JP2008500034A5

JP2008500034A5 -

Info

Publication number: JP2008500034A5
Application number: JP2007513986A
Authority: JP
Filing date: 2005-05-25
Publication date: 2008-06-19
Anticipated expiration: 2025-05-25

Claims

細胞又は組織のサンプルに存在するｍＲＮＡ転写産物の相対量について、定量および比較評価の少なくとも一方を行うための方法であって、
（ａ）複数の遺伝子に対する配列修飾プライマーを用いて、サンプルに含まれるｍＲＮＡの逆転写を１回の反応で行い、配列修飾ｃＤＮＡ分子のプールを得、
（ｂ）逆転写反応の終了後に、余った配列修飾プライマーを除去又は不活化し、
（ｃ）分析対象としたそれぞれの遺伝子について個別に増幅反応を行うが、各反応においては、遺伝子特異的プライマーを用いて配列修飾ｃＤＮＡからなるテンプレートと参照ＤＮＡテンプレートを共増幅して、測定可能な量の増幅産物を生成し、
（ｄ）配列修飾ｃＤＮＡテンプレートから誘導した増幅産物と参照ＤＮＡテンプレートから誘導した増幅産物のそれぞれの量を測定し、相対レベルを決定して、個別に行った増幅反応における、ＤＮＡに対する遺伝子特異的ｃＤＮＡの比を得、そして
（ｅ）個別に行った増幅反応から得られた、ＤＮＡに対する遺伝子特異的ｃＤＮＡの比を組み合わせて、サンプルに元々存在するｍＲＮＡ転写産物の相対量を反映する、該比のサンプル特異的プロファイルを得る
ことを包含する方法。
サンプルが、細胞又は組織の溶解物又はホモジェネートを含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
逆転写反応の前に、サンプルからＲＮＡ、又はＲＮＡとＤＮＡを単離することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
逆転写反応を、サンプルに含まれるＤＮＡが二本鎖の状態を維持する条件下で行うことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
配列修飾プライマーが、次の３つの機能的セグメント（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含有するオリゴヌクレオチドであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
（ａ）特定の遺伝子のセンス鎖ＤＮＡ配列のみならずｍＲＮＡ配列に相補的なヌクレオチド配列であって、続いて行う増幅反応に用いる下流側のプライマーのための結合部位に対する相補的ヌクレオチド配列を含有するヌクレオチド配列を含む、５'−末端セグメント、
（ｂ）該遺伝子のセンス鎖ＤＮＡ配列のみならずｍＲＮＡ配列に非相補的である１つ又は複数のヌクレオチドを含むヌクレオチド配列からなる、中央セグメント、及び
（ｃ）該遺伝子のセンス鎖ＤＮＡ配列のみならずｍＲＮＡ配列に相補的なヌクレオチド配列を含む、３'−末端セグメント。
逆転写反応の終了後に行う余った配列修飾プライマーの除去又は不活性化を、酵素分解によって行うことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
酵素分解を、一本鎖ＤＮＡ特異的エキソヌクレアーゼを用いて行うことを特徴とする、請求項６に記載の方法。
個々の増幅反応をそれぞれ物理的に隔離された反応容器において行うことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
参照ＤＮＡテンプレートが、サンプルに存在しているか又は別の原料から単離したゲノムＤＮＡを含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
参照ＤＮＡテンプレートが、クローニング又は合成したＤＮＡオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドを含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
個別の増幅反応におけるｃＤＮＡテンプレートと参照ＤＮＡテンプレートの共増幅を、同じプライマーを用いて競合的に行うことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
逆転写反応によって生成されるｃＤＮＡ分子のヌクレオチド配列を修飾し、ｃＤＮＡ由来の増幅産物を、同じ増幅反応によって得られる参照ＤＮＡテンプレート由来の増幅産物から区別するために、該配列の修飾を用いることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
増幅産物の定量を、増幅反応の間に行うことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
増幅産物の定量を、増幅反応の終了後に行うことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
個別の遺伝子特異的増幅反応において、配列修飾ｃＤＮＡテンプレートと参照ＤＮＡテンプレートから誘導する増幅産物の相対レベルが、増幅反応を実施する前の増幅反応系に元々存在した配列修飾ｃＤＮＡテンプレートと参照ＤＮＡテンプレートの相対量を反映することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
ｃＤＮＡテンプレートと参照ＤＮＡテンプレートを増幅するために、ポリメラーゼ連鎖反応、リガーゼ連鎖反応又は転写媒介性増幅を用いることを特徴とする、請求項１又は１１に記載の方法。
増幅産物の定量に、解離曲線解析、差別化部位におけるプライマー伸長法、配列特異的なハイブリダイゼーションプローブ、質量分析法、又は直接的又は間接的な蛍光共鳴エネルギー移動に基づく解析を用いることを特徴とする、請求項１又は１２に記載の方法。
差別化部位におけるプライマー伸長法が、ミニシークエンシング法、サイクリックミニシークエンシング法、ピロシークエンシング法（登録商標）及び対立遺伝子特異的プライマー伸長法からなる群より選ばれることを特徴とする、請求項１７に記載の方法。
配列特異的なハイブリダイゼーションプローブが、二重に標識した加水分解プローブ及びモレキュラービーコン（登録商標）プローブからなる群より選ばれることを特徴とする、請求項１７に記載の方法。
細胞又は組織のサンプルに存在するｍＲＮＡ転写産物の相対量について定量および比較評価の少なくとも一方を行うためのキットであって、請求項５に記載の配列修飾プライマーを含むことを特徴とするキット。