JP2004113136A - 非乳頭状腎細胞がんの感受性と相関するmmp−1プロモーターのsnpを用いた腎細胞がんの発症リスクを予測する分子レベルでの検査方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】MMP−1は腫瘍細胞の浸潤や転移と相関しており、転写のレベルに影響するMMP−1プロモーターのポリモルフィズムと相関している。本発明は、腎細胞がんの発症リスクとこのポリモルフィズムとの相関を明らかにし、腎細胞がんの発症リスクを予測する分子レベルでの検査方法を確立することが課題である。
【解決手段】本発明では、転写のレベルに影響するMMP−1プロモーターのポリモルフィズムと腎細胞がんの発症リスクとの相関に着目し、非乳頭状腎細胞がんの患者群と健康なボランティア群との間で、MMP−1遺伝子のプロモーター ポリモルフィズムに有意差があるか否かを調査した。
【解決手段】本発明では、転写のレベルに影響するMMP−1プロモーターのポリモルフィズムと腎細胞がんの発症リスクとの相関に着目し、非乳頭状腎細胞がんの患者群と健康なボランティア群との間で、MMP−1遺伝子のプロモーター ポリモルフィズムに有意差があるか否かを調査した。
Description
【0001】
【発明の属する技術分野】
非乳頭状腎細胞がんの感受性と相関するMMP−1プロモーターのSNPを用いた、腎細胞がんまたは非乳頭状腎細胞がんの発症リスクを予測する分子レベルでの検査方法に関する。
【0002】
【従来の技術】
Case−control study により大腸がん患者集団と正常対照群とを比較解析することにより、大腸がんの原因遺伝子の single nucleotide polymorphism(SNP)の内から、モンゴロイド特に日本人を対象とした、大腸がんの発症、浸潤、転移のし易さを判定できる検査方法の確立に寄与し得るSNPとして、matrix metalloproteinase−1(MMP−1)遺伝子と matrix metalloproteinase−3(MMP−3)遺伝子のSNPが適していることが知られている。MMP−1およびMMP−3遺伝子のSNP解析結果からは、発症前診断に利用することにより、日本人における大腸発がんのリスクを推定することが可能となっている(特願2002−40049)。腎細胞がん(renal cell carcinoma ; RCC)は、泌尿器の悪性腫瘍の原因としては3番目に多く、また成人の悪性腫瘍の約2%を占めている(非特許文献1)。超音波、CTおよびMRIのような非侵襲イメージング法が広く用いられるようになって、偶然にRCCという診断が下されるケースが、着実に増加している(非特許文献2)。これらスクリーニング用の検出ツールの改良にもかかわらず、生命を脅かすRCC(局所浸潤性腫瘍または転移性腫瘍)の比率は、減少してはいない(非特許文献3)。RCC患者の約25%は、プレゼンテーションの時点で転移性の疾患を有しているが、転移性の傷害の治療はほとんど成功しないか、あるいはリスク患者における遠方への転移の予防もできない状態である(非特許文献4)。がんのステージIからIVのそれぞれにおける5年生存率は、91%、74%、67%および32%であることが報告されている(非特許文献2)。INFαの間歇的な筋肉内注射は、IL−2併用の有無にかかわらず、転移性RCC治療のゴールドスタンダードであり、患者の約20%が、この治療法の恩恵を受けているに過ぎない(特許文献5−非特許文献9)。この事実が、遺伝子診断を含めた新規なスクリーニングシステムが、RCC早期発見のために必須であることを示している。
【0003】
【非特許文献1】Greenlee,R.T.,Murray,T.,Bolden,S.,Wingo,P.A Cancer statistics, 2000.CA. Cancer J Clin. 50: 7, 2000.
【非特許文献2】Allan, J.P., Amnon, Z., Arie, S.B.The changingnatural history of renal cell carcinoma. J.Urol. 166:1611−1623,2001.
【非特許文献3】Hock, L.M., Lynch, J., and Balaji, K.C. Increasing incidence of all stages of kidney cancer in the last 2 decades in the United States: an analysis of surveillance, epidemiology and end results program data. J.Urol, 167:57−60,2002.
【非特許文献4】Ritchie, A.W., Chisholm, G.D. The natural history of renal cell carcinoma. Semin Oncol.10: 390−400, 1983.
【非特許文献5】Kirkwood, J.M., Harris, J.E., Vera, R., Sandler, S., Fischer, D.S., Khandekar, J., Ernstoff, M.S., Gordon, L., Lutes, R., Bonomi, P., Lytton, B., Cobleigh, M., Taylor,S.J. A randomized studyof low and high doses of leukocyteα−interferon in metastatic renal cell carcinoma: The American Cancer Society Collaborative Trial. Cancer Res. 45: 863−871,1985.
【非特許文献6】Figlin, R.A., Abi−Aad, A.S., Bellderrun, A., deKernion, J.B. The role of interferon and Interleukin−2 in the immunotherapeutic approach to renal cell carcinoma. Semin Oncol, 18:102−107,1991.
【非特許文献7】Fossa, S.D., Kramar, A., Droz, J.P., Prognostic factors and survival in patients with metastatic renal cell carcinoma treated with chemotherapy or interferon−alpha. Eur J Cancer. 30:1310−1314,1994.
【非特許文献8】Canobbio, L., Rubagotti, A., Miglietta, L., Cannata, D., Curotto, A., Amoroso, D., Boccado, F. Prognostic factors for survival in patients with advanced renal cell carcinoma treated with interleukin−2 and interferon−alpha. J.Cancer Res. Clin. Oncol.121: 753−756,1995.
【非特許文献9】Gratama, J.W., Schmitz, P.I., Goey, S.H., Lamers, C.H., Stoter, G., Bolhuis, R.L. Modulaction of immune parameters in patients with metastatic renal−cell cancer Receiving combination immunotherapy (IL−2, IFN alpha and autologous IL−2−activated lymphocytes). Int J Cancer.65: 152−156,1996.
【0004】
【発明が解決しようとする課題】
MMP−1は腫瘍細胞の浸潤や転移と相関しており、転写のレベルに影響するMMP−1プロモーターのポリモルフィズムと相関している。本発明は、腎細胞がんの発症リスクとこのポリモルフィズムとの相関を明らかにし、腎細胞がんの発症リスクを予測する分子レベルでの検査方法を確立することが課題である。
【0005】
【課題を解決するための手段】
腫瘍の浸潤と転移のプロセスは、腫瘍細胞の周囲の細胞外マトリックス(extracellular matrix ; ECM)や結合組織の分解または切断を必要とする(Hart,I. R. and Saini, A. Biology of tumor metastasis. Lancet, 339:1453−1457,1992.;Kohn, E. C. and Liotta, L. A. Molecular insights into cancer invasion: strategies for prevention and intervention. Cancer Res., 55: 1856−1862, 1995.)。MMPは、一般的に、ECMや基底膜コンポーメントを分解することができる(Chambers, A.F., and Matrisian, L.M. Changing views of the role of matrix metalloproteinases in metastasis. J.Natl.Cancer Inst. (Bethesda), 89: 1260−1270,1997)。染色体11q22に位置するMMP−1遺伝子は、種々の腫瘍細胞で発現されているとともに、正常細胞( stromal fibroblasts , macrophages , endothelial cells , epithelial cells )において最も広く発現している(Zhu, Y., Spitz, M. R., Lei, L., Mills, G, B., and Wu, X. A single nucleotide Polymorphism in the matrix metalloproteinase−1 promoter enhances lung cancer susceptibility. Cancer Res., 61:7825−7829,2001;Nishioka, Y., Kobayashi, K., Sagae, S., Ishioka, S., Nishikawa, A., Matsushima, M., Kanamori, Y., Minaguchi, T., Nakamura, Y., Tokino, T., and Kudo, R. A single nucleotide polymorphism in the matrix metalloproteinase−1 promoter in endometrial carcinoma. Jpn. J.Cancer Res., 91:612−615, 2000.;Stetler−Stevenson, W. G.,Liotta, L. A., and Kleiner, D. E. Extracellular matrix 6: role of matrix metalloproteinases in tumor invasion and metastasis. FASEB J., 7:1434−1441, 1993;Brinkerhoff, C. E., Rutter, J. L., and Benbow, U. Interstitial collagenases as markers of tumorprogression. Clin. Cancer Res., 6:4823−4830, 2000.)。Murray らは、結腸直腸がんや食道がんの予後の悪さとMMP−1の発現との相関を示した(Murray, G. I., Duncan, M. E., Oneil, P., Melvin, W. T. and Forthergill, J. E. Matrix metalloproteinase−1 is associated with poor prognosis in colorectal cancer. Nat. Med., 2:461−462, 1996.;Murray, G. I., Duncan, M. E., Oneil, P., Mckay, J. A., Melvin, W. T. and Forthergill, J. E. Matrix metalloproteinase−1 is associated with poor prognosis in oesophagial cancer. J.Pathol. 185:256−261, 1998.)。
【0006】
最近の文献は、MMP−1プロモーター領域の −1607 bp におけるグアニン挿入ポリモルフィズム(2Gアリル)によって、Ets転写因子の結合サイトにおけるコア認識配列である5’‐GGA‐3’配列(Rutter, J. L., Mitchell, T. I., Buttice, G., Meyers, J., Gusella, J. F., Ozelius, L.J., and Brinckerhoff, C. E. A single nucleotide polymorphism in the matrix metalloproteinase−1 promoter creates an Ets binding site and augments transcription. Cancer Res., 58: 5321−5325, 1998.)が生ずることを報告している(Kanamori, Y., Matsushima, M., Minaguchi, T., Kobayashi, K., Sagae, S., Kudo, R., Terakawa, N., and Nakamura, Y. Correlation between expression of the matrix Metalloproteinase−1 gene in ovarian cancer and insertion/deletion polymorphism in Its promoter region. Cancer Res., 59: 4225−4227, 1999.;Graves, B.J. Inner workings of a transcription factor partnership. Science (Washington DC), 279: 1000−1001. 1998;Buttice, G., Duterque−Coquillaud, M., Basuyaux, J.P., Carrere, S., Kurkinen, M., and Stehelin, D.Erg, an Ets−family member, differentially regulates human collagenase 1(MMP−1) and stromelysin1 (MMP3) gene expression by physically interacting with theFos/Jun complex. Oncogene, 13:2297−2306, 1996;.Basuyaux, J. P., Ferreira, E., Stehelin, D., and Buttice, G. The Ets transcription factors interact with each other and with the c−Fos/c−Jun complex via distinct protein domains in a DNA−dependent and −independent manner. J. Biol. Chem., 272: 26188−26195, 1997;Ye, S., Dhillon, S., Turner, S. J., Bateman, A. C., Theaker, J. M., Pickering, R. M., Day, I., and Howell, W. M. Invasiveness of cutaneous malignant melanoma is Influenced by matrix metalloproteinase 1 gene polymorphism. Cancer Res., 61:1296−1298, 2001)。これまでに蓄積された証拠から、プロモーター領域の2Gホモザイガス ポリモルフィズムは、1Gホモザイゴート(Kanamori, Y., Matsushima, M., Minaguchi, T., Kobayashi, K., Sagae, S., Kudo, R., Terakawa, N., and Nakamura, Y. Correlation between expression of the matrix Metalloproteinase−1 gene in ovarian cancer and insertion/deletion polymorphism in Its promoter region. Cancer Res. 59: 4225−4227, 1999.)よりも高い転写活性を有しており、悪性黒色腫(Ye, S., Dhillon, S., Turner, S. J., Bateman, A. C., Theaker, J. M., Pickering, R. M., Day, I., and Howell, W. M. Invasiveness of cutaneous malignant melanoma is Influenced by matrix metalloproteinase 1 gene polymorphism. Cancer Res., 61:1296−1298, 2001)と同様に、卵巣がん(Kanamori, Y., Matsushima, M., Minaguchi, T., Kobayashi, K., Sagae, S., Kudo, R., Terakawa, N., and Nakamura, Y. Correlation between expression of the matrix Metalloproteinase−1 gene in ovarian cancer and insertion/deletion polymorphism in Its promoter region. Cancer Res., 59: 4225−4227, 1999.)、子宮内膜がん(Nishioka, Y., Kobayashi, K., Sagae, S., Ishioka, S., Nishikawa, A., Matsushima, M., Kanamori, Y., Minaguchi, T., Nakamura, Y., Tokino, T., and Kudo, R. A single nucleotide polymorphism in the matrix metalloproteinase−1 promoter in endometrial carcinoma. Jpn. J.Cancer Res.,91:612−615, 2000.)、大腸がん(Ghilardi, G., Biondi, M. L., Mangoni, J., Leviti, S., DeMonti, M., Guagnellini, E., and Scorza, R. Matrix metalloproteinase−1 promoter polymorphism 1G/2G is correlated with colorectal cancer invasiveness. Clinical Cancer Res., 7:2344−2346, 2001)および肺がん(Zhu, Y., Spitz, M. R., Lei, L., Mills, G, B., and Wu, X. A single nucleotide Polymorphism in the matrix metalloproteinase−1 promoter enhances lung cancer susceptibility. Cancer Res., 61:7825−7829, 2001)を含むいくつかのヒト腫瘍の悪性化と相関している。本発明は、MMP−1プロモーターポリモルフィズムが、日本人におけるRCCの感受性と有意に相関していることを示した。現時点においては、非乳頭状RCCの感受性におけるMMP−1プロモーター ポリモルフィズムの明確な影響を示した最初の報告である。
【0007】
MMP−1は、RCCを含む種々の腫瘍により高レベルで発現されている(Stephanie, C. and Graeme, I.M. Matrix metalloproteinases in tumor invasionand metastasis. J.Pathol.189:300−308,1999.)。またMMP−1は、細胞外マトリックスを分解することができるタンパク分解酵素であり、腫瘍の浸潤および転移のポテンシャルを強めていると考えられる。これまでに蓄積された証拠から、乳がん、大腸がん、脳腫瘍、肺がん、前立腺がん(Marie−Annick, F., Richard, R.D., and Richard,B. Physiological roles of matrix metalloproteinases:implications for tumor growth and metastasis. Can.J.Physiol.Pharmacol.77: 465−480,1999.)、食道がん(Stephanie, C.and Graeme, I.M. Matrix metalloproteinases in tumor invasion and metastasis. J.Pathol.189:300−308, 1999.)および直腸がん(Hewitt, R.E., Leach, I.E., Powe, D.G., Clark, I.M., Cawstone, T.E., and Turner, D.R.Distribution of collagenase and tissue inhibitor of metalloproteinase(TIMP) in colorectal tumors. Int.J.Cancer.49: 666−672,1991.)における予後の悪さと、MMP mRNAあるいはMMP−1発現との密接な相関が示唆されている。腫瘍のセルラインを用いて、Rutterらにより、−1607 bp の位置に2Gホモザイゴートを含むMMP−1プロモーターは、1Gプロモーターよりも高い転写活性を有していることが示された(Rutter, J. L., Mitchell, T. I., Buttice, G., Meyers, J., Gusella, J. F., Ozelius, L.J., and Brinckerhoff, C. E. A single nucleotide polymorphism in the matrix metalloproteinase−1 promoter creates an Ets binding site and augments transcription. Cancer Res., 58: 5321−5325, 1998.)。最近、これらのデータは、他のデータによって臨床的にも確認されており、1Gアリルを有する患者に比較して、2Gアリルを有する患者においてがん組織における有意に高レベルなMMP−1発現が観察されている(Kanamori, Y., Matsushima, M., Minaguchi, T., Kobayashi, K., Sagae, S., Kudo, R., Terakawa, N., and Nakamura, Y. Correlation between expression of the matrix Metalloproteinase−1 gene in ovarian cancer and insertion/deletion polymorphism in Its promoter region. Cancer Res., 59: 4225−4227, 1999.)。この証拠から、MMP−1プロモーター領域における特定アリルのポリモルフィズムが、特定の形質に対すると同様に、腫瘍への感受性に対しても強いインパクトを有するという仮説が立てられた。そして、これがRCCにおける患者の予後に影響することが示された。
【0008】
本発明において、患者と対照群との間の年齢調整とは無関係に、RCCと2G/2G遺伝子型との有意な相関が見られた。この結果は、健康な対照群における、MMP−1プロモーターの1G/2Gポリモルフィズムの遺伝子型分布が、年齢によって影響されないことを示している。MMP−1ポリモルフィズムと多くのがんとの相関(Zhu, Y., Spitz, M. R., Lei, L., Mills, G, B., and Wu, X.A single nucleotide Polymorphism in the matrix metalloproteinase−1 promoter enhances lung cancer susceptibility. Cancer Res., 61:7825−7829, 2001;Nishioka, Y., Kobayashi, K., Sagae, S., Ishioka, S., Nishikawa, A., Matsushima, M., Kanamori, Y., Minaguchi, T., Nakamura, Y., Tokino, T., and Kudo, R. A single nucleotide polymorphism in the matrix metalloproteinase−1 promoter in endometrial carcinoma. Jpn. J.Cancer Res., 91:612−615, 2000.; Kanamori, Y., Matsushima, M., Minaguchi, T., Kobayashi, K., Sagae, S., Kudo, R., Terakawa, N., and Nakamura, Y. Correlation between expression of the matrix Metalloproteinase−1 gene in ovarian cancer and insertion/deletion polymorphism in Its promoter region. Cancer Res., 59: 4225−4227, 1999.;Ye, S., Dhillon, S., Turner, S. J., Bateman, A. C., Theaker, J. M., Pickering, R. M., Day, I., and Howell, W. M. Invasiveness ofcutaneous malignant melanoma is Influenced by matrix metalloproteinase 1 gene polymorphism. Cancer Res., 61:1296−1298, 2001; Ghilardi, G., Biondi, M. L., Mangoni, J., Leviti, S., DeMonti, M., Guagnellini, E., and Scorza, R. Matrix metalloproteinase−1 promoter polymorphism 1G/2G is correlated with colorectal cancer invasiveness. Clinical Cancer Res., 7:2344−2346, 2001)が示唆されているので、2G/2G遺伝子型の頻度は、がんによる死亡率が加齢とともに増加するため、減少すると推測することも可能である。しかしながら、がんの発生率(日本においては約0.01%/年)があまりにも低い値である(Marumo,K.,Satomi,Y.,Miyao,N.,Hasegawa,M.,Tomita,Y.,Igarashi,T.,Onishi,T.,Nakazawa,H.,Fukuda,M.,Ozono,S.,Terachi,T.,Tsushima,T.,Nakamoto,T.,Kawamura, J.The prevalence of renal cell carcinoma:a nation−wide survey in Japan in 1997. Int.J.Urol.8(7):359−65,2001.)ため、全ポピュレーションにおける遺伝子型分布に影響しないと考えられる。
【0009】
MMP−1は、stromal cellと同様に、がん細胞により産生されることが知られており(Thrash−Bingham CA, Salazar H, Freed JJ, Greenberg RE, Tartof KD. Genomic alterations and instabilities in renal cell carcinomas and their relationship to tumor pathology. Cancer Res, 55:6189−6195, 1995.)、従って、MMP−1遺伝子の2Gアリルが、染色体11q22−23上にloss of heterozygosity(LOH)が発生する時に選択的に残されるという仮説(Noll,W.W.,Belloni,D.R.,Rutter,J.L.,Storm,C.A.,Schned,A.R.,Titus− Ernstoff,M.S., and Brinckerhoff,C.E. Loss of heterozygosity on chromosome 11q22−23in melanoma is associated with retention of the insertion polymorphism in the Matrix metalloproteinase−1 promoter. Am.J.Pathol.158(2):691−697,2001.)を証明することが重要である。本発明者らは、1G/2G遺伝子型を有するRCC組織のがん領域からの1個のDNA試料におけるLOHを調べたが、MMP−1ローカスには、いかなるLOHも存在しないことを示した。このデータは、非乳頭状RCCでは染色体11q上に高頻度のLOHを示さないとする、以前のLOH研究(Brinkerhoff, C. E., Rutter, J. L., and Benbow, U. Interstitial collagenases as markers of tumor progression. Clin. Cancer Res., 6:4823−4830, 2000.)の結果と一致していた。
【0010】
最近の研究および本発明の結果から、MMP−1プロモーターのポリモルフィズムは、通常はいくつかのがんと関連しており、ポピュレーションの違いによっては影響されないと考えられる。
【0011】
【発明の実施の形態】
発明の実施の形態を、実施例にもとづき図面を参照して説明するが、本発明はこれらの実施例のみに限定されるものではない。
【0012】
【実施例】
病理学的に非乳頭状RCCと確認された患者119名(男性85名、女性34名)、年齢と性別を調整した健康なボランティア105名(対照群A)、性別はマッチングしているが年齢はミスマッチングしている健康なボランティア220名(対照群B)を、本実施例用に登録した。患者群と対照群の平均年齢は、それぞれ61.4才(範囲 32−84才)、56.4才(範囲 34−99才)および47.9才(範囲 23−99才)であった(表1)。山口大学施設倫理委員会(Serial No.33)により承認された文書によるインフォームドコンセントを、全ての患者から得た。
【0013】
【表1】
【0014】
ゲノムDNAは、血液(患者群より61試料、対照群は全員)または新鮮凍結正常腎臓(患者群より61試料)のいずれかから得た。これらの試料は手術時に急速凍結し、使用するまで−80℃で保存した。PCR−based LOH analysis (Noll,W.W.,Belloni,D.R.,Rutter,J.L.,Storm,C.A.,Schned,A.R.,Titus−Ernstoff,M.S., and Brinckerhoff, C.E. Loss of hetero−zygosity on chromosome 11q22−23 in melanoma is associated with retention of the insertion polymorphismin the Matrix metalloproteinase−1 promoter. Am.J.Pathol.158(2):691−697,2001.)用として、21腫瘍組織試料からDNAを抽出した。DNAzol (Molecular Research Center, Cincinnati, Ohio)および GenTLE(TAKARA, Kyoto, Japan)は、正常組織および全血からのDNA抽出に用いた。組織病理学的知見に基づいて、全ての患者においてRCCと診断された。健康な対照群は、山口大学附属病院における検査により、外見上の異常が見出されなかったボランティアにより構成されている。被験者はすべて、遺伝学的にネイティブな日本人であった。
【0015】
PCR用のプライマーは、順方向は5’‐CAGTGGCAAGTGTTCTTTGG‐3’、逆方向は5’‐CTCCCACCTTTCCCACTGTA‐3’であった。20ng のゲノムDNA、0.5μlの各プライマー(10mM)、1μlの8mM dNTP混合液、1μlの10×バッファー [ 100 mM Tris−HCl (pH 8.3) , 500 mM KCl , 15 mM MgCl2 , 0.01% (w/v) gelatin ]、5.95μlの滅菌脱イオン水および 5U/μl のAmpliTaq Gold DNA polymerase (PERKIN ELMER, Branchburg, NJ) を含む10μl溶液中で、PCR反応を行った。PCR反応の条件は以下の通り:95℃で10分、94℃1分−55℃1分―94℃10分−72℃10分の反応を30サイクル、最後に72℃で10分。PCR産物をExoSAP−IT (Amersham Bioscience, Japan)と37℃で20分間混合し、次に2種類の加水分解酵素ExonucleaseIと Shrimp Alkaline Phosphataseで80℃、20分間反応させて未反応のdNTP、一本鎖プライマーおよび外来の一本鎖DNAを分解させた。DNAシークエンシング反応は、BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (Applied Biosystems, Japan)を用いて行った。Dye Terminator Removal Kit (Applied Biosystems)で精製した後、DNA配列をApplied Biosystems model 377 DNA sequencer (Applied Biosystems)で検出した(Smith, L. M., Sanders, J. Z., Kaiser, R. J., Hughes, P., Dodd, C., Connell, C .R., Heiner, C., Kent, S. B. H., and Hood, L. E. Fluorescence detection in automated DNA sequence analysis. Nature.321: 674−679, 1986.)。
【0016】
統計解析は、以下の手法を用いて行った。患者群および健常対照群におけるMMP−1プロモーターの遺伝子頻度は、Hardy−Weinberg equilibrium distribution (χ2 < 3.84, P < 0.05)と一致していた。患者群と健常対照群との間の遺伝子型の違いは、χ2 testを適用した。臨床病理学的パラメーターと遺伝子型との相関は正確検定により評価した。オッズ比と95%信頼区間は、相対危険率を評価するために用いた。全ての統計解析はStatView (version 5; SAS Institute Inc., NC)を用い、P < 0.05を統計学的有意差ありとみなした。すべての非乳頭状RCC患者は、the tumor−node−metastasis (TNM) classification によりステージを分類した。腫瘍は、WHO基準に従って、病理学的に分類した。
【0017】
MMP−1プロモーターの−1607の位置におけるGの挿入(2Gアリル)またはGの欠失(1Gアリル)を、RCC患者および対照群において決定した。表2は、すべてのケースにおける遺伝子型分布を示している。もっとも高いMMP−1転写レベルを有する2G/2G遺伝子型の頻度を、1G/1Gおよび1G/2G遺伝子型の頻度と比較した。RCC患者119例中の72例(60.5%)が2G/2G遺伝子型を示したのに対し、年齢および性別調整対照群(グループA)においては105例中の39例(37.1%)だけが2G/2G遺伝子型を示した(表2)。
【0018】
【表2】
【0019】
対照群と比較して、RCCにおいては有意に高い頻度で2G/2G遺伝子型が見出された(P=0.0005 ; OR , 2.592 ; 95%CI , 1.516−4.433)。2Gアリル頻度は、2つの対照群間では統計学的な差を示さなかった(P=0.5460)。性別調整群(グループB)と比較した時、RCC患者において2G/2G遺伝子型は、再び有意に高かった(P=0.0006 ; OR , 2.213 ; 95%CI , 1.395−3.509)。
【0020】
MMP−1遺伝子型ポリモルフィズムと臨床上の背景との関係はと言えば、性、等級およびステージのようないくつかの形質と遺伝子型との間には、統計学的に有意な相関はなかった(表3)。染色体11q22−23上のLOHは、MMP−1プロモーターにおける挿入ポリモルフィズムの保持と相関しているという仮説(Noll,W.W.,Belloni,D.R.,Rutter,J.L.,Storm,C.A.,Schned,A.R.,Titus−Ernstoff, M.S., and Brinckerhoff,C.E. Loss of heterozygosity on chromosome 11q22−23 in melanoma is associated with retention of the insertion polymorphism in the Matrix metalloproteinase−1 promoter. Am.J.Pathol.158(2):691−697,2001.)を研究するために、1G/2G遺伝子型(n=21)を有する腫瘍DNAのPCR産物を直接シークエンシングにより分析した。その結果、この遺伝子座にはいかなるLOHも存在しなかった。
【0021】
【表3】
【0022】
【発明の効果】
MMP−1は腫瘍細胞の浸潤や転移と相関しており、転写のレベルに影響するMMP−1プロモーターのポリモルフィズムと相関している。本発明は、腎細胞がんの発症リスクとこのポリモルフィズムとの相関を明らかにし、日本人における腎細胞がんの発症リスクを予測する分子レベルでの検査方法を確立することができた。
【発明の属する技術分野】
非乳頭状腎細胞がんの感受性と相関するMMP−1プロモーターのSNPを用いた、腎細胞がんまたは非乳頭状腎細胞がんの発症リスクを予測する分子レベルでの検査方法に関する。
【0002】
【従来の技術】
Case−control study により大腸がん患者集団と正常対照群とを比較解析することにより、大腸がんの原因遺伝子の single nucleotide polymorphism(SNP)の内から、モンゴロイド特に日本人を対象とした、大腸がんの発症、浸潤、転移のし易さを判定できる検査方法の確立に寄与し得るSNPとして、matrix metalloproteinase−1(MMP−1)遺伝子と matrix metalloproteinase−3(MMP−3)遺伝子のSNPが適していることが知られている。MMP−1およびMMP−3遺伝子のSNP解析結果からは、発症前診断に利用することにより、日本人における大腸発がんのリスクを推定することが可能となっている(特願2002−40049)。腎細胞がん(renal cell carcinoma ; RCC)は、泌尿器の悪性腫瘍の原因としては3番目に多く、また成人の悪性腫瘍の約2%を占めている(非特許文献1)。超音波、CTおよびMRIのような非侵襲イメージング法が広く用いられるようになって、偶然にRCCという診断が下されるケースが、着実に増加している(非特許文献2)。これらスクリーニング用の検出ツールの改良にもかかわらず、生命を脅かすRCC(局所浸潤性腫瘍または転移性腫瘍)の比率は、減少してはいない(非特許文献3)。RCC患者の約25%は、プレゼンテーションの時点で転移性の疾患を有しているが、転移性の傷害の治療はほとんど成功しないか、あるいはリスク患者における遠方への転移の予防もできない状態である(非特許文献4)。がんのステージIからIVのそれぞれにおける5年生存率は、91%、74%、67%および32%であることが報告されている(非特許文献2)。INFαの間歇的な筋肉内注射は、IL−2併用の有無にかかわらず、転移性RCC治療のゴールドスタンダードであり、患者の約20%が、この治療法の恩恵を受けているに過ぎない(特許文献5−非特許文献9)。この事実が、遺伝子診断を含めた新規なスクリーニングシステムが、RCC早期発見のために必須であることを示している。
【0003】
【非特許文献1】Greenlee,R.T.,Murray,T.,Bolden,S.,Wingo,P.A Cancer statistics, 2000.CA. Cancer J Clin. 50: 7, 2000.
【非特許文献2】Allan, J.P., Amnon, Z., Arie, S.B.The changingnatural history of renal cell carcinoma. J.Urol. 166:1611−1623,2001.
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【非特許文献5】Kirkwood, J.M., Harris, J.E., Vera, R., Sandler, S., Fischer, D.S., Khandekar, J., Ernstoff, M.S., Gordon, L., Lutes, R., Bonomi, P., Lytton, B., Cobleigh, M., Taylor,S.J. A randomized studyof low and high doses of leukocyteα−interferon in metastatic renal cell carcinoma: The American Cancer Society Collaborative Trial. Cancer Res. 45: 863−871,1985.
【非特許文献6】Figlin, R.A., Abi−Aad, A.S., Bellderrun, A., deKernion, J.B. The role of interferon and Interleukin−2 in the immunotherapeutic approach to renal cell carcinoma. Semin Oncol, 18:102−107,1991.
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【非特許文献9】Gratama, J.W., Schmitz, P.I., Goey, S.H., Lamers, C.H., Stoter, G., Bolhuis, R.L. Modulaction of immune parameters in patients with metastatic renal−cell cancer Receiving combination immunotherapy (IL−2, IFN alpha and autologous IL−2−activated lymphocytes). Int J Cancer.65: 152−156,1996.
【0004】
【発明が解決しようとする課題】
MMP−1は腫瘍細胞の浸潤や転移と相関しており、転写のレベルに影響するMMP−1プロモーターのポリモルフィズムと相関している。本発明は、腎細胞がんの発症リスクとこのポリモルフィズムとの相関を明らかにし、腎細胞がんの発症リスクを予測する分子レベルでの検査方法を確立することが課題である。
【0005】
【課題を解決するための手段】
腫瘍の浸潤と転移のプロセスは、腫瘍細胞の周囲の細胞外マトリックス(extracellular matrix ; ECM)や結合組織の分解または切断を必要とする(Hart,I. R. and Saini, A. Biology of tumor metastasis. Lancet, 339:1453−1457,1992.;Kohn, E. C. and Liotta, L. A. Molecular insights into cancer invasion: strategies for prevention and intervention. Cancer Res., 55: 1856−1862, 1995.)。MMPは、一般的に、ECMや基底膜コンポーメントを分解することができる(Chambers, A.F., and Matrisian, L.M. Changing views of the role of matrix metalloproteinases in metastasis. J.Natl.Cancer Inst. (Bethesda), 89: 1260−1270,1997)。染色体11q22に位置するMMP−1遺伝子は、種々の腫瘍細胞で発現されているとともに、正常細胞( stromal fibroblasts , macrophages , endothelial cells , epithelial cells )において最も広く発現している(Zhu, Y., Spitz, M. R., Lei, L., Mills, G, B., and Wu, X. A single nucleotide Polymorphism in the matrix metalloproteinase−1 promoter enhances lung cancer susceptibility. Cancer Res., 61:7825−7829,2001;Nishioka, Y., Kobayashi, K., Sagae, S., Ishioka, S., Nishikawa, A., Matsushima, M., Kanamori, Y., Minaguchi, T., Nakamura, Y., Tokino, T., and Kudo, R. A single nucleotide polymorphism in the matrix metalloproteinase−1 promoter in endometrial carcinoma. Jpn. J.Cancer Res., 91:612−615, 2000.;Stetler−Stevenson, W. G.,Liotta, L. A., and Kleiner, D. E. Extracellular matrix 6: role of matrix metalloproteinases in tumor invasion and metastasis. FASEB J., 7:1434−1441, 1993;Brinkerhoff, C. E., Rutter, J. L., and Benbow, U. Interstitial collagenases as markers of tumorprogression. Clin. Cancer Res., 6:4823−4830, 2000.)。Murray らは、結腸直腸がんや食道がんの予後の悪さとMMP−1の発現との相関を示した(Murray, G. I., Duncan, M. E., Oneil, P., Melvin, W. T. and Forthergill, J. E. Matrix metalloproteinase−1 is associated with poor prognosis in colorectal cancer. Nat. Med., 2:461−462, 1996.;Murray, G. I., Duncan, M. E., Oneil, P., Mckay, J. A., Melvin, W. T. and Forthergill, J. E. Matrix metalloproteinase−1 is associated with poor prognosis in oesophagial cancer. J.Pathol. 185:256−261, 1998.)。
【0006】
最近の文献は、MMP−1プロモーター領域の −1607 bp におけるグアニン挿入ポリモルフィズム(2Gアリル)によって、Ets転写因子の結合サイトにおけるコア認識配列である5’‐GGA‐3’配列(Rutter, J. L., Mitchell, T. I., Buttice, G., Meyers, J., Gusella, J. F., Ozelius, L.J., and Brinckerhoff, C. E. A single nucleotide polymorphism in the matrix metalloproteinase−1 promoter creates an Ets binding site and augments transcription. Cancer Res., 58: 5321−5325, 1998.)が生ずることを報告している(Kanamori, Y., Matsushima, M., Minaguchi, T., Kobayashi, K., Sagae, S., Kudo, R., Terakawa, N., and Nakamura, Y. Correlation between expression of the matrix Metalloproteinase−1 gene in ovarian cancer and insertion/deletion polymorphism in Its promoter region. Cancer Res., 59: 4225−4227, 1999.;Graves, B.J. Inner workings of a transcription factor partnership. Science (Washington DC), 279: 1000−1001. 1998;Buttice, G., Duterque−Coquillaud, M., Basuyaux, J.P., Carrere, S., Kurkinen, M., and Stehelin, D.Erg, an Ets−family member, differentially regulates human collagenase 1(MMP−1) and stromelysin1 (MMP3) gene expression by physically interacting with theFos/Jun complex. Oncogene, 13:2297−2306, 1996;.Basuyaux, J. P., Ferreira, E., Stehelin, D., and Buttice, G. The Ets transcription factors interact with each other and with the c−Fos/c−Jun complex via distinct protein domains in a DNA−dependent and −independent manner. J. Biol. Chem., 272: 26188−26195, 1997;Ye, S., Dhillon, S., Turner, S. J., Bateman, A. C., Theaker, J. M., Pickering, R. M., Day, I., and Howell, W. M. Invasiveness of cutaneous malignant melanoma is Influenced by matrix metalloproteinase 1 gene polymorphism. Cancer Res., 61:1296−1298, 2001)。これまでに蓄積された証拠から、プロモーター領域の2Gホモザイガス ポリモルフィズムは、1Gホモザイゴート(Kanamori, Y., Matsushima, M., Minaguchi, T., Kobayashi, K., Sagae, S., Kudo, R., Terakawa, N., and Nakamura, Y. Correlation between expression of the matrix Metalloproteinase−1 gene in ovarian cancer and insertion/deletion polymorphism in Its promoter region. Cancer Res. 59: 4225−4227, 1999.)よりも高い転写活性を有しており、悪性黒色腫(Ye, S., Dhillon, S., Turner, S. J., Bateman, A. C., Theaker, J. M., Pickering, R. M., Day, I., and Howell, W. M. Invasiveness of cutaneous malignant melanoma is Influenced by matrix metalloproteinase 1 gene polymorphism. Cancer Res., 61:1296−1298, 2001)と同様に、卵巣がん(Kanamori, Y., Matsushima, M., Minaguchi, T., Kobayashi, K., Sagae, S., Kudo, R., Terakawa, N., and Nakamura, Y. Correlation between expression of the matrix Metalloproteinase−1 gene in ovarian cancer and insertion/deletion polymorphism in Its promoter region. Cancer Res., 59: 4225−4227, 1999.)、子宮内膜がん(Nishioka, Y., Kobayashi, K., Sagae, S., Ishioka, S., Nishikawa, A., Matsushima, M., Kanamori, Y., Minaguchi, T., Nakamura, Y., Tokino, T., and Kudo, R. A single nucleotide polymorphism in the matrix metalloproteinase−1 promoter in endometrial carcinoma. Jpn. J.Cancer Res.,91:612−615, 2000.)、大腸がん(Ghilardi, G., Biondi, M. L., Mangoni, J., Leviti, S., DeMonti, M., Guagnellini, E., and Scorza, R. Matrix metalloproteinase−1 promoter polymorphism 1G/2G is correlated with colorectal cancer invasiveness. Clinical Cancer Res., 7:2344−2346, 2001)および肺がん(Zhu, Y., Spitz, M. R., Lei, L., Mills, G, B., and Wu, X. A single nucleotide Polymorphism in the matrix metalloproteinase−1 promoter enhances lung cancer susceptibility. Cancer Res., 61:7825−7829, 2001)を含むいくつかのヒト腫瘍の悪性化と相関している。本発明は、MMP−1プロモーターポリモルフィズムが、日本人におけるRCCの感受性と有意に相関していることを示した。現時点においては、非乳頭状RCCの感受性におけるMMP−1プロモーター ポリモルフィズムの明確な影響を示した最初の報告である。
【0007】
MMP−1は、RCCを含む種々の腫瘍により高レベルで発現されている(Stephanie, C. and Graeme, I.M. Matrix metalloproteinases in tumor invasionand metastasis. J.Pathol.189:300−308,1999.)。またMMP−1は、細胞外マトリックスを分解することができるタンパク分解酵素であり、腫瘍の浸潤および転移のポテンシャルを強めていると考えられる。これまでに蓄積された証拠から、乳がん、大腸がん、脳腫瘍、肺がん、前立腺がん(Marie−Annick, F., Richard, R.D., and Richard,B. Physiological roles of matrix metalloproteinases:implications for tumor growth and metastasis. Can.J.Physiol.Pharmacol.77: 465−480,1999.)、食道がん(Stephanie, C.and Graeme, I.M. Matrix metalloproteinases in tumor invasion and metastasis. J.Pathol.189:300−308, 1999.)および直腸がん(Hewitt, R.E., Leach, I.E., Powe, D.G., Clark, I.M., Cawstone, T.E., and Turner, D.R.Distribution of collagenase and tissue inhibitor of metalloproteinase(TIMP) in colorectal tumors. Int.J.Cancer.49: 666−672,1991.)における予後の悪さと、MMP mRNAあるいはMMP−1発現との密接な相関が示唆されている。腫瘍のセルラインを用いて、Rutterらにより、−1607 bp の位置に2Gホモザイゴートを含むMMP−1プロモーターは、1Gプロモーターよりも高い転写活性を有していることが示された(Rutter, J. L., Mitchell, T. I., Buttice, G., Meyers, J., Gusella, J. F., Ozelius, L.J., and Brinckerhoff, C. E. A single nucleotide polymorphism in the matrix metalloproteinase−1 promoter creates an Ets binding site and augments transcription. Cancer Res., 58: 5321−5325, 1998.)。最近、これらのデータは、他のデータによって臨床的にも確認されており、1Gアリルを有する患者に比較して、2Gアリルを有する患者においてがん組織における有意に高レベルなMMP−1発現が観察されている(Kanamori, Y., Matsushima, M., Minaguchi, T., Kobayashi, K., Sagae, S., Kudo, R., Terakawa, N., and Nakamura, Y. Correlation between expression of the matrix Metalloproteinase−1 gene in ovarian cancer and insertion/deletion polymorphism in Its promoter region. Cancer Res., 59: 4225−4227, 1999.)。この証拠から、MMP−1プロモーター領域における特定アリルのポリモルフィズムが、特定の形質に対すると同様に、腫瘍への感受性に対しても強いインパクトを有するという仮説が立てられた。そして、これがRCCにおける患者の予後に影響することが示された。
【0008】
本発明において、患者と対照群との間の年齢調整とは無関係に、RCCと2G/2G遺伝子型との有意な相関が見られた。この結果は、健康な対照群における、MMP−1プロモーターの1G/2Gポリモルフィズムの遺伝子型分布が、年齢によって影響されないことを示している。MMP−1ポリモルフィズムと多くのがんとの相関(Zhu, Y., Spitz, M. R., Lei, L., Mills, G, B., and Wu, X.A single nucleotide Polymorphism in the matrix metalloproteinase−1 promoter enhances lung cancer susceptibility. Cancer Res., 61:7825−7829, 2001;Nishioka, Y., Kobayashi, K., Sagae, S., Ishioka, S., Nishikawa, A., Matsushima, M., Kanamori, Y., Minaguchi, T., Nakamura, Y., Tokino, T., and Kudo, R. A single nucleotide polymorphism in the matrix metalloproteinase−1 promoter in endometrial carcinoma. Jpn. J.Cancer Res., 91:612−615, 2000.; Kanamori, Y., Matsushima, M., Minaguchi, T., Kobayashi, K., Sagae, S., Kudo, R., Terakawa, N., and Nakamura, Y. Correlation between expression of the matrix Metalloproteinase−1 gene in ovarian cancer and insertion/deletion polymorphism in Its promoter region. Cancer Res., 59: 4225−4227, 1999.;Ye, S., Dhillon, S., Turner, S. J., Bateman, A. C., Theaker, J. M., Pickering, R. M., Day, I., and Howell, W. M. Invasiveness ofcutaneous malignant melanoma is Influenced by matrix metalloproteinase 1 gene polymorphism. Cancer Res., 61:1296−1298, 2001; Ghilardi, G., Biondi, M. L., Mangoni, J., Leviti, S., DeMonti, M., Guagnellini, E., and Scorza, R. Matrix metalloproteinase−1 promoter polymorphism 1G/2G is correlated with colorectal cancer invasiveness. Clinical Cancer Res., 7:2344−2346, 2001)が示唆されているので、2G/2G遺伝子型の頻度は、がんによる死亡率が加齢とともに増加するため、減少すると推測することも可能である。しかしながら、がんの発生率(日本においては約0.01%/年)があまりにも低い値である(Marumo,K.,Satomi,Y.,Miyao,N.,Hasegawa,M.,Tomita,Y.,Igarashi,T.,Onishi,T.,Nakazawa,H.,Fukuda,M.,Ozono,S.,Terachi,T.,Tsushima,T.,Nakamoto,T.,Kawamura, J.The prevalence of renal cell carcinoma:a nation−wide survey in Japan in 1997. Int.J.Urol.8(7):359−65,2001.)ため、全ポピュレーションにおける遺伝子型分布に影響しないと考えられる。
【0009】
MMP−1は、stromal cellと同様に、がん細胞により産生されることが知られており(Thrash−Bingham CA, Salazar H, Freed JJ, Greenberg RE, Tartof KD. Genomic alterations and instabilities in renal cell carcinomas and their relationship to tumor pathology. Cancer Res, 55:6189−6195, 1995.)、従って、MMP−1遺伝子の2Gアリルが、染色体11q22−23上にloss of heterozygosity(LOH)が発生する時に選択的に残されるという仮説(Noll,W.W.,Belloni,D.R.,Rutter,J.L.,Storm,C.A.,Schned,A.R.,Titus− Ernstoff,M.S., and Brinckerhoff,C.E. Loss of heterozygosity on chromosome 11q22−23in melanoma is associated with retention of the insertion polymorphism in the Matrix metalloproteinase−1 promoter. Am.J.Pathol.158(2):691−697,2001.)を証明することが重要である。本発明者らは、1G/2G遺伝子型を有するRCC組織のがん領域からの1個のDNA試料におけるLOHを調べたが、MMP−1ローカスには、いかなるLOHも存在しないことを示した。このデータは、非乳頭状RCCでは染色体11q上に高頻度のLOHを示さないとする、以前のLOH研究(Brinkerhoff, C. E., Rutter, J. L., and Benbow, U. Interstitial collagenases as markers of tumor progression. Clin. Cancer Res., 6:4823−4830, 2000.)の結果と一致していた。
【0010】
最近の研究および本発明の結果から、MMP−1プロモーターのポリモルフィズムは、通常はいくつかのがんと関連しており、ポピュレーションの違いによっては影響されないと考えられる。
【0011】
【発明の実施の形態】
発明の実施の形態を、実施例にもとづき図面を参照して説明するが、本発明はこれらの実施例のみに限定されるものではない。
【0012】
【実施例】
病理学的に非乳頭状RCCと確認された患者119名(男性85名、女性34名)、年齢と性別を調整した健康なボランティア105名(対照群A)、性別はマッチングしているが年齢はミスマッチングしている健康なボランティア220名(対照群B)を、本実施例用に登録した。患者群と対照群の平均年齢は、それぞれ61.4才(範囲 32−84才)、56.4才(範囲 34−99才)および47.9才(範囲 23−99才)であった(表1)。山口大学施設倫理委員会(Serial No.33)により承認された文書によるインフォームドコンセントを、全ての患者から得た。
【0013】
【表1】
【0014】
ゲノムDNAは、血液(患者群より61試料、対照群は全員)または新鮮凍結正常腎臓(患者群より61試料)のいずれかから得た。これらの試料は手術時に急速凍結し、使用するまで−80℃で保存した。PCR−based LOH analysis (Noll,W.W.,Belloni,D.R.,Rutter,J.L.,Storm,C.A.,Schned,A.R.,Titus−Ernstoff,M.S., and Brinckerhoff, C.E. Loss of hetero−zygosity on chromosome 11q22−23 in melanoma is associated with retention of the insertion polymorphismin the Matrix metalloproteinase−1 promoter. Am.J.Pathol.158(2):691−697,2001.)用として、21腫瘍組織試料からDNAを抽出した。DNAzol (Molecular Research Center, Cincinnati, Ohio)および GenTLE(TAKARA, Kyoto, Japan)は、正常組織および全血からのDNA抽出に用いた。組織病理学的知見に基づいて、全ての患者においてRCCと診断された。健康な対照群は、山口大学附属病院における検査により、外見上の異常が見出されなかったボランティアにより構成されている。被験者はすべて、遺伝学的にネイティブな日本人であった。
【0015】
PCR用のプライマーは、順方向は5’‐CAGTGGCAAGTGTTCTTTGG‐3’、逆方向は5’‐CTCCCACCTTTCCCACTGTA‐3’であった。20ng のゲノムDNA、0.5μlの各プライマー(10mM)、1μlの8mM dNTP混合液、1μlの10×バッファー [ 100 mM Tris−HCl (pH 8.3) , 500 mM KCl , 15 mM MgCl2 , 0.01% (w/v) gelatin ]、5.95μlの滅菌脱イオン水および 5U/μl のAmpliTaq Gold DNA polymerase (PERKIN ELMER, Branchburg, NJ) を含む10μl溶液中で、PCR反応を行った。PCR反応の条件は以下の通り:95℃で10分、94℃1分−55℃1分―94℃10分−72℃10分の反応を30サイクル、最後に72℃で10分。PCR産物をExoSAP−IT (Amersham Bioscience, Japan)と37℃で20分間混合し、次に2種類の加水分解酵素ExonucleaseIと Shrimp Alkaline Phosphataseで80℃、20分間反応させて未反応のdNTP、一本鎖プライマーおよび外来の一本鎖DNAを分解させた。DNAシークエンシング反応は、BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (Applied Biosystems, Japan)を用いて行った。Dye Terminator Removal Kit (Applied Biosystems)で精製した後、DNA配列をApplied Biosystems model 377 DNA sequencer (Applied Biosystems)で検出した(Smith, L. M., Sanders, J. Z., Kaiser, R. J., Hughes, P., Dodd, C., Connell, C .R., Heiner, C., Kent, S. B. H., and Hood, L. E. Fluorescence detection in automated DNA sequence analysis. Nature.321: 674−679, 1986.)。
【0016】
統計解析は、以下の手法を用いて行った。患者群および健常対照群におけるMMP−1プロモーターの遺伝子頻度は、Hardy−Weinberg equilibrium distribution (χ2 < 3.84, P < 0.05)と一致していた。患者群と健常対照群との間の遺伝子型の違いは、χ2 testを適用した。臨床病理学的パラメーターと遺伝子型との相関は正確検定により評価した。オッズ比と95%信頼区間は、相対危険率を評価するために用いた。全ての統計解析はStatView (version 5; SAS Institute Inc., NC)を用い、P < 0.05を統計学的有意差ありとみなした。すべての非乳頭状RCC患者は、the tumor−node−metastasis (TNM) classification によりステージを分類した。腫瘍は、WHO基準に従って、病理学的に分類した。
【0017】
MMP−1プロモーターの−1607の位置におけるGの挿入(2Gアリル)またはGの欠失(1Gアリル)を、RCC患者および対照群において決定した。表2は、すべてのケースにおける遺伝子型分布を示している。もっとも高いMMP−1転写レベルを有する2G/2G遺伝子型の頻度を、1G/1Gおよび1G/2G遺伝子型の頻度と比較した。RCC患者119例中の72例(60.5%)が2G/2G遺伝子型を示したのに対し、年齢および性別調整対照群(グループA)においては105例中の39例(37.1%)だけが2G/2G遺伝子型を示した(表2)。
【0018】
【表2】
【0019】
対照群と比較して、RCCにおいては有意に高い頻度で2G/2G遺伝子型が見出された(P=0.0005 ; OR , 2.592 ; 95%CI , 1.516−4.433)。2Gアリル頻度は、2つの対照群間では統計学的な差を示さなかった(P=0.5460)。性別調整群(グループB)と比較した時、RCC患者において2G/2G遺伝子型は、再び有意に高かった(P=0.0006 ; OR , 2.213 ; 95%CI , 1.395−3.509)。
【0020】
MMP−1遺伝子型ポリモルフィズムと臨床上の背景との関係はと言えば、性、等級およびステージのようないくつかの形質と遺伝子型との間には、統計学的に有意な相関はなかった(表3)。染色体11q22−23上のLOHは、MMP−1プロモーターにおける挿入ポリモルフィズムの保持と相関しているという仮説(Noll,W.W.,Belloni,D.R.,Rutter,J.L.,Storm,C.A.,Schned,A.R.,Titus−Ernstoff, M.S., and Brinckerhoff,C.E. Loss of heterozygosity on chromosome 11q22−23 in melanoma is associated with retention of the insertion polymorphism in the Matrix metalloproteinase−1 promoter. Am.J.Pathol.158(2):691−697,2001.)を研究するために、1G/2G遺伝子型(n=21)を有する腫瘍DNAのPCR産物を直接シークエンシングにより分析した。その結果、この遺伝子座にはいかなるLOHも存在しなかった。
【0021】
【表3】
【0022】
【発明の効果】
MMP−1は腫瘍細胞の浸潤や転移と相関しており、転写のレベルに影響するMMP−1プロモーターのポリモルフィズムと相関している。本発明は、腎細胞がんの発症リスクとこのポリモルフィズムとの相関を明らかにし、日本人における腎細胞がんの発症リスクを予測する分子レベルでの検査方法を確立することができた。
Claims (4)
- 非乳頭状腎細胞がんの感受性と相関するMMP−1プロモーターのSNPを用いた、腎細胞がんの発症リスクを予測する分子レベルでの検査方法。
- 非乳頭状腎細胞がんの感受性と相関するMMP−1プロモーターのSNPを用いた、非乳頭状腎細胞がんの発症リスクを予測する分子レベルでの検査方法。
- 日本人を対象とする、非乳頭状腎細胞がんの感受性と相関するMMP−1プロモーターのSNPを用いた請求項1または2に記載の検査方法。
- 非乳頭状腎細胞がんの感受性と相関するMMP−1プロモーターのSNPが 5’‐GGA‐3’配列を有することを特徴とする、請求項1から3のいずれかに記載の検査方法。
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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JP2008500034A (ja) * | 2004-05-26 | 2008-01-10 | ステンマン,ヤコブ | 小さな生物学的サンプルにおけるmRNA発現レベルの定量及び/又は比較評価を行うための方法 |
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