCC CGG TGG CTC CGC TAC ACC CAG CGC AGC CCC CAC 295 His Pro Asp Leu Pro Arg Trp Leu Arg Tyr Thr Gln Arg Ser Pro His 70 75 80 CAC CCT GGC TTC CTC TAC GGC TCT GCC ACC CCA GAA GAT CGT GGG CTC 343 His Pro Gly Phe Leu Tyr Gly Ser Ala Thr Pro Glu Asp Arg Gly Leu 85 90 95 100 CAG GTC ATT GAG GTC ACA GCC TAC AAT CGG GAC AGC TTT GAT ACC ACT 391 Gln Val Ile Glu Val Thr Ala Tyr Asn Arg Asp Ser Phe Asp Thr Thr 105 110 115 CGG CAG AGG CTG GTG CTG GAG ATT GGG GAC CCA GAA GGC CCC CTG CTG 439 Arg Gln Arg Leu Val Leu Glu Ile Gly Asp Pro Glu Gly Pro Leu Leu 120 125 130 CCA TAC CAA GCC GAG TTC CTG GTG CGC AGC CAC GAT GCG GAG GAG GTG 487 Pro Tyr Gln Ala Glu Phe Leu Val Arg Ser His Asp Ala Glu Glu Val 135 140 145 CTG CCC TCA ACA CCT GCC AGC CGC TTC CTC TCA GCC TTG GGG GGA CTC 535 Leu Pro Ser Thr Pro Ala Ser Arg Phe Leu Ser Ala Leu Gly Gly Leu 150 155 160 TGG GAG CCC GGA GAG CTT CAG CTG CTC AAC GTC ACC TCT GCC TTG GAC 583 Trp Glu Pro Gly Glu Leu Gln Leu Leu Asn Val Thr Ser Ala Leu Asp 165 170 175 180 CGT GGG GGC CGT GTC CCC CTT CCC ATT GAG GGC CGA AAA GAA GGG GTA 631 Arg Gly Gly Arg Val Pro Leu Pro Ile Glu Gly Arg Lys Glu Gly Val 185 190 195 TAC ATT AAG GTG GGT TCT GCC TCA CCT TTT TCT ACT TGC CTG AAG ATG 679 Tyr Ile Lys Val Gly Ser Ala Ser Pro Phe Ser Thr Cys Leu Lys Met 200 205 210 GTG GCA TCC CCC GAT AGC CAC GCC CGC TGT GCC CAG GGC CAG CCT CCA 727 Val Ala Ser Pro Asp Ser His Ala Arg Cys Ala Gln Gly Gln Pro Pro 215 220 225 CTT CTG TCT TGC TAC GAC ACC TTG GCA CCC CAC TTC CGC GTT GAC TGG 775 Leu Leu Ser Cys Tyr Asp Thr Leu Ala Pro His Phe Arg Val Asp Trp 230 235 240 TGC AAT GTG ACC CTG GTG GAT AAG TCA GTG CCG GAG CCT GCA GAT GAG 823 Cys Asn Val Thr Leu Val Asp Lys Ser Val Pro Glu Pro Ala Asp Glu 245 250 255 260 GTG CCC ACC CCA GGT GAT GGG ATC CTG GAG CAT GAC CCG TTC TTC TGC 871 Val Pro Thr Pro Gly Asp Gly Ile Leu Glu His Asp Pro Phe Phe Cys 265 270 275 CCA CCC ACT GAG GCC CCA GAC CGT GAC TTC TTG GTG GAT GCT CTG GTC 919 Pro Pro Thr Glu Ala Pro Asp Arg Asp Phe Leu Val Asp Ala Leu Val 280 285 290 ACC CTC CTG GTG CCC CTG CTG GTG GCC CTG CTT CTC ACC TTG CTG CTG 967 Thr Leu Leu Val Pro Leu Leu Val Ala Leu Leu Leu Thr Leu Leu Leu 295 300 305 GCC TAT GTC ATG TGC TGC CGG CGG GAG GGA AGG CTG AAG AGA GAC CTG 1015 Ala Tyr Val Met Cys Cys Arg Arg Glu Gly Arg Leu Lys Arg Asp Leu 310 315 320 GCT ACC TCC GAC ATC CAG ATG GTC CAC CAC TGC ACC ATC CAC GGG AAC 1063 Ala Thr Ser Asp Ile Gln Met Val His His Cys Thr Ile His Gly Asn 325 330 335 340 ACA GAG GAG CTG CGG CAG ATG GCG GCC AGC CGC GAG GTG CCC CGG CCA 1111 Thr Glu Glu Leu Arg Gln Met Ala Ala Ser Arg Glu Val Pro Arg Pro 345 350 355 CTC TCC ACC CTG CCC ATG TTC AAT GTG CAC ACA GGT GAG CGG CTG CCT 1159 Leu Ser Thr Leu Pro Met Phe Asn Val His Thr Gly Glu Arg Leu Pro 360 365 370 CCC CGC GTG GAC AGC GCC CAG GTG CCC CTC ATT CTG GAC CAG CAC TGA 1207 Pro Arg Val Asp Ser Ala Gln Val Pro Leu Ile Leu Asp Gln His 375 380 385 CAGCCCAGCC AGTGGTTCCA GGTCCAGCCC TGACTTCATC CTCCCTTCTC TGTCCACACC 1267 ACGAGTGGCA CATCCCACCT GCTGATTCCA GCTCCTGGCC CTCCTGGAAC CCAGGCTCTA 1327 AACAAGCAGG GAGAGGGGGT GGGGTGGGGT GAGAGTGTGT GGAGTAAGGA CATTCAGAAT 1387 AAATATCTGC TGCTCTGCTC ACCAATTGCT GCTGGCAGCC TCTCCCGTC 1436

【００６７】配列番号：１２配列の長さ：１０６４配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：cDNA to mRNA 配列： CCCCTGTCTC TGTCACTCAC CGGGCGGGCC AGGCCGGGCA GCC ATG GCT GAG ACA 55 Met Ala Glu Thr 1 CTC TTC TGG ACT CCT CTC CTC GTG GTT CTC CTG GCA GGG CTG GGG GAC 103 Leu Phe Trp Thr Pro Leu Leu Val Val Leu Leu Ala Gly Leu Gly Asp 5 10 15 20 ACC GAG GCC CAG CAG ACC ACG CTA CAC CCA CTT GTG GGC CGT GTC TTT 151 Thr Glu Ala Gln Gln Thr Thr Leu His Pro Leu Val Gly Arg Val Phe 25 30 35 GTG CAC ACC TTG GAC CAT GAG ACG TTT CTG AGC CTT CCT GAG CAT GTC 199 Val His Thr Leu Asp His Glu Thr Phe Leu Ser Leu Pro Glu His Val 40 45 50 GCT GTC CCA CCC GCT GTC CAC ATC ACC TAC CAC GCC CAC CTC CAG GGA 247 Ala Val Pro Pro Ala Val His Ile Thr Tyr His Ala His Leu Gln Gly 55 60 65 CAC CCA GAC CTG CCC CGG TGG CTC CGC TAC ACC CAG CGC AGC CCC CAC 295 His Pro Asp Leu Pro Arg Trp Leu Arg Tyr Thr Gln Arg Ser Pro His 70 75 80 CAC CCT GGC TTC CTC TAC GGC TCT GCC ACC CCA GAA GAT CGT GGG CTC 343 His Pro Gly Phe Leu Tyr Gly Ser Ala Thr Pro Glu Asp Arg Gly Leu 85 90 95 100 CAG GTC ATT GAG GTC ACA GCC TAC AAT CGG GAC AGC TTT GAT ACC ACT 391 Gln Val Ile Glu Val Thr Ala Tyr Asn Arg Asp Ser Phe Asp Thr Thr 105 110 115 CGG CAG AGG CTG GTG CTG GAG ATT GGG GAC CCA GAA GGC CCC CTG CTG 439 Arg Gln Arg Leu Val Leu Glu Ile Gly Asp Pro Glu Gly Pro Leu Leu 120 125 130 CCA TAC CAA GCC GAG TTC CTG GTG CGC AGC CAC GAT GCG GAG GAG GTG 487 Pro Tyr Gln Ala Glu Phe Leu Val Arg Ser His Asp Ala Glu Glu Val 135 140 145 CTG CCC TCA ACA CCT GCC AGC CGC TTC CTC TCA GCC TTG GGG GGA CTC 535 Leu Pro Ser Thr Pro Ala Ser Arg Phe Leu Ser Ala Leu Gly Gly Leu 150 155 160 TGG GAG CCC GGA GAG CTT CAG CTG CTC AAC GTC ACC TCT GCC TTG GAC 583 Trp Glu Pro Gly Glu Leu Gln Leu Leu Asn Val Thr Ser Ala Leu Asp 165 170 175 180 CGT GGG GGC CGT GTC CCC CTT CCC ATT GAG GGC CGA AAA GGA AGG CTG 631 Arg Gly Gly Arg Val Pro Leu Pro Ile Glu Gly Arg Lys Gly Arg Leu 185 190 195 AAG AGA GAC CTG GCT ACC TCC GAC ATC CAG ATG GTC CAC CAC TGC ACC 679 Lys Arg Asp Leu Ala Thr Ser Asp Ile Gln Met Val His His Cys Thr 200 205 210 ATC CAC GGG AAC ACA GAG GAG CTG CGG CAG ATG GCG GCC AGC CGC GAG 727 Ile His Gly Asn Thr Glu Glu Leu Arg Gln Met Ala Ala Ser Arg Glu 215 220 225 GTG CCC CGG CCA CTC TCC ACC CTG CCC ATG TTC AAT GTG CAC ACA GGT 775 Val Pro Arg Pro Leu Ser Thr Leu Pro Met Phe Asn Val His Thr Gly 230 235 240 GAG CGG CTG CCT CCC CGC GTG GAC AGC GCC CAG GTG CCC CTC ATT CTG 823 Glu Arg Leu Pro Pro Arg Val Asp Ser Ala Gln Val Pro Leu Ile Leu 245 250 255 260 GAC CAG CAC TGA 835 Asp Gln His CAGCCCAGCC AGTGGTTCCA GGTCCAGCCC TGACTTCATC CTCCCTTCTC TGTCCACACC 895 ACGAGTGGCA CATCCCACCT GCTGATTCCA GCTCCTGGCC CTCCTGGAAC CCAGGCTCTA 955 AACAAGCAGG GAGAGGGGGT GGGGTGGGGT GAGAGTGTGT GGAGTAAGGA CATTCAGAAT 1015 AAATATCTGC TGCTCTGCTC ACCAATTGCT GCTGGCAGCC TCTCCCGTC 1064

【００６８】配列番号：１３配列の長さ：１８７３配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：cDNA to mRNA 配列： AGGAGTTTCG ACCCGCGCTG GCGAGTCATG AGCGCCAAGT TTCCCACTGG CGCGCAAACT 60 TGAGTTACTT TTGAGCGTGG ATACTGGCGA AGAGGCTGCG GGCGGTATTA GCGTTTGCAG 120 CGACTTGGCT CGGGCAGCTG ACCCAAGTGT CCTGTCTTCC TTCCTCTGCT TGTCTCTAGG 180 CTCTGAAACT GCGGAGCGGC CACCGGACGC CTTCTGGAGC AGGTAGCAGC 230 ATG CAG CCG CCT CCA AGT CTG TGC GGA CCG GCC CTG GTT GCG CTG GTT 278 Met Gln Pro Pro Pro Ser Leu Cys Gly Pro Ala Leu Val Ala Leu Val 1 5 10 15 CTT GCC TGC GGC CTG TCG CGG ATC TGG GGA GAG GAG AGA GGC TTC CCG 326 Leu Ala Cys Gly Leu Ser Arg Ile Trp Gly Glu Glu Arg Gly Phe Pro 20 25 30 CCT GAC AGG GCC ACT CCG CTT TTG CAA ACC GCA GAG ATA ATG ACG CCA 374 Pro Asp Arg Ala Thr Pro Leu Leu Gln Thr Ala Glu Ile Met Thr Pro 35 40 45 CCC ACT AAG ACC TTA TGG CCC AAG GGT TCC AAC GCC AGT CTG GCG CGG 422 Pro Thr Lys Thr Leu Trp Pro Lys Gly Ser Asn Ala Ser Leu Ala Arg 50 55 60 TCG TTG GCA CCT GCG GAG GTG CCT AAA GGA GAC AGG ACG GCA GGA TCT 470 Ser Leu Ala Pro Ala Glu Val Pro Lys Gly Asp Arg Thr Ala Gly Ser 65 70 75 80 CCG CCA CGC ACC ATC TCC CCT CCC CCG TGC CAA GGA CCC ATC GAG ATC 518 Pro Pro Arg Thr Ile Ser Pro Pro Pro Cys Gln Gly Pro Ile Glu Ile 85 90 95 AAG GAG ACT TTC AAA TAC ATC AAC ACG GTT GTG TCC TGC CTT GTG TTC 566 Lys Glu Thr Phe Lys Tyr Ile Asn Thr Val Val Ser Cys Leu Val Phe 100 105 110 GTG CTG GGG ATC ATC GGG AAC TCC ACA CTT CTG AGA ATT ATC TAC AAG 614 Val Leu Gly Ile Ile Gly Asn Ser Thr Leu Leu Arg Ile Ile Tyr Lys 115 120 125 AAC AAG TGC ATG CGA AAC GGT CCC AAT ATC TTG ATC GCC AGC TTG GCT 662 Asn Lys Cys Met Arg Asn Gly Pro Asn Ile Leu Ile Ala Ser Leu Ala 130 135 140 CTG GGA GAC CTG CTG CAC ATC GTC ATT GAC ATC CCT ATC AAT GTC TAC 710 Leu Gly Asp Leu Leu His Ile Val Ile Asp Ile Pro Ile Asn Val Tyr 145 150 155 160 AAG CTG CTG GCA GAG GAC TGG CCA TTT GGA GCT GAG ATG TGT AAG CTG 758 Lys Leu Leu Ala Glu Asp Trp Pro Phe Gly Ala Glu Met Cys Lys Leu 165 170 175 GTG CCT TTC ATA CAG AAA GCC TCC GTG GGA ATC ACT GTG CTG AGT CTA 806 Val Pro Phe Ile Gln Lys Ala Ser Val Gly Ile Thr Val Leu Ser Leu 180 185 190 TGT GCT CTG AGT ATT GAC AGA TAT CGA GCT GTT GCT TCT TGG AGT AGA 854 Cys Ala Leu Ser Ile Asp Arg Tyr Arg Ala Val Ala Ser Trp Ser Arg 195 200 205 ATT AAA GGA ATT GGG GTT CCA AAA TGG ACA GCA GTA GAA ATT GTT TTG 902 Ile Lys Gly Ile Gly Val Pro Lys Trp Thr Ala Val Glu Ile Val Leu 210 215 220 ATT TGG GTG GTC TCT GTG GTT CTG GCT GTC CCT GAA GCC ATA GGT TTT 950 Ile Trp Val Val Ser Val Val Leu Ala Val Pro Glu Ala Ile Gly Phe 225 230 235 240 GAT ATA ATT ACG ATG GAC TAC AAA GGA AGT TAT CTG CGA ATC TGC TTG 998 Asp Ile Ile Thr Met Asp Tyr Lys Gly Ser Tyr Leu Arg Ile Cys Leu 245 250 255 CTT CAT CCC GTT CAG AAG ACA GCT TTC ATG CAG TTT TAC AAG ACA GCA 1046 Leu His Pro Val Gln Lys Thr Ala Phe Met Gln Phe Tyr Lys Thr Ala 260 265 270 AAA GAT TGG TGG CTA TTC AGT TTC TAT TTC TGC TTG CCA TTG GCC ATC 1094 Lys Asp Trp Trp Leu Phe Ser Phe Tyr Phe Cys Leu Pro Leu Ala Ile 275 280 285 ACT GCA TTT TTT TAT ACA CTA ATG ACC TGT GAA ATG TTG AGA AAG AAA 1142 Thr Ala Phe Phe Tyr Thr Leu Met Thr Cys Glu Met Leu Arg Lys Lys 290 295 300 AGT GGC ATG CAG ATT GCT TTA AAT GAT CAC CTA AAG CAG AGA CGG GAA 1190 Ser Gly Met Gln Ile Ala Leu Asn Asp His Leu Lys Gln Arg Arg Glu 305 310 315 320 GTG GCC AAA ACC GTC TTT TGC CTG GTC CTT GTC TTT GCC CTC TGC TGG 1238 Val Ala Lys Thr Val Phe Cys Leu Val Leu Val Phe Ala Leu Cys Trp 325 330 335 CTT CCC CTT CAC CTC AGC AGG ATT CTG AAG CTC ACT CTT TAT AAT CAG 1286 Leu Pro Leu His Leu Ser Arg Ile Leu Lys Leu Thr Leu Tyr Asn Gln 340 345 350 AAT GAT CCC AAT AGA TGT GAA CTT TTG AGC TTT CTG TTG GTA TTG GAC 1334 Asn Asp Pro Asn Arg Cys Glu Leu Leu Ser Phe Leu Leu Val Leu Asp 355 360 365 TAT ATT GGT ATC AAC ATG GCT TCA CTG AAT TCC TGC ATT AAC CCA ATT 1382 Tyr Ile Gly Ile Asn Met Ala Ser Leu Asn Ser Cys Ile Asn Pro Ile 370 375 380 GCT CTG TAT TTG GTG AGC AAA AGA TTC AAA AAC TGC TTT AAG TCA TGC 1430 Ala Leu Tyr Leu Val Ser Lys Arg Phe Lys Asn Cys Phe Lys Ser Cys 385 390 395 400 TTA TGC TGC TGG TGC CAG TCA TTT GAA GAA AAA CAG TCC TTG GAG GAA 1478 Leu Cys Cys Trp Cys Gln Ser Phe Glu Glu Lys Gln Ser Leu Glu Glu 405 410 415 AAG CAG TCG TGC TTA AAG TTC AAA GCT AAT GAT CAC GGA TAT GAC AAC 1526 Lys Gln Ser Cys Leu Lys Phe Lys Ala Asn Asp His Gly Tyr Asp Asn 420 425 430 TTC CGT TCC AGT AAT AAA TAC AGC TCA TCT TGA 1559 Phe Arg Ser Ser Asn Lys Tyr Ser Ser Ser 435 440 AAGAAGAACT ATTCACTGTA TTTCATTTTC TTTATATTGG ACCGAAGTCA TTAAAACAAA 1619 ATGAAACATT TGCCAAAACA AAACAAAAAA CTATGTATTT GCACAGCACA CTATTAAAAT 1679 ATTAAGTGTA ATTATTTTAA CACTCACAGC TACATATGAC ATTTTATGAG CTGTTTACGG 1739 CATGGAAAGA AAATCAGTGG GAATTAAGAA AGCCTCGTCG TGAAAGCACT TAATTTTTTA 1799 CAGTTAGCAC TTCAACATAG CTCTTAACAA CTTCCAGGAT ATTCACACAA CACTTAGGCT 1859 TAAAAATGAG CTCA 1873

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の増幅方法の概要を示す図である。

【図２】本発明の増幅方法の概要を示す図である。

【図３】アガロースゲル電気泳動の結果を示す写真であ
る。

【図４】アガロースゲル電気泳動の結果を示す写真であ
る。

【図５】アガロースゲル電気泳動の結果を示す写真であ
る。

【符号の説明】

１…プライマー，１’…プライマー，２…混入ＲＮＡ，
３…混入ｃＤＮＡ，４…５’側プライマー，５…
３’側プライマー

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】標的ｍＲＮＡの３’側非翻訳領域の少な
くとも一部と相補的なオリゴヌクレオチドプライマーを
用いてｃＤＮＡを合成し、得られるｃＤＮＡを、５’側
プライマーと、前記オリゴヌクレオチドプライマーより
も上流に配置させた３’側プライマーとを用いて増幅す
ることを特徴とする微量遺伝子産物の特異的増幅方法。
【請求項２】微量遺伝子産物が、ジストログリカン、
α−サルコグリカン又はエンドセリンＢ受容体をコード
するｃＤＮＡである請求項１記載の微量遺伝子産物の特
異的増幅方法。
【請求項３】ｃＤＮＡ合成用プライマーとｃＤＮＡ増
幅用３’側プライマーとの距離が１ｋｂ以内である請求
項１又は２記載の微量遺伝子産物の特異的増幅方法。
【請求項４】ｃＤＮＡ増幅用５’側プライマーが標的
ｍＲＮＡの翻訳領域の上流に隣接しており、かつ、ｃＤ
ＮＡ増幅用３’側プライマーが標的ｍＲＮＡの翻訳領域
の下流に隣接しているものである請求項１〜３のいずれ
か１項に記載の微量遺伝子産物の特異的増幅方法。