JP2006511213A - Ｒｔ−ｐｃｒによる核酸の絶対定量 - Google Patents

Abstract

キャリブレーションデータ（例えば、ＲＴ−ＰＣＲによるＲＮＡの絶対定量のための標準曲線）の生成における使用のためのｃＲＮＡを得るための方法が、開示される。この方法は、以下の工程を包含する：単位複製配列、この単位複製配列に対して３’に位置するプロモーター配列を含む合成オリゴヌクレオチドを提供する工程；この合成オリゴヌクレオチドのインビトロ転写により、相補的ＲＮＡ（ｃＲＮＡ）を合成する工程；独立した方法により、ｃＲＮＡを定量的にアッセイする工程；および既知の量のｃＲＮＡを用いてキャリブレーションデータを生成する工程。

Description

本発明は、分子生物学に関連する。より詳細には、本発明は、実時間ＰＣＲ方法および遺伝子発現の絶対定量に関する。

（背景）
基本的なＰＣＲ技術は、目的のＤＮＡ配列の増幅に適用される。逆転写酵素ＰＣＲ（ＰＴ−ＰＣＲ）においては、ＰＣＲプロトコールに逆転写工程が加えられる。これは、特定のｍＲＮＡ転写物の検出および定量のための基本的ＰＣＲ方法論に適合する。従って、ＲＴ−ＰＣＲは、遺伝子発現レベルを測定しそして比較するために好適である。有用な比較の例としては、個々の生物体に置ける異なった組織型での発現、異なった生物体間での同じ組織型における発現、および同じ組織型における実験処理に応じた発現が挙げられる。定量は、相対的（すなわち、サンプル間における倍数差に関連して表される）であっても、絶対的（すなわち、ＲＮＡの実際量に関連して表される）であってもよい。

従来、逆転写工程におけるｃＤＮＡの合成に従い、ＰＣＲは、増幅工程において適切な終点まで行われ、次いで、反応性生物の定量は、別個の検出（すなわち、アッセイ）工程において実行される。「実時間」ＰＣＲ（または「動態学的ＰＣＲ」）として公知であるＰＴ−ＰＣＲの変法において、増幅工程と検出工程とは一緒にされる。ＰＣＲ産物のサイクル毎の増加が、実時間で定量される。これは、増幅反応において、従来の順プライマーおよび逆プライマーに加えて「プローブ」を含むことによって達成される。このプローブは、増幅配列内にハイブリダイズし、代表的に約２０〜２５ヌクレオチド長である。市販のＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ ＣＡ）は、蛍光レポーター部分（色素）を５’末端に含み、クエンチャー部分（色素）を３’末端に含む。インタクトなプローブにおいて、レポーターの蛍光は、クエンチャー部分による内部クエンチングを介して、強く抑制される。エキソヌクレアーゼ作用として、Ｔａｑポリメラーゼの進行は、ハイブリダイゼーションプローブを消化し、レポーターがクエンチされ、蛍光を生じ、この蛍光が検出されそして定量される。

実時間ＰＣＲによるｍＲＮＡの定量は、相対的であっても絶対的であってもよい。どちらの場合においても、サンプルにおけるｍＲＮＡの定量は、適切な標準曲線に関連する。相対的定量のための標準曲線の場合、量は、基本サンプルに関連して表され、この基本サンプルは、しばしば「キャリブレーター」と呼ばれる。実験サンプルについて、標的量は、標準曲線から、キャリブレーターの値で除算することによって決定される。従って、キャリブレーターは、１×サンプルとなり、全ての他の量は、キャリブレーターに関するｎ倍の差で表される。例えば、遺伝子発現における薬物効果の研究において、未処理コントロールは、好適なキャリブレータートして役立つ。実験量がキャリブレーション量で除算されるため、標準曲線単位（例えば、蛍光強度）は、除かれる。これは、相対定量について、標的配列を含むＲＮＡまたはＤＮＡの任意の供給源が、適切な連続希釈物の調製の後に、標準曲線を作成するために使用され得ることを意味する。

対照的に、実時間ＰＣＲによるｍＲＮＡの絶対定量は、標的配列を含むＲＮＡの絶対量が既知である標準を、独立的に必要とする。代表的に、標的配列を含むｃＤＮＡを含むプラスミドが、得られなければならない。ｃＤＮＡを含む（そして他のオープンリーディングフレームを含まない）プラスミドの制限フラグメントは、ゲル精製され、そして逆転写される。得られたｃＤＮＡのＡ_２６０が測定され、そしてｃＲＮＡは、標準曲線を作成するために使用される。相補的ＲＮＡコピー数は、Ａ_２６０およびｍＲＮＡの分子量から計算される。これは、１つの遺伝子または少数の遺伝子の発現が繰り返しアッセイされる場合（例えば、ＨＩＶ患者におけるウイルスロードの臨床試験）に、殆ど難を示さない。しかし、実時間ＰＣＲによって多数の異なる標的が定量されなければならない状況では、絶対定量のためのこのアプローチは、時間がかかりすぎ、労力がかかりすぎるため、非実用的である。

（発明の要旨）
本発明は、ＲＴ−ＰＣＲによるＲＮＡの絶対定量のための、キャリブレーションデータ（例えば、標準曲線）生成における使用のためのｃＲＮＡを得る方法を提供する。この方法は、以下の工程を包含する：単位複製配列、この単位複製配列に対して３’に位置するプロモーター配列を含む合成オリゴヌクレオチドを提供する工程；この合成オリゴヌクレオチドのインビトロ転写により、相補的ＲＮＡ（ｃＲＮＡ）を合成する工程；独立した方法により、ｃＲＮＡを定量的にアッセイする工程；および既知の量のｃＲＮＡを用いてキャリブレーションデータを生成する工程。

好ましくは、このプロモーター配列は、バクテリオファージ配列である。本発明において有用なプロモーター配列の例は、Ｔ７プロモーター配列（例えば、５’ＣＣＴＡＴＡＧＴＧＡＧＴＣＧＴＡＴＴＡ ３’（配列番号１））である。合成オリゴヌクレオチドは、単位複製配列に隣接する２〜２０ヌクレオチド、好ましくは８〜１２ヌクレオチドの５’フランキング配列を、必要に応じて含む。本発明の幾つかの実施形態において、５’フランキング配列は、５〜２０個の連続したチミン残基（すなわち、オリゴｄ（Ｔ）領域）を含む。合成オリゴヌクレオチドは、単位複製配列とプロモーター領域との間の２〜２０ヌクレオチド、好ましくは８〜１２ヌクレオチドの３’フランキング配列を、必要に応じて含む。

単位複製配列の長さは、好ましくは３０〜７０ヌクレオチドであり、より好ましくは、４０〜６０ヌクレオチドである。合成オリゴヌクレオチドの長さは、好ましくは６０〜１４０ヌクレオチド、より好ましくは７０〜１３０ヌクレオチド、８０〜１２０ヌクレオチド、または９０〜１１０ヌクレオチドである。

本発明はまた、試験サンプル中の特定の核酸分子（例えば、特定のＲＮＡ転写物）の存在量を決定するためのＲＴ−ＰＣＲ方法の特徴を有する。この方法は、以下の工程を有する：（ａ）単位複製配列およびこの単位複製配列に対して３’に位置するプロモーター配列を含む合成オリゴヌクレオチドを提供する工程；（ｂ）このオリゴヌクレオチドのインビトロ転写により、ｃＲＮＡを合成する工程；（ｃ）このｃＲＮＡを用いて連続希釈物を生成する工程；（ｄ）ｃＲＮＡの逆転写により、一本鎖ｃＤＮＡを合成する工程；（ｅ）ｃＤＮＡを用いてＰＣＲキャリブレーションデータを生成する工程；（ｇ）試験サンプルからＰＣＲ試験サンプルデータを得る工程；および（ｈ）このＰＣＲ試験サンプルデータをＰＣＲキャリブレーションデータと比較する工程。本発明の好ましい実施形態において、ｃＲＮＡは、独立した方法（例えば、Ａ_２６０）によって定量的にアッセイされ、一本鎖ｃＤＮＡの合成の前に異種ＲＮＡ（例えば、酵母全ＲＮＡ）と混合される。

本明細書中で使用される場合、「単位複製配列」は、ＰＣＲ反応において増幅される、事前に選択された特定の核酸配列を意味する。

本明細書中で使用される場合、「フランキング配列」は、合成オリゴヌクレオチド中で単位複製配列に隣接するヌクレオチド配列を意味する。５’フランキング配列は、単位複製配列に対して５’に位置する。３’フランキング配列は、単位複製配列に対して３’に位置する。

本明細書中で使用される場合、「ＰＣＲキャリブレーションデータ」は、標的配列に対応する既知の量の核酸配列を用いて生成されたＰＣＲデータを意味し、これに対して、試験データは定量の目的で比較される。キャリブレーションデータは、相対的であっても絶対的であってもよい。

本明細書中で使用される場合、「標準曲線」は、キャリブレーションデータのプロット（通常、半対数的である）を意味する。

本明細書中で使用される場合、「合成オリゴヌクレオチド」は、生細胞における酵素的重合よりもむしろ合成有機化学によって産生された、特定のヌクレオチドの配列を含む核酸を意味する。

本明細書中で使用される場合、「標的配列」は、アッセイされるべき配列（例えば、目的の遺伝子、ｃＤＮＡまたはＲＮＡにおける配列）を意味する。

他に規定されない限り、本明細書中で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般に理解される意味と同じ意味を有する。競合する場合、本出願（定義を含む）が支配する。本明細書中で記載される全ての刊行物、特許および他の参考文献は、参考として援用される。

以下で示される物質、方法および実施例は、例示のみであり、限定を意図しない。本発明の他の特徴および利点は、詳細な説明および特許請求の範囲から明白になる。

（発明の詳細な説明）
本発明において、公知の要素または工程の新規の組み合わせが、ＲＴ−ＰＣＲによるＲＮＡの絶対定量のためのＰＣＲキャリブレーションデータの生成における使用のための、ｃＲＮＡを得るための単純な方法に集合されている。効率の増大は、これを実時間ＲＴ−ＰＣＲによるｍＲＮＡの絶対定量を多くの異なった標的配列を含む高処理条件で行うことを実用的にした方法によって提供される。従って、この方法は、生物学的基礎研究および薬物発見プログラムのような状況において有用である。

本発明は、有利にも、標的配列を含むｃＤＮＡを含むプラスミドを得る必要が全くない。さらに、本発明は、ｃＤＮＡを含む（そして他のオープンリーディングフレームを含まない）プラスミドの制限フラグメントを作製し、そし精製する必要がない。この単純化は、合成オリゴヌクレオチドをインビトロ転写工程と組み合わせて用いることからもたらされる。インビトロ転写工程の後、従来の実時間ＰＣＲ方法論が、改変を伴うかまたは伴わずに適用され得る。インビトロ転写工程に続く工程の種々の局面の詳細な考察については、一般に、ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ，１９９７，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓを参照のこと。Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，１９８９，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓもまた、参照のこと。

インビトロ転写によって得られたＲＮＡが、ＲＮＡの絶対定量のためのＰＣＲキャリブレーションデータを生成するための使用される場合、インビトロ転写工程によって得られたＲＮＡのサンプルは、定量的にアッセイされる。これは、例えば、ＲＮＡの液体の吸収を２６０ｎｍ（Ａ_２６０）で測定することによってなされ得る。Ａ_２６０値は、ＲＮＡ濃度値に変換され得、これは、含まれるｃＲＮＡ分子の計算された分子量に基づき、コピー数に変換され得る。

合成オリゴヌクレオチドの設計は、当該分野の通常技術の範囲内である。一般に、合成オリゴヌクレオチドは、単位複製配列、プロモーター配列および任意の単位複製配列フランキング配列を含む（図１）。合成オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列は、単位複製配列の配列、標的配列内の単位複製配列に隣接する配列、およびプロモーター配列の選択を含む考慮に依存する。

単位複製配列の長さは、重要ではない。好ましくは、単位複製配列長は、３０〜７０ヌクレオチドの範囲である。より好ましくは、４０〜６０ヌクレオチドの範囲である。ＰＣＲ系における特定の単位複製配列の増幅は、適切な順プライマーおよび適切な逆プライマーの設計および合成によって達成される。ＰＣＲプライマーの設計および合成は、当該分野で周知であり、市販のプライマー設計ソフトウェア、試薬および装置を用いる。このような市販のソフトウェアの例は、ＰｒｉｍｅｒＥｘｐｒｅｓｓ（登録商標）（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）である。

５’フランキング配列、３’フランキング配列、またはその両方が、隣接する単位複製配列に含まれ得る。好ましくは、両方が含まれる。フランキング配列は、存在する場合、配列および長さにおいて互いに異なる。任意のフランキング配列の長さは、重要ではない。好ましくは、各府ランキング配列は、２〜２０ヌクレオチドであり、より好ましくは、８〜１２ヌクレオチドである。フランキング配列のヌクレオチド配列は、重要ではない。例えば、これは、標的配列にハイブリダイズするように設計され得るが、このような相補性は必須ではない。本発明の幾つかの実施形態において、合成オリゴヌクレオチドにおける５’フランキング配列は、ポリＴテイルを含むか、またはポリＴテイルからなる。これは、その後生成されるｃＲＮＡ内に対応するポリＡテイルを生じ、これは、逆転写反応をプライミングするために有用である。好適なポリＴ（ポリＡ）テイルは、５〜２０ヌクレオチドであり、約１６ヌクレオチドが好ましい。

プロモーター配列が、合成オリゴヌクレオチド内に組み込まれる。インビトロ転写反応において使用される反応条件下で効率的に機能する任意のプロモーター配列が、使用され得る。バクテリオファージプロモーター配列が、インビトロ転写反応のためにしばしば使用される。本発明において有用なプロモーターの特定の例は、Ｔ７、ＳＰ６およびＴ３プロモーターである。好ましいＴ７プロモーター配列は、Ｔ７プロモーター配列であり、例えば、５’ＣＣＴＡＴＡＧＴＧＡＧＴＣＧＴＡＴＴＡ ３’（配列番号１）。当業者は、プロモーターの末端は、常にきちんと定義されるわけではなく、天然に存在するプロモーター配列の重要でない変化が、プロモーター機能を維持したまま（または改善さえして）しばしば起こり得る。好適なプロモーター配列は、過度の実験をすることなく、当業者によって選択され得、そして組み込まれ得る。本発明における使用のために好適なプロモーター配列は、市販されている。

合成オリゴヌクレオチドの全体の長さ（すなわち、単位複製配列、プロモーター、任意の単位複製配列フランキング配列を含む）は、化学合成を可能にするために十分短くなければならず、インビトロ転写を可能にするために十分長くなければならない。多くの場合、この長さは、６０〜１４０ヌクレオチドの範囲である。好ましくは、この長さは、７０〜１３０ヌクレオチド、８０〜１２０ヌクレオチド、または９０〜１１０ヌクレオチドの範囲である。

合成オリゴヌクレオチドの正確な長さは、上で考察した配列構成要素に関する特定の選択に従って設計される。一旦設計されると、合成オリゴヌクレオチドは、当業者によって公知の方法、物質および装置を用いて合成され得る。本発明における使用のために好適な合成オリゴヌクレオチドは、市場の供給元（例えば、Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｎｏｖａｔｏ，ＣＡ）およびＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））から得られ得る。

本発明は、一般に、適用可能な分析の方法論を含むことが理解されるべきである。従って、本発明は、いかなる特定の標的配列、単位複製配列または合成オリゴヌクレオチドに対しても、特異的ではない。

本発明における使用のための合成オリゴヌクレオチドは、任意の好適な合成方法によって得られ得る。１００ヌクレオチドを優に超える所定の配列を有するオリゴヌクレオチドの合成のための方法、物質および装置は、当該分野で公知である。例えば、Ｃｈｅｎｇら，２００２，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３０（１８）ｅ９３を参照のこと。本発明における使用のためにカスタム合成されたオリゴヌクレオチドは、市場の供給元（例えば、Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．（Ｎｏｖａｔｏ，ＣＡ）；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））から得られ得る。合成オリゴヌクレオチドの精製は、従来技術（例えば、逆相ＨＰＬＣ）を用いて達成され得る。合成オリゴヌクレオチドの配列は、標準的な配列決定方法によって確認され得る。

本発明のインビトロ転写工程は、公知の技術および物質を用いて実施され得る。所望の収率の達成は、高ヌクレオチド濃度および高ポリメラーゼ濃度の存在下でのＲＮＡ合成のための最適化反応条件を含み得る。インビトロ転写工程を実施するための試薬およびキットは、市販されている。好適な市販の転写キットは、ＭＥＧＡｓｈｏｒｔｓｃｒｉｐｔ^ＴＭＴ７キット（Ａｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ；カタログ番号１３５４）である。部分的一本鎖テンプレートが、インビトロ転写反応のために使用され得る。例えば、Ｔ７プロモーター領域に対するプライマー相補性が、短い二本鎖領域を作製するために使用され得、この二本鎖領域に対し、Ｔ７ポリメラーゼが結合し、転写を開始する。あるいは、二本鎖テンプレートが、使用され得る。例えば、プライマーを合成オリゴヌクレオチドのプロモーター領域にアニールし得、そしてこれをＤＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｋｌｅｎｏｗフラグメント）を用いて伸長させ得る。次いで、得られた二本鎖テンプレートは、精製され得、そしてインビトロ転写に使用され得る。二本鎖テンプレートアプローチの改変において、合成オリゴヌクレオチドに相補的である完全な第２鎖が、合成され得、アニールされ得る。ｃＲＮＡ生成物は、単一種として得られるべきである。これは、例えば、ゲル電気泳動によって評価され得る。

信頼し得る標準曲線の作成のために、ｃＲＮＡの正確な連続希釈が所望される。ＲＮＡ標準の調製および特徴付けに関しては、一般に、Ｃｏｌｌｉｎｓら，１９９５，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２２６：１２０〜１２９を参照のこと。好ましくは、キャリアＲＮＡが、連続希釈において使用される。好ましいキャリアＲＮＡは、約２５ｎｇ／ｍｌの酵母全ＲＮＡ（Ａｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ；カタログ番号７１１８）である。

本発明に従う方法において、ｃＤＮＡの合成は、従来的逆転写反応において達成され得る。逆転写酵素反応のための方法および物質は、当該分野で公知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前出）を参照のこと。逆転写反応のためのキットは、種々の市場の供給元（例えば、ｈｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ Ａｒｃｈｉｖｅ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ））から得られ得る。

本発明は、以下の実施例によってさらに例示される。実施例は、例示の目的のみに提供される。これらは、決して本発明の範囲または内容を限定すると考えられるべきではない。

（プライマー、プローブ設計およびオリゴヌクレオチドテンプレート）
Ｔａｑｍａｎ順プライマーおよびＴａｑｍａｎ逆プライマー、ならびに５’ＦＡＭ標識化ＭＧＢプローブを、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ共通配列から、ＰｒｉｍｅｒＥｘｐｒｅｓｓ（登録商標）（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して設計した。インビトロ転写反応のためのオリゴヌクレオチドテンプレートを、遺伝子特異的配列の１０塩基対を、単位複製配列の５’末端および３’末端に付加し、その後にＴ７プロモーター領域（５’ＣＣＴＡＴＡＧＴＧＡＧＴＣＧＴＡＴＴＡ ３’（配列番号１）からなる）を、３’の１０塩基対の外側に付加することによって設計した。

（合成オリゴヌクレオチドを使用するインビトロ転写）
部分的に一本鎖のオリゴヌクレオチドテンプレートを使用するインビトロ転写反応を、市販のキット（Ｔ７−ＭＥＧＡｓｈｏｒｔｓｃｒｉｐｔ Ｋｉｔ，Ａｍｂｉｏｎ Ｉｎｃ．，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）を使用して実施した。部分的に一本鎖のテンプレートを、等モル量（２０μＭ）の１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＬ（ｐＨ８．０），１ｍＭ ＥＤＴＡ，０．１ＭＮａＣｌ）中で９５℃まで５分間熱し、そして室温まで冷却して、合成オリゴヌクレオチドテンプレートのＴ７プロモーター領域のみに対して相補的であるＴ７プライマー（５’ＡＡＴＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧ ３’）をアニールすることによって調製した。部分的に一本鎖のテンプレート（１．５反応濃度）を、製造業者（Ａｍｂｉｏｎ Ｉｎｃ．，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）のプロトコールに従い、３７℃で４時間のインビトロ転写反応で用いた。オリゴヌクレオチドテンプレートＤＮＡを、２ＵのＲＮａｓｅ非含有ＤＮａｓｅ １（Ａｍｂｉｏｎ Ｉｎｃ．，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）を３７℃で１５分間添加することによって除去した。反応を、２０μＬのホルムアミド（５０％ ｖ／ｖ）の添加、ボルテックス、および９５℃で３分間の過熱によって停止した。インビトロ転写反応物を、市販のキット（ＭＥＧＡｃｌｅａｒ Ｋｉｔ^ＴＭ，Ａｍｂｉｏｎ）を用い、供給元の推奨プロトコールに従って精製した。

ｃＲＮＡの濃度を、２６０ｎｍでのＵＶ吸収の測定によって決定した。ｃＲＮＡの質を、１５０ｎｇのアリコートを１０％ ＴＢＥ尿素ポリアクリルアミド（ＢｉｏＲａｄ，Ｉｎｃ．，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）上に泳動させることによって評価した。

（標準曲線のためのｃＤＮＡの合成）
サイズ測定用ゲル（ｓｉｚｉｎｇ ｇｅｌ）上で正しい大きさの単一のバンドを産生した相補的ＲＮＡ調製物を、酵母剪断ＲＮＡに加えた（これの中にスパイクした）。まず、ｃＲＮＡを、８連続の１：１０の連続希釈に供した。各希釈物のアリコートを、酵母剪断ＲＮＡ（１μｇ／μＬ）（ＡｍｂｉｏｎＩｎｃ．，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）のバックグラウンドに加えた。相補的ＤＮＡを、１０μｇのスパイクした酵母全（剪断）ＲＮＡをテンプレートとして用いることによって実施する、８つの対応する逆転写反応物（１００μＬ）中で生成した。逆転写反応を、市販のキット（Ｈｉｇｈ−ＣａｐａｃｉｔｙｃＤＮＡ Ａｒｃｈｉｖｅ Ｋｉｔ，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、供給元の推奨プロトコールに従って実施した。

（実験サンプルからのｃＤＮＡの合成）
肺、肝臓、心臓、脾臓、胸腺、胚および脳からのラット全ＲＮＡ（１０μｇ）（Ａｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．）を、逆転写キット（Ｈｉｇｈ ＣａｐａｃｉｔｙｃＤＮＡ Ａｒｃｈｉｖｅ Ｋｉｔ，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いたｃＤＮＡ合成反応（キットの供給元によって供給されるプロトコールに従う）のためのテンプレートとして使用した。各ｃＤＮＡ合成反応物（１００ｎｇ全ＲＮＡ開始テンプレート）からの１μｌのアリコートを、各定量的ＲＴ−ＰＣＲ反応のための実験的サンプルとして使用した。

（Ｔａｑｍａｎ熱サイクル）
標準および実験サンプルのための４連のＰＣＲ反応を、９６ウェルプレート中で混合し、次いで、３８４ウェル光学プレート（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）に移した。実時間反応を、７９００ＨＴ ｔｈｅｒｍａｌ ｃｙｃｌｅｒモデル（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）中で回した。熱サイクル条件は、以下であった：５０℃で２分間（ウラシルＮ−脱グリコシダーゼ消化）；９５℃で１０分間（Ｔａｑ熱安定性ポリメラーゼの活性化）；ならびに９５℃で１５秒および６０℃で６０秒の４０サイクル、９００ｎＭの順プライマーおよび逆プライマー、２００ｎＭ Ｔａｑｍａｎ ＭＧＢプローブ、および１×Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いた。各反応ウェルにおいて、蛍光発光を、７秒毎にラン（ｒｕｎ）の長さについて測定した。標準曲線を、標準を使用して得られたＰＣＲデータから作成した（図２）。

転写量を、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用した絶対ｃＲＮＡ標準曲線との比較により、各実験サンプルについて決定した。種々の実験サンプルについてのコピー数を、実験サンプルＰＣＲデータの標準曲線に対する比較によって得た。コピー数の結果を、図３に要約する。

他の実施形態は、以下の特許請求の範囲の範囲内である。

図１は、本発明における使用のための合成オリゴヌクレオチドの一般構造の略図である。図１に図示される構造は、５’フランキング配列および３’フランキング配列を含むが、これらは任意である。 図２は、ＲＴ−ＰＣＲによるｍＲＮＡの絶対定量のための標準曲線である。精製ｃＲＮＡを、６回連続した１：１０連続希釈に供し、次いで、酵母全ＲＮＡバックグラウンドに置いた（「スパイクした」）。ｃＲＮＡの各希釈物を、ＲＴ−ＰＣＲのための開始テンプレートとして使用されるｃＤＮＡの合成のために使用した。ＲＴ−ＰＣＲを、４連で行った（Ｒ^２＝．９９８０）。Ｃｔ値（サイクル閾値）が、ＲＴ−ＰＣＲアッセイの結果である。Ｃｔは、反応が指数関数的になったときに記録されるサイクル数である。これが起こるとき、従って、以下の等式が当てはまる：Ｃｔ＝２^初期量。Ｃｔは、未知数および標準について生成される。次いで、未知数に対するＣｔ値を、Ｃｔ標準値と比較した。 図３は、本発明に従うｍＲＮＡの絶対定量の結果を示す棒グラフである。伝令ＲＮＡコピー数を、ラットからの組織（肺、肝臓、腎臓、心臓、脾臓、胸腺、胚および脳）において、図２に示す標準曲線に基づいて決定した。

【配列表】

Claims (18)

1. ＲＴ−ＰＣＲによるＲＮＡの絶対定量のためのキャリブレーションデータを生成する方法であって、該方法は、以下：
   （ａ）単位複製配列および該単位複製配列に対して３’に位置するプロモーター配列を含む合成オリゴヌクレオチドを提供する工程；
   （ｂ）該オリゴヌクレオチドのインビトロ転写により、相補的ＲＮＡ（ｃＲＮＡ）を合成する工程；
   （ｃ）独立した方法により、該ｃＲＮＡを定量的にアッセイする工程；および
   （ｄ）既知の量の該ｃＲＮＡを用いてキャリブレーションデータを生成する工程、
   を、包含する方法。
2. 前記プロモーター配列が、バクテリオファージプロモーター配列である、請求項１に記載の方法。
3. 前記バクテリオファージプロモーター配列が、Ｔ７プロモーター配列である、請求項２に記載の方法。
4. 前記Ｔ７プロモーター配列が、本質的に５’ＣＣＴＡＴＡＧＴＧＡＧＴＣＧＴＡＴＴＡ ３’（配列番号１）からなる、請求項３に記載の方法。
5. 前記単位複製配列に隣接する２〜２０個のヌクレオチドからなる５’フランキング配列をさらに含む、請求項１に記載の方法。
6. 前記５’フランキング配列が、８〜１２個のヌクレオチドからなる、請求項５に記載の方法。
7. 前記５’フランキング配列が、ポリＴテイルを含む、請求項５に記載の方法。
8. 前記合成オリゴヌクレオチドが、前記単位複製配列と前記プロモーター配列との間の２〜２０個のヌクレオチドからなる３’フランキング配列をさらに含む、請求項１に記載の方法。
9. 前記３’フランキング配列が、８〜１２個のヌクレオチドからなる、請求項８に記載の方法。
10. 前記単位複製配列の長さが、３０〜７０ヌクレオチドである、請求項１に記載の方法。
11. 前記単位複製配列の長さが、４０〜６０ヌクレオチドである、請求項１０に記載の方法。
12. 前記合成オリゴヌクレオチドの長さが、６０〜１４０ヌクレオチドである、請求項１に記載の方法。
13. 前記合成オリゴヌクレオチドの長さが、７０〜１３０ヌクレオチドである、請求項１２に記載の方法。
14. 前記合成オリゴヌクレオチドの長さが、８０〜１２０ヌクレオチドである、請求項１３に記載の方法。
15. 前記合成オリゴヌクレオチドの長さが、９０〜１１０ヌクレオチドである、請求項１４に記載の方法。
16. 試験サンプル中の単位複製配列を含む核酸分子の存在量を決定する方法であって、該方法は、以下：
    （ａ）単位複製配列および該単位複製配列に対して３’に位置するプロモーター配列を含む合成オリゴヌクレオチドを提供する工程；
    （ｂ）該オリゴヌクレオチドのインビトロ転写により、ｃＲＮＡを合成する工程；
    （ｃ）該ｃＲＮＡを用いて連続希釈物を生成する工程；
    （ｄ）ｃＲＮＡの逆転写により、一本鎖ｃＤＮＡを合成する工程；
    （ｅ）ＲＴ−ＰＣＲキャリブレーションデータを生成する工程；
    （ｇ）該試験サンプルからＲＴ−ＰＣＲ試験サンプルデータを得る工程；および
    （ｈ）該ＰＣＲ試験サンプルデータを該ＰＣＲキャリブレーションデータと比較する工程、
    を、包含する方法。
17. 前記ｃＲＮＡを定量する工程をさらに包含する、請求項１６に記載の方法。
18. 前記一本鎖ｃＤＮＡを合成する前に、前記ｃＲＮＡを異種ＲＮＡと混合する工程をさらに包含する、請求項１７に記載の方法。

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