JP2003199593A - ヒトＨＮＦ−１α遺伝子増幅用多重ＰＣＲプライマーセット - Google Patents
ヒトＨＮＦ−１α遺伝子増幅用多重ＰＣＲプライマーセットInfo
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 ヒトＨＮＦ−１α遺伝子増幅用多重ＰＣＲプ
ライマーセットを提供する。 【解決手段】 特定の配列を有するオリゴヌクレオチド
セットまたはその変異オリゴヌクレオチドから選ばれる
１以上のプライマーセットを含むヒトＨＮＦ−１α遺伝
子の標的配列増幅用プライマープール。前記プライマー
プールを用いた多重ＰＣＲによってヒトＨＮＦ−１α遺
伝子の標的領域を低コストで特異的に、且つ、速くて高
い敏感度をもって増幅できる。
ライマーセットを提供する。 【解決手段】 特定の配列を有するオリゴヌクレオチド
セットまたはその変異オリゴヌクレオチドから選ばれる
１以上のプライマーセットを含むヒトＨＮＦ−１α遺伝
子の標的配列増幅用プライマープール。前記プライマー
プールを用いた多重ＰＣＲによってヒトＨＮＦ−１α遺
伝子の標的領域を低コストで特異的に、且つ、速くて高
い敏感度をもって増幅できる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は多重ＰＣＲ用プライ
マー、前記プライマーを用いた塩基配列の分析方法及び
前記プライマーを含む標的ＤＮＡ配列増幅用キットに関
する。
マー、前記プライマーを用いた塩基配列の分析方法及び
前記プライマーを含む標的ＤＮＡ配列増幅用キットに関
する。
【０００２】
【従来の技術】ハイブリッド核酸の検出に用いられる方
法の一つにＰＣＲ法があり、ＰＣＲ法は当業界によく知
られている（特許文献１、特許文献２及び特許文献
３）。ＰＣＲ法においては、核酸増幅標的配列の対応ス
トランドに相補的な核酸プライマーが、変性された試料
にアニーリングされる。次に、ＤＮＡ重合酵素（普通、
熱に対して安定的である。）が前記ハイブリッドプライ
マーからＤＮＡ２重ストランドを延長する。次に、標的
核酸を増幅するために前記過程を繰り返す。プライマー
が前記標的核酸にハイブリッドされなければ、対応する
増幅されるべきＰＣＲ産物も無くなる。この場合、前記
ＰＣＲプライマーはハイブリッドプローブとしての役割
を果たす。
法の一つにＰＣＲ法があり、ＰＣＲ法は当業界によく知
られている（特許文献１、特許文献２及び特許文献
３）。ＰＣＲ法においては、核酸増幅標的配列の対応ス
トランドに相補的な核酸プライマーが、変性された試料
にアニーリングされる。次に、ＤＮＡ重合酵素（普通、
熱に対して安定的である。）が前記ハイブリッドプライ
マーからＤＮＡ２重ストランドを延長する。次に、標的
核酸を増幅するために前記過程を繰り返す。プライマー
が前記標的核酸にハイブリッドされなければ、対応する
増幅されるべきＰＣＲ産物も無くなる。この場合、前記
ＰＣＲプライマーはハイブリッドプローブとしての役割
を果たす。
【０００３】ＰＣＲ法において、増幅された核酸産物は
様々な方式により、例えば、標識したプライマーを用い
て増幅ストランドに標識ヌクレオチドを挿入することに
より検出できる。ＰＣＲに用いられるプライマーとして
は、放射性物質、蛍光染料、ジゴキシゲニン(digoxygen
in;以下、DIG)、ホースラディッシュパーオキシダーゼ、
アルカリ性フォスファターゼ、アクリジニウムエステ
ル、ビオチン及びジャックビーンウレアーゼなどで標識
したものがあるが、これに限定されるものではない。標
識されていないプライマーを使用して得られたＰＣＲ産
物は、電気泳動ゲル分離後に染料で可視化するなどの方
法によって検出できる。
様々な方式により、例えば、標識したプライマーを用い
て増幅ストランドに標識ヌクレオチドを挿入することに
より検出できる。ＰＣＲに用いられるプライマーとして
は、放射性物質、蛍光染料、ジゴキシゲニン(digoxygen
in;以下、DIG)、ホースラディッシュパーオキシダーゼ、
アルカリ性フォスファターゼ、アクリジニウムエステ
ル、ビオチン及びジャックビーンウレアーゼなどで標識
したものがあるが、これに限定されるものではない。標
識されていないプライマーを使用して得られたＰＣＲ産
物は、電気泳動ゲル分離後に染料で可視化するなどの方
法によって検出できる。
【０００４】ヒトゲノムは約３０億個の塩基配列を有す
るため、特定の遺伝子を単離して分析することは困難で
ある。このような難点を解決するために導入された実験
方法のうち最も画期的な一つが、特定の配列を増幅する
ＰＣＲ法である。ＰＣＲ法は特定の核酸配列の末端に相
補的な塩基よりなるプライマーセット（対）を用いてそ
れらの間にある遺伝子を短時間に数十万倍以上増幅させ
るものである(参照:Saikiら、Science 239:487,1988)。
るため、特定の遺伝子を単離して分析することは困難で
ある。このような難点を解決するために導入された実験
方法のうち最も画期的な一つが、特定の配列を増幅する
ＰＣＲ法である。ＰＣＲ法は特定の核酸配列の末端に相
補的な塩基よりなるプライマーセット（対）を用いてそ
れらの間にある遺伝子を短時間に数十万倍以上増幅させ
るものである(参照:Saikiら、Science 239:487,1988)。
【０００５】このようなＰＣＲ法は、疾病関連遺伝子の
分析に多用されている。特に、前記ＰＣＲ法による疾病
関連遺伝子の増幅は、医療系における遺伝子変異分析の
方法に汎用されている。前記遺伝子変異の分析は、特定
の疾病関連遺伝子を増幅させた後、塩基配列の分析、混
成化及び一本鎖ＤＮＡ高次構造多型(SSCP:single stran
d conformational polymorphism)などの過程を通じて行
われる。遺伝子の変異とは、欠失、置換、付加及び逆位
などを含むものであって、遺伝子配列に変化が生じたこ
とを意味する。ここには、単一塩基配列多型も含まれ
る。
分析に多用されている。特に、前記ＰＣＲ法による疾病
関連遺伝子の増幅は、医療系における遺伝子変異分析の
方法に汎用されている。前記遺伝子変異の分析は、特定
の疾病関連遺伝子を増幅させた後、塩基配列の分析、混
成化及び一本鎖ＤＮＡ高次構造多型(SSCP:single stran
d conformational polymorphism)などの過程を通じて行
われる。遺伝子の変異とは、欠失、置換、付加及び逆位
などを含むものであって、遺伝子配列に変化が生じたこ
とを意味する。ここには、単一塩基配列多型も含まれ
る。
【０００６】遺伝子変異の分析法において、標的遺伝子
が小さい場合には単一ＰＣＲにより全ての分析を行うこ
とができる。しかし、標的遺伝子が相対的に大きい場
合、例えば、１ｋｂ以上である場合、単一ＰＣＲが好適
でない場合がある。従って、標的遺伝子が大きい場合、
ＰＣＲを複数回に亘って行わなければならない。ほとん
どの疾病関連遺伝子は、普通１.５ｋｂ以上であるた
め、複数のＰＣＲが疾病関連遺伝子の変異分析法で行な
われている。
が小さい場合には単一ＰＣＲにより全ての分析を行うこ
とができる。しかし、標的遺伝子が相対的に大きい場
合、例えば、１ｋｂ以上である場合、単一ＰＣＲが好適
でない場合がある。従って、標的遺伝子が大きい場合、
ＰＣＲを複数回に亘って行わなければならない。ほとん
どの疾病関連遺伝子は、普通１.５ｋｂ以上であるた
め、複数のＰＣＲが疾病関連遺伝子の変異分析法で行な
われている。
【０００７】しかしながら、複数のＰＣＲは多量のサン
プル、例えば、患者のＤＮＡまたは血液を必要とする。
また、複数のＰＣＲは、高コスト及び手間を必要とす
る。
プル、例えば、患者のＤＮＡまたは血液を必要とする。
また、複数のＰＣＲは、高コスト及び手間を必要とす
る。
【０００８】このような短所を解消するために講じられ
た方法が、多重ＰＣＲ法(multiplexPCR)である。多重Ｐ
ＣＲ法は、遺伝子の複数の標的配列を一つの反応容器内
で同時に増幅するものである。すなわち、各標的配列を
増幅し得る以上のプライマーセット（プライマープー
ル）を一つの反応容器に入れ、単一ＰＣＲ操作により複
数の標的配列を増幅させるのである。
た方法が、多重ＰＣＲ法(multiplexPCR)である。多重Ｐ
ＣＲ法は、遺伝子の複数の標的配列を一つの反応容器内
で同時に増幅するものである。すなわち、各標的配列を
増幅し得る以上のプライマーセット（プライマープー
ル）を一つの反応容器に入れ、単一ＰＣＲ操作により複
数の標的配列を増幅させるのである。
【０００９】このような多重ＰＣＲ法は当業界でよく知
られ、例えば、特許文献４には複数の公知のＤＮＡ配列
欠失を同時に検出する方法が開示されている。前記特許
文献４に開示された技術は、標的にハイブリダイズする
第１のプローブセットを用いる。標的が存在すれば、前
記プローブが延びる。延長産物はＰＣＲ法を用いて増幅
される。
られ、例えば、特許文献４には複数の公知のＤＮＡ配列
欠失を同時に検出する方法が開示されている。前記特許
文献４に開示された技術は、標的にハイブリダイズする
第１のプローブセットを用いる。標的が存在すれば、前
記プローブが延びる。延長産物はＰＣＲ法を用いて増幅
される。
【００１０】多重ＰＣＲ法用のプライマーは、標的ＤＮ
Ａ配列にのみ特異的であり、標的ＤＮＡを十分に増幅す
るため、プライマー相互の干渉があってはならない。
Ａ配列にのみ特異的であり、標的ＤＮＡを十分に増幅す
るため、プライマー相互の干渉があってはならない。
【００１１】このプライマーセットを用いた多重ＰＣＲ
法は、単一ＰＣＲに比べて、標的ＤＮＡを増幅させるの
に手間及びコストを大いに低減できる。特に、多重ＰＣ
Ｒ法は、ＤＮＡチップを用いた遺伝子変異の分析に際
し、１種以上のＤＮＡサンプルを増幅をする際に有用で
ある。
法は、単一ＰＣＲに比べて、標的ＤＮＡを増幅させるの
に手間及びコストを大いに低減できる。特に、多重ＰＣ
Ｒ法は、ＤＮＡチップを用いた遺伝子変異の分析に際
し、１種以上のＤＮＡサンプルを増幅をする際に有用で
ある。
【００１２】一方、ＨＮＦ−１α遺伝子における点突然
変異は、ＭＯＤＹ(maturity-onsetdiabetes of the you
ng)３を引き起こすことが知られている（特許文献５；
特許文献６；特許文献７）。ＭＯＤＹ３は、第２型糖尿
病の１０ないし３０％以上を占めるＭＯＤＹ疾病（ＭＯ
ＤＹ１,２,３,４,５）（青年期に発生する糖尿病）の一
種である。従って、ヒトＨＮＦ−１α遺伝子の変異の分
析は、糖尿病を発症する傾向を予測可能にする。これら
の理由から、ＤＮＡチップを用いた変異分析などのヒト
ＨＮＦ−１α遺伝子の迅速な分析のために、ヒトＨＮＦ
−１α遺伝子増幅用の多重ＰＣＲプライマーセットの開
発が望まれる。
変異は、ＭＯＤＹ(maturity-onsetdiabetes of the you
ng)３を引き起こすことが知られている（特許文献５；
特許文献６；特許文献７）。ＭＯＤＹ３は、第２型糖尿
病の１０ないし３０％以上を占めるＭＯＤＹ疾病（ＭＯ
ＤＹ１,２,３,４,５）（青年期に発生する糖尿病）の一
種である。従って、ヒトＨＮＦ−１α遺伝子の変異の分
析は、糖尿病を発症する傾向を予測可能にする。これら
の理由から、ＤＮＡチップを用いた変異分析などのヒト
ＨＮＦ−１α遺伝子の迅速な分析のために、ヒトＨＮＦ
−１α遺伝子増幅用の多重ＰＣＲプライマーセットの開
発が望まれる。
【００１３】
【特許文献１】米国特許第４,６８３,１９５号明細書
【特許文献２】米国特許第４,６８３,２０２号明細書
【特許文献３】米国特許第４,８００,１５９号明細書
【特許文献４】米国特許第５,５８２,９８９号明細書
【特許文献５】Matschinsky & Magnuson, in ’Molecul
ar Pathogenesis of MODYs’, Karger, 1998
ar Pathogenesis of MODYs’, Karger, 1998
【特許文献６】米国特許第５,５４１,０６０号明細書
【特許文献７】ＷＯ ９３２１３４３号公報
【００１４】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、ヒト
ＨＮＦ−１α遺伝子の標的配列を多重ＰＣＲ法により増
幅する多重ＰＣＲプライマーセットを含むプライマープ
ールを提供することにある。
ＨＮＦ−１α遺伝子の標的配列を多重ＰＣＲ法により増
幅する多重ＰＣＲプライマーセットを含むプライマープ
ールを提供することにある。
【００１５】本発明の他の目的は、前記プライマープー
ルを用いてＨＮＦ−１α遺伝子の標的配列を増幅する方
法を提供することにある。
ルを用いてＨＮＦ−１α遺伝子の標的配列を増幅する方
法を提供することにある。
【００１６】本発明のさらに他の目的は、前記プライマ
ープールを用いてＨＮＦ−１α遺伝子の標的ヌクレオチ
ド配列を分析する方法を提供することにある。
ープールを用いてＨＮＦ−１α遺伝子の標的ヌクレオチ
ド配列を分析する方法を提供することにある。
【００１７】本発明のさらに他の目的は、前記プライマ
ープールを含む標的配列増幅用のキットを提供すること
にある。
ープールを含む標的配列増幅用のキットを提供すること
にある。
【００１８】
【課題を解決するための手段】本発明は、次のプライマ
ーセットよりなる群から選ばれる１種以上、より好まし
くは２種以上、特に好ましくは３種以上のヒトＨＮＦ−
１α遺伝子の標的配列増幅用ＰＣＲプライマーセットを
含むヒトＨＮＦ−１α遺伝子の標的配列増幅用プライマ
ープールである。
ーセットよりなる群から選ばれる１種以上、より好まし
くは２種以上、特に好ましくは３種以上のヒトＨＮＦ−
１α遺伝子の標的配列増幅用ＰＣＲプライマーセットを
含むヒトＨＮＦ−１α遺伝子の標的配列増幅用プライマ
ープールである。
【００１９】（ａ）配列番号３の塩基配列を有するオリ
ゴヌクレオチドまたはその変異オリゴヌクレオチド及び
配列番号４の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまた
はその変異オリゴヌクレオチドを含むプライマーセット
と、（ｂ）配列番号５の塩基配列を有するオリゴヌクレ
オチドまたはその変異オリゴヌクレオチド及び配列番号
６の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはその変
異オリゴヌクレオチドを含むプライマーセットと、
（ｃ）配列番号７の塩基配列を有するオリゴヌクレオチ
ドまたはその変異オリゴヌクレオチド及び配列番号８の
塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはその変異オ
リゴヌクレオチドを含むプライマーセットと、（ｄ）配
列番号９の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたは
その変異オリゴヌクレオチド及び配列番号１０の塩基配
列を有するオリゴヌクレオチドまたはその変異オリゴヌ
クレオチドを含むプライマーセットと、（ｅ）配列番号
１１の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはその
変異オリゴヌクレオチド及び配列番号１２の塩基配列を
有するオリゴヌクレオチドまたはその変異オリゴヌクレ
オチドを含むプライマーセットと、（ｆ）配列番号１３
の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはその変異
オリゴヌクレオチド及び配列番号１４の塩基配列を有す
るオリゴヌクレオチドまたはその変異オリゴヌクレオチ
ドを含むプライマーセットと、（ｇ）配列番号１５の塩
基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはその変異オリ
ゴヌクレオチド及び配列番号１６の塩基配列を有するオ
リゴヌクレオチドまたはその変異オリゴヌクレオチドを
含むプライマーセットと、（ｈ）配列番号１７の塩基配
列を有するオリゴヌクレオチドまたはその変異オリゴヌ
クレオチド及び配列番号１８の塩基配列を有するオリゴ
ヌクレオチドまたはその変異オリゴヌクレオチドを含む
プライマーセットと、（ｉ）配列番号１９の塩基配列を
有するオリゴヌクレオチドまたはその変異オリゴヌクレ
オチド及び配列番号２０の塩基配列を有するオリゴヌク
レオチドまたはその変異オリゴヌクレオチドを含むプラ
イマーセットと、（ｊ）配列番号２１の塩基配列を有す
るオリゴヌクレオチドまたはその変異オリゴヌクレオチ
ド及び配列番号２２の塩基配列を有するオリゴヌクレオ
チドまたはその変異オリゴヌクレオチドを含むプライマ
ーセット：ここで、前記変異オリゴヌクレオチドは、該
当オリゴヌクレオチドの３’末端、５’末端または３’
末端及び５’末端の両方に連結または欠失された１ない
し３個のさらなるヌクレオチドを有するオリゴヌクレオ
チドである。
ゴヌクレオチドまたはその変異オリゴヌクレオチド及び
配列番号４の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまた
はその変異オリゴヌクレオチドを含むプライマーセット
と、（ｂ）配列番号５の塩基配列を有するオリゴヌクレ
オチドまたはその変異オリゴヌクレオチド及び配列番号
６の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはその変
異オリゴヌクレオチドを含むプライマーセットと、
（ｃ）配列番号７の塩基配列を有するオリゴヌクレオチ
ドまたはその変異オリゴヌクレオチド及び配列番号８の
塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはその変異オ
リゴヌクレオチドを含むプライマーセットと、（ｄ）配
列番号９の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたは
その変異オリゴヌクレオチド及び配列番号１０の塩基配
列を有するオリゴヌクレオチドまたはその変異オリゴヌ
クレオチドを含むプライマーセットと、（ｅ）配列番号
１１の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはその
変異オリゴヌクレオチド及び配列番号１２の塩基配列を
有するオリゴヌクレオチドまたはその変異オリゴヌクレ
オチドを含むプライマーセットと、（ｆ）配列番号１３
の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはその変異
オリゴヌクレオチド及び配列番号１４の塩基配列を有す
るオリゴヌクレオチドまたはその変異オリゴヌクレオチ
ドを含むプライマーセットと、（ｇ）配列番号１５の塩
基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはその変異オリ
ゴヌクレオチド及び配列番号１６の塩基配列を有するオ
リゴヌクレオチドまたはその変異オリゴヌクレオチドを
含むプライマーセットと、（ｈ）配列番号１７の塩基配
列を有するオリゴヌクレオチドまたはその変異オリゴヌ
クレオチド及び配列番号１８の塩基配列を有するオリゴ
ヌクレオチドまたはその変異オリゴヌクレオチドを含む
プライマーセットと、（ｉ）配列番号１９の塩基配列を
有するオリゴヌクレオチドまたはその変異オリゴヌクレ
オチド及び配列番号２０の塩基配列を有するオリゴヌク
レオチドまたはその変異オリゴヌクレオチドを含むプラ
イマーセットと、（ｊ）配列番号２１の塩基配列を有す
るオリゴヌクレオチドまたはその変異オリゴヌクレオチ
ド及び配列番号２２の塩基配列を有するオリゴヌクレオ
チドまたはその変異オリゴヌクレオチドを含むプライマ
ーセット：ここで、前記変異オリゴヌクレオチドは、該
当オリゴヌクレオチドの３’末端、５’末端または３’
末端及び５’末端の両方に連結または欠失された１ない
し３個のさらなるヌクレオチドを有するオリゴヌクレオ
チドである。
【００２０】本発明はまた、本発明による前記プライマ
ープールを用いてヒトＨＮＦ−１α遺伝子の１種以上の
標的配列をＰＣＲする段階を含むヒトＨＮＦ−１α遺伝
子の１種以上の標的配列を増幅する方法を提供する。
ープールを用いてヒトＨＮＦ−１α遺伝子の１種以上の
標的配列をＰＣＲする段階を含むヒトＨＮＦ−１α遺伝
子の１種以上の標的配列を増幅する方法を提供する。
【００２１】本発明はまた、本発明による前記プライマ
ープールを用いてヒトＨＮＦ−１α遺伝子の１種以上の
標的配列を分析する段階を含むヒトＨＮＦ−１α遺伝子
の１種以上の標的配列を分析する方法を提供する。
ープールを用いてヒトＨＮＦ−１α遺伝子の１種以上の
標的配列を分析する段階を含むヒトＨＮＦ−１α遺伝子
の１種以上の標的配列を分析する方法を提供する。
【００２２】併せて、本発明は、本発明による前記プラ
イマープールを含むヒトＨＮＦ−１α遺伝子の１種以上
の標的ＤＮＡ配列増幅用キットを提供する。前記キット
は前記プライマープールの他に、ｄＮＴＰ溶液、ＤＮＡ
重合酵素、緩衝溶液を含むＰＣＲ反応に必要な通常の試
薬を含む。
イマープールを含むヒトＨＮＦ−１α遺伝子の１種以上
の標的ＤＮＡ配列増幅用キットを提供する。前記キット
は前記プライマープールの他に、ｄＮＴＰ溶液、ＤＮＡ
重合酵素、緩衝溶液を含むＰＣＲ反応に必要な通常の試
薬を含む。
【００２３】更に、本発明は、ヒトＨＮＦ−１α遺伝子
の遺伝的な変異を決定するのに利用できる。そのような
変異には、第２型糖尿病の約１０ないし３０％を占める
青年期発病糖尿病の一種であるＭＯＤＹ３疾病の変異が
含まれる。ヒトＨＮＦ−１α遺伝子の遺伝的な変異を分
析することにより、個体の糖尿病の体頂を予見できる。
の遺伝的な変異を決定するのに利用できる。そのような
変異には、第２型糖尿病の約１０ないし３０％を占める
青年期発病糖尿病の一種であるＭＯＤＹ３疾病の変異が
含まれる。ヒトＨＮＦ−１α遺伝子の遺伝的な変異を分
析することにより、個体の糖尿病の体頂を予見できる。
【００２４】
【発明の実施の形態】本発明への理解の一助とするため
に、この明細書に用いられた用語のいくつかを、下記に
示す。“核酸”とは、一つのヌクレオチドのペントース
の３’位置が次のペントースの５’位置にフォスフォジ
エステル基により結合され、前記ヌクレオチド残基（塩
基）は、ヌクレオチドの線形順序で特定の配列に連結さ
れた、共有的に連結されたヌクレオチドの配列である。
“ポリヌクレオチド”とは、長さ約１００ヌクレオチド
以上の配列の核酸である。
に、この明細書に用いられた用語のいくつかを、下記に
示す。“核酸”とは、一つのヌクレオチドのペントース
の３’位置が次のペントースの５’位置にフォスフォジ
エステル基により結合され、前記ヌクレオチド残基（塩
基）は、ヌクレオチドの線形順序で特定の配列に連結さ
れた、共有的に連結されたヌクレオチドの配列である。
“ポリヌクレオチド”とは、長さ約１００ヌクレオチド
以上の配列の核酸である。
【００２５】“オリゴヌクレオチド”とは、短いポリヌ
クレオチドまたはポリヌクレオチドの一部のことをい
う。オリゴヌクレオチドは、普通約２ないし約１００塩
基の配列である。
クレオチドまたはポリヌクレオチドの一部のことをい
う。オリゴヌクレオチドは、普通約２ないし約１００塩
基の配列である。
【００２６】核酸は様々な形の突然変異を含むと知られ
ている。この明細書の“点”突然変異は単一の塩基位置
におけるヌクレオチド配列の変化のことをいう。“単一
ヌクレオチド多型”（ＳＮＰ）とは、特定の核酸位置に
おいて最も頻度が高い塩基からの変異のことをいう。
ている。この明細書の“点”突然変異は単一の塩基位置
におけるヌクレオチド配列の変化のことをいう。“単一
ヌクレオチド多型”（ＳＮＰ）とは、特定の核酸位置に
おいて最も頻度が高い塩基からの変異のことをいう。
【００２７】“標的核酸”とは、対象となる特定の核酸
配列のことをいう。従って、“標的”は、対象となる核
酸分子内に存在しうる。
配列のことをいう。従って、“標的”は、対象となる核
酸分子内に存在しうる。
【００２８】“核酸プローブ”とは、対象となる核酸に
ハイブリッドされうるオリゴヌクレオチドまたはポリヌ
クレオチドのことをいう。核酸プローブは精製された制
限産物と共に天然に存在するか、合成、組換え、または
ＰＣＲ増幅によって生産できる。“核酸プローブ”と
は、本発明の方法に用いられるオリゴヌクレオチドまた
はポリヌクレオチドのことをいう。同じオリゴヌクレオ
チドがまた増幅用プライマーとしてＰＣＲ法に利用でき
るが、この明細書では、“プライマー”と呼ぶ。ここ
で、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドはフォ
スフォロチオエート（phosphorothioate）結合のように
変形された結合を含むこともある。
ハイブリッドされうるオリゴヌクレオチドまたはポリヌ
クレオチドのことをいう。核酸プローブは精製された制
限産物と共に天然に存在するか、合成、組換え、または
ＰＣＲ増幅によって生産できる。“核酸プローブ”と
は、本発明の方法に用いられるオリゴヌクレオチドまた
はポリヌクレオチドのことをいう。同じオリゴヌクレオ
チドがまた増幅用プライマーとしてＰＣＲ法に利用でき
るが、この明細書では、“プライマー”と呼ぶ。ここ
で、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドはフォ
スフォロチオエート（phosphorothioate）結合のように
変形された結合を含むこともある。
【００２９】“相補的”とは、ＡはＴと対をなし、Ｃは
Ｇと対をなす塩基対規則に従い対象となる核酸（すなわ
ち、ヌクレオチドの配列）と関連して用いられる。例え
ば、配列５’−Ａ−Ｇ−Ｔ−３’は３’−Ｔ−Ｃ−Ａ−
５’と相補的である。相補性は、塩基対規則に従い核酸
塩基の一部のみが対象となる“部分的”の場合がある。
これに対し、塩基対規則に従って全ての塩基が対象とな
る“完全な”または“全体的”な場合もある。
Ｇと対をなす塩基対規則に従い対象となる核酸（すなわ
ち、ヌクレオチドの配列）と関連して用いられる。例え
ば、配列５’−Ａ−Ｇ−Ｔ−３’は３’−Ｔ−Ｃ−Ａ−
５’と相補的である。相補性は、塩基対規則に従い核酸
塩基の一部のみが対象となる“部分的”の場合がある。
これに対し、塩基対規則に従って全ての塩基が対象とな
る“完全な”または“全体的”な場合もある。
【００３０】“相同性”とは、相補性の度合いをいう。
部分的な相補性または完全な相補性（すなわち、同一
性）がありうる。
部分的な相補性または完全な相補性（すなわち、同一
性）がありうる。
【００３１】多重ＰＣＲ法によってヒトＨＮＦ−１α遺
伝子増幅用プライマープールを開発するに当たって、次
のことが考慮されうる。
伝子増幅用プライマープールを開発するに当たって、次
のことが考慮されうる。
【００３２】プライマープールはヒトＨＮＦ−１α遺伝
子に特異的に結合し、標的ＤＮＡを十分に増幅するた
め、プライマー相互間の干渉があってはならない。ま
た、各プライマーが類似したＴｍ(melting temperatur
e)を有し、かつ、プライマー対同士の２量体の形成がな
いことが好ましい。また、各プライマーはヘアピンや自
己２量体を形成してはならない。マイクロサテライト領
域及び繰り返し配列領域はプライマー配列から排除され
なければならない。
子に特異的に結合し、標的ＤＮＡを十分に増幅するた
め、プライマー相互間の干渉があってはならない。ま
た、各プライマーが類似したＴｍ(melting temperatur
e)を有し、かつ、プライマー対同士の２量体の形成がな
いことが好ましい。また、各プライマーはヘアピンや自
己２量体を形成してはならない。マイクロサテライト領
域及び繰り返し配列領域はプライマー配列から排除され
なければならない。
【００３３】
【実施例】以下、本発明を実施例を通じて一層詳細に説
明する。これら実施例は本発明を例示的に説明するため
のものであって、本発明の範囲がこれら実施例に限定さ
れることはない。
明する。これら実施例は本発明を例示的に説明するため
のものであって、本発明の範囲がこれら実施例に限定さ
れることはない。
【００３４】実施例１：ヒトＨＮＦ−１α遺伝子の１０
の標的配列増幅用プライマーの製作表１に示すように、
ＰＣＲ産物の大きさが５ｂｐ以上の違いとなるようにプ
ライマーをデザインした。プライマーは標的ＤＮＡ配列
にのみ特異的であり、プライマー相互間の干渉がなくて
標的ＤＮＡを十分に増幅し得るようにデザインされてい
る。さらに、各プライマーは類似したＴｍを有し、プラ
イマーセット間の２量体の形成はなく、各プライマー
は、ヘアピン及び自己２量体を形成せず、一つの塩基が
４回以上繰り返えさないようにデザインされている。な
お、マイクロサテライト領域及び繰り返し配列領域は、
プライマー配列から排除している。
の標的配列増幅用プライマーの製作表１に示すように、
ＰＣＲ産物の大きさが５ｂｐ以上の違いとなるようにプ
ライマーをデザインした。プライマーは標的ＤＮＡ配列
にのみ特異的であり、プライマー相互間の干渉がなくて
標的ＤＮＡを十分に増幅し得るようにデザインされてい
る。さらに、各プライマーは類似したＴｍを有し、プラ
イマーセット間の２量体の形成はなく、各プライマー
は、ヘアピン及び自己２量体を形成せず、一つの塩基が
４回以上繰り返えさないようにデザインされている。な
お、マイクロサテライト領域及び繰り返し配列領域は、
プライマー配列から排除している。
【００３５】HYBsimulatorTM(Advanced Gene Computing
Technologies, Inc)をプライマー分析に用いた。
Technologies, Inc)をプライマー分析に用いた。
【００３６】また、ＰＣＲ産物の増幅効率性を高めるた
めに、正方向プライマーにはＴ７プロモータ配列（ｔａ
ａｔａｃｇａｃｔｃａｃｔａｔａｇｇｇ；配列番号１）
を、逆方向プライマーにはＴ３プロモータ配列（ｇｔａ
ａｃｃｃｔｃａｃｔａａａｇｇｇａ；配列番号２）を
５’末端に付けて用いた。
めに、正方向プライマーにはＴ７プロモータ配列（ｔａ
ａｔａｃｇａｃｔｃａｃｔａｔａｇｇｇ；配列番号１）
を、逆方向プライマーにはＴ３プロモータ配列（ｇｔａ
ａｃｃｃｔｃａｃｔａａａｇｇｇａ；配列番号２）を
５’末端に付けて用いた。
【００３７】各プライマーの配列及び特性は、下記表１
の通りである。
の通りである。
【００３８】
【表１】
【００３９】実施例２：単一ＰＣＲによるヒトＨＮＦ−
１α遺伝子の増幅 実施例１により製作された各プライマーセットを用い、
ヒトＨＮＦ−１α遺伝子標的部位を単一ＰＣＲによって
増幅した。反応条件は、初期変性（９５℃において５
分）、変性（９５℃において３０秒）、アニーリング
（６４℃において１５秒）及び延長（７２℃において３
０秒）の３０回の繰り返し、及び最終延長（７２℃にお
いて３分）とした。反応溶液の組成は、下記の通りであ
った。
１α遺伝子の増幅 実施例１により製作された各プライマーセットを用い、
ヒトＨＮＦ−１α遺伝子標的部位を単一ＰＣＲによって
増幅した。反応条件は、初期変性（９５℃において５
分）、変性（９５℃において３０秒）、アニーリング
（６４℃において１５秒）及び延長（７２℃において３
０秒）の３０回の繰り返し、及び最終延長（７２℃にお
いて３分）とした。反応溶液の組成は、下記の通りであ
った。
【００４０】
ＤＮａｓｅ及びＲＮａｓｅが存在しない滅菌水 １２．８μｌ
ｄＮＴＰミックス（各ヌクレオシド２．５ｍＭ） ２μｌ
１０×Ｔａｑ重合酵素緩衝溶液 ２μｌ
プライマーセット（各プライマー１０ｐｍｏｌ） ２μｌ
ゲノムＤＮＡ（２００ｎｇ−１．０μｇ） １μｌ
Ｔａｑ重合酵素（５ユニット／μｌ） ０．２μｌ
前記単一ＰＣＲ産物の結果を図１に示す。これは、１．
８％アガロースゲル電気泳動上において分子量マーカー
を基準として確かめた。図１において、レーン１及びレ
ーン１３は５０ｂｐＤＮＡラダー分子量マーカーを示
し、レーン２はプロモータ、レーン３はエクソン１、レ
ーン４はエクソン２、レーン５はエクソン３、レーン６
はエクソン４、レーン７はエクソン５、レーン８はエク
ソン６、レーン９はエクソン７、レーン１０はエクソン
８及び９、レーン１１はエクソン１０部分を各々増幅し
たＰＣＲ産物を示し、レーン１２は下記実施例３で得た
多重ＰＣＲ産物を示す。
８％アガロースゲル電気泳動上において分子量マーカー
を基準として確かめた。図１において、レーン１及びレ
ーン１３は５０ｂｐＤＮＡラダー分子量マーカーを示
し、レーン２はプロモータ、レーン３はエクソン１、レ
ーン４はエクソン２、レーン５はエクソン３、レーン６
はエクソン４、レーン７はエクソン５、レーン８はエク
ソン６、レーン９はエクソン７、レーン１０はエクソン
８及び９、レーン１１はエクソン１０部分を各々増幅し
たＰＣＲ産物を示し、レーン１２は下記実施例３で得た
多重ＰＣＲ産物を示す。
【００４１】図１に示すように、ヒトＨＮＦ−１α遺伝
子の標的領域は実施例１により製作された各プライマー
セットを用いて、ヒトＨＮＦαシングルＰＣＲによって
増幅された。
子の標的領域は実施例１により製作された各プライマー
セットを用いて、ヒトＨＮＦαシングルＰＣＲによって
増幅された。
【００４２】実施例３：多重ＰＣＲによるヒトＨＮＦ−
１α遺伝子の標的領域の増幅 実施例１により製作されたプライマーセットを用いて多
重ＰＣＲを行った。反応条件は、初期変性（９５℃にお
いて５分）、変性（９５℃において３０秒）、アニーリ
ング（６４℃において１５秒）及び延長（７２℃におい
て３０秒）の３０回繰り返し、及び最終延長（７２℃に
おいて３分）であった。前記各種プライマーセットを、
一の反応容器内に添加した、反応溶液の組成は、下記の
通りとした。
１α遺伝子の標的領域の増幅 実施例１により製作されたプライマーセットを用いて多
重ＰＣＲを行った。反応条件は、初期変性（９５℃にお
いて５分）、変性（９５℃において３０秒）、アニーリ
ング（６４℃において１５秒）及び延長（７２℃におい
て３０秒）の３０回繰り返し、及び最終延長（７２℃に
おいて３分）であった。前記各種プライマーセットを、
一の反応容器内に添加した、反応溶液の組成は、下記の
通りとした。
【００４３】
ＤＮａｓｅ及びＲＮａｓｅが存在しない滅菌水 １８．４μｌ
ｄＮＴＰミックス（各ヌクレオシド２．５ｍＭ） ５μｌ
１０×Ｔａｑ重合酵素緩衝溶液 ５μｌ
プライマーセット（各プライマー１０ｐｍｏｌ） ２０μｌ
ゲノムＤＮＡ（２００ｎｇ−１．０μｇ） １μｌ
Ｔａｑ重合酵素（５ユニット／μｌ） ０．６μｌ
得られた多重ＰＣＲ産物を１．８％アガロースゲル電気
泳動によって確かめた（図１参照）。図１のレーン１２
に示すように、前記プライマーを用いた多重ＰＣＲの結
果、ヒトＨＮＦ−１α遺伝子の１０種の標的領域（５７
９，４５９，３６５，３０８，３３２，２４１，２８
６，２３０，４１４，１７１ｂｐ）がいずれも増幅され
た。
泳動によって確かめた（図１参照）。図１のレーン１２
に示すように、前記プライマーを用いた多重ＰＣＲの結
果、ヒトＨＮＦ−１α遺伝子の１０種の標的領域（５７
９，４５９，３６５，３０８，３３２，２４１，２８
６，２３０，４１４，１７１ｂｐ）がいずれも増幅され
た。
【００４４】実施例４：変異プライマーを用いた多重Ｐ
ＣＲによるＨＮＦ−１α遺伝子の標的部位の増幅 ４種のプライマーセット（プロモータ、エクソン１、エ
クソン２、エクソン８増幅用プライマーセット）の一方
の末端に、鋳型となるＤＮＡに相補的な３ヌクレオシド
を追加し、他方の末端に３個のヌクレオシドが欠失され
た変異プライマー（表２）を合成し、実施例３の方法と
同様にして多重ＰＣＲを行った（図２）。
ＣＲによるＨＮＦ−１α遺伝子の標的部位の増幅 ４種のプライマーセット（プロモータ、エクソン１、エ
クソン２、エクソン８増幅用プライマーセット）の一方
の末端に、鋳型となるＤＮＡに相補的な３ヌクレオシド
を追加し、他方の末端に３個のヌクレオシドが欠失され
た変異プライマー（表２）を合成し、実施例３の方法と
同様にして多重ＰＣＲを行った（図２）。
【００４５】
【表２】
【００４６】多重ＰＣＲの結果を、図２のＡ〜Ｅに示
す。図２のＡは、変異させたプロモータプライマーセッ
トを用いた多重ＰＣＲ産物の電気泳動写真であり、図２
のＢは、変異させたエクソン１プライマーセットを用い
た多重ＰＣＲ産物の電気泳動写真であり、図２のＣは、
変形させたエクソン２プライマーセットを用いた多重Ｐ
ＣＲ産物の電気泳動写真であり、図２のＤは、変形させ
たエクソン８プライマーセットを用いた多重ＰＣＲ産物
の電気泳動写真であり、そして図２のＥは、前記変形さ
れたプライマーセットを全て用いた多重ＰＣＲ産物の電
気泳動写真である。図２のＡないしＥにおいて、レーン
１は、５０ｂｐＤＮＡラダー分子量マーカーを示し、レ
ーン２は、前記表１のプライマーセットのみを用いて多
重ＰＣＲした結果を示し、レーン３は、前記表２の変異
させたプライマーセットを用いて多重ＰＣＲした結果を
示し、そしてレーン４は、変異の有無を問わずに該当プ
ライマーセットを用いずに多重ＰＣＲを行なった結果を
示す。
す。図２のＡは、変異させたプロモータプライマーセッ
トを用いた多重ＰＣＲ産物の電気泳動写真であり、図２
のＢは、変異させたエクソン１プライマーセットを用い
た多重ＰＣＲ産物の電気泳動写真であり、図２のＣは、
変形させたエクソン２プライマーセットを用いた多重Ｐ
ＣＲ産物の電気泳動写真であり、図２のＤは、変形させ
たエクソン８プライマーセットを用いた多重ＰＣＲ産物
の電気泳動写真であり、そして図２のＥは、前記変形さ
れたプライマーセットを全て用いた多重ＰＣＲ産物の電
気泳動写真である。図２のＡないしＥにおいて、レーン
１は、５０ｂｐＤＮＡラダー分子量マーカーを示し、レ
ーン２は、前記表１のプライマーセットのみを用いて多
重ＰＣＲした結果を示し、レーン３は、前記表２の変異
させたプライマーセットを用いて多重ＰＣＲした結果を
示し、そしてレーン４は、変異の有無を問わずに該当プ
ライマーセットを用いずに多重ＰＣＲを行なった結果を
示す。
【００４７】図２のＡないしＥから見られるように、４
個の変異させたプライマーセットにより該当遺伝子部位
がいずれも増幅されることが確かめられた。
個の変異させたプライマーセットにより該当遺伝子部位
がいずれも増幅されることが確かめられた。
【００４８】実施例５：サザンブロッティングによる多
重ＰＣＲ産物の確認 実施例２及び実施例３の増幅されたＰＣＲ産物を１.８
％アガロースゲル上において電気泳動した（図１参
照）。このゲルを変性溶液（０．５ＮＮａＯＨ＋１．５
Ｍ ＮａＣｌ）において１５分間ゆっくり振りつつ、ゲ
ル上の２重ストランドＤＮＡを変性させた。この過程を
２回繰り返した後、蒸留水にてゲルを洗浄し、１５分間
中和溶液（３Ｍ ＮａＣｌ，０．５Ｍ トリス−ＨＣ
ｌ，ｐＨ ７．５）にてゆっくり振りつつゲルを２回中
和させた。次に、ゲルに存在するＤＮＡ及びナイロン膜
を２０×ＳＳＣ溶液にて１２時間反応させ、ＤＮＡをナ
イロン膜に移動させた。ナイロン膜を１２０℃において
３０分間放置またはＵＶを照射することにより交差結合
させ、蒸留水にてその膜を１ないし２分間洗浄した後に
乾燥させた。
重ＰＣＲ産物の確認 実施例２及び実施例３の増幅されたＰＣＲ産物を１.８
％アガロースゲル上において電気泳動した（図１参
照）。このゲルを変性溶液（０．５ＮＮａＯＨ＋１．５
Ｍ ＮａＣｌ）において１５分間ゆっくり振りつつ、ゲ
ル上の２重ストランドＤＮＡを変性させた。この過程を
２回繰り返した後、蒸留水にてゲルを洗浄し、１５分間
中和溶液（３Ｍ ＮａＣｌ，０．５Ｍ トリス−ＨＣ
ｌ，ｐＨ ７．５）にてゆっくり振りつつゲルを２回中
和させた。次に、ゲルに存在するＤＮＡ及びナイロン膜
を２０×ＳＳＣ溶液にて１２時間反応させ、ＤＮＡをナ
イロン膜に移動させた。ナイロン膜を１２０℃において
３０分間放置またはＵＶを照射することにより交差結合
させ、蒸留水にてその膜を１ないし２分間洗浄した後に
乾燥させた。
【００４９】前述のように、ＤＮＡ付き膜を２０ｍｌの
混成化溶液に入れ、６２℃において約２時間予混成化反
応を行い、その溶液を放棄した。次に、ＤＮＡ付き膜及
びＤＩＧ標識のプローブ５ｐｍｏｌ／ｍｌを混成化溶液
バグ１０ｍｌに入れ、６２℃において約１２時間反応さ
せた。この反応中にＤＩＧ標識のプローブは、膜にある
ＤＮＡに相補的な遺伝子部位に結合される。そして、結
合できなかったプローブを除去するために、２×洗浄用
溶液（２×ＳＳＣ＋０．１％ ＳＤＳ）にて常温で５分
間２回繰り返して洗浄を行い、０．５×洗浄用溶液
（０．５×ＳＳＣ＋０．１％ ＳＤＳ）にて６２℃で１
５分間２回繰り返し洗浄を行った。
混成化溶液に入れ、６２℃において約２時間予混成化反
応を行い、その溶液を放棄した。次に、ＤＮＡ付き膜及
びＤＩＧ標識のプローブ５ｐｍｏｌ／ｍｌを混成化溶液
バグ１０ｍｌに入れ、６２℃において約１２時間反応さ
せた。この反応中にＤＩＧ標識のプローブは、膜にある
ＤＮＡに相補的な遺伝子部位に結合される。そして、結
合できなかったプローブを除去するために、２×洗浄用
溶液（２×ＳＳＣ＋０．１％ ＳＤＳ）にて常温で５分
間２回繰り返して洗浄を行い、０．５×洗浄用溶液
（０．５×ＳＳＣ＋０．１％ ＳＤＳ）にて６２℃で１
５分間２回繰り返し洗浄を行った。
【００５０】その後、ＤＩＧに結合する抗体を入れる前
に、他の部分に抗体が付かないように２０ｍｌのブロッ
キング溶液にて３０ないし６０分間放置した後、新しい
ブロッキング溶液２０ｍｌにアルカリ性ホスファターゼ
を連結させたヒツジ抗−ＤＩＧ抗体（Ｒｏｃｈｅ社製）
を１μｌだけ添加して３０分間反応させた。続けて、洗
浄緩衝液（１００ｍＭ マレイン酸、１５０ｍＭ Ｎａ
Ｃｌ, ｐＨ ７.５（常温２０℃）、０．３％ Ｔｗｅ
ｅｎ ２０）にて１５分ずつ２回洗浄を行った。次に、
膜上にあるＤＮＡとプローブとの結合を確かめるため
に、アルカリ性ホスファターゼの基質であるＣＤＰ−ス
ター（ＣＤＰ−Ｓｔａｒ）を検出緩衝溶液に１：１００
の比率にて混ぜたもので膜を５分間処理した後、Ｘ−線
フィルムに感光させた。感光されたフィルムを現像して
プローブが付いた位置を確かめた。その結果を図３に示
す。図３において、レーン１３は、ＤＩＧにて標識され
た分子量マーカーを示し、レーン２はプロモータ、レー
ン３はエクソン１、レーン４はエクソン２、レーン５は
エクソン３、レーン６はエクソン４、レーン７はエクソ
ン５、レーン８はエクソン６、レーン９はエクソン７、
レーン１０はエクソン８及び９、レーン１１はエクソン
１０部分を各々増幅した単一ＰＣＲ産物を示し、そして
レーン１２は多重ＰＣＲ産物を示す。
に、他の部分に抗体が付かないように２０ｍｌのブロッ
キング溶液にて３０ないし６０分間放置した後、新しい
ブロッキング溶液２０ｍｌにアルカリ性ホスファターゼ
を連結させたヒツジ抗−ＤＩＧ抗体（Ｒｏｃｈｅ社製）
を１μｌだけ添加して３０分間反応させた。続けて、洗
浄緩衝液（１００ｍＭ マレイン酸、１５０ｍＭ Ｎａ
Ｃｌ, ｐＨ ７.５（常温２０℃）、０．３％ Ｔｗｅ
ｅｎ ２０）にて１５分ずつ２回洗浄を行った。次に、
膜上にあるＤＮＡとプローブとの結合を確かめるため
に、アルカリ性ホスファターゼの基質であるＣＤＰ−ス
ター（ＣＤＰ−Ｓｔａｒ）を検出緩衝溶液に１：１００
の比率にて混ぜたもので膜を５分間処理した後、Ｘ−線
フィルムに感光させた。感光されたフィルムを現像して
プローブが付いた位置を確かめた。その結果を図３に示
す。図３において、レーン１３は、ＤＩＧにて標識され
た分子量マーカーを示し、レーン２はプロモータ、レー
ン３はエクソン１、レーン４はエクソン２、レーン５は
エクソン３、レーン６はエクソン４、レーン７はエクソ
ン５、レーン８はエクソン６、レーン９はエクソン７、
レーン１０はエクソン８及び９、レーン１１はエクソン
１０部分を各々増幅した単一ＰＣＲ産物を示し、そして
レーン１２は多重ＰＣＲ産物を示す。
【００５１】図３に示すように、単一ＰＣＲ及び多重Ｐ
ＣＲの同じ位置にプローブが付き、増幅された産物が同
じものであることが分かった。
ＣＲの同じ位置にプローブが付き、増幅された産物が同
じものであることが分かった。
【００５２】実施例６：配列分析を通じた多重ＰＣＲ産
物の確認 実施例３の方法と同様にして多重ＰＣＲ産物を増幅させ
た後、１.８％アガロースゲル上で各産物を展開させ、
各々のＤＮＡバンドを切り出してゲル抽出キットを用い
てＤＮＡを精製した。このようにして精製されたＤＮＡ
をＡＢＩ３７００を用いて塩基配列を確かめ、ヒトＨＮ
Ｆ−１α遺伝子の該当配列と比較分析した（図４）。
物の確認 実施例３の方法と同様にして多重ＰＣＲ産物を増幅させ
た後、１.８％アガロースゲル上で各産物を展開させ、
各々のＤＮＡバンドを切り出してゲル抽出キットを用い
てＤＮＡを精製した。このようにして精製されたＤＮＡ
をＡＢＩ３７００を用いて塩基配列を確かめ、ヒトＨＮ
Ｆ−１α遺伝子の該当配列と比較分析した（図４）。
【００５３】図４は、プロモータ増幅型プライマーセッ
トを用いてＰＣＲした結果を示している。配列番号３及
び配列番号４を含むプライマーセットの増幅産物に該当
するＰＣＲ増幅産物を分離し、自動配列分析方法を用い
て塩基配列を分析した。得られたヌクレオチド配列（配
列番号３１）（“クエリー”と呼ぶ。）をLagergene(DN
Astar inc.)というプログラムによってヒトＨＮＦ−１
α遺伝子プロモータの知られた配列（“プロモータ”と
呼ぶ。）と比較した（図４）。図４に示すように、前記
ＰＣＲ産物はＨＮＦ−１α遺伝子プロモータの知られた
配列と完全な配列相同性を示した。整列に用いられたギ
ャップ頻度は０％であった。プロモータ以外の他のエク
ソンに該当するＰＣＲ産物を同じ方法により配列分析し
た。各ＰＣＲ産物は知られた該当エクソン配列と９５％
以上の相同性を示した。
トを用いてＰＣＲした結果を示している。配列番号３及
び配列番号４を含むプライマーセットの増幅産物に該当
するＰＣＲ増幅産物を分離し、自動配列分析方法を用い
て塩基配列を分析した。得られたヌクレオチド配列（配
列番号３１）（“クエリー”と呼ぶ。）をLagergene(DN
Astar inc.)というプログラムによってヒトＨＮＦ−１
α遺伝子プロモータの知られた配列（“プロモータ”と
呼ぶ。）と比較した（図４）。図４に示すように、前記
ＰＣＲ産物はＨＮＦ−１α遺伝子プロモータの知られた
配列と完全な配列相同性を示した。整列に用いられたギ
ャップ頻度は０％であった。プロモータ以外の他のエク
ソンに該当するＰＣＲ産物を同じ方法により配列分析し
た。各ＰＣＲ産物は知られた該当エクソン配列と９５％
以上の相同性を示した。
【００５４】実施例７：多重ＰＣＲ用反応溶液の安定性
の検査 ゲノムＤＮＡを除いた実施例３において用いられた多重
ＰＣＲ用反応溶液を、安定性を検査するために大量製造
した。一回のＰＣＲに必要な４９μｌの反応溶液を複数
の０．２ｍｌ−ＰＣＲチューブに分画した。前記反応溶
液を含むチューブの一部は−２０℃で、一部は−７０℃
で３ケ月間保存した。１日、３日、４日、１週間、２週
間、３週間及び１２週間後に各チューブの反応溶液を用
いて多重ＰＣＲを行った。
の検査 ゲノムＤＮＡを除いた実施例３において用いられた多重
ＰＣＲ用反応溶液を、安定性を検査するために大量製造
した。一回のＰＣＲに必要な４９μｌの反応溶液を複数
の０．２ｍｌ−ＰＣＲチューブに分画した。前記反応溶
液を含むチューブの一部は−２０℃で、一部は−７０℃
で３ケ月間保存した。１日、３日、４日、１週間、２週
間、３週間及び１２週間後に各チューブの反応溶液を用
いて多重ＰＣＲを行った。
【００５５】図５に、多重ＰＣＲの結果を示す。図５に
おいて、最初のレーンは分子量マーカーであり、レーン
２は−２０℃における保存反応溶液を用いて得られた多
重ＰＣＲ産物であり、レーン３は−７０℃における保存
反応溶液を用いて得られた多重ＰＣＲ産物である。図５
に示すように、本発明に用いた多重ＰＣＲ用反応溶液
は、−２０℃または−７０℃において安定的であった。
おいて、最初のレーンは分子量マーカーであり、レーン
２は−２０℃における保存反応溶液を用いて得られた多
重ＰＣＲ産物であり、レーン３は−７０℃における保存
反応溶液を用いて得られた多重ＰＣＲ産物である。図５
に示すように、本発明に用いた多重ＰＣＲ用反応溶液
は、−２０℃または−７０℃において安定的であった。
【００５６】実施例８：様々なＰＣＲ機器を用いた遺伝
子増幅 様々なＰＣＲ装置を用い、実施例３の方法に従い多重Ｐ
ＣＲを行った。増幅された多重ＰＣＲ産物は、ＰＣＲ装
置によるＰＣＲ産物の依存性を検査するために１．８％
アガロースゲルで電気泳動した（図６ＡないしＣ）。
子増幅 様々なＰＣＲ装置を用い、実施例３の方法に従い多重Ｐ
ＣＲを行った。増幅された多重ＰＣＲ産物は、ＰＣＲ装
置によるＰＣＲ産物の依存性を検査するために１．８％
アガロースゲルで電気泳動した（図６ＡないしＣ）。
【００５７】図６Ａは、ＰＴＣ−１００（ＭＪリサーチ
社製）を用いて増幅した多重ＰＣＲ産物を示し、図６Ｂ
は、GeneAmp 9700（アプライド・バイオシステム社製）
を用いて増幅した多重ＰＣＲ産物を示し、そして図６Ｃ
は、Mult-Block System(ThermoHybaidCo.)を用いて増幅
した多重ＰＣＲ産物を示す。
社製）を用いて増幅した多重ＰＣＲ産物を示し、図６Ｂ
は、GeneAmp 9700（アプライド・バイオシステム社製）
を用いて増幅した多重ＰＣＲ産物を示し、そして図６Ｃ
は、Mult-Block System(ThermoHybaidCo.)を用いて増幅
した多重ＰＣＲ産物を示す。
【００５８】図６Ａないし図６Ｃにおいて、レーン１は
分子量マーカーである５０ｂｐのＤＮＡラダーであり、
レーン２は表１に示されたプライマーセットを用いて得
られた多重ＰＣＲ産物である。図中、矢印は各々３５０
ｂｐ及び５０ｂｐを示す。
分子量マーカーである５０ｂｐのＤＮＡラダーであり、
レーン２は表１に示されたプライマーセットを用いて得
られた多重ＰＣＲ産物である。図中、矢印は各々３５０
ｂｐ及び５０ｂｐを示す。
【００５９】図６に示すように、ＰＣＲ装置に関係なく
類似したＰＣＲ産物の様相が得られ、これは、本発明の
プライマーセットを用いて得られたＰＣＲ産物が安定的
でかつ経済的であるということを意味する。
類似したＰＣＲ産物の様相が得られ、これは、本発明の
プライマーセットを用いて得られたＰＣＲ産物が安定的
でかつ経済的であるということを意味する。
【００６０】
【発明の効果】本発明によるヒトＨＮＦ−１α遺伝子増
幅用プライマープールは、多重ＰＣＲにより該当遺伝子
を効果的に増幅した。特に、本発明の多重ＰＣＲ用プラ
イマープールはＰＣＲ反応に必要な試料が相対的に少な
く、ＤＮＡチップを用いた疾病関連の遺伝子の分析法に
有用である。
幅用プライマープールは、多重ＰＣＲにより該当遺伝子
を効果的に増幅した。特に、本発明の多重ＰＣＲ用プラ
イマープールはＰＣＲ反応に必要な試料が相対的に少な
く、ＤＮＡチップを用いた疾病関連の遺伝子の分析法に
有用である。
【００６１】本発明のプライマープールはヒトＨＮＦ−
１α遺伝子の塩基配列分析用または増幅用キットに有効
である。
１α遺伝子の塩基配列分析用または増幅用キットに有効
である。
【００６２】
【配列表】
<110> 三星電子株式会社
<120> MULTIPLEX PCR PRIMER SET FOR HUMAN HNF-1 ALPHA GENE AMPLIFICATI
ON
<130> 2002Ｐ775
<150> KR2001-080909
<151> 2001-12-18
<160> 31
<170> PatentIn 1.71
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Bacteriophage T7
<400> 1
taatacgact cactataggg
20
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> Bacteriophage T3
<400> 2
gtaaccctca ctaaaggga
19
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer for amplifying promoter of MODY3 gene
<400> 3
tggccgtgag catcctctgc c
21
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer for amplifying promoter of MODY3 gene
<400> 4
gcgtgggttg cgtttgcctg c
21
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer for amplifying exon1 of MODY3 gene
<400> 5
cgtggccctg tggcagccga
20
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer for amplifying exon1 of MODY3 gene
<400> 6
gggctcgtta ggagctgagg g
21
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer for amplifying exon2 of MODY3 gene
<400> 7
cccttgctga gcagatcccg tc
22
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer for amplifying exon2 of MODY3 gene
<400> 8
gggatggtga agcttccagc c
21
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer for amplifying exon3 of MODY3 gene
<400> 9
gcaaggtcag gggaatggac
20
<210> 10
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer for amplifying exon3 of MODY3 gene
<400> 10
cgccgttgta cctattgcac tcc
23
<210> 11
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer for amplifying exon4 of MODY3 gene
<400> 11
ggctcatggg tggctatttc tgc
23
<210> 12
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer for amplifying exon4 of MODY3 gene
<400> 12
cgtgtccctt gtccccacat acc
23
<210> 13
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer for amplifying exon5 of MODY3 gene
<400> 13
tgctgaggca ggacactgct tc
22
<210> 14
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer for amplifying exon5 of MODY3 gene
<400> 14
tacaagcaag gacactcacc agc
23
<210> 15
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer for amplifying exon6 of MODY3 gene
<400> 15
cccggacaca gcttggcttc c
21
<210> 16
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer for amplifying exon6 of MODY3 gene
<400> 16
atccccacca gcttaccgat gac
23
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer for amplifying exon7 of MODY3 gene
<400> 17
caggcctggc ctccacgcag
20
<210> 18
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer for amplifying exon7 of MODY3 gene
<400> 18
ggggctctgc agctgagcca t
21
<210> 19
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer for amplifying exon8 and 9 of MODY3 gene
<400> 19
ggcccagtac acccacacgg g
21
<210> 20
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer for amplifying exon8 and 9 of MODY3 gene
<400> 20
gggcagggac agtaagggag g
21
<210> 21
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer for amplifying exon10 of MODY3 gene
<400> 21
gccttgtttg cctctgcagt g
21
<210> 22
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer for amplifying exon10 of MODY3 gene
<400> 22
ggccatctgg gtggagatga ag
22
<210> 23
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> modified forward primer for amplifying promoter of MODY3 gene
<400> 23
ccgtgagcat cctctgccct t
21
<210> 24
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> modified reverse primer for amplifying promoter of MODY3 gene
<400> 24
accgcgtggg ttgcgtttgc c
21
<210> 25
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> modified forward primer for amplifying exon1 of MODY3 gene
<400> 25
ccgcgtggcc ctgtggcagc
20
<210> 26
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> modified reverse primer for amplifying exon1 of MODY3 gene
<400> 26
ctcgttagga gctgaggggg g
21
<210> 27
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> modified forward primer for amplifying exon2 of MODY3 gene
<400> 27
ttgctgagca gatcccgtcc tt
22
<210> 28
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> modified reverse primer for amplifying exon2 of MODY3 gene
<400> 28
atggggatgg tgaagcttcc a
21
<210> 29
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> modified forward primer for amplifying exon8 of MODY3 gene
<400> 29
ggtggcccag tacacccaca c
21
<210> 30
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> modified reverse primer for amplifying exon8 of MODY3 gene
<400> 30
cagggacagt aagggagggg g
21
<210> 31
<211> 434
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 31
ctcctgtctc agcatgatgc ccctacaagg ttctttcggg ggtgggaccc aacgctgctc
60
tcctgatggc ctccctggct cccagcacct tccatcccag ctgctcaggg cccctcacct
120
gcgcctcccc caccctcccc tctgcccact cccatcgcag gccatagctc cctgtccctc
180
tccgctgcca tgaggcctgc actttgcagg gctgaagtcc aaagttcagt cccttcgcta
240
agcacacgga taaatatgaa ccttggagaa tttccccagc tccaatgtaa acagaacagg
300
caggggccct gattcacggg ccgctggggc cagggttggg ggttgggggt gcccacaggg
360
cttggctagt ggggttttgg gggggcagtg ggtgcaagga gtttggtttg tgtctgccgg
420
ccggcaggca aacg
434
【図１】 ヒトＨＮＦ−１α遺伝子のエクソン１ないし
１０をシンプルＰＣＲ及び多重ＰＣＲでも増幅したＰＣ
Ｒ産物の電気泳動の結果を示す図である。
１０をシンプルＰＣＲ及び多重ＰＣＲでも増幅したＰＣ
Ｒ産物の電気泳動の結果を示す図である。
【図２】 ＡないしＥは、変異プライマーセットからな
るプライマープールを用いて得られた多重ＰＣＲ産物の
電気泳動写真である。
るプライマープールを用いて得られた多重ＰＣＲ産物の
電気泳動写真である。
【図３】 エクソン別のプライマーセットをプローブと
して用いた単一ＰＣＲ産物及び多重ＰＣＲ産物のサザン
ブロット写真である。
して用いた単一ＰＣＲ産物及び多重ＰＣＲ産物のサザン
ブロット写真である。
【図４】 プロモータ増幅用プライマーセットを用いて
得られたＰＣＲ産物に該当する単一ＰＣＲ産物の塩基配
列と公知のヒトＨＮＦ−１α遺伝子のプロモータ塩基配
列とを比較して示す図である。
得られたＰＣＲ産物に該当する単一ＰＣＲ産物の塩基配
列と公知のヒトＨＮＦ−１α遺伝子のプロモータ塩基配
列とを比較して示す図である。
【図５】 多重ＰＣＲ反応溶液の安定性を調べた結果を
示すアガロースゲル電気泳動写真である。
示すアガロースゲル電気泳動写真である。
【図６】 ＡないしＣは、ＰＣＲ増幅装置による多重Ｐ
ＣＲ産物の様子を示す電気泳動写真である。
ＣＲ産物の様子を示す電気泳動写真である。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(72)発明者 李 貞 男
大韓民国大田広域市儒城区田民洞462−４
番地 世宗アパート101棟803号
Ｆターム(参考） 4B024 AA11 CA09 HA14
4B063 QA18 QQ42 QQ52 QR32 QR40
QR56 QR62 QS25 QS34
Claims (14)
- 【請求項１】 次のプライマーセットよりなる群から選
ばれるヒトＨＮＦ−１α遺伝子の１以上の標的配列増幅
用の１以上のＰＣＲプライマーセットを含むヒトＨＮＦ
−１α遺伝子の標的配列増幅用プライマープール： （ａ）配列番号３の塩基配列を有するオリゴヌクレオチ
ドまたはその変異オリゴヌクレオチド及び配列番号４の
塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはその変異オ
リゴヌクレオチドを含むプライマーセットと、 （ｂ）配列番号５の塩基配列を有するオリゴヌクレオチ
ドまたはその変異オリゴヌクレオチド及び配列番号６の
塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはその変異オ
リゴヌクレオチドを含むプライマーセットと、 （ｃ）配列番号７の塩基配列を有するオリゴヌクレオチ
ドまたはその変異オリゴヌクレオチド及び配列番号８の
塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはその変異オ
リゴヌクレオチドを含むプライマーセットと、 （ｄ）配列番号９の塩基配列を有するオリゴヌクレオチ
ドまたはその変異オリゴヌクレオチド及び配列番号１０
の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはその変異
オリゴヌクレオチドを含むプライマーセットと、 （ｅ）配列番号１１の塩基配列を有するオリゴヌクレオ
チドまたはその変異オリゴヌクレオチド及び配列番号１
２の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはその変
異オリゴヌクレオチドを含むプライマーセットと、 （ｆ）配列番号１３の塩基配列を有するオリゴヌクレオ
チドまたはその変異オリゴヌクレオチド及び配列番号１
４の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはその変
異オリゴヌクレオチドを含むプライマーセットと、 （ｇ）配列番号１５の塩基配列を有するオリゴヌクレオ
チドまたはその変異オリゴヌクレオチド及び配列番号１
６の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはその変
異オリゴヌクレオチドを含むプライマーセットと、 （ｈ）配列番号１７の塩基配列を有するオリゴヌクレオ
チドまたはその変異オリゴヌクレオチド及び配列番号１
８の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはその変
異オリゴヌクレオチドを含むプライマーセットと、 （ｉ）配列番号１９の塩基配列を有するオリゴヌクレオ
チドまたはその変異オリゴヌクレオチド及び配列番号２
０の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはその変
異オリゴヌクレオチドを含むプライマーセットと、 （ｊ）配列番号２１の塩基配列を有するオリゴヌクレオ
チドまたはその変異オリゴヌクレオチド及び配列番号２
２の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはその変
異オリゴヌクレオチドを含むプライマーセット：ここ
で、前記変異オリゴヌクレオチドは、該当オリゴヌクレ
オチドの３’末端、５’末端または３’末端及び５’末
端の両方に連結または欠失された１ないし３個のさらな
るヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドである。 - 【請求項２】 １以上のプライマーが５’末端にＴ７プ
ロモーター配列またはＴ３プロモーター配列を含む請求
項１に記載のプライマープール。 - 【請求項３】 配列番号３、５、７、９、１１、１３、
１５、１７、１９及び２１の配列を有する１以上のプラ
イマーが５’末端にＴ７プロモーター配列を含み、配列
番号４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０
及び２２の配列を有する１以上のプライマーが５’末端
にＴ３プロモーターを含む請求項１に記載のプライマー
プール。 - 【請求項４】 ヒトＨＮＦ−１α遺伝子の１以上の標的
配列を次のプライマーセットよりなる群から選ばれる１
以上のＰＣＲプライマーセットを用いてＰＣＲする段階
を含むヒトＨＮＦ−１α遺伝子の１以上の標的配列を増
幅する方法： （ａ）配列番号３の塩基配列を有するオリゴヌクレオチ
ドまたはその変異オリゴヌクレオチド及び配列番号４の
塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはその変異オ
リゴヌクレオチドを含むプライマーセットと、 （ｂ）配列番号５の塩基配列を有するオリゴヌクレオチ
ドまたはその変異オリゴヌクレオチド及び配列番号６の
塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはその変異オ
リゴヌクレオチドを含むプライマーセットと、 （ｃ）配列番号７の塩基配列を有するオリゴヌクレオチ
ドまたはその変異オリゴヌクレオチド及び配列番号８の
塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはその変異オ
リゴヌクレオチドを含むプライマーセットと、 （ｄ）配列番号９の塩基配列を有するオリゴヌクレオチ
ドまたはその変異オリゴヌクレオチド及び配列番号１０
の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはその変異
オリゴヌクレオチドを含むプライマーセットと、 （ｅ）配列番号１１の塩基配列を有するオリゴヌクレオ
チドまたはその変異オリゴヌクレオチド及び配列番号１
２の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはその変
異オリゴヌクレオチドを含むプライマーセットと、 （ｆ）配列番号１３の塩基配列を有するオリゴヌクレオ
チドまたはその変異オリゴヌクレオチド及び配列番号１
４の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはその変
異オリゴヌクレオチドを含むプライマーセットと、 （ｇ）配列番号１５の塩基配列を有するオリゴヌクレオ
チドまたはその変異オリゴヌクレオチド及び配列番号１
６の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはその変
異オリゴヌクレオチドを含むプライマーセットと、 （ｈ）配列番号１７の塩基配列を有するオリゴヌクレオ
チドまたはその変異オリゴヌクレオチド及び配列番号１
８の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはその変
異オリゴヌクレオチドを含むプライマーセットと、 （ｉ）配列番号１９の塩基配列を有するオリゴヌクレオ
チドまたはその変異オリゴヌクレオチド及び配列番号２
０の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはその変
異オリゴヌクレオチドを含むプライマーセットと、 （ｊ）配列番号２１の塩基配列を有するオリゴヌクレオ
チドまたはその変異オリゴヌクレオチド及び配列番号２
２の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはその変
異オリゴヌクレオチドを含むプライマーセット：ここ
で、前記変異オリゴヌクレオチドは、該当オリゴヌクレ
オチドの３’末端、５’末端または３’末端及び５’末
端の両方に連結または欠失された１ないし３個のさらな
るヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドである。 - 【請求項５】 １以上のプライマーが５’末端にＴ７プ
ロモーター配列またはＴ３プロモーター配列を含む請求
項４に記載の方法。 - 【請求項６】 配列番号３、５、７、９、１１、１３、
１５、１７、１９及び２１の配列を有する１以上のプラ
イマーが５’末端にＴ７プロモーター配列を含み、配列
番号４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０
及び２２の配列を有する１以上のプライマーが５’末端
にＴ３プロモーターを含む請求項４に記載の方法。 - 【請求項７】 ０．１μＭ〜１μＭ濃度の各プライマー
及び１００ｎｇ〜１μｇの鋳型ＤＮＡを混合する段階を
さらに含む請求項４に記載の方法。 - 【請求項８】 前記ＰＣＲは初期変性１〜５分（９０〜
９８℃）、変性１０秒〜１分（９０〜９８℃）、アニー
リング５秒〜３分（６０〜６５℃）、延長５秒〜５分
（７０〜７５℃）、最終延長１〜１０分（７０〜７５
℃）の反応条件下で行う請求項４に記載の方法。 - 【請求項９】 ヒトＨＮＦ−１α遺伝子の１以上の標的
ヌクレオチド配列を次のプライマーセットよりなる群か
ら選ばれる１以上のＰＣＲプライマーセットを用いて配
列分析する方法： （ａ）配列番号３の塩基配列を有するオリゴヌクレオチ
ドまたはその変異オリゴヌクレオチド及び配列番号４の
塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはその変異オ
リゴヌクレオチドを含むプライマーセットと、 （ｂ）配列番号５の塩基配列を有するオリゴヌクレオチ
ドまたはその変異オリゴヌクレオチド及び配列番号６の
塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはその変異オ
リゴヌクレオチドを含むプライマーセットと、 （ｃ）配列番号７の塩基配列を有するオリゴヌクレオチ
ドまたはその変異オリゴヌクレオチド及び配列番号８の
塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはその変異オ
リゴヌクレオチドを含むプライマーセットと、 （ｄ）配列番号９の塩基配列を有するオリゴヌクレオチ
ドまたはその変異オリゴヌクレオチド及び配列番号１０
の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはその変異
オリゴヌクレオチドを含むプライマーセットと、 （ｅ）配列番号１１の塩基配列を有するオリゴヌクレオ
チドまたはその変異オリゴヌクレオチド及び配列番号１
２の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはその変
異オリゴヌクレオチドを含むプライマーセットと、 （ｆ）配列番号１３の塩基配列を有するオリゴヌクレオ
チドまたはその変異オリゴヌクレオチド及び配列番号１
４の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはその変
異オリゴヌクレオチドを含むプライマーセットと、 （ｇ）配列番号１５の塩基配列を有するオリゴヌクレオ
チドまたはその変異オリゴヌクレオチド及び配列番号１
６の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはその変
異オリゴヌクレオチドを含むプライマーセットと、 （ｈ）配列番号１７の塩基配列を有するオリゴヌクレオ
チドまたはその変異オリゴヌクレオチド及び配列番号１
８の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはその変
異オリゴヌクレオチドを含むプライマーセットと、 （ｉ）配列番号１９の塩基配列を有するオリゴヌクレオ
チドまたはその変異オリゴヌクレオチド及び配列番号２
０の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはその変
異オリゴヌクレオチドを含むプライマーセットと、 （ｊ）配列番号２１の塩基配列を有するオリゴヌクレオ
チドまたはその変異オリゴヌクレオチド及び配列番号２
２の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはその変
異オリゴヌクレオチドを含むプライマーセット：ここ
で、前記変異オリゴヌクレオチドは、該当オリゴヌクレ
オチドの３’末端、５’末端または３’末端及び５’末
端の両方に連結または欠失された１ないし３個のさらな
るヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドである。 - 【請求項１０】 １以上のプライマーが５’末端にＴ７
プロモーター配列またはＴ３プロモーター配列を含む請
求項９に記載の方法。 - 【請求項１１】 配列番号３、５、７、９、１１、１
３、１５、１７、１９及び２１の配列を有する１以上の
プライマーが５’末端にＴ７プロモーター配列を含み、
配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、
２０及び２２の配列を有する１以上のプライマーが５’
末端にＴ３プロモーターを含む請求項９に記載の方法。 - 【請求項１２】 請求項１に記載のプライマープールを
含む、ヒトＨＮＦ−１α遺伝子の標的配列の増幅用キッ
ト。 - 【請求項１３】 １以上のプライマーが５’末端にＴ７
プロモーター配列またはＴ３プロモーター配列を含む請
求項１２に記載のキット。 - 【請求項１４】 配列番号３、５、７、９、１１、１
３、１５、１７、１９及び２１の配列を有する１以上の
プライマーが５’末端にＴ７プロモーター配列を含み、
配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、
２０及び２２の配列を有する１以上のプライマーが５’
末端にＴ３プロモーターを含む請求項１２に記載のキッ
ト。
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