JP3892803B2 - ヒトＨＮＦ−１α遺伝子増幅用多重ＰＣＲプライマーセット - Google Patents
ヒトＨＮＦ−１α遺伝子増幅用多重ＰＣＲプライマーセット Download PDFInfo
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は多重ＰＣＲ用プライマー、前記プライマーを用いた塩基配列の分析方法及び前記プライマーを含む標的ＤＮＡ配列増幅用キットに関する。
【０００２】
【従来の技術】
ハイブリッド核酸の検出に用いられる方法の一つにＰＣＲ法があり、ＰＣＲ法は当業界によく知られている（特許文献１、特許文献２及び特許文献３）。ＰＣＲ法においては、核酸増幅標的配列の対応ストランドに相補的な核酸プライマーが、変性された試料にアニーリングされる。次に、ＤＮＡ重合酵素（普通、熱に対して安定的である。）が前記ハイブリッドプライマーからＤＮＡ２重ストランドを延長する。次に、標的核酸を増幅するために前記過程を繰り返す。プライマーが前記標的核酸にハイブリッドされなければ、対応する増幅されるべきＰＣＲ産物も無くなる。この場合、前記ＰＣＲプライマーはハイブリッドプローブとしての役割を果たす。
【０００３】
ＰＣＲ法において、増幅された核酸産物は様々な方式により、例えば、標識したプライマーを用いて増幅ストランドに標識ヌクレオチドを挿入することにより検出できる。ＰＣＲに用いられるプライマーとしては、放射性物質、蛍光染料、ジゴキシゲニン(digoxygenin;以下、DIG)、ホースラディッシュパーオキシダーゼ、アルカリ性フォスファターゼ、アクリジニウムエステル、ビオチン及びジャックビーンウレアーゼなどで標識したものがあるが、これに限定されるものではない。標識されていないプライマーを使用して得られたＰＣＲ産物は、電気泳動ゲル分離後に染料で可視化するなどの方法によって検出できる。
【０００４】
ヒトゲノムは約３０億個の塩基配列を有するため、特定の遺伝子を単離して分析することは困難である。このような難点を解決するために導入された実験方法のうち最も画期的な一つが、特定の配列を増幅するＰＣＲ法である。ＰＣＲ法は特定の核酸配列の末端に相補的な塩基よりなるプライマーセット（対）を用いてそれらの間にある遺伝子を短時間に数十万倍以上増幅させるものである(参照:Saikiら、Science 239:487,1988)。
【０００５】
このようなＰＣＲ法は、疾病関連遺伝子の分析に多用されている。特に、前記ＰＣＲ法による疾病関連遺伝子の増幅は、医療系における遺伝子変異分析の方法に汎用されている。前記遺伝子変異の分析は、特定の疾病関連遺伝子を増幅させた後、塩基配列の分析、混成化及び一本鎖ＤＮＡ高次構造多型(SSCP:single strand conformational polymorphism)などの過程を通じて行われる。遺伝子の変異とは、欠失、置換、付加及び逆位などを含むものであって、遺伝子配列に変化が生じたことを意味する。ここには、単一塩基配列多型も含まれる。
【０００６】
遺伝子変異の分析法において、標的遺伝子が小さい場合には単一ＰＣＲにより全ての分析を行うことができる。しかし、標的遺伝子が相対的に大きい場合、例えば、１ｋｂ以上である場合、単一ＰＣＲが好適でない場合がある。従って、標的遺伝子が大きい場合、ＰＣＲを複数回に亘って行わなければならない。ほとんどの疾病関連遺伝子は、普通１.５ｋｂ以上であるため、複数のＰＣＲが疾病関連遺伝子の変異分析法で行なわれている。
【０００７】
しかしながら、複数のＰＣＲは多量のサンプル、例えば、患者のＤＮＡまたは血液を必要とする。また、複数のＰＣＲは、高コスト及び手間を必要とする。
【０００８】
このような短所を解消するために講じられた方法が、多重ＰＣＲ法(multiplex PCR)である。多重ＰＣＲ法は、遺伝子の複数の標的配列を一つの反応容器内で同時に増幅するものである。すなわち、各標的配列を増幅し得る以上のプライマーセット（プライマープール）を一つの反応容器に入れ、単一ＰＣＲ操作により複数の標的配列を増幅させるのである。
【０００９】
このような多重ＰＣＲ法は当業界でよく知られ、例えば、特許文献４には複数の公知のＤＮＡ配列欠失を同時に検出する方法が開示されている。前記特許文献４に開示された技術は、標的にハイブリダイズする第１のプローブセットを用いる。標的が存在すれば、前記プローブが延びる。延長産物はＰＣＲ法を用いて増幅される。
【００１０】
多重ＰＣＲ法用のプライマーは、標的ＤＮＡ配列にのみ特異的であり、標的ＤＮＡを十分に増幅するため、プライマー相互の干渉があってはならない。
【００１１】
このプライマーセットを用いた多重ＰＣＲ法は、単一ＰＣＲに比べて、標的ＤＮＡを増幅させるのに手間及びコストを大いに低減できる。特に、多重ＰＣＲ法は、ＤＮＡチップを用いた遺伝子変異の分析に際し、１種以上のＤＮＡサンプルを増幅をする際に有用である。
【００１２】
一方、ＨＮＦ−１α遺伝子における点突然変異は、ＭＯＤＹ(maturity-onset diabetes of the young)３を引き起こすことが知られている（特許文献５；特許文献６；特許文献７）。ＭＯＤＹ３は、第２型糖尿病の１０ないし３０％以上を占めるＭＯＤＹ疾病（ＭＯＤＹ１,２,３,４,５）（青年期に発生する糖尿病）の一種である。従って、ヒトＨＮＦ−１α遺伝子の変異の分析は、糖尿病を発症する傾向を予測可能にする。これらの理由から、ＤＮＡチップを用いた変異分析などのヒトＨＮＦ−１α遺伝子の迅速な分析のために、ヒトＨＮＦ−１α遺伝子増幅用の多重ＰＣＲプライマーセットの開発が望まれる。
【００１３】
【特許文献１】
米国特許第４,６８３,１９５号明細書
【特許文献２】
米国特許第４,６８３,２０２号明細書
【特許文献３】
米国特許第４,８００,１５９号明細書
【特許文献４】
米国特許第５,５８２,９８９号明細書
【特許文献５】
Matschinsky & Magnuson, in ’Molecular Pathogenesis of MODYs’, Karger, 1998
【特許文献６】
米国特許第５,５４１,０６０号明細書
【特許文献７】
ＷＯ ９３２１３４３号公報
【００１４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、ヒトＨＮＦ−１α遺伝子の標的配列を多重ＰＣＲ法により増幅する多重ＰＣＲプライマーセットを含むプライマープールを提供することにある。
【００１５】
本発明の他の目的は、前記プライマープールを用いてＨＮＦ−１α遺伝子の標的配列を増幅する方法を提供することにある。
【００１６】
本発明のさらに他の目的は、前記プライマープールを用いてＨＮＦ−１α遺伝子の標的ヌクレオチド配列を分析する方法を提供することにある。
【００１７】
本発明のさらに他の目的は、前記プライマープールを含む標的配列増幅用のキットを提供することにある。
【００１８】
【課題を解決するための手段】
本発明は、１０種のヒトＨＮＦ−１α遺伝子の標的配列増幅に用いられる、（ａ）〜（ｊ）に示されるＰＣＲプライマーセットを含むヒトＨＮＦ−１α遺伝子の標的配列増幅用プライマープールである。
【００１９】
（ａ）配列番号３の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド及び配列番号４の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含むプライマーセットと、
（ｂ）配列番号５の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド及び配列番号６の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含むプライマーセットと、
（ｃ）配列番号７の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド及び配列番号８の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含むプライマーセットと、
（ｄ）配列番号９の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド及び配列番号１０の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含むプライマーセットと、
（ｅ）配列番号１１の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド及び配列番号１２の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含むプライマーセットと、
（ｆ）配列番号１３の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド及び配列番号１４の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含むプライマーセットと、
（ｇ）配列番号１５の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド及び配列番号１６の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含むプライマーセットと、
（ｈ）配列番号１７の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド及び配列番号１８の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含むプライマーセットと、
（ｉ）配列番号１９の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド及び配列番号２０の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含むプライマーセットと、
（ｊ）配列番号２１の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド及び配列番号２２の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット。
【００２０】
本発明はまた、本発明による前記プライマープールを用いてヒトＨＮＦ−１α遺伝子の１０種の標的配列をＰＣＲする段階を含むヒトＨＮＦ−１α遺伝子の１０種の標的配列を増幅する方法を提供する。
【００２１】
本発明はまた、本発明による前記プライマープールを用いてヒトＨＮＦ−１α遺伝子の１０種の標的配列を分析する段階を含むヒトＨＮＦ−１α遺伝子の１０種の標的配列を分析する方法を提供する。
【００２２】
併せて、本発明は、本発明による前記プライマープールを含むヒトＨＮＦ−１α遺伝子の１０種の標的ＤＮＡ配列増幅用キットを提供する。前記キットは前記プライマープールの他に、ｄＮＴＰ溶液、ＤＮＡ重合酵素、緩衝溶液を含むＰＣＲ反応に必要な通常の試薬を含む。
【００２３】
更に、本発明は、ヒトＨＮＦ−１α遺伝子の遺伝的な変異を決定するのに利用できる。そのような変異には、第２型糖尿病の約１０ないし３０％を占める青年期発病糖尿病の一種であるＭＯＤＹ３疾病の変異が含まれる。ヒトＨＮＦ−１α遺伝子の遺伝的な変異を分析することにより、個体の糖尿病の体頂を予見できる。
【００２４】
【発明の実施の形態】
本発明への理解の一助とするために、この明細書に用いられた用語のいくつかを、下記に示す。“核酸”とは、一つのヌクレオチドのペントースの３’位置が次のペントースの５’位置にフォスフォジエステル基により結合され、前記ヌクレオチド残基（塩基）は、ヌクレオチドの線形順序で特定の配列に連結された、共有的に連結されたヌクレオチドの配列である。“ポリヌクレオチド”とは、長さ約１００ヌクレオチド以上の配列の核酸である。
【００２５】
“オリゴヌクレオチド”とは、短いポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの一部のことをいう。オリゴヌクレオチドは、普通約２ないし約１００塩基の配列である。
【００２６】
核酸は様々な形の突然変異を含むと知られている。この明細書の“点”突然変異は単一の塩基位置におけるヌクレオチド配列の変化のことをいう。“単一ヌクレオチド多型”（ＳＮＰ）とは、特定の核酸位置において最も頻度が高い塩基からの変異のことをいう。
【００２７】
“標的核酸”とは、対象となる特定の核酸配列のことをいう。従って、“標的”は、対象となる核酸分子内に存在しうる。
【００２８】
“核酸プローブ”とは、対象となる核酸にハイブリッドされうるオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドのことをいう。核酸プローブは精製された制限産物と共に天然に存在するか、合成、組換え、またはＰＣＲ増幅によって生産できる。“核酸プローブ”とは、本発明の方法に用いられるオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドのことをいう。同じオリゴヌクレオチドがまた増幅用プライマーとしてＰＣＲ法に利用できるが、この明細書では、“プライマー”と呼ぶ。ここで、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドはフォスフォロチオエート（phosphorothioate）結合のように変形された結合を含むこともある。
【００２９】
“相補的”とは、ＡはＴと対をなし、ＣはＧと対をなす塩基対規則に従い対象となる核酸（すなわち、ヌクレオチドの配列）と関連して用いられる。例えば、配列５’−Ａ−Ｇ−Ｔ−３’は３’−Ｔ−Ｃ−Ａ−５’と相補的である。相補性は、塩基対規則に従い核酸塩基の一部のみが対象となる“部分的”の場合がある。これに対し、塩基対規則に従って全ての塩基が対象となる“完全な”または“全体的”な場合もある。
【００３０】
“相同性”とは、相補性の度合いをいう。部分的な相補性または完全な相補性（すなわち、同一性）がありうる。
【００３１】
多重ＰＣＲ法によってヒトＨＮＦ−１α遺伝子増幅用プライマープールを開発するに当たって、次のことが考慮されうる。
【００３２】
プライマープールはヒトＨＮＦ−１α遺伝子に特異的に結合し、標的ＤＮＡを十分に増幅するため、プライマー相互間の干渉があってはならない。また、各プライマーが類似したＴｍ(melting temperature)を有し、かつ、プライマー対同士の２量体の形成がないことが好ましい。また、各プライマーはヘアピンや自己２量体を形成してはならない。マイクロサテライト領域及び繰り返し配列領域はプライマー配列から排除されなければならない。
【００３３】
【実施例】
以下、本発明を実施例を通じて一層詳細に説明する。これら実施例は本発明を例示的に説明するためのものであって、本発明の範囲がこれら実施例に限定されることはない。
【００３４】
実施例１：ヒトＨＮＦ−１α遺伝子の１０の標的配列増幅用プライマーの製作
表１に示すように、ＰＣＲ産物の大きさが５ｂｐ以上の違いとなるようにプライマーをデザインした。プライマーは標的ＤＮＡ配列にのみ特異的であり、プライマー相互間の干渉がなくて標的ＤＮＡを十分に増幅し得るようにデザインされている。さらに、各プライマーは類似したＴｍを有し、プライマーセット間の２量体の形成はなく、各プライマーは、ヘアピン及び自己２量体を形成せず、一つの塩基が４回を超えて繰り返えさないようにデザインされている。なお、マイクロサテライト領域及び繰り返し配列領域は、プライマー配列から排除している。
【００３５】
HYBsimulatorTM(Advanced Gene Computing Technologies, Inc)をプライマー分析に用いた。
【００３６】
また、ＰＣＲ産物の増幅効率性を高めるために、正方向プライマーにはＴ７プロモータ配列（ｔａａｔａｃｇａｃｔｃａｃｔａｔａｇｇｇ；配列番号１）を、逆方向プライマーにはＴ３プロモータ配列（ｇｔａａｃｃｃｔｃａｃｔａａａｇｇｇａ；配列番号２）を５’末端に付けて用いた。
【００３７】
各プライマーの配列及び特性は、下記表１の通りである。
【００３８】
【表１】
【００３９】
実施例２：単一ＰＣＲによるヒトＨＮＦ−１α遺伝子の増幅
実施例１により製作された各プライマーセットを用い、ヒトＨＮＦ−１α遺伝子標的部位を単一ＰＣＲによって増幅した。反応条件は、初期変性（９５℃において５分）、変性（９５℃において３０秒）、アニーリング（６４℃において１５秒）及び延長（７２℃において３０秒）の３０回の繰り返し、及び最終延長（７２℃において３分）とした。反応溶液の組成は、下記の通りであった。
【００４０】
ＤＮａｓｅ及びＲＮａｓｅが存在しない滅菌水 １２．８μｌ
ｄＮＴＰミックス（各ヌクレオシド２．５ｍＭ） ２μｌ
１０×Ｔａｑ重合酵素緩衝溶液 ２μｌ
プライマーセット（各プライマー１０ｐｍｏｌ） ２μｌ
ゲノムＤＮＡ（２００ｎｇ−１．０μｇ） １μｌ
Ｔａｑ重合酵素（５ユニット／μｌ） ０．２μｌ
前記単一ＰＣＲ産物の結果を図１に示す。これは、１．８％アガロースゲル電気泳動上において分子量マーカーを基準として確かめた。図１において、レーン１及びレーン１３は５０ｂｐＤＮＡラダー分子量マーカーを示し、レーン２はプロモータ、レーン３はエクソン１、レーン４はエクソン２、レーン５はエクソン３、レーン６はエクソン４、レーン７はエクソン５、レーン８はエクソン６、レーン９はエクソン７、レーン１０はエクソン８及び９、レーン１１はエクソン１０部分を各々増幅したＰＣＲ産物を示し、レーン１２は下記実施例３で得た多重ＰＣＲ産物を示す。
【００４１】
図１に示すように、ヒトＨＮＦ−１α遺伝子の標的領域は実施例１により製作された各プライマーセットを用いて、ヒトＨＮＦαシングルＰＣＲによって増幅された。
【００４２】
実施例３：多重ＰＣＲによるヒトＨＮＦ−１α遺伝子の標的領域の増幅
実施例１により製作されたプライマーセットを用いて多重ＰＣＲを行った。反応条件は、初期変性（９５℃において５分）、変性（９５℃において３０秒）、アニーリング（６４℃において１５秒）及び延長（７２℃において３０秒）の３０回繰り返し、及び最終延長（７２℃において３分）であった。前記各種プライマーセットを、一の反応容器内に添加した、反応溶液の組成は、下記の通りとした。
【００４３】
ＤＮａｓｅ及びＲＮａｓｅが存在しない滅菌水 １８．４μｌ
ｄＮＴＰミックス（各ヌクレオシド２．５ｍＭ） ５μｌ
１０×Ｔａｑ重合酵素緩衝溶液 ５μｌ
プライマーセット（各プライマー１０ｐｍｏｌ） ２０μｌ
ゲノムＤＮＡ（２００ｎｇ−１．０μｇ） １μｌ
Ｔａｑ重合酵素（５ユニット／μｌ） ０．６μｌ
得られた多重ＰＣＲ産物を１．８％アガロースゲル電気泳動によって確かめた（図１参照）。図１のレーン１２に示すように、前記プライマーを用いた多重ＰＣＲの結果、ヒトＨＮＦ−１α遺伝子の１０種の標的領域（５７９，４５９，３６５，３０８，３３２，２４１，２８６，２３０，４１４，１７１ｂｐ）がいずれも増幅された。
【００４４】
実施例４：変異プライマーを用いた多重ＰＣＲによるＨＮＦ−１α遺伝子の標的部位の増幅
４種のプライマーセット（プロモータ、エクソン１、エクソン２、エクソン８増幅用プライマーセット）の一方の末端に、鋳型となるＤＮＡに相補的な３ヌクレオシドを追加し、他方の末端に３個のヌクレオシドが欠失された変異プライマー（表２）を合成し、実施例３の方法と同様にして多重ＰＣＲを行った（図２）。
【００４５】
【表２】
【００４６】
多重ＰＣＲの結果を、図２のＡ〜Ｅに示す。図２のＡは、変異させたプロモータプライマーセットを用いた多重ＰＣＲ産物の電気泳動写真であり、図２のＢは、変異させたエクソン１プライマーセットを用いた多重ＰＣＲ産物の電気泳動写真であり、図２のＣは、変形させたエクソン２プライマーセットを用いた多重ＰＣＲ産物の電気泳動写真であり、図２のＤは、変形させたエクソン８プライマーセットを用いた多重ＰＣＲ産物の電気泳動写真であり、そして図２のＥは、前記変形されたプライマーセットを全て用いた多重ＰＣＲ産物の電気泳動写真である。図２のＡないしＥにおいて、レーン１は、５０ｂｐＤＮＡラダー分子量マーカーを示し、レーン２は、前記表１のプライマーセットのみを用いて多重ＰＣＲした結果を示し、レーン３は、前記表２の変異させたプライマーセットを用いて多重ＰＣＲした結果を示し、そしてレーン４は、変異の有無を問わずに該当プライマーセットを用いずに多重ＰＣＲを行なった結果を示す。
【００４７】
図２のＡないしＥから見られるように、４個の変異させたプライマーセットにより該当遺伝子部位がいずれも増幅されることが確かめられた。
【００４８】
実施例５：サザンブロッティングによる多重ＰＣＲ産物の確認
実施例２及び実施例３の増幅されたＰＣＲ産物を１.８％アガロースゲル上において電気泳動した（図１参照）。このゲルを変性溶液（０．５ＮＮａＯＨ＋１．５Ｍ ＮａＣｌ）において１５分間ゆっくり振りつつ、ゲル上の２重ストランドＤＮＡを変性させた。この過程を２回繰り返した後、蒸留水にてゲルを洗浄し、１５分間中和溶液（３Ｍ ＮａＣｌ，０．５Ｍ トリス−ＨＣｌ，ｐＨ ７．５）にてゆっくり振りつつゲルを２回中和させた。次に、ゲルに存在するＤＮＡ及びナイロン膜を２０×ＳＳＣ溶液にて１２時間反応させ、ＤＮＡをナイロン膜に移動させた。ナイロン膜を１２０℃において３０分間放置またはＵＶを照射することにより交差結合させ、蒸留水にてその膜を１ないし２分間洗浄した後に乾燥させた。
【００４９】
前述のように、ＤＮＡ付き膜を２０ｍｌの混成化溶液に入れ、６２℃において約２時間予混成化反応を行い、その溶液を放棄した。次に、ＤＮＡ付き膜及びＤＩＧ標識のプローブ５ｐｍｏｌ／ｍｌを混成化溶液バグ１０ｍｌに入れ、６２℃において約１２時間反応させた。この反応中にＤＩＧ標識のプローブは、膜にあるＤＮＡに相補的な遺伝子部位に結合される。そして、結合できなかったプローブを除去するために、２×洗浄用溶液（２×ＳＳＣ＋０．１％ ＳＤＳ）にて常温で５分間２回繰り返して洗浄を行い、０．５×洗浄用溶液（０．５×ＳＳＣ＋０．１％ ＳＤＳ）にて６２℃で１５分間２回繰り返し洗浄を行った。
【００５０】
その後、ＤＩＧに結合する抗体を入れる前に、他の部分に抗体が付かないように２０ｍｌのブロッキング溶液にて３０ないし６０分間放置した後、新しいブロッキング溶液２０ｍｌにアルカリ性ホスファターゼを連結させたヒツジ抗−ＤＩＧ抗体（Ｒｏｃｈｅ社製）を１μｌだけ添加して３０分間反応させた。続けて、洗浄緩衝液（１００ｍＭ マレイン酸、１５０ｍＭ ＮａＣｌ, ｐＨ ７.５（常温２０℃）、０．３％ Ｔｗｅｅｎ ２０）にて１５分ずつ２回洗浄を行った。次に、膜上にあるＤＮＡとプローブとの結合を確かめるために、アルカリ性ホスファターゼの基質であるＣＤＰ−スター（ＣＤＰ−Ｓｔａｒ）を検出緩衝溶液に１：１００の比率にて混ぜたもので膜を５分間処理した後、Ｘ−線フィルムに感光させた。感光されたフィルムを現像してプローブが付いた位置を確かめた。その結果を図３に示す。図３において、レーン１３は、ＤＩＧにて標識された分子量マーカーを示し、レーン２はプロモータ、レーン３はエクソン１、レーン４はエクソン２、レーン５はエクソン３、レーン６はエクソン４、レーン７はエクソン５、レーン８はエクソン６、レーン９はエクソン７、レーン１０はエクソン８及び９、レーン１１はエクソン１０部分を各々増幅した単一ＰＣＲ産物を示し、そしてレーン１２は多重ＰＣＲ産物を示す。
【００５１】
図３に示すように、単一ＰＣＲ及び多重ＰＣＲの同じ位置にプローブが付き、増幅された産物が同じものであることが分かった。
【００５２】
実施例６：配列分析を通じた多重ＰＣＲ産物の確認
実施例３の方法と同様にして多重ＰＣＲ産物を増幅させた後、１.８％アガロースゲル上で各産物を展開させ、各々のＤＮＡバンドを切り出してゲル抽出キットを用いてＤＮＡを精製した。このようにして精製されたＤＮＡをＡＢＩ３７００を用いて塩基配列を確かめ、ヒトＨＮＦ−１α遺伝子の該当配列と比較分析した（図４）。
【００５３】
図４は、プロモータ増幅型プライマーセットを用いてＰＣＲした結果を示している。配列番号３及び配列番号４を含むプライマーセットの増幅産物に該当するＰＣＲ増幅産物を分離し、自動配列分析方法を用いて塩基配列を分析した。得られたヌクレオチド配列（配列番号３１）（“クエリー”と呼ぶ。）をLagergene(DNAstar inc.)というプログラムによってヒトＨＮＦ−１α遺伝子プロモータの知られた配列（“プロモータ”と呼ぶ。）と比較した（図４）。図４に示すように、前記ＰＣＲ産物はＨＮＦ−１α遺伝子プロモータの知られた配列と完全な配列相同性を示した。整列に用いられたギャップ頻度は０％であった。プロモータ以外の他のエクソンに該当するＰＣＲ産物を同じ方法により配列分析した。各ＰＣＲ産物は知られた該当エクソン配列と９５％以上の相同性を示した。
【００５４】
実施例７：多重ＰＣＲ用反応溶液の安定性の検査
ゲノムＤＮＡを除いた実施例３において用いられた多重ＰＣＲ用反応溶液を、安定性を検査するために大量製造した。一回のＰＣＲに必要な４９μｌの反応溶液を複数の０．２ｍｌ−ＰＣＲチューブに分画した。前記反応溶液を含むチューブの一部は−２０℃で、一部は−７０℃で３ケ月間保存した。１日、３日、４日、１週間、２週間、３週間及び１２週間後に各チューブの反応溶液を用いて多重ＰＣＲを行った。
【００５５】
図５に、多重ＰＣＲの結果を示す。図５において、最初のレーンは分子量マーカーであり、レーン２は−２０℃における保存反応溶液を用いて得られた多重ＰＣＲ産物であり、レーン３は−７０℃における保存反応溶液を用いて得られた多重ＰＣＲ産物である。図５に示すように、本発明に用いた多重ＰＣＲ用反応溶液は、−２０℃または−７０℃において安定的であった。
【００５６】
実施例８：様々なＰＣＲ機器を用いた遺伝子増幅
様々なＰＣＲ装置を用い、実施例３の方法に従い多重ＰＣＲを行った。増幅された多重ＰＣＲ産物は、ＰＣＲ装置によるＰＣＲ産物の依存性を検査するために１．８％アガロースゲルで電気泳動した（図６ＡないしＣ）。
【００５７】
図６Ａは、ＰＴＣ−１００（ＭＪリサーチ社製）を用いて増幅した多重ＰＣＲ産物を示し、図６Ｂは、GeneAmp 9700（アプライド・バイオシステム社製）を用いて増幅した多重ＰＣＲ産物を示し、そして図６Ｃは、Mult-Block System(ThermoHybaidCo.)を用いて増幅した多重ＰＣＲ産物を示す。
【００５８】
図６Ａないし図６Ｃにおいて、レーン１は分子量マーカーである５０ｂｐのＤＮＡラダーであり、レーン２は表１に示されたプライマーセットを用いて得られた多重ＰＣＲ産物である。図中、矢印は各々３５０ｂｐ及び５０ｂｐを示す。
【００５９】
図６に示すように、ＰＣＲ装置に関係なく類似したＰＣＲ産物の様相が得られ、これは、本発明のプライマーセットを用いて得られたＰＣＲ産物が安定的でかつ経済的であるということを意味する。
【００６０】
【発明の効果】
本発明によるヒトＨＮＦ−１α遺伝子増幅用プライマープールは、多重ＰＣＲにより該当遺伝子を効果的に増幅した。特に、本発明の多重ＰＣＲ用プライマープールはＰＣＲ反応に必要な試料が相対的に少なく、ＤＮＡチップを用いた疾病関連の遺伝子の分析法に有用である。
【００６１】
本発明のプライマープールはヒトＨＮＦ−１α遺伝子の塩基配列分析用または増幅用キットに有効である。
【００６２】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 ヒトＨＮＦ−１α遺伝子のエクソン１ないし１０をシンプルＰＣＲ及び多重ＰＣＲでも増幅したＰＣＲ産物の電気泳動の結果を示す図である。
【図２】 ＡないしＥは、変異プライマーセットからなるプライマープールを用いて得られた多重ＰＣＲ産物の電気泳動写真である。
【図３】 エクソン別のプライマーセットをプローブとして用いた単一ＰＣＲ産物及び多重ＰＣＲ産物のサザンブロット写真である。
【図４】 プロモータ増幅用プライマーセットを用いて得られたＰＣＲ産物に該当する単一ＰＣＲ産物の塩基配列と公知のヒトＨＮＦ−１α遺伝子のプロモータ塩基配列とを比較して示す図である。
【図５】 多重ＰＣＲ反応溶液の安定性を調べた結果を示すアガロースゲル電気泳動写真である。
【図６】 ＡないしＣは、ＰＣＲ増幅装置による多重ＰＣＲ産物の様子を示す電気泳動写真である。
【発明の属する技術分野】
本発明は多重ＰＣＲ用プライマー、前記プライマーを用いた塩基配列の分析方法及び前記プライマーを含む標的ＤＮＡ配列増幅用キットに関する。
【０００２】
【従来の技術】
ハイブリッド核酸の検出に用いられる方法の一つにＰＣＲ法があり、ＰＣＲ法は当業界によく知られている（特許文献１、特許文献２及び特許文献３）。ＰＣＲ法においては、核酸増幅標的配列の対応ストランドに相補的な核酸プライマーが、変性された試料にアニーリングされる。次に、ＤＮＡ重合酵素（普通、熱に対して安定的である。）が前記ハイブリッドプライマーからＤＮＡ２重ストランドを延長する。次に、標的核酸を増幅するために前記過程を繰り返す。プライマーが前記標的核酸にハイブリッドされなければ、対応する増幅されるべきＰＣＲ産物も無くなる。この場合、前記ＰＣＲプライマーはハイブリッドプローブとしての役割を果たす。
【０００３】
ＰＣＲ法において、増幅された核酸産物は様々な方式により、例えば、標識したプライマーを用いて増幅ストランドに標識ヌクレオチドを挿入することにより検出できる。ＰＣＲに用いられるプライマーとしては、放射性物質、蛍光染料、ジゴキシゲニン(digoxygenin;以下、DIG)、ホースラディッシュパーオキシダーゼ、アルカリ性フォスファターゼ、アクリジニウムエステル、ビオチン及びジャックビーンウレアーゼなどで標識したものがあるが、これに限定されるものではない。標識されていないプライマーを使用して得られたＰＣＲ産物は、電気泳動ゲル分離後に染料で可視化するなどの方法によって検出できる。
【０００４】
ヒトゲノムは約３０億個の塩基配列を有するため、特定の遺伝子を単離して分析することは困難である。このような難点を解決するために導入された実験方法のうち最も画期的な一つが、特定の配列を増幅するＰＣＲ法である。ＰＣＲ法は特定の核酸配列の末端に相補的な塩基よりなるプライマーセット（対）を用いてそれらの間にある遺伝子を短時間に数十万倍以上増幅させるものである(参照:Saikiら、Science 239:487,1988)。
【０００５】
このようなＰＣＲ法は、疾病関連遺伝子の分析に多用されている。特に、前記ＰＣＲ法による疾病関連遺伝子の増幅は、医療系における遺伝子変異分析の方法に汎用されている。前記遺伝子変異の分析は、特定の疾病関連遺伝子を増幅させた後、塩基配列の分析、混成化及び一本鎖ＤＮＡ高次構造多型(SSCP:single strand conformational polymorphism)などの過程を通じて行われる。遺伝子の変異とは、欠失、置換、付加及び逆位などを含むものであって、遺伝子配列に変化が生じたことを意味する。ここには、単一塩基配列多型も含まれる。
【０００６】
遺伝子変異の分析法において、標的遺伝子が小さい場合には単一ＰＣＲにより全ての分析を行うことができる。しかし、標的遺伝子が相対的に大きい場合、例えば、１ｋｂ以上である場合、単一ＰＣＲが好適でない場合がある。従って、標的遺伝子が大きい場合、ＰＣＲを複数回に亘って行わなければならない。ほとんどの疾病関連遺伝子は、普通１.５ｋｂ以上であるため、複数のＰＣＲが疾病関連遺伝子の変異分析法で行なわれている。
【０００７】
しかしながら、複数のＰＣＲは多量のサンプル、例えば、患者のＤＮＡまたは血液を必要とする。また、複数のＰＣＲは、高コスト及び手間を必要とする。
【０００８】
このような短所を解消するために講じられた方法が、多重ＰＣＲ法(multiplex PCR)である。多重ＰＣＲ法は、遺伝子の複数の標的配列を一つの反応容器内で同時に増幅するものである。すなわち、各標的配列を増幅し得る以上のプライマーセット（プライマープール）を一つの反応容器に入れ、単一ＰＣＲ操作により複数の標的配列を増幅させるのである。
【０００９】
このような多重ＰＣＲ法は当業界でよく知られ、例えば、特許文献４には複数の公知のＤＮＡ配列欠失を同時に検出する方法が開示されている。前記特許文献４に開示された技術は、標的にハイブリダイズする第１のプローブセットを用いる。標的が存在すれば、前記プローブが延びる。延長産物はＰＣＲ法を用いて増幅される。
【００１０】
多重ＰＣＲ法用のプライマーは、標的ＤＮＡ配列にのみ特異的であり、標的ＤＮＡを十分に増幅するため、プライマー相互の干渉があってはならない。
【００１１】
このプライマーセットを用いた多重ＰＣＲ法は、単一ＰＣＲに比べて、標的ＤＮＡを増幅させるのに手間及びコストを大いに低減できる。特に、多重ＰＣＲ法は、ＤＮＡチップを用いた遺伝子変異の分析に際し、１種以上のＤＮＡサンプルを増幅をする際に有用である。
【００１２】
一方、ＨＮＦ−１α遺伝子における点突然変異は、ＭＯＤＹ(maturity-onset diabetes of the young)３を引き起こすことが知られている（特許文献５；特許文献６；特許文献７）。ＭＯＤＹ３は、第２型糖尿病の１０ないし３０％以上を占めるＭＯＤＹ疾病（ＭＯＤＹ１,２,３,４,５）（青年期に発生する糖尿病）の一種である。従って、ヒトＨＮＦ−１α遺伝子の変異の分析は、糖尿病を発症する傾向を予測可能にする。これらの理由から、ＤＮＡチップを用いた変異分析などのヒトＨＮＦ−１α遺伝子の迅速な分析のために、ヒトＨＮＦ−１α遺伝子増幅用の多重ＰＣＲプライマーセットの開発が望まれる。
【００１３】
【特許文献１】
米国特許第４,６８３,１９５号明細書
【特許文献２】
米国特許第４,６８３,２０２号明細書
【特許文献３】
米国特許第４,８００,１５９号明細書
【特許文献４】
米国特許第５,５８２,９８９号明細書
【特許文献５】
Matschinsky & Magnuson, in ’Molecular Pathogenesis of MODYs’, Karger, 1998
【特許文献６】
米国特許第５,５４１,０６０号明細書
【特許文献７】
ＷＯ ９３２１３４３号公報
【００１４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、ヒトＨＮＦ−１α遺伝子の標的配列を多重ＰＣＲ法により増幅する多重ＰＣＲプライマーセットを含むプライマープールを提供することにある。
【００１５】
本発明の他の目的は、前記プライマープールを用いてＨＮＦ−１α遺伝子の標的配列を増幅する方法を提供することにある。
【００１６】
本発明のさらに他の目的は、前記プライマープールを用いてＨＮＦ−１α遺伝子の標的ヌクレオチド配列を分析する方法を提供することにある。
【００１７】
本発明のさらに他の目的は、前記プライマープールを含む標的配列増幅用のキットを提供することにある。
【００１８】
【課題を解決するための手段】
本発明は、１０種のヒトＨＮＦ−１α遺伝子の標的配列増幅に用いられる、（ａ）〜（ｊ）に示されるＰＣＲプライマーセットを含むヒトＨＮＦ−１α遺伝子の標的配列増幅用プライマープールである。
【００１９】
（ａ）配列番号３の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド及び配列番号４の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含むプライマーセットと、
（ｂ）配列番号５の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド及び配列番号６の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含むプライマーセットと、
（ｃ）配列番号７の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド及び配列番号８の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含むプライマーセットと、
（ｄ）配列番号９の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド及び配列番号１０の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含むプライマーセットと、
（ｅ）配列番号１１の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド及び配列番号１２の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含むプライマーセットと、
（ｆ）配列番号１３の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド及び配列番号１４の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含むプライマーセットと、
（ｇ）配列番号１５の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド及び配列番号１６の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含むプライマーセットと、
（ｈ）配列番号１７の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド及び配列番号１８の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含むプライマーセットと、
（ｉ）配列番号１９の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド及び配列番号２０の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含むプライマーセットと、
（ｊ）配列番号２１の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド及び配列番号２２の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット。
【００２０】
本発明はまた、本発明による前記プライマープールを用いてヒトＨＮＦ−１α遺伝子の１０種の標的配列をＰＣＲする段階を含むヒトＨＮＦ−１α遺伝子の１０種の標的配列を増幅する方法を提供する。
【００２１】
本発明はまた、本発明による前記プライマープールを用いてヒトＨＮＦ−１α遺伝子の１０種の標的配列を分析する段階を含むヒトＨＮＦ−１α遺伝子の１０種の標的配列を分析する方法を提供する。
【００２２】
併せて、本発明は、本発明による前記プライマープールを含むヒトＨＮＦ−１α遺伝子の１０種の標的ＤＮＡ配列増幅用キットを提供する。前記キットは前記プライマープールの他に、ｄＮＴＰ溶液、ＤＮＡ重合酵素、緩衝溶液を含むＰＣＲ反応に必要な通常の試薬を含む。
【００２３】
更に、本発明は、ヒトＨＮＦ−１α遺伝子の遺伝的な変異を決定するのに利用できる。そのような変異には、第２型糖尿病の約１０ないし３０％を占める青年期発病糖尿病の一種であるＭＯＤＹ３疾病の変異が含まれる。ヒトＨＮＦ−１α遺伝子の遺伝的な変異を分析することにより、個体の糖尿病の体頂を予見できる。
【００２４】
【発明の実施の形態】
本発明への理解の一助とするために、この明細書に用いられた用語のいくつかを、下記に示す。“核酸”とは、一つのヌクレオチドのペントースの３’位置が次のペントースの５’位置にフォスフォジエステル基により結合され、前記ヌクレオチド残基（塩基）は、ヌクレオチドの線形順序で特定の配列に連結された、共有的に連結されたヌクレオチドの配列である。“ポリヌクレオチド”とは、長さ約１００ヌクレオチド以上の配列の核酸である。
【００２５】
“オリゴヌクレオチド”とは、短いポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの一部のことをいう。オリゴヌクレオチドは、普通約２ないし約１００塩基の配列である。
【００２６】
核酸は様々な形の突然変異を含むと知られている。この明細書の“点”突然変異は単一の塩基位置におけるヌクレオチド配列の変化のことをいう。“単一ヌクレオチド多型”（ＳＮＰ）とは、特定の核酸位置において最も頻度が高い塩基からの変異のことをいう。
【００２７】
“標的核酸”とは、対象となる特定の核酸配列のことをいう。従って、“標的”は、対象となる核酸分子内に存在しうる。
【００２８】
“核酸プローブ”とは、対象となる核酸にハイブリッドされうるオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドのことをいう。核酸プローブは精製された制限産物と共に天然に存在するか、合成、組換え、またはＰＣＲ増幅によって生産できる。“核酸プローブ”とは、本発明の方法に用いられるオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドのことをいう。同じオリゴヌクレオチドがまた増幅用プライマーとしてＰＣＲ法に利用できるが、この明細書では、“プライマー”と呼ぶ。ここで、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドはフォスフォロチオエート（phosphorothioate）結合のように変形された結合を含むこともある。
【００２９】
“相補的”とは、ＡはＴと対をなし、ＣはＧと対をなす塩基対規則に従い対象となる核酸（すなわち、ヌクレオチドの配列）と関連して用いられる。例えば、配列５’−Ａ−Ｇ−Ｔ−３’は３’−Ｔ−Ｃ−Ａ−５’と相補的である。相補性は、塩基対規則に従い核酸塩基の一部のみが対象となる“部分的”の場合がある。これに対し、塩基対規則に従って全ての塩基が対象となる“完全な”または“全体的”な場合もある。
【００３０】
“相同性”とは、相補性の度合いをいう。部分的な相補性または完全な相補性（すなわち、同一性）がありうる。
【００３１】
多重ＰＣＲ法によってヒトＨＮＦ−１α遺伝子増幅用プライマープールを開発するに当たって、次のことが考慮されうる。
【００３２】
プライマープールはヒトＨＮＦ−１α遺伝子に特異的に結合し、標的ＤＮＡを十分に増幅するため、プライマー相互間の干渉があってはならない。また、各プライマーが類似したＴｍ(melting temperature)を有し、かつ、プライマー対同士の２量体の形成がないことが好ましい。また、各プライマーはヘアピンや自己２量体を形成してはならない。マイクロサテライト領域及び繰り返し配列領域はプライマー配列から排除されなければならない。
【００３３】
【実施例】
以下、本発明を実施例を通じて一層詳細に説明する。これら実施例は本発明を例示的に説明するためのものであって、本発明の範囲がこれら実施例に限定されることはない。
【００３４】
実施例１：ヒトＨＮＦ−１α遺伝子の１０の標的配列増幅用プライマーの製作
表１に示すように、ＰＣＲ産物の大きさが５ｂｐ以上の違いとなるようにプライマーをデザインした。プライマーは標的ＤＮＡ配列にのみ特異的であり、プライマー相互間の干渉がなくて標的ＤＮＡを十分に増幅し得るようにデザインされている。さらに、各プライマーは類似したＴｍを有し、プライマーセット間の２量体の形成はなく、各プライマーは、ヘアピン及び自己２量体を形成せず、一つの塩基が４回を超えて繰り返えさないようにデザインされている。なお、マイクロサテライト領域及び繰り返し配列領域は、プライマー配列から排除している。
【００３５】
HYBsimulatorTM(Advanced Gene Computing Technologies, Inc)をプライマー分析に用いた。
【００３６】
また、ＰＣＲ産物の増幅効率性を高めるために、正方向プライマーにはＴ７プロモータ配列（ｔａａｔａｃｇａｃｔｃａｃｔａｔａｇｇｇ；配列番号１）を、逆方向プライマーにはＴ３プロモータ配列（ｇｔａａｃｃｃｔｃａｃｔａａａｇｇｇａ；配列番号２）を５’末端に付けて用いた。
【００３７】
各プライマーの配列及び特性は、下記表１の通りである。
【００３８】
【表１】
実施例２：単一ＰＣＲによるヒトＨＮＦ−１α遺伝子の増幅
実施例１により製作された各プライマーセットを用い、ヒトＨＮＦ−１α遺伝子標的部位を単一ＰＣＲによって増幅した。反応条件は、初期変性（９５℃において５分）、変性（９５℃において３０秒）、アニーリング（６４℃において１５秒）及び延長（７２℃において３０秒）の３０回の繰り返し、及び最終延長（７２℃において３分）とした。反応溶液の組成は、下記の通りであった。
【００４０】
ＤＮａｓｅ及びＲＮａｓｅが存在しない滅菌水 １２．８μｌ
ｄＮＴＰミックス（各ヌクレオシド２．５ｍＭ） ２μｌ
１０×Ｔａｑ重合酵素緩衝溶液 ２μｌ
プライマーセット（各プライマー１０ｐｍｏｌ） ２μｌ
ゲノムＤＮＡ（２００ｎｇ−１．０μｇ） １μｌ
Ｔａｑ重合酵素（５ユニット／μｌ） ０．２μｌ
前記単一ＰＣＲ産物の結果を図１に示す。これは、１．８％アガロースゲル電気泳動上において分子量マーカーを基準として確かめた。図１において、レーン１及びレーン１３は５０ｂｐＤＮＡラダー分子量マーカーを示し、レーン２はプロモータ、レーン３はエクソン１、レーン４はエクソン２、レーン５はエクソン３、レーン６はエクソン４、レーン７はエクソン５、レーン８はエクソン６、レーン９はエクソン７、レーン１０はエクソン８及び９、レーン１１はエクソン１０部分を各々増幅したＰＣＲ産物を示し、レーン１２は下記実施例３で得た多重ＰＣＲ産物を示す。
【００４１】
図１に示すように、ヒトＨＮＦ−１α遺伝子の標的領域は実施例１により製作された各プライマーセットを用いて、ヒトＨＮＦαシングルＰＣＲによって増幅された。
【００４２】
実施例３：多重ＰＣＲによるヒトＨＮＦ−１α遺伝子の標的領域の増幅
実施例１により製作されたプライマーセットを用いて多重ＰＣＲを行った。反応条件は、初期変性（９５℃において５分）、変性（９５℃において３０秒）、アニーリング（６４℃において１５秒）及び延長（７２℃において３０秒）の３０回繰り返し、及び最終延長（７２℃において３分）であった。前記各種プライマーセットを、一の反応容器内に添加した、反応溶液の組成は、下記の通りとした。
【００４３】
ＤＮａｓｅ及びＲＮａｓｅが存在しない滅菌水 １８．４μｌ
ｄＮＴＰミックス（各ヌクレオシド２．５ｍＭ） ５μｌ
１０×Ｔａｑ重合酵素緩衝溶液 ５μｌ
プライマーセット（各プライマー１０ｐｍｏｌ） ２０μｌ
ゲノムＤＮＡ（２００ｎｇ−１．０μｇ） １μｌ
Ｔａｑ重合酵素（５ユニット／μｌ） ０．６μｌ
得られた多重ＰＣＲ産物を１．８％アガロースゲル電気泳動によって確かめた（図１参照）。図１のレーン１２に示すように、前記プライマーを用いた多重ＰＣＲの結果、ヒトＨＮＦ−１α遺伝子の１０種の標的領域（５７９，４５９，３６５，３０８，３３２，２４１，２８６，２３０，４１４，１７１ｂｐ）がいずれも増幅された。
【００４４】
実施例４：変異プライマーを用いた多重ＰＣＲによるＨＮＦ−１α遺伝子の標的部位の増幅
４種のプライマーセット（プロモータ、エクソン１、エクソン２、エクソン８増幅用プライマーセット）の一方の末端に、鋳型となるＤＮＡに相補的な３ヌクレオシドを追加し、他方の末端に３個のヌクレオシドが欠失された変異プライマー（表２）を合成し、実施例３の方法と同様にして多重ＰＣＲを行った（図２）。
【００４５】
【表２】
多重ＰＣＲの結果を、図２のＡ〜Ｅに示す。図２のＡは、変異させたプロモータプライマーセットを用いた多重ＰＣＲ産物の電気泳動写真であり、図２のＢは、変異させたエクソン１プライマーセットを用いた多重ＰＣＲ産物の電気泳動写真であり、図２のＣは、変形させたエクソン２プライマーセットを用いた多重ＰＣＲ産物の電気泳動写真であり、図２のＤは、変形させたエクソン８プライマーセットを用いた多重ＰＣＲ産物の電気泳動写真であり、そして図２のＥは、前記変形されたプライマーセットを全て用いた多重ＰＣＲ産物の電気泳動写真である。図２のＡないしＥにおいて、レーン１は、５０ｂｐＤＮＡラダー分子量マーカーを示し、レーン２は、前記表１のプライマーセットのみを用いて多重ＰＣＲした結果を示し、レーン３は、前記表２の変異させたプライマーセットを用いて多重ＰＣＲした結果を示し、そしてレーン４は、変異の有無を問わずに該当プライマーセットを用いずに多重ＰＣＲを行なった結果を示す。
【００４７】
図２のＡないしＥから見られるように、４個の変異させたプライマーセットにより該当遺伝子部位がいずれも増幅されることが確かめられた。
【００４８】
実施例５：サザンブロッティングによる多重ＰＣＲ産物の確認
実施例２及び実施例３の増幅されたＰＣＲ産物を１.８％アガロースゲル上において電気泳動した（図１参照）。このゲルを変性溶液（０．５ＮＮａＯＨ＋１．５Ｍ ＮａＣｌ）において１５分間ゆっくり振りつつ、ゲル上の２重ストランドＤＮＡを変性させた。この過程を２回繰り返した後、蒸留水にてゲルを洗浄し、１５分間中和溶液（３Ｍ ＮａＣｌ，０．５Ｍ トリス−ＨＣｌ，ｐＨ ７．５）にてゆっくり振りつつゲルを２回中和させた。次に、ゲルに存在するＤＮＡ及びナイロン膜を２０×ＳＳＣ溶液にて１２時間反応させ、ＤＮＡをナイロン膜に移動させた。ナイロン膜を１２０℃において３０分間放置またはＵＶを照射することにより交差結合させ、蒸留水にてその膜を１ないし２分間洗浄した後に乾燥させた。
【００４９】
前述のように、ＤＮＡ付き膜を２０ｍｌの混成化溶液に入れ、６２℃において約２時間予混成化反応を行い、その溶液を放棄した。次に、ＤＮＡ付き膜及びＤＩＧ標識のプローブ５ｐｍｏｌ／ｍｌを混成化溶液バグ１０ｍｌに入れ、６２℃において約１２時間反応させた。この反応中にＤＩＧ標識のプローブは、膜にあるＤＮＡに相補的な遺伝子部位に結合される。そして、結合できなかったプローブを除去するために、２×洗浄用溶液（２×ＳＳＣ＋０．１％ ＳＤＳ）にて常温で５分間２回繰り返して洗浄を行い、０．５×洗浄用溶液（０．５×ＳＳＣ＋０．１％ ＳＤＳ）にて６２℃で１５分間２回繰り返し洗浄を行った。
【００５０】
その後、ＤＩＧに結合する抗体を入れる前に、他の部分に抗体が付かないように２０ｍｌのブロッキング溶液にて３０ないし６０分間放置した後、新しいブロッキング溶液２０ｍｌにアルカリ性ホスファターゼを連結させたヒツジ抗−ＤＩＧ抗体（Ｒｏｃｈｅ社製）を１μｌだけ添加して３０分間反応させた。続けて、洗浄緩衝液（１００ｍＭ マレイン酸、１５０ｍＭ ＮａＣｌ, ｐＨ ７.５（常温２０℃）、０．３％ Ｔｗｅｅｎ ２０）にて１５分ずつ２回洗浄を行った。次に、膜上にあるＤＮＡとプローブとの結合を確かめるために、アルカリ性ホスファターゼの基質であるＣＤＰ−スター（ＣＤＰ−Ｓｔａｒ）を検出緩衝溶液に１：１００の比率にて混ぜたもので膜を５分間処理した後、Ｘ−線フィルムに感光させた。感光されたフィルムを現像してプローブが付いた位置を確かめた。その結果を図３に示す。図３において、レーン１３は、ＤＩＧにて標識された分子量マーカーを示し、レーン２はプロモータ、レーン３はエクソン１、レーン４はエクソン２、レーン５はエクソン３、レーン６はエクソン４、レーン７はエクソン５、レーン８はエクソン６、レーン９はエクソン７、レーン１０はエクソン８及び９、レーン１１はエクソン１０部分を各々増幅した単一ＰＣＲ産物を示し、そしてレーン１２は多重ＰＣＲ産物を示す。
【００５１】
図３に示すように、単一ＰＣＲ及び多重ＰＣＲの同じ位置にプローブが付き、増幅された産物が同じものであることが分かった。
【００５２】
実施例６：配列分析を通じた多重ＰＣＲ産物の確認
実施例３の方法と同様にして多重ＰＣＲ産物を増幅させた後、１.８％アガロースゲル上で各産物を展開させ、各々のＤＮＡバンドを切り出してゲル抽出キットを用いてＤＮＡを精製した。このようにして精製されたＤＮＡをＡＢＩ３７００を用いて塩基配列を確かめ、ヒトＨＮＦ−１α遺伝子の該当配列と比較分析した（図４）。
【００５３】
図４は、プロモータ増幅型プライマーセットを用いてＰＣＲした結果を示している。配列番号３及び配列番号４を含むプライマーセットの増幅産物に該当するＰＣＲ増幅産物を分離し、自動配列分析方法を用いて塩基配列を分析した。得られたヌクレオチド配列（配列番号３１）（“クエリー”と呼ぶ。）をLagergene(DNAstar inc.)というプログラムによってヒトＨＮＦ−１α遺伝子プロモータの知られた配列（“プロモータ”と呼ぶ。）と比較した（図４）。図４に示すように、前記ＰＣＲ産物はＨＮＦ−１α遺伝子プロモータの知られた配列と完全な配列相同性を示した。整列に用いられたギャップ頻度は０％であった。プロモータ以外の他のエクソンに該当するＰＣＲ産物を同じ方法により配列分析した。各ＰＣＲ産物は知られた該当エクソン配列と９５％以上の相同性を示した。
【００５４】
実施例７：多重ＰＣＲ用反応溶液の安定性の検査
ゲノムＤＮＡを除いた実施例３において用いられた多重ＰＣＲ用反応溶液を、安定性を検査するために大量製造した。一回のＰＣＲに必要な４９μｌの反応溶液を複数の０．２ｍｌ−ＰＣＲチューブに分画した。前記反応溶液を含むチューブの一部は−２０℃で、一部は−７０℃で３ケ月間保存した。１日、３日、４日、１週間、２週間、３週間及び１２週間後に各チューブの反応溶液を用いて多重ＰＣＲを行った。
【００５５】
図５に、多重ＰＣＲの結果を示す。図５において、最初のレーンは分子量マーカーであり、レーン２は−２０℃における保存反応溶液を用いて得られた多重ＰＣＲ産物であり、レーン３は−７０℃における保存反応溶液を用いて得られた多重ＰＣＲ産物である。図５に示すように、本発明に用いた多重ＰＣＲ用反応溶液は、−２０℃または−７０℃において安定的であった。
【００５６】
実施例８：様々なＰＣＲ機器を用いた遺伝子増幅
様々なＰＣＲ装置を用い、実施例３の方法に従い多重ＰＣＲを行った。増幅された多重ＰＣＲ産物は、ＰＣＲ装置によるＰＣＲ産物の依存性を検査するために１．８％アガロースゲルで電気泳動した（図６ＡないしＣ）。
【００５７】
図６Ａは、ＰＴＣ−１００（ＭＪリサーチ社製）を用いて増幅した多重ＰＣＲ産物を示し、図６Ｂは、GeneAmp 9700（アプライド・バイオシステム社製）を用いて増幅した多重ＰＣＲ産物を示し、そして図６Ｃは、Mult-Block System(ThermoHybaidCo.)を用いて増幅した多重ＰＣＲ産物を示す。
【００５８】
図６Ａないし図６Ｃにおいて、レーン１は分子量マーカーである５０ｂｐのＤＮＡラダーであり、レーン２は表１に示されたプライマーセットを用いて得られた多重ＰＣＲ産物である。図中、矢印は各々３５０ｂｐ及び５０ｂｐを示す。
【００５９】
図６に示すように、ＰＣＲ装置に関係なく類似したＰＣＲ産物の様相が得られ、これは、本発明のプライマーセットを用いて得られたＰＣＲ産物が安定的でかつ経済的であるということを意味する。
【００６０】
【発明の効果】
本発明によるヒトＨＮＦ−１α遺伝子増幅用プライマープールは、多重ＰＣＲにより該当遺伝子を効果的に増幅した。特に、本発明の多重ＰＣＲ用プライマープールはＰＣＲ反応に必要な試料が相対的に少なく、ＤＮＡチップを用いた疾病関連の遺伝子の分析法に有用である。
【００６１】
本発明のプライマープールはヒトＨＮＦ−１α遺伝子の塩基配列分析用または増幅用キットに有効である。
【００６２】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 ヒトＨＮＦ−１α遺伝子のエクソン１ないし１０をシンプルＰＣＲ及び多重ＰＣＲでも増幅したＰＣＲ産物の電気泳動の結果を示す図である。
【図２】 ＡないしＥは、変異プライマーセットからなるプライマープールを用いて得られた多重ＰＣＲ産物の電気泳動写真である。
【図３】 エクソン別のプライマーセットをプローブとして用いた単一ＰＣＲ産物及び多重ＰＣＲ産物のサザンブロット写真である。
【図４】 プロモータ増幅用プライマーセットを用いて得られたＰＣＲ産物に該当する単一ＰＣＲ産物の塩基配列と公知のヒトＨＮＦ−１α遺伝子のプロモータ塩基配列とを比較して示す図である。
【図５】 多重ＰＣＲ反応溶液の安定性を調べた結果を示すアガロースゲル電気泳動写真である。
【図６】 ＡないしＣは、ＰＣＲ増幅装置による多重ＰＣＲ産物の様子を示す電気泳動写真である。
Claims (14)
- ヒトＨＮＦ−１α遺伝子の１０種の標的配列をＰＣＲするのに用いられ、
（ａ）〜（ｊ）に示されるＰＣＲプライマーセットを含むヒトＨＮＦ−１α遺伝子の標的配列増幅用プライマープール：
（ａ）配列番号３の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド及び配列番号４の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含むプライマーセットと、
（ｂ）配列番号５の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド及び配列番号６の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含むプライマーセットと、
（ｃ）配列番号７の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド及び配列番号８の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含むプライマーセットと、
（ｄ）配列番号９の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド及び配列番号１０の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含むプライマーセットと、
（ｅ）配列番号１１の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド及び配列番号１２の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含むプライマーセットと、
（ｆ）配列番号１３の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド及び配列番号１４の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含むプライマーセットと、
（ｇ）配列番号１５の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド及び配列番号１６の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含むプライマーセットと、
（ｈ）配列番号１７の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド及び配列番号１８の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含むプライマーセットと、
（ｉ）配列番号１９の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド及び配列番号２０の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含むプライマーセットと、
（ｊ）配列番号２１の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド及び配列番号２２の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット。 - １以上のプライマーが５’末端にＴ７プロモーター配列またはＴ３プロモーター配列を含む請求項１に記載のプライマープール。
- 配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９及び２１の配列を有する１以上のプライマーが５’末端にＴ７プロモーター配列を含み、配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０及び２２の配列を有する１以上のプライマーが５’末端にＴ３プロモーターを含む請求項１に記載のプライマープール。
- （ａ）〜（ｊ）に示されるＰＣＲプライマーセットを用いて、
ヒトＨＮＦ−１α遺伝子の１０種の標的配列をＰＣＲする段階を含むヒトＨＮＦ−１α遺伝子の２以上の標的配列を増幅する方法：
（ａ）配列番号３の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド及び配列番号４の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含むプライマーセットと、
（ｂ）配列番号５の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド及び配列番号６の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含むプライマーセットと、
（ｃ）配列番号７の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド及び配列番号８の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含むプライマーセットと、
（ｄ）配列番号９の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド及び配列番号１０の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含むプライマーセットと、
（ｅ）配列番号１１の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド及び配列番号１２の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含むプライマーセットと、
（ｆ）配列番号１３の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド及び配列番号１４の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含むプライマーセットと、
（ｇ）配列番号１５の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド及び配列番号１６の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含むプライマーセットと、
（ｈ）配列番号１７の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド及び配列番号１８の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含むプライマーセットと、
（ｉ）配列番号１９の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド及び配列番号２０の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含むプライマーセットと、
（ｊ）配列番号２１の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド及び配列番号２２の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット。 - １以上のプライマーが５’末端にＴ７プロモーター配列またはＴ３プロモーター配列を含む請求項４に記載の方法。
- 配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９及び２１の配列を有する１以上のプライマーが５’末端にＴ７プロモーター配列を含み、配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０及び２２の配列を有する１以上のプライマーが５’末端にＴ３プロモーターを含む請求項４に記載の方法。
- ０．１μＭ〜１μＭ濃度の各プライマー及び１００ｎｇ〜１μｇの鋳型ＤＮＡを混合する段階をさらに含む請求項４に記載の方法。
- 前記ＰＣＲは初期変性１〜５分（９０〜９８℃）、変性１０秒〜１分（９０〜９８℃）、アニーリング５秒〜３分（６０〜６５℃）、延長５秒〜５分（７０〜７５℃）、最終延長１〜１０分（７０〜７５℃）の反応条件下で行う請求項４に記載の方法。
- （ａ）〜（ｊ）に示されるＰＣＲプライマーセットを用いて、ヒトＨＮＦ−１α遺伝子の１０種の標的配列の分析をする方法：
（ａ）配列番号３の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド及び配列番号４の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含むプライマーセットと、
（ｂ）配列番号５の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド及び配列番号６の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含むプライマーセットと、
（ｃ）配列番号７の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド及び配列番号８の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含むプライマーセットと、
（ｄ）配列番号９の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド及び配列番号１０の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含むプライマーセットと、
（ｅ）配列番号１１の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド及び配列番号１２の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含むプライマーセットと、
（ｆ）配列番号１３の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド及び配列番号１４の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含むプライマーセットと、
（ｇ）配列番号１５の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド及び配列番号１６の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含むプライマーセットと、
（ｈ）配列番号１７の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド及び配列番号１８の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含むプライマーセットと、
（ｉ）配列番号１９の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド及び配列番号２０の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含むプライマーセットと、
（ｊ）配列番号２１の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド及び配列番号２２の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット。 - １以上のプライマーが５’末端にＴ７プロモーター配列またはＴ３プロモーター配列を含む請求項９に記載の方法。
- 配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９及び２１の配列を有する１以上のプライマーが５’末端にＴ７プロモーター配列を含み、配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０及び２２の配列を有する１以上のプライマーが５’末端にＴ３プロモーターを含む請求項９に記載の方法。
- 請求項１に記載のプライマープールを含む、ヒトＨＮＦ−１α遺伝子の標的配列の増幅用キット。
- １以上のプライマーが５’末端にＴ７プロモーター配列またはＴ３プロモーター配列を含む請求項１２に記載のキット。
- 配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９及び２１の配列を有する１以上のプライマーが５’末端にＴ７プロモーター配列を含み、配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０及び２２の配列を有する１以上のプライマーが５’末端にＴ３プロモーターを含む請求項１２に記載のキット。
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