ES2341013T3 - Metodo para la medicion cuantitativa y/o comparativa de niveles de expresion de mrna en muestras biologicas pequeños. - Google Patents
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Abstract
Un método para la valoración cuantitativa y/o comparativa de las cantidades relativas de transcritos de mRNA presentes en una muestra celular o tisular, caracterizado por las operaciones de: (a) llevar a cabo la transcripción inversa del mRNA contenido en la muestra utilizando cebadores modificadores de secuencia para diversos genes en la misma reacción, para obtener un conjunto de moléculas de cDNA secuencialmente modificadas, en que los cebadores modificadores de secuencia son oligonucleótidos que comprenden tres segmentos funcionales: (i) un segmento 5''-terminal que comprende una secuencia nucleotídica, que es complementaria de la secuencia de mRNA así como de la secuencia de DNA de cadena sentido de un gen específico y contiene la secuencia nucleotídica complementaria de los sitios ligantes para los cebadores cadena abajo utilizados en subsiguientes reacciones de multiplicación, (ii) un segmento central que consiste en una secuencia nucleotídica que comprende uno o múltiples nucleótidos, que no son complementarios de la secuencia de mRNA ni de la secuencia de DNA de cadena sentido de dicho gen, y (iii) un segmento 3''-terminal que comprende una secuencia nucleotídica, que es complementaria de la secuencia de mRNA así como de la secuencia de DNA de cadena sentido de dicho gen, (b) eliminar o inactivar los cebadores modificadores de secuencia superfluos después de la compleción de la transcripción inversa, (c) llevar a cabo reacciones de multiplicación individuales para cada uno de los genes analizados, de modo que, en cada una de las reacciones, moldes de cDNA secuencialmente modificados se multipliquen conjuntamente con un molde de DNA de referencia, de manera competitiva utilizando los mismos cebadores génicamente específicos para ambos moldes para generar cantidades mensurables de productos de multiplicación, (d) medir cuantitativamente las cantidades y determinar los niveles relativos de los productos de multiplicación derivados de los moldes de cDNA secuencialmente modificado y de DNA de referencia para obtener una relación de cDNA a DNA génicamente específica en cada una de las reacciones de multiplicación individuales, utilizando las modificaciones secuenciales en las moléculas de cDNA generadas durante la transcripción inversa para distinguir los productos de multiplicación derivados de cDNA de los productos de multiplicación derivados del molde de cDNA de referencia presentes en la misma reacción de multiplicación, y (e) combinar las relaciones de cDNA a DNA génicamente específicas determinadas en las reacciones de multiplicación individuales para generar un perfil de dichas relaciones, específico de la muestra, que refleje las cantidades relativas de transcritos de mRNA originalmente presentes en la muestra.
Description
Método para la medición cuantitativa y/o
comparativa de niveles de expresión de mRNA en nuestras biológicas
pequeñas.
El presente invento se refiere al diagnóstico de
estados patológicos y fisiológicos en seres humanos y al control
del tratamiento así como al seguimiento de dichos estados. El
invento se refiere también a la caracterización de cambios celular
o tisularmente específicos en los patrones y vías de expresión
génica de diferentes estados. La técnica descrita permite la
medición comparativa y/o cuantitativa de transcritos de mRNA
contenidos en pequeñas muestras celulares o tisulares.
El desarrollo de tecnologías relacionadas con
ciencias biológicas ha conducido a un rápido aumento de la
información genética disponible. La compleción de la secuenciación
del genoma humano y la política del Proyecto del Genoma Humano
sobre accesibilidad inmediata a los datos han permitido crear el
fundamento para estudiar la expresión génica en estados
fisiológicos y patológicos. Técnicas tales como las micromatrices
para expresión génica, la reacción en cadena de la polimerasa con
presentación diferencial (DD-PCR; del inglés,
differential display polymerase chain
reaction) y la reacción en cadena de la polimerasa con
transcriptasa inversa en modo cuantitativo
(qRT-PCR; del inglés, quantitative
reverse transcriptase polymerase chain
reaction), junto con algoritmos estadísticos de
agrupamiento, han proporcionado herramientas para la caracterización
de patrones y vías de expresión génica. Esto ha conducido a la
definición de nuevas subcategorías de enfermedades conocidas,
basadas en perfiles de expresión génica, con pronósticos diferentes
y respuestas potencialmente diferentes a fármacos específicos y
otras modalidades de tratamiento.
La tecnología de micromatrices de DNA ha sido el
principal contribuyente a la rápida acumulación de datos de
expresión génica. Utilizando esta tecnología, se han desarrollado
clasificaciones basadas en expresión génica para diversas
enfermedades malignas. Sin embargo, en la actualidad, la tecnología
de micromatrices para expresión génica presenta importantes
limitaciones técnicas como método diagnóstico en un laboratorio
clínico ya que es bastante insensible y su precisión cuantitativa
sólo es moderada.
El análisis de la expresión génica en un
escenario clínico está sometido a desafíos técnicos específicos a
causa de las características de los diferentes tipos de muestras
clínicas. Las muestras tisulares sólidas, tal como una muestra
histológica de tejido embebido en parafina o congelado, contienen
normalmente una mezcla heterogénea de diferentes tipos celulares.
La medición de la expresión génica en un tipo celular o tisular
específico de una muestra requiere el aislamiento de células o
islotes de células a partir de secciones microscópicas, por
ejemplo, por microdisección, o la graduación de las cantidades
relativas de los diferentes tipos celulares presentes en secciones
cortadas de la muestra. En biopsias con aguja y muestras
citológicas, la cantidad de células muestreadas es normalmente
pequeña y se desconoce la cantidad exacta de células. En muestras de
sangre, la proporción de células diana es pequeña en muchos casos y
se requiere el enriquecimiento de las muestras en cuanto a tipos
celulares específicos. La recuperación de RNA mensajero (mRNA) de
estos tipos de muestras es a menudo limitada, lo que aumenta los
requisitos de sensibilidad para las técnicas utilizadas para el
análisis de la expresión génica. Además, durante la preparación y
el almacenamiento de las muestras, así como durante la purificación
del ácido nucleico, se producen variaciones en la degradación y
recuperación del mRNA de una muestra a otra. Con objeto de obtener
resultados comparables de las muestras tisulares obtenidas in
vivo, se requiere la normalización de las variaciones en los
niveles y la integridad del mRNA de una muestra a otra.
La qRT-PCR ha sido muy usada
para validar los resultados sobre niveles de expresión génica que se
han obtenido al utilizar micromatrices para expresión génica. La
sensibilidad de la qRT-PCR es suficiente para la
medición cuantitativa de la expresión génica en muestras que
contienen cantidades mínimas de células o incluso células sueltas.
A causa de la naturaleza logarítmica de la multiplicación de los
ácidos nucleicos durante la PCR, esta técnica es sensible a
variaciones de un tubo a otro debidas a pequeñas diferencias en las
eficacias de reacción. Para solventar este problema, se pueden
añadir moldes testigo internos de RNA o DNA a las muestras para
determinar las eficacias de reacción en las reacciones individuales.
Las variaciones en los niveles y la integridad del mRNA de una
muestra a otra son típicamente controladas normalizando los niveles
de expresión de mRNA de los genes específicos de interés con
respecto a los niveles de expresión de genes domésticos o a la
cantidad de RNA total o RNA ribosómico (rRNA) en la muestra, o
mediante la cuantificación comparativa del mRNA de múltiples genes
en la misma muestra.
Joo et al. [en el Journal of Virological
Methods 100 (2002), páginas 71-81, y en la solicitud
KR2002089746 A de patente] han descrito un método para modificar el
tamaño del molde de cDNA durante la transcripción inversa con
objeto de discriminarlo del DNA genómico. En esta técnica, se
utiliza un cebador ancla modificador del tamaño en la reacción de
transcripción inversa para insertar, en el cDNA generado, un sitio
ligante del cebador modificado. Esta técnica se basa en la
suposición de que el DNA genómico permanece como doble cadena cuando
se lleva a cabo la transcripción inversa bajo condiciones no
desnaturalizantes y, por lo tanto, no puede actuar como molde para
la transcripción inversa. En la operación de multiplicación, se
multiplican los moldes de cDNA y de DNA genómico del mismo gen
utilizando un cebador común cadena arriba y cebadores cadena abajo
distintos. Los amplicones derivados de cDNA y DNA genómico
generados difieren en cuanto a longitud para permitir la detección
y la cuantificación separadas. Generalmente, las técnicas de
RT-PCR requieren la multiplicación de una secuencia
que atraviesa al menos un límite de exón-exón, con
objeto de permitir la separación de los productos de multiplicación
derivados de cDNA y de DNA genómico. La técnica descrita por Joo
et al. permite la diferenciación del cDNA de su
correspondiente DNA genómico dentro de los límites de un solo exón
después de la multiplicación por RT-PCR. También
permite la comparación de los niveles relativos de mRNA y DNA
génicamente específicos.
D. Sun et al. ("Quantifying
porphobilinogen deaminase mRNA in microdissected nephron segments by
a modified RT-PCR", Kidney International,
volumen 61, 2002, páginas 336-341) describen un
método para la valoración cuantitativa de la cantidad de
transcritos de mRNA presentes en una muestra celular o tisular
mediante RT-PCR mutagénica
("MRT-PCR", páginas
337-338).
El presente invento proporciona un método para
la valoración cuantitativa y/o comparativa de las cantidades
relativas de transcritos de mRNA presentes en una muestra celular o
tisular. En este método, moldes de cDNA secuencialmente modificados
son conjunta y competitivamente multiplicados con un molde de DNA de
referencia utilizando los mismísimos cebadores. Esto permite
utilizar el DNA genómico contenido en, o añadido a, la muestra como
un molde de referencia universal para normalizar las variaciones en
las eficacias de multiplicación de un tubo a otro entre distintas
reacciones de multiplicación génicamente específicas. Al medir
cuantitativamente las cantidades y determinar los niveles relativos
de los productos de multiplicación derivados de moldes de cDNA
secuencialmente modificado y de DNA de referencia, se obtiene una
relación génicamente específica de cDNA a DNA en cada reacción de
multiplicación individual. Al combinar las relaciones de cDNA a DNA
para cada uno de los genes analizados, se genera un perfil de
expresión de genes específicos de muestras que refleja las
cantidades relativas de transcritos de mRNA originalmente presentes
en la muestra.
En el presente invento, se multiplican
conjuntamente moldes de cDNA secuencialmente modificado y de DNA de
referencia con los mismísimos cebadores en los mismos recipientes de
reacción. De esta manera, los niveles relativos de los productos de
multiplicación derivados de los moldes de cDNA y de referencia
permanecen constantes incluso cuando las reacciones de
multiplicación se desarrollan hasta la fase de meseta. Esto permite
la optimización de la sensibilidad del ensayo para muestras que
contienen sólo cantidades mínimas de transcritos de mRNA.
El presente invento proporciona un método
mediante el cual se lleva a cabo la transcripción inversa usando
cebadores modificadores de secuencia para uno o varios genes en la
misma reacción, para obtener un conjunto de moléculas de cDNA
secuencialmente modificadas. Las moléculas de cDNA son modificadas
en una o varias posiciones nucleotídicas sin que se alteren los
sitios ligantes de cebador utilizados en las subsiguientes
reacciones de multiplicación. Después de la compleción de la
reacción de transcripción inversa, los cebadores modificadores de
secuencia superfluos son eliminados o inactivados; es decir, se
evita que participen en las subsiguientes reacciones de
multiplicación. Se llevan a cabo reacciones de multiplicación
individuales para cada uno de los genes analizados, de modo que, en
cada una de las reacciones, se multiplican conjuntamente moldes de
cDNA secuencialmente modificado y de DNA de referencia de un modo
competitivo, utilizando los mismos cebadores génicamente
específicos. El molde de DNA de referencia comprende DNA genómico
contenido en la muestra analizada o añadido a la muestra antes de
la multiplicación. También puede comprender DNA sintético o clonado.
Las modificaciones secuenciales generadas durante la transcripción
inversa se incorporan a los productos de multiplicación derivados
de cDNA y se utilizan para la detección y la determinación separadas
de la relación de los productos de multiplicación derivados del
cDNA y del DNA de referencia en cada una de las reacciones de
multiplicación individuales. Las relaciones de cDNA a DNA
génicamente específicas determinadas en las reacciones de
multiplicación individuales son combinadas para generar un perfil
de dichas relaciones, específico de la muestra, que refleje las
cantidades relativas de transcritos de mRNA originalmente presentes
en la muestra.
En consecuencia, el objeto primario del presente
invento es un método para la evaluación cuantitativa y/o
comparativa de las cantidades relativas de transcritos de mRNA
presentes en una muestra celular o tisular, método que se
caracteriza por las operaciones (a) a (e) definidas en la
Reivindicación 1 adjunta. Más adelante se describen los diferentes
modos de implementar el método del invento.
Figura
1
Dibujo esquemático que muestra los segmentos
funcionales de los cebadores modificadores de secuencia.
Figura
2
Dibujo esquemático del principio del presente
invento. El molde de DNA de referencia puede ser incluido en la
operación de transcripción inversa, como se muestra (gráfico
superior), o puede ser añadido antes de la operación de
multiplicación. En la operación de detección (gráfico inferior), se
muestra con fines ilustrativos una sonda de hibridación doblemente
marcada. Sin embargo, el presente invento no depende de ninguna
técnica de detección específica, sino que se puede utilizar
cualquier método que permita la detección cuantitativa separada de
los productos de multiplicación derivados de los moldes de cDNA y de
DNA de referencia.
Figura
3
Intervalo de medición del ensayo para
cuantificar los niveles relativos de moldes de cDNA y de DNA de
referencia. Diluciones de cDNA de 10 veces, inversamente
transcritas a partir de 10^{9} copias de cRNA de tripsinógeno 1 y
10^{3} copias de DNA de tripsinógeno clonado (gráficos superiores)
o DNA genómico de 500 células (gráficos inferiores), fueron
conjuntamente multiplicadas en reacciones PCR anidadas. Los
productos de multiplicación del cDNA secuencialmente modificado y
del DNA genómico fueron detectados y cuantificados mediante
minisecuenciación en fase sólida. El intervalo de medición del
ensayo era más de dos órdenes de magnitud (mostrado en negro en los
gráficos de la parte derecha). El número de copias teórico del molde
de cDNA se basa en la suposición de que la eficacia de la reacción
de transcripción inversa era 100%.
Figura
4
Capacidad del ensayo de minisecuenciación para
discriminar moldes que difieren en posiciones nucleotídicas únicas.
Los productos de PCR derivados del cDNA de tripsinógeno 1 (gráfico
superior), DNA de tripsinógeno 1 clonado (gráfico central) y DNA
genómico de células tumorales (gráfico inferior) fueron
minisecuenciados con cuatro diferentes nucleótidos (dCTP, dGTP,
dATP y dTTP) marcados con ^{3}H.
Figura
5
Reproducibilidad del ensayo a la hora de
analizar un perfil de expresión de genes en células cultivadas.
Perfil de expresión de genes de MMP-2,
MMP-9, uPA, uPAR y p53 en células COLO 205
cultivadas, según se analiza durante un periodo de dos meses en
cinco experimentos independientes. Se ajusta a 100 la suma de las
relaciones de cDNA a DNA genómico de los genes individuales en cada
experimento independiente.
Figura
6
Reproducibilidad del ensayo a la hora de
analizar un perfil de expresión de genes en células cultivadas.
Perfil de expresión de genes de MMP-2,
MMP-9, uPA, uPAR y p53 en células COLO 205
cultivadas, según se analiza durante un periodo de dos meses en
cinco experimentos independientes. Los resultados representan los
valores medios \pm 1 error estándar de los cinco experimentos
independientes. Se ajusta a 100 la suma de las relaciones de cDNA a
DNA genómico de los genes individuales en cada experimento
independiente.
Figura
7
Intervalo de medición del ensayo para
cuantificar los niveles relativos de moldes de cDNA y de DNA de
referencia. Diluciones de cDNA de 10 veces, inversamente
transcritas a partir de 10^{9} copias de cRNA de tripsinógeno 2
(gráfico superior) o metaloproteinasa matricial 2
(MMP-2; gráfico inferior) y 20 ng de DNA genómico
humano, fueron conjuntamente multiplicadas en una reacción PCR en
un instrumento LightCycler. Los productos de multiplicación de los
moldes de cDNA secuencialmente modificado y de DNA genómico fueron
cuantificados mediante un análisis de curvas de fusión en un
instrumento LightCycler. El intervalo de medición del ensayo era más
de dos órdenes de magnitud (mostrado en negro en los gráficos de la
parte derecha). El número de copias teórico del molde de cDNA se
basa en la suposición de que la eficacia de la reacción de
transcripción inversa era 100%.
\vskip1.000000\baselineskip
El presente invento proporciona un método para
la valoración cuantitativa y/o comparativa de las cantidades
relativas de transcritos de mRNA presentes en una muestra celular o
tisular. La muestra comprende un producto de lisis u
homogeneización de células o tejidos. El molde de DNA de referencia
comprende DNA genómico contenido en la muestra o aislado de otra
fuente, u oligonucleótidos o polinucleótidos de DNA clonados o
sintetizados. Cuando el DNA genómico contenido en la muestra se
utiliza como un molde de DNA de referencia, se puede aislar RNA y
DNA genómico de la muestra antes de la transcripción inversa. Cuando
el DNA genómico contenido en la muestra no se utiliza como un molde
de DNA de referencia, se aísla RNA de la muestra antes de la
transcripción inversa. El molde de DNA de referencia está presente
en, o se añade a, cada una de las muestras antes de la
multiplicación. El molde de DNA de referencia puede estar presente
en la muestra durante la transcripción inversa con tal de que sea
de doble cadena. Cuando el molde de DNA de referencia es distinto
del DNA genómico contenido en la muestra, es preferiblemente
añadido en cantidades iguales a cada una de las muestras después de
la transcripción inversa pero antes de la multiplicación.
\newpage
La transcripción inversa del mRNA contenido en
la muestra se lleva a cabo utilizando cebadores modificadores de
secuencia para uno o varios genes en la misma reacción, para obtener
un conjunto de moléculas de cDNA secuencialmente modificadas.
Cuando está presente un molde de DNA de referencia en la mezcla de
reacción durante la transcripción inversa, la reacción de
transcripción inversa se lleva a cabo en unas condiciones no
desnaturalizantes bajo las cuales el DNA contenido en la muestra
permanece principalmente en forma de doble cadena y no actúa como
un molde para la síntesis de cDNA.
Los cebadores modificadores de secuencia (Figura
1) comprenden tres segmentos funcionales: un segmento
5'-terminal que comprende una secuencia
nucleotídica, que es complementaria de la secuencia de mRNA así como
de la secuencia de DNA de cadena sentido de un gen específico, y
contiene la secuencia nucleotídica complementaria de los sitios
ligantes para los cebadores cadena abajo utilizados en subsiguientes
reacciones de multiplicación; un segmento central que consiste en
una secuencia nucleotídica que comprende uno o múltiples
nucleótidos, que no son complementarios de la secuencia de mRNA ni
de la secuencia de DNA de cadena sentido de dicho gen; y un
segmento 3'-terminal que comprende una secuencia
nucleotídica, que es complementaria de la secuencia de mRNA así
como de la secuencia de DNA de cadena sentido de dicho gen.
De esta manera, el cDNA generado contiene una
modificación secuencial que comprende una o múltiples sustituciones,
inserciones o deleciones nucleotídicas en comparación con la cadena
antisentido de la correspondiente secuencia nucleotídica de DNA
genómico. Las modificaciones de las secuencias nucleotídicas están
situadas de tal modo que se incorporarán a los productos de
multiplicación pero no afectan a la secuencia nucleotídica de los
sitios ligantes de cebador utilizados en las subsiguientes
reacciones de multiplicación. Esto permite la multiplicación
conjunta de los moldes de cDNA modificado y un molde de DNA de
referencia que comprende DNA genómico, utilizando los mismísimos
cebadores.
Después de la compleción de la transcripción
inversa, es esencial evitar que los cebadores modificadores de
secuencia superfluos actúen como cebadores en las subsiguientes
reacciones de multiplicación génicamente específicas. Cualquier
cebador modificador de secuencia intacto transferido desde la
operación de transcripción inversa hasta las reacciones de
multiplicación podría cebar la multiplicación del molde de DNA de
referencia, lo que causaría la modificación de la secuencia
nucleotídica de parte del producto de multiplicación derivado del
molde de DNA de referencia. Dichas modificaciones serían idénticas a
la modificación secuencial generada en el transcrito de cDNA
durante la transcripción inversa, lo que haría que parte de los
productos de multiplicación derivados del molde de DNA de
referencia fueran idénticos a, y por lo tanto indistinguibles de, el
producto de multiplicación derivado del molde de cDNA
secuencialmente modificado. De esta manera, la cuantificación de
las cantidades relativas de los productos de multiplicación
derivados de cDNA y DNA no reflejaría las cantidades reales de los
moldes de cDNA secuencialmente modificado y de DNA de referencia
presentes en la muestra antes de la multiplicación.
Los cebadores modificadores de secuencia
superfluos pueden ser eliminados o inactivados, es decir, se evita
que actúen como cebadores en las subsiguientes reacciones de
multiplicación génicamente específicas, mediante, por ejemplo, una
degradación enzimática utilizando una exonucleasa específica para
DNA de cadena sencilla. Como resultado, los cebadores
oligonucleotídicos de cadena sencilla son degradados, pero los
híbridos de mRNA-cDNA de cadena doble y el DNA de
referencia contenidos en la muestra permanecen intactos.
Alternativamente, los cebadores modificadores de secuencia
superfluos pueden ser físicamente eliminados de la muestra por
filtración o por otros medios antes de la operación de
multiplicación.
También se puede evitar que los cebadores
modificadores de secuencia transferidos desde las reacciones de
transcripción inversa hasta las reacciones de multiplicación
génicamente específicas actúen como cebadores mediante una
hibridación con oligonucleótidos bloqueantes u otros agentes que se
unan específicamente a los segmentos funcionales
3'-terminal y/o central de los cebadores
modificadores de secuencia.
Después de la transcripción inversa y la
eliminación o inactivación de los cebadores modificadores de
secuencia superfluos, se transfieren partes alícuotas de la mezcla
de reacción a reacciones de multiplicación distintas. Las
reacciones de multiplicación individuales se llevan a cabo en
recipientes físicamente separados para cada uno de los genes
analizados, de modo que, en cada una de las reacciones, se
multiplican conjuntamente moldes de cDNA secuencialmente modificado
y el mismo molde de DNA de referencia, usando cebadores génicamente
específicos para generar cantidades mensurables de productos de
multiplicación. Los moldes de cDNA y de DNA de referencia de una
reacción de multiplicación individual son conjuntamente
multiplicados de modo competitivo utilizando los mismísimos
cebadores. La multiplicación puede ser llevada a cabo en una sola
reacción o en dos reacciones consecutivas utilizando cebadores
anidados. Los sitios ligantes de los cebadores de multiplicación
están preferiblemente situados en el mismo exón con objeto de
generar productos de multiplicación derivados de cDNA y DNA de
longitud igual o casi igual. Los sitios ligantes de los cebadores
de multiplicación están situados de tal manera que la modificación
secuencial generada en el molde de cDNA se incorporará al producto
de multiplicación. La multiplicación conjunta de los moldes de cDNA
secuencialmente modificado y de DNA de referencia en la misma
reacción y con los mismísimos cebadores da lugar a unas eficacias
de multiplicación casi iguales para los dos moldes, incluso cuando
las reacciones de multiplicación se desarrollan hasta la fase de
meseta. Como resultado, en una reacción de multiplicación
individual génicamente específica, los niveles relativos de los
productos de multiplicación que derivan de moldes de cDNA
secuencialmente modificado y de moldes de DNA de referencia reflejan
las cantidades relativas de dichos moldes originalmente presentes
en la reacción de multiplicación antes de la multiplicación. La
multiplicación puede ser llevada a cabo utilizando la reacción en
cadena de la polimerasa, la reacción en cadena de la ligasa, una
multiplicación mediada por transcripción, o cualquier otra reacción
enzimática que permita la multiplicación de dos moldes similares en
la misma reacción de un modo competitivo para que las
modificaciones secuenciales generadas en los moldes de cDNA durante
la transcripción inversa se incorporen a los productos de
multiplicación derivados de cDNA.
En el presente invento, durante la transcripción
inversa se genera una modificación en la secuencia nucleotídica de
las moléculas de cDNA. Estas modificaciones secuenciales se
incorporan a los productos de multiplicación derivados de cDNA y se
utilizan para distinguir los productos de multiplicación derivados
de cDNA de los productos de multiplicación derivados del molde de
DNA de referencia presentes en la misma reacción de
multiplicación.
La medición cuantitativa de los productos de
multiplicación puede ser llevada a cabo durante la multiplicación
(detección en tiempo real o cinética) usando sondas de hidrólisis
doblemente marcadas y secuencialmente específicas, sondas de
transferencia de energía por resonancia de fluorescencia, sondas
Molecular Beacon® o cualquier otra tecnología que permita la
detección cuantitativa individual de los productos de multiplicación
derivados de moldes de cDNA y de DNA de referencia. La medición
cuantitativa de los productos de multiplicación puede ser también
llevada a cabo después de la compleción de la reacción de
multiplicación (detección en el punto final) usando
minisecuenciación (extensión de un solo nucleótido de cebadores),
minisecuenciación cíclica, Pyrosequencing®, extensión de cebadores
específicos de alelo, análisis de curvas de fusión, sondas de
hibridación específicas de secuencias, espectrometría de masas o
cualquier otra tecnología que permita la detección cuantitativa
individual de los productos de multiplicación derivados de moldes
de cDNA y de DNA de referencia.
La multiplicación conjunta de los moldes de cDNA
secuencialmente modificado y de DNA de referencia en la misma
reacción con los mismísimos cebadores da lugar a una eficacia de
multiplicación casi igual para los dos moldes incluso cuando las
reacciones de multiplicación se desarrollan hasta la fase de meseta.
Como resultado, los niveles relativos de los productos de
multiplicación que derivan de moldes de cDNA secuencialmente
modificado y de DNA de referencia en una reacción de multiplicación
individual génicamente específica permanecen constantes durante
toda la multiplicación y reflejan las cantidades relativas de dichos
moldes originalmente presentes en la muestra antes de la
multiplicación. Al medir cuantitativamente las cantidades y
determinar los niveles relativos de los productos de multiplicación
derivados de moldes de cDNA secuencialmente modificado y de DNA de
referencia, se obtiene una relación de cDNA a DNA génicamente
específica en cada una de las reacciones de multiplicación
individuales. Se genera un perfil específico de muestra al combinar
las relaciones de cDNA a DNA génicamente específicas determinadas
en las reacciones de multiplicación individuales para cada uno de
los genes analizados. Las relaciones de cDNA a DNA en los perfiles
específicos de muestra reflejan las cantidades relativas de
transcritos de mRNA originalmente presentes en la muestra y pueden
ser utilizadas para el análisis comparativo de variaciones en los
niveles de mRNA de los genes analizados entre muestras distintas.
Si se utiliza DNA genómico contenido en la muestra como un molde de
DNA de referencia, es necesario tener en cuenta las posibles
variaciones en el número de copias de los genes analizados en el
genoma de las células de la muestra.
La expresión "cebador modificador de
secuencia" significa un cebador oligonucleotídico que se usa en
la reacción de transcripción inversa con objeto de generar una
modificación de secuencia nucleotídica en la secuencia de cDNA en
comparación con la secuencia nucleotídica de tipo silvestre de un
gen diana específico. Se pueden utilizar cebadores modificadores de
secuencia génicamente específicos para diversos genes diferentes en
la misma reacción de transcripción inversa, para generar un
conjunto de moléculas de cDNA secuencialmente modificadas.
La expresión "multiplicación conjunta"
significa la multiplicación simultánea de dos o múltiples moldes de
cDNA y/o DNA con diferentes secuencias nucleotídicas en los
productos de multiplicación generados. Un prerrequisito para la
multiplicación conjunta, como se utiliza la expresión en esta
solicitud de patente, es que los moldes tengan idénticas secuencias
de nucleótidos en los sitios ligantes de cebador usados en la
reacción de multiplicación y que la multiplicación de los citados
moldes se lleve a cabo de manera competitiva con los mismos
cebadores y otros reactivos en el mismo recipiente de reacción.
La expresión "molde de DNA de referencia"
significa un molde de DNA que está incluido en cada reacción de
multiplicación y sirve para normalizar las variaciones en la
eficacia de multiplicación de un tubo a otro. Los moldes de DNA de
referencia comprenden DNA genómico contenido en, o añadido a, la
muestra, o un conjunto de moldes génicamente específicos tales como
oligonucleótidos o polinucleótidos de DNA clonados o sintetizados
para cada uno de los genes analizados. Los moldes de cDNA
secuencialmente modificado y de DNA de referencia de una reacción
de multiplicación individual son multiplicados conjuntamente de
forma competitiva utilizando los mismos cebadores. Los moldes de
DNA de referencia sintéticos o clonados, génicamente específicos,
pueden ser concatenados por ligación u otros medios para formar un
solo polinucleótido que actúe como molde de DNA de referencia
universal para varios genes.
La expresión "eliminación o inactivación de
cebadores modificadores de secuencia superfluos" significa, para
los fines de este invento, cualquier acción tomada para evitar que
los cebadores modificadores de secuencia superfluos actúen como
cebadores en las reacciones de multiplicación génicamente
específicas posteriores a la reacción de transcripción inversa.
Dichas acciones pueden ser, por ejemplo, la degradación enzimática
de los cebadores, la separación física de los cebadores de la
muestra, y la hibridación de los cebadores con cualquier agente
bloqueante apropiado.
El presente invento es descrito con mayor
detalle en los ejemplos siguientes, los cuales se presentan sólo
con fines ilustrativos y no deben ser considerados restrictivos del
alcance del invento. Los expertos en la técnica pueden aplicar
fácilmente los principios del invento para diferentes
aplicaciones.
\vskip1.000000\baselineskip
Se llevó a cabo el experimento con objeto de
definir el intervalo de medición del ensayo a lo largo de un
intervalo de relaciones de cDNA/DNA. En este experimento, se probó
el principio del presente invento analizando una serie de
diluciones de cDNA secuencialmente modificado e inversamente
transcrito a partir del cRNA de un solo gen en relación con el
molde de DNA de referencia, el cual era A) una cantidad fija de
copias de DNA clonado del mismo gen o B) DNA genómico.
Se generó un clon de DNA de tripsinógeno 1, que
contenía las bases 46-714 de la secuencia de cDNA
del tripsinógeno 1, a partir de cDNA pancreático (Clontech)
mediante PCR. La secuencia del clon de DNA fue comprobada por
secuenciación desde ambos extremos en un analizador genético ABI
Prism 310 (Applied Biosystems) utilizando el kit central de
secuenciación cíclica con terminador colorante ABI Prism y la DNA
polimerasa AmpliTaq. El cRNA de tripsinógeno 1 fue generado
mediante transcripción in vitro usando el clon de DNA de
tripsinógeno 1 como molde (Epicentre Technologies) y fue purificado
mediante el minikit RNeasy (Qiagen). Se cultivaron células tumorales
a 37ºC en una atmósfera humidificada con CO_{2} al 5%. Las
células se mantuvieron en medio RPMI 1640 complementado con suero
bovino fetal al 10%, térmicamente inactivado,
L-glutamina 2 mM y 100 unidades/ml de penicilina y
100 \mug/ml de estreptomicina. El DNA genómico de estas células
fue extraído mediante el minikit de RNA/DNA (Qiagen).
Se llevó a cabo la transcripción inversa
utilizando la transcriptasa inversa RNasa H ThermoScript
(Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante en un
volumen de reacción de 20 \mul, en tampón para síntesis de cDNA
(Tris-acetato 50 mM, pH de 8,4; acetato potásico 75
mM; acetato magnésico 40 mM), DTT 5 mM, dNTP 1 mM, 20 picomoles de
cebador antisentido modificador de secuencia para crear una
sustitución C a G de un solo nucleótido en el cDNA generado
(5'-CAC ATA GTT GTA GAC CTT GGT GTA GAC TCG
AGG C), 7,5 U de transcriptasa inversa ThermoScript, y 5x10^{9}
copias de cRNA de tripsinógeno 1. La mezcla de reacción fue incubada
a 65ºC durante 50 minutos y a 85ºC durante 5 minutos.
Después de la transcripción inversa, los
cebadores de transcripción inversa modificadores de secuencia no
unidos fueron escindidos mediante exonucleasa I (New England
Biolabs) en un volumen de reacción de 25 \mul, en tampón de
restricción 1x (glicocola-KOH 67 mM, MgCl_{2} 6,7
mM, 2-mercaptoetanol 10 mM, pH de 9,5) y con 20 U
de exonucleasa I a 37ºC durante 60 minutos y a 80ºC durante 20
minutos. Antes de la multiplicación, el cDNA tratado con
exonucleasa I fue sucesivamente diluido 10 veces.
Se multiplicaron 5 \mul de cada una de las
diluciones del producto de transcripción inversa con A) 10^{3}
copias del clon de DNA de tripsinógeno 1 y B) DNA genómico de 500
células tumorales en un volumen de reacción de 45 \mul, en tampón
1x para PCR (Tris-HCl 10 mM, pH de 8,8, MgCl_{2}
1,5 mM, KCl 50 mM, Triton X-100 al 0,1%; Finnzymes)
que contenía 0,2 mM de cada dNTP, 20 picomoles del cebador sentido
(5'-TGA TTC TGG TGG CCC TGT-3') y
el cebador antisentido (CAC ATA GTT GTA GAC CTT GGT G), y 2 U de DNA
polimerasa Dynazyme II (Finnzymes), desnaturalizando primero los
moldes durante 5 minutos a 95ºC y multiplicándolos luego con 35
ciclos a 95ºC durante 1 minuto y a 55ºC durante 1 minuto. Luego se
multiplicaron adicionalmente 3 \mul del producto de la primera
multiplicación en un volumen de reacción de 75 \mul utilizando 7,6
picomoles del cebador sentido anidado y biotinilado
(BIO-5'-CTG GTG GCC CTG TGG
TCT-3') y 76 picomoles del cebador antisentido
anidado (5'-AGA CCT TGG TGT AGA
CTC-3') con un programa de PCR igual al de la
primera PCR. En el experimento se incluyeron tres testigos que
contenían 10^{3} copias del clon de DNA de tripsinógeno 1, DNA
genómico de 500 células, y cDNA secuencialmente modificado e
inversamente transcrito a partir de 10^{9} copias de cRNA de
tripsinógeno 1, respectivamente. Una parte alícuota de 15 \mul del
producto de PCR fue sometida a separación en un gel de agarosa al
1,5% y teñida con bromuro de etidio con objeto de excluir la
multiplicación inespecífica.
Los productos de multiplicación de los moldes de
cDNA secuencialmente modificado y de DNA de referencia fueron
detectados mediante una modificación de una reacción de
minisecuenciación en fase sólida usando nucleótidos marcados con
^{3}H [Syvänen et al., Genomics (1990) 8:
684-692; Ihalainen et al., Biotechniques
(1994) 16: 938-943; Suomalainen y Syvänen, Methods
Mol. Biol. (1998) 86: 121-131]. Después de la
multiplicación por PCR, se capturaron 10 \mul del producto de PCR
en los pocillos de placas de microtitulación para centelleo
revestidos con estreptavidina (Perkin-Elmer
Wallac), con 40 \mul de tampón (NaCl 0,15 M, fosfato Na 20 mM, pH
de 7,4, y Tween-20 al 0,1%) por pocillo. Las
muestras fueron incubadas durante 1 hora a temperatura ambiental
(TA) con sacudimiento suave, después de lo cual la placa fue lavada
cuatro veces con un tampón que contenía Tris-HCl 40
mM (pH de 8,8), EDTA 1 mM, NaCl 50 mM, Tween-20 al
0,1%) usando un aparato automático para lavar microplacas (Tecan 96
PW). Los productos de PCR unidos fueron desnaturalizados con 100
\mul de NaOH 50 mM durante 5 minutos a TA. Luego se lavaron los
pocillos cuatro veces con el tampón de lavado.
Se añadió a los pocillos la mezcla de la
reacción de minisecuenciación, que contenía el cebador de la
operación de detección (5'-GTA GAC CTT GGT GTA GAC
TC-3') en una concentración de 0,2 \muM, los
apropiados ^{3}H-dNTPs (dCTP para los productos
de multiplicación que derivan de los moldes de DNA de referencia y
dGTP para el producto de multiplicación que deriva del cDNA
secuencialmente modificado; Amersham Biosciences) en una
concentración de 0,02 \muM y 0,5 U de DNA polimerasa Dynazyme en
100 \mul de tampón 1x para PCR. Se incubaron los pocillos a 55ºC
durante 15 minutos con sacudimiento suave. Los pocillos fueron
lavados cuatro veces con el tampón de lavado, y la radiactividad
incorporada fue medida en un contador MicroBeta de radiación beta
(EG&G Wallac) y fue expresada como cuentas por minuto (cpm).
Los productos de multiplicación que derivaban de los testigos
fueron minisecuenciados con cuatro ^{3}H-dNTPs
diferentes (dGTP, dCTP, dATP y dTTP). El análisis de cada muestra
por minisecuenciación fue llevado a cabo en dos reacciones paralelas
para cada uno de los nucleótidos.
Para determinar el intervalo de medición del
ensayo, se multiplicaron conjuntamente diluciones de 10 veces del
cDNA transcrito a partir de 10^{9} copias de cRNA de tripsinógeno
1 y el molde de DNA de referencia (10^{3} copias de DNA de
tripsinógeno 1 clonado o DNA genómico de 500 células). Todas las
reacciones de multiplicación por PCR anidada se desarrollaron hasta
la fase de meseta. El intervalo de medición del ensayo era más de
dos órdenes de magnitud, variando de una relación teórica de cDNA a
DNA de menos de 1:1 (10^{3} copias de cDNA y 10^{3} copias de
DNA clonado o DNA genómico de 500 células) a más de 100:1 (10^{5}
copias de cDNA y 10^{3} copias de DNA clonado o DNA genómico de
500 células). El número de copias teórico del molde de cDNA se basa
en la suposición de que la eficacia de la reacción de transcripción
inversa era 100% (Figura 3).
El ensayo de minisecuenciación proporcionó una
discriminación precisa de las diferencias de secuencia de un solo
nucleótido en los productos de cDNA de tripsinógeno 1, DNA de
tripsinógeno 1 clonado y DNA genómico separadamente multiplicados.
El producto de multiplicación de cDNA de tripsinógeno 1 fue
detectado con dGTP marcado con ^{3}H, mientras que los de DNA de
tripsinógeno 1 clonado y de DNA genómico fueron detectados con dCTP
marcado con ^{3}H. El cebado erróneo de los cebadores de
detección de la minisecuenciación fue excluido al minisecuenciar
todos los productos de multiplicación con dATP y dTTP marcados con
^{3}H (Figura 4).
\vskip1.000000\baselineskip
Se llevó a cabo el experimento con objeto de
ensayar la reproducibilidad del ensayo en cuanto a analizar un
perfil de expresión génica en una línea celular. En este
experimento, se analizaron los perfiles de expresión de cinco genes
[metaloproteinasa matricial 2 (MMP-2; del inglés,
matrix-metalloproteinase-2),
metaloproteinasa matricial 9 (MMP-9), activador de
plasminógeno de tipo urocinasa (uPA; del inglés,
urokinase-type plasminogen
activator), receptor del activador de plasminógeno de tipo
urocinasa (uPAR; del inglés, urokinase-type
plasminogen activator receptor) y p53] en
células de adenocarcinoma de colon humano COLO 205 llevando primero
a cabo una operación de transcripción inversa múltiple de mRNA
extraído de las células COLO 205, con cebadores modificadores de
secuencia para cada uno de los cinco genes. Esto fue seguido de
reacciones de multiplicación individuales génicamente específicas
para que, en cada una de las reacciones, cDNA secuencialmente
modificado y DNA genómico, que servía como molde de DNA de
referencia, fueran multiplicados conjuntamente de forma competitiva,
utilizando los mismos cebadores génicamente específicos. Los
productos de multiplicación de los moldes de cDNA secuencialmente
modificado y de DNA genómico fueron detectados y cuantificados
mediante una minisecuenciación cíclica [Järveläinen et al.,
Hepatology (2001) 33: 1148-1153]. Las relaciones de
cDNA a DNA génicamente específicas determinadas en las reacciones
de multiplicación individuales fueron combinadas para generar un
perfil de dichas relaciones que reflejara las cantidades relativas
de transcritos de mRNA originalmente presentes en la muestra.
Se cultivaron células COLO 205 (Colección
Americana de Cultivos Tipo, Rockville, Maryland, EE.UU.) a 37ºC en
una atmósfera humidificada con CO_{2} al 5%. Las células fueron
mantenidas en medio RPMI 1640 complementado con suero bovino fetal
al 10%, térmicamente inactivado, L-glutamina 2 mM y
100 unidades/ml de penicilina y 100 \mug/ml de estreptomicina.
Para cada uno de los experimentos, se utilizó la misma muestra de
mRNA extraída de COLO 205 usando el kit de mRNA Oligotex Direct
(Qiagen). El DNA genómico humano se adquirió a Roche Diagnostic
(Mannheim, Alemania).
Se llevó a cabo la transcripción inversa
utilizando transcriptasa inversa (RT) SuperScript II (Invitrogen)
de acuerdo con las instrucciones del fabricante combinando primero,
en un volumen de reacción de 12 \mul, 2 picomoles de cada uno de
los cebadores antisentido modificadores de secuencia para crear una
sustitución A a G de un solo nucleótido (subrayada) en el cDNA
generado [5'-GGG AAT GGT TGA AGG GAG GGG CGG
GGA G-3' (MMP-2),
5'-AAA GGT TAG AGA ATC CAA GTT TGT TAG
A-3' (MMP-9), 5'-ATT
CAG TGT AAG GAG TGG TCC TCG CCC CA-3' (uPA),
5'-CAA CAC AAC AGC GGC AAC AAT ATT GAT AAT
(uPAR) y 5'-AAG GGT GGG GTG AAA ATG CGG ATG
T-3' (p53)], dNTP 0,5 mM, y mRNA extraído de
10^{5} células COLO 205 e incubando a 65ºC durante 5 minutos.
Después de esto, se continuó la reacción de transcripción inversa
en un volumen de reacción de 20 \mul, en tampón para primera
cadena (Tris-acetato 50 mM, pH de 8,3; acetato
potásico 75 mM; cloruro magnésico 3 mM) que contenía DTT 10 mM y 200
U de RT SuperScript, a 42ºC durante 50 minutos, después de lo cual
se inactivó la reacción por calentamiento a 70ºC durante 15
minutos.
Después de la transcripción inversa, los
cebadores de transcripción inversa modificadores de secuencia no
unidos fueron degradados mediante exonucleasa I (New England
Biolabs) en un volumen de reacción de 25 \mul, en tampón de
restricción 1x (glicocola-KOH 67 mM, MgCl_{2} 6,7
mM, 2-mercaptoetanol 10 mM, pH de 9,5) y con 20 U
de exonucleasa I a 37ºC durante 60 minutos y a 80ºC durante 20
minutos.
Se multiplicaron conjuntamente 2,5 \mul del
producto de transcripción inversa con 2 ng de DNA genómico humano
en reacciones de multiplicación génicamente específicas separadas,
en un volumen de reacción de 25 \mul, en tampón para PCR 1x
(Tris-HCl 10 mM, pH de 8,8, MgCl_{2} 1,5 mM, KCl
50 mM, Triton X-100 al 0,1%; Finnzymes) que
contenía 0,2 mM de cada dNTP, 20 picomoles del cebador sentido
[5'-CTG GAT GGA GGA AAA CCA AG-3'
(MMP-2), 5'-TGG GCC CTC TCT TCT
CA-3' (MMP-9),
5'-TTG GCC AGT TAT CCC TTC-3' (uPA),
5'-GAA GAG AAA AGC TGG AGG AAG G-3'
(uPAR) o 5'-TGG AGC TGG AAG GGT
CAA-3' (p53)], 20 picomoles del cebador antisentido
[5'-GGG AAT GGT TGA AGG GAG-3'
(MMP-2), 5'-AAA GGT TAG AGA ATC CAA
GTT-3' (MMP-9),
5'-ATT CAG TGT AAG GAG TGG TC-3'
(uPA), 5'-CAA CAC AAC AGC GGC AAC
AA-3' (uPAR) o 5'-AAG GGT GGG GTG
AAA ATG-3' (p53)], y 2 U de DNA polimerasa Dynazyme
II (Finnzymes), desnaturalizando primero los moldes durante 5
minutos a 95ºC y multiplicándolos luego con 35 ciclos a 95ºC
durante 1 minuto y a 55ºC durante 1 minuto. La contaminación de las
muestras de mRNA con cDNA fue excluida llevando a cabo reacciones
testigo sin transcriptasa inversa para cada una de las muestras.
Una parte alícuota de 15 \mul del producto de PCR fue sometida a
separación en un gel de agarosa al 2% y teñida con bromuro de
etidio con objeto de excluir la multiplicación inespecífica.
Los productos de multiplicación de los moldes de
cDNA secuencialmente modificado y de DNA genómico fueron detectados
mediante la minisecuenciación cíclica descrita por Järveläinen et
al. (Hepatology, 2001, 33: 1148-1153), una
modificación de la minisecuenciación en fase sólida utilizando
nucleótidos marcados con ^{3}H [Syvänen et al., Genomics
(1990) 8: 684-692; Ihalainen et al.,
Biotechniques (1994) 16: 938-943; Suomalainen y
Syvänen, Methods Mol. Biol. (1998) 86: 121-131] con
modificaciones menores. Después de la multiplicación por PCR, se
eliminaron los cebadores y dNTPs sin reaccionar añadiendo
directamente 1 U de fosfatasa alcalina de camarón (Roche) y 5 U de
exonucleasa I a la mezcla de reacción PCR. La degradación de los
cebadores y dNTPs se llevó a cabo a 37ºC durante 30 minutos,
después de lo cual se inactivaron las enzimas por incubación a 80ºC
durante 15 minutos. Los productos de PCR enzimáticamente tratados
fueron después filtrados junto con 220 \mul de agua usando el
sistema de filtración Microcon-96 YM con unidades
filtrantes YM-30 (corte de 50 pares de bases para
el DNA de doble cadena) y luego lavados dos veces con 250 \mul de
agua. Finalmente, se recuperaron por centrifugación los productos
de retención y se ajustaron los volúmenes a 50 \mul. Se
transfirieron cuatro partes alícuotas, de 5 \mul cada una, de los
productos de PCR separados por filtración a placas de 96 pocillos
para PCR (Thermo-Fast 96, Abgene, Epsom, Surrey,
Inglaterra) que contenían reactivos para la reacción de
minisecuenciación cíclica. Estos pocillos contenían 3 picomoles del
cebador de minisecuenciación cíclica biotinilado
[5'biotina-TTC CCG CTC AGC CCT
CCC-3' (MMP-2),
5'biotina-TTG TTT TTT GTT GGA GTG TTT CTA
A-3' (MMP-9),
5'biotina-CCA ATC CTC ACT GGG TGG
GG-3' (uPA), 5'biotina-ATG GGA GAG
CTC TTG TTA TTA T-3' (uPAR) o
5'biotina-TTT TAC ATT CTG CAA GCA CAT
C-3' (p53)], 2 picomoles de los nucleótidos marcados
con ^{3}H, dCTP o dTTP, y 0,5 U de DNA polimerasa Dynazyme en 15
\mul de tampón Dynazyme.
Se cubrió la placa con el papel sellador de
aluminio (Adhesive PCR Foil Seal, Abgene) y se llevó a cabo la
extensión cíclica de cebadores por generación de ciclos a 96ºC
durante 10 segundos y a 57ºC durante 10 segundos, para 50 ciclos.
Después de la generación de los ciclos, las mezclas de reacción de
minisecuenciación cíclica completas fueron transferidas a los
pocillos de placas de microtitulación para centelleo revestidos con
estreptavidina (Perkin-Elmer Wallac), con 20 \mul
de tampón (NaCl 0,15 M, fosfato Na 20 mM, pH de 7,4, y
Tween-20 al 0,1%) por pocillo. Las muestras fueron
incubadas durante 1 hora a temperatura ambiental (TA) con
sacudimiento suave, después de lo cual la placa fue lavada una vez
con tampón TENT [Tris-HCl 40 mM (pH de 8,8), EDTA 1
mM, NaCl 50 mM, Tween-20 al 0,1%] usando un aparato
automático para lavar microplacas (Tecan 96 PW), una vez con NaOH
50 mM durante 5 minutos a TA y una vez más con tampón TENT. La
radiactividad incorporada fue medida en un contador MicroBeta de
radiación beta (EG&G Wallac) y fue expresada como cuentas por
minuto (cpm). El análisis de cada muestra por minisecuenciación fue
llevado a cabo en dos reacciones paralelas para cada uno de los
nucleótidos
marcados.
marcados.
Como se muestra en las Figuras 5 y 6, el ensayo
es reproducible. Los valores medios y los errores estándares
fueron, respectivamente, 13,5 y 2,4 para MMP-2, 1,7
y 0,8 para MMP-9, 8,5 y 0,7 para uPA, 31,2 y 2,5
para uPAR, y 48,1 y 2,9 para p53 (Figura 6).
\vskip1.000000\baselineskip
Se llevó a cabo el experimento con objeto de
definir el intervalo de medición del ensayo a lo largo de un
intervalo de relaciones de cDNA/DNA. En este experimento, se probó
el principio del presente invento analizando una serie de
diluciones de cDNA secuencialmente modificado e inversamente
transcrito a partir del cRNA de un solo gen en relación con el
molde de DNA de referencia, el cual era 20 ng de DNA genómico humano
que correspondían a aproximadamente 10^{4} copias de cada gen. La
PCR fue llevada a cabo en un instrumento LightCycler (Roche Applied
Science), y los productos de multiplicación de los moldes de cDNA
secuencialmente modificado y de DNA genómico fueron detectados y
cuantificados mediante un análisis de curvas de fusión en el
instrumento LightCycler.
Se obtuvieron clones de cDNA de tripsinógeno 2 y
MMP-2 de longitud completa de la Colección Americana
de Cultivos Tipo. Las secuencias de los clones de cDNA fueron
comprobadas por secuenciación desde ambos extremos en un analizador
genético ABI Prism 310 (Applied Biosystems) utilizando el kit
central de secuenciación cíclica con terminador colorante ABI Prism
y la DNA polimerasa AmpliTaq. Los cRNAs de tripsinógeno 2 y
MMP-2 fueron generados por transcripción in
vitro usando los clones de cDNA de tripsinógeno 2 y
MMP-2 como moldes (Epicentre Technologies) y fueron
purificados mediante el minikit RNeasy (Qiagen).
Se llevó a cabo una transcripción inversa usando
el kit para qRT-PCR, de 2 operaciones, DyNAmo
Capillary SYBR Green (Finnzymes) de acuerdo con las instrucciones
del fabricante, utilizando los cebadores antisentido modificadores
de secuencia para crear sustituciones (subrayadas) de A a G o de T a
C de cinco (tripsinógeno 2) o seis (MMP-2)
nucleótidos en el cDNA generado [5'-CCA CAC AGA ACA
TGT TGC TGG CGG CCC TTC CA-3'
(tripsinógeno 2) y 5'-GAA GAG ACT CGG TAG GGA
CAC GCC GGG CGG AGT GA-3'
(MMP-2)] usando 5x10^{9} copias de cRNA de
tripsinógeno 2 o MMP-2 como moldes.
Después de la transcripción inversa, los
cebadores de transcripción inversa modificadores de secuencia no
unidos fueron degradados mediante exonucleasa I (New England
Biolabs) en un volumen de reacción de 25 \mul, en tampón de
restricción 1x (glicocola-KOH 67 mM, MgCl_{2} 6,7
mM, 2-mercaptoetanol 10 mM, pH de 9,5) y con 20 U
de exonucleasa I a 37ºC durante 60 minutos y a 80ºC durante 20
minutos. El cDNA tratado con exonucleasa I fue sucesivamente
diluido 10 veces antes de la multiplicación.
2,5 \mul de cada una de las diluciones de los
productos de transcripción inversa tratados con exonucleasa I
fueron multiplicados con 20 ng de DNA genómico humano en reacciones
de multiplicación génicamente específicas usando el kit para
qRT-PCR, de 2 operaciones, DyNAmo Capillary SYBR
Green (Finnzymes) de acuerdo con las instrucciones del fabricante,
usando los cebadores 5'-GCC AGG CTA AGT GTG
AAG-3' (sentido de tripsinógeno 2),
5'-CCA CAC AGA ACA TGT TGC T-3'
(antisentido de tripsinógeno 2), 5'-CTG GAT GGA GGA
AAA CCA AG-3' (sentido de MMP-2),
5'-GGG AAT GGT TGA AGG GAG-3'
(antisentido de MMP-2) durante 30 ciclos. Se llevó a
cabo la PCR en un instrumento LightCycler (Roche Applied Science)
durante 30 ciclos con desnaturalización a 95ºC (15 segundos de
mantenimiento) e hibridación a 57ºC (1 minuto de mantenimiento). La
velocidad de transición de la temperatura fue 20ºC/s, y se adquirió
la fluorescencia al final de la hibridación. La contaminación de las
muestras de cRNA con cDNA fue excluida llevando a cabo reacciones
testigo sin transcriptasa inversa para cada una de las muestras. Una
parte alícuota de 15 \mul del producto de PCR fue sometida a
separación en un gel de agarosa al 2% y teñida con bromuro de
etidio con objeto de excluir la multiplicación inespecífica.
Los productos de multiplicación de los moldes de
cDNA secuencialmente modificado y de DNA genómico fueron detectados
y cuantificados mediante un análisis de curvas de fusión en el
instrumento LightCycler inmediatamente después de la multiplicación
con una desnaturalización adicional a 95ºC con un mantenimiento de 0
segundos, un enfriamiento hasta 57ºC a una velocidad de 20ºC/s, y
una adquisición continua de curvas de fusión con una rampa de
0,1ºC/s hasta 98ºC. Se obtuvo un gráfico de derivadas de las curvas
de fusión con el uso de los ajustes por defecto del software
LightCycler.
Al usar los cebadores modificadores de secuencia
para crear sustituciones de A a G o de T a C de cinco o seis
nucleótidos en los cDNAs generados, fue posible detectar y
cuantificar los productos de multiplicación de los cDNAs y del DNA
genómico, que difieren en sus temperaturas de fusión en
aproximadamente 4ºC, utilizando el análisis de las curvas de
fusión. Para determinar el intervalo de medición del ensayo,
diluciones de 10 veces del cDNA transcrito a partir de 10^{9}
copias de cRNA de tripsinógeno 2 o cRNA de MMP-2
fueron conjuntamente multiplicadas con 20 ng de DNA genómico
humano. El intervalo de medición del ensayo para el tripsinógeno 2
fue más de dos órdenes de magnitud, variando de una relación teórica
de cDNA a DNA de menos de 10:1 (10^{5} copias de cDNA y 20 ng de
DNA genómico humano que corresponden a aproximadamente 10^{4}
copias del gen) a más de 1000:1 (10^{7} copias de cDNA y 20 ng de
DNA genómico humano que corresponden a aproximadamente 10^{4}
copias del gen). El intervalo de medición del ensayo para
MMP-2 fue más de dos órdenes de magnitud, variando
de una relación teórica de cDNA a DNA de menos de 1:10 (10^{3}
copias de cDNA y 20 ng de DNA genómico humano que corresponden a
aproximadamente 10^{4} copias del gen) a más de 10:1 (10^{5}
copias de cDNA y 20 ng de DNA genómico humano que corresponden a
aproximadamente 10^{4} copias del gen). El número de copias
teórico del molde de cDNA se basa en la suposición de que la
eficacia de la reacción de transcripción inversa era 100% (Figura
7).
Claims (17)
1. Un método para la valoración cuantitativa y/o
comparativa de las cantidades relativas de transcritos de mRNA
presentes en una muestra celular o tisular, caracterizado por
las operaciones de:
- (a)
- llevar a cabo la transcripción inversa del mRNA contenido en la muestra utilizando cebadores modificadores de secuencia para diversos genes en la misma reacción, para obtener un conjunto de moléculas de cDNA secuencialmente modificadas, en que los cebadores modificadores de secuencia son oligonucleótidos que comprenden tres segmentos funcionales:
- (i)
- un segmento 5'-terminal que comprende una secuencia nucleotídica, que es complementaria de la secuencia de mRNA así como de la secuencia de DNA de cadena sentido de un gen específico y contiene la secuencia nucleotídica complementaria de los sitios ligantes para los cebadores cadena abajo utilizados en subsiguientes reacciones de multiplicación,
- (ii)
- un segmento central que consiste en una secuencia nucleotídica que comprende uno o múltiples nucleótidos, que no son complementarios de la secuencia de mRNA ni de la secuencia de DNA de cadena sentido de dicho gen, y
- (iii)
- un segmento 3'-terminal que comprende una secuencia nucleotídica, que es complementaria de la secuencia de mRNA así como de la secuencia de DNA de cadena sentido de dicho gen,
- (b)
- eliminar o inactivar los cebadores modificadores de secuencia superfluos después de la compleción de la transcripción inversa,
- (c)
- llevar a cabo reacciones de multiplicación individuales para cada uno de los genes analizados, de modo que, en cada una de las reacciones, moldes de cDNA secuencialmente modificados se multipliquen conjuntamente con un molde de DNA de referencia, de manera competitiva utilizando los mismos cebadores génicamente específicos para ambos moldes para generar cantidades mensurables de productos de multiplicación,
- (d)
- medir cuantitativamente las cantidades y determinar los niveles relativos de los productos de multiplicación derivados de los moldes de cDNA secuencialmente modificado y de DNA de referencia para obtener una relación de cDNA a DNA génicamente específica en cada una de las reacciones de multiplicación individuales, utilizando las modificaciones secuenciales en las moléculas de cDNA generadas durante la transcripción inversa para distinguir los productos de multiplicación derivados de cDNA de los productos de multiplicación derivados del molde de cDNA de referencia presentes en la misma reacción de multiplicación, y
- (e)
- combinar las relaciones de cDNA a DNA génicamente específicas determinadas en las reacciones de multiplicación individuales para generar un perfil de dichas relaciones, específico de la muestra, que refleje las cantidades relativas de transcritos de mRNA originalmente presentes en la muestra.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Un método de acuerdo con la Reivindicación 1,
caracterizado por que la muestra comprende un producto
celular o tisular de lisis u homogeneización.
3. Un método de acuerdo con la Reivindicación 1,
caracterizado por que, ante de la transcripción inversa, se
aísla RNA o RNA y DNA de la muestra.
4. Un método de acuerdo con la Reivindicación 1,
caracterizado por que la reacción de transcripción inversa
se lleva a cabo en unas condiciones bajo las cuales el DNA contenido
en la muestra permanece en forma de doble cadena.
5. Un método de acuerdo con la Reivindicación 1,
caracterizado por que los cebadores modificadores de
secuencia superfluos son eliminados o inactivados por degradación
enzimática después de la compleción de la transcripción
inversa.
6. Un método de acuerdo con la Reivindicación 5,
caracterizado por que dicha degradación enzimática se lleva
a cabo utilizando una exonucleasa específica de DNA de cadena
sencilla.
7. Un método de acuerdo con la Reivindicación 1,
caracterizado por que las reacciones de multiplicación
individuales se llevan a cabo en recipientes de reacción
físicamente separados.
8. Un método de acuerdo con la Reivindicación 1,
caracterizado por que el molde de DNA de referencia comprende
DNA genómico contenido en la muestra o aislado de una fuente
distinta.
\newpage
9. Un método de acuerdo con la Reivindicación 1,
caracterizado por que el molde de DNA de referencia comprende
oligonucleótidos o polinucleótidos de DNA clonados o
sintetizados.
10. Un método de acuerdo con la Reivindicación
1, caracterizado por que la medición cuantitativa de los
productos de multiplicación se lleva a cabo durante la
multiplicación.
11. Un método de acuerdo con la Reivindicación
1, caracterizado por que la medición cuantitativa de los
productos de multiplicación se lleva a cabo después de la
compleción de la reacción de multiplicación.
12. Un método de acuerdo con la Reivindicación
1, caracterizado por que los niveles relativos de los
productos de multiplicación que derivan de los moldes de cDNA
secuencialmente modificado y de DNA de referencia en una reacción
de multiplicación individual génicamente específica reflejan las
cantidades relativas de dichos moldes originalmente presentes en la
reacción de multiplicación antes de la multiplicación.
13. Un método de acuerdo con la Reivindicación
1, caracterizado por que, para la multiplicación de los
moldes de cDNA y de DNA de referencia, se utiliza la reacción en
cadena de la polimerasa, la reacción en cadena de la ligasa o la
multiplicación mediada por transcripción.
14. Un método de acuerdo con la Reivindicación
1, caracterizado por que, para la medición cuantitativa de
los productos de multiplicación, se utilizan el análisis de curvas
de fusión, la extensión de cebadores en el sitio de diferenciación,
sondas de hibridación secuencialmente específicas, la espectrometría
de masas, o ensayos basados en la transferencia directa o indirecta
de energía por resonancia de fluorescencia.
15. Un método de acuerdo con la Reivindicación
14, caracterizado por que la extensión de cebadores en el
sitio de diferenciación es seleccionada del grupo que consiste en
minisecuenciación, minisecuenciación cíclica,
Pyro-
sequencing® y extensión de cebadores específicos de alelo.
sequencing® y extensión de cebadores específicos de alelo.
16. Un método de acuerdo con la Reivindicación
14, caracterizado por que las sondas de hibridación
secuencialmente específicas son seleccionadas del grupo que
consiste en sondas de hidrólisis doblemente marcadas y sondas
Molecular Beacon®.
17. Un método de acuerdo con la Reivindicación
1, caracterizado por que en el método se aplica un kit de
ensayo que comprende cebadores modificadores de secuencia para
varios genes, un medio para eliminar o inactivar cebadores
modificadores de secuencia superfluos después de la compleción de la
transcripción inversa, y cebadores génicamente específicos
adecuados para la multiplicación conjunta de moldes de cDNA
secuencialmente modificado y un molde de DNA de referencia de
manera competitiva en reacciones de multiplicación individuales para
cada uno de los genes analizados.
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