JP3400789B2 - プローブ作成方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、標的となるＤＮＡ又は
ＲＮＡ（以下「標的ＤＮＡ等」と略記する）などの遺伝
物質をハイブリッド形成により検定するために用いる、
該遺伝物質と相補的な配列を持つポリヌクレオチドであ
るプローブ作成方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】標的となるＤＮＡ等の試料の検定をこれ
と相補的な配列を持つＤＮＡプローブとのハイブリッド
形成により行う方法は、従来、プロシーディングス オ
ブ ザナショナル アカデミー オブ サイエンシズ
オブ ユー エス エー 80巻(1983年) 第278頁から28
2頁 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 80 (1983) pp.278-
282) に記載されているように、フィルターなどの固相
上でハイブリダイゼーション反応を行うインホモジニア
ス法が中心であった。この方法では核酸試料の固相上へ
の固定、未反応プローブの洗浄などの操作が必要なこ
と、及びハイブリダイゼーション反応に長時間を要する
などの問題点があった。

【０００３】そこで、(1) 液中でのハイブリダイゼーシ
ョン反応を可能とする、ホモジニアスな手法が開発され
た。かかる手法は、特開昭58-23795に記載されている。
この方法は、化学発光触媒と蛍光体を別々のＤＮＡオリ
ゴマーのそれぞれ3'端と5'端に標識しておき、標的ＤＮ
Ａへのハイブリダイゼーションにより両者を隣接せしめ
て、エネルギー受容体である蛍光体からの化学発光条件
下での発光を検出することにより標的ＤＮＡの有無を判
定している。

【０００４】さらに、(2) 蛍光体間のエネルギー移動に
よる、エネルギー供与側の蛍光体の消光の程度を検出す
ることによる、液中でのＤＮＡハイブリッド体の検出法
が特開昭62-244399号公報に記載されている。この方法
では、二本鎖を形成するＤＮＡオリゴマーのそれぞれの
3'端と5'端にエネルギー移動を起こす２種の蛍光体を標
識しておき、標的ＤＮＡとのハイブリッド形成による二
本鎖オリゴマーの解離に基づくエネルギー移動の解消に
よる、エネルギー供与体からの発光の回復を計測するこ
とでハイブリッド形成を判定している。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】上記(1) の化学発光触
媒と蛍光体を標識する方法では、(a) 標的ＤＮＡの検出
に２種類のＤＮＡオリゴマーを用いるため、検出に関わ
る反応が３分子反応であり、ハイブリダイゼーション反
応に要する時間が長くなるという欠点がある。また、
(b) 標的ＤＮＡとその相補鎖との再結合反応の影響を受
け易いという欠点も生ずる。さらに(c)ハイブリダイゼ
ーション反応の時間の短縮とハイブリダイゼーションの
効率を上げるために標識オリゴマーの濃度を増加させる
と雑音となるバックグラウンドの発光が増えてしまうと
いう問題がある。このため従来、標的ＤＮＡ検出の高感
度化にはおのずから限界があった。

【０００６】また、上記(2) の二本鎖ＤＮＡオリゴマー
と標的二本鎖ＤＮＡ間の再結合反応を利用する方法で
は、競合反応を利用するため標的ＤＮＡに対する標識Ｄ
ＮＡオリゴマーのハイブリダイゼーション効率を上げる
ことに問題があり、やはり標的ＤＮＡ検出高感度化には
限界があった。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者は、上記課題を
解決すべく鋭意検討した結果、エネルギー供与体とエネ
ルギー受容体とを標識した一本鎖ポリヌクレオチドをプ
ローブとして用いることでこの課題を解決しうることを
見出した。すなわち、本発明は中間部分、及び、その中
間部分の両端部からそれぞれ両側に伸びるポリヌクレオ
チドを有し、該中間部分の両端部の近傍のヌクレオチド
を、それぞれ、その間でエネルギー移動が生ずるような
エネルギー供与体及びエネルギー受容体で標識した一本
鎖ポリヌクレオチドを調製し、該一本鎖ポリヌクレオチ
ドを試料のＤＮＡ又はＲＮＡにハイブリダイゼーション
させる処理を行い、該エネルギー供与体を励起したとき
に生ずる、エネルギー移動によるエネルギー供与体又は
エネルギー受容体における蛍光発光の、標的ＤＮＡ又は
ＲＮＡとのハイブリッド形成の有無による変化を検出す
ることにより、該試料中の標的ＤＮＡ又はＲＮＡの定量
を行う方法を提供するものである。

【０００８】本発明においては、中間部分及びその中間
部分の両端部からそれぞれ両側に伸びるポリヌクレオチ
ドを有し、該中間部分の両端部の近傍のヌクレオチド
を、それぞれその間でエネルギー移動を生ずるようなエ
ネルギー供与体及びエネルギー受容体で標識した一本鎖
ポリヌクレオチド鎖をプローブとすることが必要であ
る。

【０００９】プローブの基となる一本鎖ポリヌクレオチ
ドの具体的な塩基配列は、標的ＤＮＡ等の塩基配列及び
本発明の実施態様に応じて決定される。すなわち、一本
鎖ヌクレオチドを標識しているエネルギー供与体とエネ
ルギー受容体との距離を、標的ＤＮＡ等とのハイブリッ
ド未形成時において、エネルギー供与体とエネルギー受
容体の間で、エネルギーの移動が生ずるべくプローブを
設計するか否かにより相違する。

【００１０】すなわち、(1) ハイブリッド未形成時にエ
ネルギー移動が生ずるべくプローブを設計する場合に
は、ハイブリッド形成時には、エネルギー移動を生じな
い程十分に、エネルギー供与体とエネルギー受容体が離
れるように設計することが必要である。具体的には、中
間部分のポリヌクレオチドの塩基配列が標的ＤＮＡ等の
塩基配列と相補性を有し、かつ、中間部分の両端部から
それぞれ両側に伸びるポリヌクレオチドの塩基配列が相
互に相補性を有するべくプローブの塩基配列を設計する
のが好ましい。

【００１１】かかる場合、中間部のポリヌクレオチドに
含まれる塩基は、一般的には、少なくとも10個以上、好
ましくは20個以上となるように設計し、この中間部分の
両端部からそれぞれ両側に伸びるポリヌクレオチドに含
まれる塩基は６個以上、より好ましくは６〜20個になる
よう設計することで、後述するステップを経て本発明の
目的を達成し得る。

【００１２】なお、上記において「相補性を有する」と
は、所要のハイブリダイズが可能な程度に互いに相補的
であることを意味するもので、完全に互いの塩基が相補
的である場合はもちろん、ポイントミューテーション、
数塩基程度の挿入・欠失により、非相補的な塩基が含ま
れている場合も含まれる。 (2) ハイブリッド未形成時には、エネルギー移動を生じ
ないようにプローブを設計する場合には、ハイブリッド
形成時には、エネルギー移動を生ずるのに十分にエネル
ギー受容体とエネルギー供与体とが接近するように設計
することが必要である。

【００１３】具体的には、中間部分のポリヌクレオチド
の塩基配列が標的ＤＮＡ等の塩基配列と相補性がなく、
中間部分の両端部から、それぞれ両側に伸びるポリヌク
レオチドの塩基配列が、標的ＤＮＡ等の近接する塩基配
列とそれぞれ相補性を有するべく、プローブの塩基配列
を設計するのが好ましい。かかる場合、中間部のヌクレ
オチド鎖に含まれる塩基は、一般的には、少なくとも10
個以上、好ましくは20個以上となるように設計し、この
中間部分の両端部から、それぞれ両側に伸びるポリヌク
レオチドに含まれる塩基は８個以上、好ましくは20個以
上となるように；さらに標的ＤＮＡ等とハイブリッドさ
せた場合にプローブの中間部分の両端部からそれぞれ両
側に伸びるポリヌクレオチドに含まれる塩基は８個以
上、好ましくは20個以上となるように；さらに標的ＤＮ
Ａ等とハイブリダイズさせた場合にエネルギー供与体と
エネルギー受容体との間の距離が少なくとも10塩基、好
ましくは４塩基以下になるように設計することで、後述
するステップを経て本発明の目的を達成し得る。

【００１４】なお、上記において「相補性がなく」とは
完全に非相補的であるのが好ましいが、所要のハイブリ
ダイズが生起しない程度に非相補的な場合も含まれる。
このようにして設計されたプローブは、通常公知の方法
に従い化学合成することにより得ることができる。(1)
(2)のごとく設計し、得られたポリヌクレオチドの中間
部分の両端部の近傍のヌクレオチドをそれぞれ相互にエ
ネルギー移動を生ずるようなエネルギー供与体とエネル
ギー受容体とで標識することで、本発明の第一の構成要
件であるプローブが完成する。

【００１５】標識部位となるヌクレオチドは、中間部分
の両端部の近傍に存在することが必須である。中間部分
の両端部の近傍とは、プローブの中間部分の両端部のヌ
クレオチドから5'又は3'方向に向かって１個目のヌクレ
オチドから5'末端又は3'末端に位置するヌクレオチドに
該当する部分全てを指すが、好ましくは、中間部の両末
端から５塩基以内の部分を指すものである。

【００１６】エネルギー供与体とエネルギー受容体の種
類は、相互にエネルギーの励起移動が起り、かかる励起
移動が測定可能な限りにおいて特に限定されない。エネ
ルギー供与体及びエネルギー受容体間の無輻射的なエネ
ルギー移動の効率については、フェルスター (Von Th.
Foerster)による式が知られている (アンナーレン デ
ア フュジーク シリーズ６, ２巻 (1948年) 第55頁か
ら75頁 (Annalen der Physik. 6. Folge. Band2. (194
8) pp.55-75) 参照) 。これによれば、エネルギー移動
速度は、エネルギー供与体とエネルギー受容体間との距
離の６乗に反比例し、エネルギー供与体の発光スペクト
ルとエネルギー受容体の吸収スペクトルの重なりに比例
する。また、エネルギー供与体とエネルギー受容体の配
向によっても影響を受ける。

【００１７】エネルギー移動のエネルギー供与体及びエ
ネルギー受容体間の距離依存性の実験的研究がストライ
ヤー(L.Stryer)とホーグランド (R.P.Haugland) によっ
て報告されている (プロシーディングス オブ ザ ナ
ショナル アカデミー オブサイエンシズ オブ ユー
エス エー 58巻 (1967年) 第719頁から726頁 (Pro
c. Natl. Acad. Sci.USA. 58 (1967) pp.719-726) 参
照) これは、ポリペプチドオリゴマーのペプチドの個数
を変えることにより、その両端にあるエネルギー供与体
とエネルギー受容体の距離を変化させたもので、エネル
ギー移動の距離依存性がフェルスターの式とよく一致し
ていることを示している。またエネルギー移動の効率と
して、エネルギー供与体及びエネルギー受容体間の距離
1.２nmのとき１00％、4.６nmのときの16％という値を得
ている。

【００１８】したがって、一本鎖ＤＮＡオリゴマーに標
識されたエネルギー供与体とエネルギー受容体の距離
が、一本鎖ＤＮＡオリゴマー単独のときと標的となるＤ
ＮＡあるいはＲＮＡとハイブリダイゼーションしている
ときで大きく違えば、エネルギー供与体を光で励起した
ときのエネルギー供与体又はエネルギー受容体からの発
光量は変化するのでこの変化量を計測することにより、
標的ＤＮＡ又はＲＮＡとハイブリダイゼーションしてい
るＤＮＡオリゴマー量を定量することができる。すなわ
ち、標的ＤＮＡ量又はＲＮＡ量を定量することができ
る。

【００１９】エネルギー供与体としては、例えば、フル
オロセイン、フルオレセインイソチオシアネイト等のフ
ルオレセイン系の色素等を；エネルギー受容体として
は、例えば、テトラメチルローダミンイソチオシアネイ
ト（ＴＲＩＴＣ）等のローダミン系の色素及びアルミニ
ウムフタロシアニン等のフタロシアニン系の色素等を例
示することができる。なお、エネルギー供与体としては
アルゴンイオンレーザー(発振波長488nm)で効率よく励
起できるフルオレセインイソチオシアネイト (ＦＩＴ
Ｃ) が好ましく、これに対応する受容体としては、励起
スペクトルがＦＩＴＣの蛍光スペクトルと重なりが大き
く、かつ蛍光スペクトルの極大がＦＩＴＣのそれと100n
m近く離れているスルフォローダミン101 の塩化スルフ
ォン酸誘導体(商品名 テキサスレッド) を用いるのが好
ましい。

【００２０】エネルギー供与体とエネルギー受容体との
プローブへの標識方法は、標識する物質により異なる
が、一般的には、特開昭61-44353に開示された方法に従
うのが好適である。この方法は、ポリヌクレオチドの蛍
光体標識部位のリン酸結合を官能基を有するホスホン酸
結合に置き換え、この官能基と蛍光体結合させることに
より蛍光体標識を実現するものであり、任意の位置に標
識物を導入できる手法である。

【００２１】エネルギー供与体及びエネルギー受容体を
それぞれ１分子ずつ標識する場合には、例えばホスホン
酸を予め導入したポリヌクレオチドにエネルギー供与体
又はエネルギー受容体の一方を標識し (特開昭61-44353
号公報) 、反応生成物を液体クロマトグラフィー等で随
時モニターし、この際ＤＮＡ由来の260nm 付近の吸光度
とエネルギー供与体又はエネルギー受容体に特異的な吸
光度とを比較し、エネルギー供与体又はエネルギー受容
体がある程度導入はされているが、２個以上導入されて
いるポリヌクレオチドがそれほど多くないと判断可能な
段階で反応を停止させ、反応生成物を電気泳動法等を用
いて分離し、エネルギー供与体又はエネルギー受容体が
１分子導入されたポリヌクレオチドのみを単離後、他方
のエネルギー供与体又はエネルギー受容体を同様の方法
を用いて標識する方法を用いることができる。

【００２２】さらに、エネルギー供与体又はエネルギー
受容体の標識位置を、中間部の両端部の近傍の互いに異
なる塩基配列に対応させて確定する場合には、予め、そ
れぞれの標識物に対応すべきプローブの5'側又は3'側に
相当するポリヌクレオチドを別々に調製し、それぞれの
ポリヌクレオチドの所望の位置にエネルギー供与体又は
エネルギー受容体を標識させた後で両者を連結させる方
法を用いることができる。かかる場合それぞれのポリヌ
クレオチドに含まれる塩基数は通常６〜50塩基であり、
10〜20塩基であることが好ましい。そしてこの２つの標
識ポリヌクレオチドを通常公知の方法で連結させ、所望
のエネルギー供与体とエネルギー受容体の標識位置が確
定したプローブを調製することができる。

【００２３】なお、標識するエネルギー供与体及びエネ
ルギー受容体は、通常それぞれ１ヶ所に標識すれば足り
るが、必要な場合は、同一の近傍部分内であれば複数ヶ
所に標識することもできる。さらに、エネルギー供与体
及びエネルギー受容体の標識方法は上記に限定されるも
のではなく、例えば上記のヌクレオチド骨格のリン原子
への標識方法以外に、塩基に直接標識する手段 (サイエ
ンス 238巻 (1987年) 336〜341頁)をも好適な標識方法
として選択することができる。

【００２４】次に、前記より得られた標識プローブと標
識ＤＮＡ等をハイブリダイズすることが必要である。こ
のハイブリダイズの方法として、従来より広く用いられ
ているサザンブロットフィルターハイブリダイゼーショ
ン法 (Southern, E., J. Mol. Biol., 98,503, 1975)等
の固相法を採用することができるのはもちろんである
が、従来は、自動化には好適であるが、従来標的ＤＮＡ
等の検出の感度に問題があるとされた液相法をも用いる
ことができる。

【００２５】この液相ハイブリダイゼーションはハイブ
リダイズさせるＤＮＡ同士を、一価の陽イオンの存在下
で適当な温度条件を設定することによって、簡便・正確
に行うことができる。液相として用いる緩衝液は、ハイ
ブリダイズを阻害しない範囲で広く用いることができ
る。例えば、リン酸緩衝液やトリス塩酸緩衝液をpH８付
近に調整して用いることができる。一価の陽イオンとし
ても特に限定されず、例えばナトリウムイオンを好まし
いものとして用いることができる。

【００２６】ハイブリダイズの反応自体は、ＤＮＡ分子
自らの折りたたみ等を解消し、ハイブリダイズし易くす
るための昇温過程と、ハイブリダイズを行う降温過程を
通して行われる。昇温過程は60〜95℃、好ましくは65℃
付近まで液相温度を上昇させることにより行われ、降温
過程は一旦昇温させた液相を37℃〜室温、好ましくは25
℃付近まで下降させることによって行われる。一般にこ
の降温過程に要する時間は、少なくとも５分以上は必要
であるが、15分間あれば十分にハイブリダイズは終了す
る。

【００２７】さらに、ハイブリダイズ前後の標識された
エネルギー供与体あるいは受容体における励起による蛍
光発光の変化を検出して、試料中の標的ＤＮＡ等の定量
を行なう必要がある。ハイブリッド未形成時に、エネル
ギー供与体と受容体間にエネルギー移動が生ずるよう
に、かつハイブリッド形成時には、エネルギー移動が生
じないようにプローブを設計した場合には、ハイブリッ
ド形成時に生ずる受容体からの発光量の減少分を計測す
ることにより、又は、供与体からの発光量の増加分を計
測することにより、標的ＤＮＡ等の定量を行ない得る。

【００２８】逆にハイブリッド未形成時にエネルギー移
動を生じないように、かつハイブリッド形成時にエネル
ギー移動を生ずるようにプローブを設計した場合には、
ハイブリッド形成時に生ずる受容体からの発光量の増加
分又は供与体からの発光量の減少分を計測することによ
り、標的ＤＮＡ等の定量を行ない得る。エネルギー供与
体又は受容体の励起は、少なくとも供与体を特異的に励
起することができる特性を有する光を照射することによ
り行なわれる。

【００２９】例えば、エネルギー供与体としてＦＩＴＣ
を、エネルギー受容体としてテキサスレッドを用いた場
合には、ＦＩＴＣを効率良く励起することができる発振
波長488nm のアルゴンレーザー等を用いてＦＩＴＣを励
起するのが好ましい。試料中の標的ＤＮＡ等の量に対応
する蛍光量の増減は、目視法によって測定することもで
きるが、簡便性・正確性を期するうえでハイブリダイズ
から蛍光量測定までの一連の操作を専用の測定機器を用
いて測定するのが好ましい。

【００３０】かかる測定機器は例えば図１に示した構成
による。図１において、１は試料を封入する試料管であ
る。２は光源である。光源の種類は、標識されたエネル
ギー供与体及び受容体の種類に応じて選択される。３,
４は干渉フィルターである。このフィルターの半値幅は
20〜30nm程度が好ましい。５、６は光電子増幅装置であ
る。７〜11はレンズである。

【００３１】なお、試料から発する蛍光の強度は、光線
の照射方向とほぼ直角をなす方向で測定するのが好まし
い。標的ＤＮＡ等の定量は、濃度既知の標準試料を使用
して検量線を作成して行なうことができる。標的となる
ＤＮＡ等については、特に限定はなく、ファージ、ウイ
ルス、細菌を始めとするヒトその他の高等生物のゲノム
ＤＮＡ等を対象とすることができる。

【００３２】

【発明の効果】本発明によれば、自動化に好適な液中で
のハイブリダイゼーション反応を実現できるホモジニア
スなＤＮＡの検定法の高感度化が実現できる。すなわ
ち、標識ＤＮＡオリゴマーと標的ＤＮＡとの近似的な２
分子反応によりハイブリダイゼーション反応を実現でき
るため、ハイブリダイゼーションの効率を高くすること
ができる。また、単一のＤＮＡオリゴマーを用いた標的
ＤＮＡとの競合反応を行うため、ＤＮＡオリゴマー内の
二本鎖形成部分と標的ＤＮＡとのハイブリダイゼーショ
ン部分の塩基長を別々に選定できる。このため、ＤＮＡ
オリゴマー内の二本鎖再形成を抑え標的ＤＮＡとのハイ
ブリダイゼーションの効率を高くすることができる。

【００３３】

【実施例】以下、実施例を挙げて、本発明について具体
的に説明する。

【００３４】

【実施例１】 本実施例はハイブリッド未形成時にエネ
ルギー移動を生じないように、かつハイブリッド形成時
にエネルギー移動を生ずるべく設計したプローブについ
ての一実施態様である。本実施例の概略を図２に示す。
本実施例においては、標的ＤＮＡ試料17として、Ｍ13フ
ァージのＤＮＡ (二本鎖のＭ13mp８RF DNA) を用いた。

【００３５】(１) プローブとして用いるＤＮＡオリゴ
マーの調製 本実施例においてプローブとして用いる二本鎖ＤＮＡオ
リゴマーを以下の様に設計した。図２において、一本鎖
ＤＮＡオリゴマー12の端部13の塩基配列としてＭ13ファ
ージのＤＮＡシーケンス用のプライマーと同一の配列番
号１で示される15塩基配列及び中間配列を介してこれに
隣接する配列番号２で示される15塩基配列とを選択し、
さらに中間部分14として標的ＤＮＡの塩基配列と相関の
ない配列番号３で示された30塩基配列を選択し、計60塩
基からなるＤＮＡオリゴマー12を設計した。

【００３６】この60塩基からなるＤＮＡオリゴマー12の
うち30塩基分ずつを、以下の標識過程に付する目的で市
販のＤＮＡシンセサイザーより合成した。 (２) ＤＮＡオリゴマーの標識 エネルギー供与体15としてフルオロセインイソチアネイ
ト (ＦＩＴＣ) (同仁化学社製) を、エネルギー受容体
16としてスルフォローダミン101 の塩化スルフォン酸誘
導体 (商品名テキサスレッド：モレキュラープローブ社
製) を選択して上記 (１)で得られた一本鎖ＤＮＡオリ
ゴマーを以下の手順で標識してプローブを調製した。

【００３７】標識法として、ポリヌクレオチドの蛍光体
標識部位のリン酸結合を官能基を有するホスホン酸結合
に置き換え、この官能基と蛍光体を結合させる蛍光体標
識法である特開昭61-44535号公報に開示してある方法を
用いた。端部１３における標識位置は、5'末端から3'方
向に13番目のグアニン (Ｇ) と14番目のシトシン (Ｃ)
の間のリン酸部分と、3'末端側から5'方向に13番目のチ
ミン (Ｔ) と14番目のグアニン (Ｇ) の間のリン酸部分
とした。すなわち、ＤＮＡ試料１７とハイブリダイゼー
ションさせると標識物同士が４塩基分離れて位置するよ
うに標識部位を設定した。

【００３８】これらのリン酸結合の部分を、特開昭61-4
4535号公報に開示された方法に従い、前記の２つの30塩
基からなるオリゴヌクレオチドを別々に、エネルギー供
与体15であるＦＩＴＣとエネルギー受容体16であるテキ
サスレッドで標識した。この別々の蛍光色素15、16で標
識したオリゴヌクレオチドをそれぞれの連結部の両側の
10塩基に対して相補的な塩基配列を有する20塩基のオリ
ゴヌクレオチドをＤＮＡシンセサイザーで合成し、この
20塩基のオリゴヌクレオチドと蛍光体が標識された２種
類の30塩基のオリゴヌクレオチドとを前記したハイブリ
ダイゼーション条件下（１00mM Na⁺イオンの存在下で65
℃まで昇温後、10分間で25℃まで降温）で、ハイブリダ
イズ後、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて、本実施例で使用
する標識プローブ12と上記20塩基のオリゴヌクレオチド
の複合体を得た。

【００３９】このＤＮＡ複合体を、通常公知の方法によ
りホルムアミドで一本鎖ＤＮＡに変性して、ゲル電気泳
動により分子量分離して、本実施例で使用する標識プロ
ーブ12を得た。 (３) 標的ＤＮＡ量の測定 次に上記（２）により得られた標識プローブ12を用いて
標的ＤＮＡ17の量を測定した。

【００４０】この測定には図１に示した構成の測定機器
を用いた。試料管１として、キャピラリーセルを、光源
２として出力10mWの空冷アルゴンレーザー（発振波長４
88nm）を、３及び４の干渉フィルターとして、それぞれ
５15nm及び６10nmをピークとする半値幅25nmの干渉フィ
ルターを用いた。又、試料19から発する蛍光の強度は、
アルゴンレーザー２の照射方向とほぼ直角をなす方向で
測定した。

【００４１】標識プローブ12と標的ＤＮＡ試料17を微量
のサンプルの測定が可能なキャピラリーセル１に、pH８
に調整した１00mMのNa⁺イオンを含有するリン酸緩衝
液、標的試料17及び標識プローブ12を封入した（図２、
18）。先ず、アルゴンレーザー２をキャピラリーセル１
に照射し、この時のＦＩＴＣに由来する515nm近傍の蛍
光量とテキサスレッドに由来する610nm近傍の蛍光量を
測定した。

【００４２】次にキャピラリーセル１の温度を65℃まで
上昇させた後、10分間かけて25℃まで冷却した。25℃ま
で冷却した際の、アルゴンレーザー２の照射による515n
m近傍と610nm近傍の蛍光量を測定した。この結果、標的
ＤＮＡ試料17であるＭ13nm８ＲＦＤＮＡの添加量に対し
て用量依存的に、エネルギー受容体として選択したテキ
サスレッド16に由来する610nm近傍の蛍光量が増加し
た。

【００４３】これにより、標識プローブ12と標的ＤＮＡ
試料17が複合体19を形成して、エネルギー供与体15とエ
ネルギー受容体16の間のエネルギー移動を惹起すること
により、定量的に標的試料17の存在量が測定可能である
ことが判明した。

【００４４】

【実施例２】 本実施例は、ハイブリッド未形成時にエ
ネルギー移動を生ずるように、かつハイブリッド形成時
にエネルギー移動を生じないように設計したプローブに
ついての一実施態様である。本実施例の概略を図３に示
す。用いた標的ＤＮＡ試料25は、実施例１と同様にして
Ｍ13ファージのＤＮＡ(二本鎖のＭ13nm８RF DNA) を用
いた。

【００４５】(１) プローブとして用いるＤＮＡオリゴ
マーの調製 本実施例において用いる一本鎖ＤＮＡオリゴマーを以下
の様に設計した。図３において、一本鎖ＤＮＡオリゴマ
ー20の両方の端部21として配列番号４で示される６塩基
配列を；中間部分22として配列番号５で示される30塩基
配列を選択し、計42塩基からなるＤＮＡオリゴマーを設
計した。

【００４６】この中間部分22は、Ｍ13mp８クローニング
用の部位及びそれに隣接する部位にハイブリダイゼーシ
ョンする配列であり、端部21は互いに相補的であるの
で、このＤＮＡオリゴマーを単独でハイブリダイゼーシ
ョン条件下に置いた場合、互いにハイブリダイズして二
本鎖を形成し得る。このプローブとして用いる一本鎖オ
リゴマー20は、実施例１と同様に、予め21塩基からなる
２つのオリゴヌクレオチドを市販のＤＮＡシンセサイザ
ーで合成し、エネルギー供与体23であるＦＩＴＣとエネ
ルギー受容体24であるテキサスレッドを下記（２）の方
法により標識した標識プローブである。

【００４７】(２) ＤＮＡオリゴマーの標識 実施例１と同様にして、エネルギー供与体23としてＦＩ
ＴＣを、エネルギー受容体24としてテキサスレッドを選
択して上記 (１) に示すそれぞれの21塩基の一本鎖オリ
ゴマーを標識してこれらを連結して標識プローブ20を調
製した。なお、標識位置は、一本鎖ＤＮＡオリゴマー20
の5'端から3'方向に１番目のグアニン (Ｇ) と２番目の
アデニン (Ａ) の間のリン酸部分と、3'端から5'方向に
５番目のアデニン (Ａ) と６番目のグアニン (Ｇ) の間
のリン酸部分とした。

【００４８】(３) 標的ＤＮＡ量の測定 先ず、調製した標識プローブ20を、キャピラリーセル１
中で実施例１と同一の条件で、端部21同士をハイブリダ
イズさせた（図３、26）。この時点で、キャピラリーセ
ル１にアルゴンレーザー２を照射して、エネルギー供与
体23とエネルギー受容体24に由来する蛍光量を測定し
た。

【００４９】次に、このキャピラリーセル１に標的ＤＮ
Ａ試料25を添加し、再び前記のハイブリダイゼーション
反応を行ない、反応後のキャピラリーセルにアルゴンレ
ーザー２を照射してエネルギー供与体23とエネルギー受
容体24に由来する蛍光量を測定した。この結果、標的Ｄ
ＮＡ試料25であるＭ13nm８ＲＦＤＮＡの添加量に対して
用量依存的に、エネルギー受容体として選択したテキサ
スレッド24に由来する610nm近傍の蛍光量が減少した。

【００５０】これにより、ハイブリダイズすることによ
って生ずる標識プローブ26におけるエネルギー供与体23
からエネルギー受容体24へのエネルギー移動によるテキ
サスレッド24に由来する610nm近傍の蛍光量が、標的Ｄ
ＮＡ試料25と標識プローブ26と中間部分22のハイブリダ
イズにより標識プローブ26における端部21同士の水素結
合が切断されエネルギー供与体23とエネルギー受容体24
の距離が離れて、相互間のエネルギー移動を生じなくな
ることにより（28）、定量的にＤＮＡ標識試料25の存在
量が測定可能であることが判明した。

【００５１】

【配列表】 配列番号 ：１ 配列の長さ：15 配列の型 ：核酸 鎖の数 ：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 起源 ：Ｍ13ファージ 配列 ＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡ ＣＧＧＣＣ 配列番号 ：２ 配列の長さ：15 配列の型 ：核酸 鎖の数 ：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 起源 ：Ｍ13ファージ 配列 ＡＧＴＧＣＣＡＡＧＣ ＴＴＧＧＣ 配列番号 ：３ 配列の長さ：30 配列の型 ：核酸 鎖の数 ：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ＡＣＡＴＴＴＴＧＣＴ ＧＣＣＧＧＴＣＡＣＧ ＧＴＴＣＧＡＡＣＣＧ 配列番号 ：４ 配列の長さ：６ 配列の型 ：核酸 鎖の数 ：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 起源 ：Ｍ13ファージ 配列 ＧＡＴＡＴＣ 配列番号 ：５ 配列の長さ：30 配列の型 ：核酸 鎖の数 ：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 起源 ：Ｍ13ファージ 配列 ＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡ ＣＧＧＣＣＡＧＴＧＣ ＣＡＡＧＣＴＴＧＧＣ

【図面の簡単な説明】

【図１】 本発明の実施に供する測定機器の構成であ
る。

【図２】 実施例１の概略図である。

【図３】 実施例２の概略図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 15/09 ZNA C12Q 1/68 G01N 33/53 G01N 33/542 G01N 33/566

Claims (5)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 標的核酸内の連続する２つの塩基配列領
   域に各々相補的な塩基配列からなる第１塩基配列と第２
   塩基配列とについて、前記第１塩基配列の一方の端に第
   １の端部が続く第１の一本鎖ポリヌクレオチドと、前記
   第２塩基配列の一方の端に前記第１の端部と相補的な塩
   基配列からなる第２の端部が続く第２の一本鎖ポリヌク
   レオチドを準備する工程と、 前記第１の端部にエネルギー供与体を結合させ、かつ前
   記第２の端部にエネルギー受容体を結合させることによ
   り、前記第１の一本鎖ポリヌクレオチド及び前記第２の
   一本鎖ポリヌクレオチドを標識する工程と、 その後、前記第１塩基配列の他端と前記第２塩基配列の
   他端とを結合させることにより、前記第１の一本鎖ポリ
   ヌクレオチドと前記第２の一本鎖ポリヌクレオチドとを
   結合させる工程とを有し、 前記結合させる工程では、結合された前記第１の一本鎖
   ポリヌクレオチド及び前記第２の一本鎖ポリヌクレオチ
   ドにおける前記第１の端部と前記第２の端部とが、ハイ
   ブリダイズして２本鎖を形成することを特徴とするプロ
   ーブ作成方法。
2. 【請求項２】 標的核酸と相補性がない塩基配列からな
   る第１塩基配列及び第２塩基配列と、前記標的核酸に含
   まれる第３塩基配列に相補的な塩基配列からなる第１の
   端部と、前記第３塩基配列に隣接する第４塩基配列に相
   補的な塩基配列からなる第２の端部とについて、前記第
   １塩基配列の一方の端に前記第１の端部が続く第１の一
   本鎖ポリヌクレオチドと、前記第２塩基配列の一方の端
   に前記第２の端部が続く第２の一本鎖ポリヌクレオチド
   を準備する工程と、 前記第１の端部にエネルギー供与体を結合させ、かつ前
   記第２の端部にエネルギー受容体を結合させることによ
   り、前記第１の一本鎖ポリヌクレオチド及び前記第２の
   一本鎖ポリヌクレオチドを標識する工程と、 前記第１塩基配列の他端と前記第２塩基配列の他端とを
   結合させる工程とを有することを特徴とするプローブ作
   成方法。
3. 【請求項３】 前記標識する工程より前に、前記第１の
   端部及び前記第２の端部の各々の所定のリン酸結合を、
   官能基を有するホスホン酸結合に置き換える工程をさら
   に有し、 前記標識する工程では、前記第１の端部の置き換えられ
   た前記ホスホン酸結合における官能基にエネルギー供与
   体を結合させ、かつ前記第２の端部の置き換えられた前
   記ホスホン酸結合における官能基にエネルギー受容体を
   結合させることにより、前記標識を行うことを特徴とす
   る請求項１又は請求項２に記載のプローブ作成方法。
4. 【請求項４】 前記標識する工程では、前記第１の端部
   の任意の塩基に直接エネルギー供与体を結合させ、かつ
   前記第２の端部の任意の塩基に直接エネルギー受容体を
   結合させることにより、前記標識を行うことを特徴とす
   る請求項１又は請求項２に記載のプローブ作成方法。
5. 【請求項５】 前記結合させる工程は、 前記第１塩基配列の他端と前記第２塩基配列の他端との
   各々から任意の範囲の塩基配列を各々の前記他端を隣接
   させるようにして並べた塩基配列に、相補的な塩基配列
   を有するポリヌクレオチド断片を用意する工程と、 前記ポリヌクレオチド断片に前記第１の一本鎖ポリヌク
   レオチド及び前記第２の一本鎖ポリヌクレオチドをハイ
   ブリダイズさせる工程と、 前記ポリヌクレオチド断片にハイブリダイズした前記第
   １の一本鎖ポリヌクレオチド及び前記第２の一本鎖ポリ
   ヌクレオチドをリガーゼを用いて結合させる工程と、 変性処理を行い、結合された前記第１の一本鎖ポリヌク
   レオチド及び前記第２の一本鎖ポリヌクレオチドを得る
   工程とを有することを特徴とする請求項１又は請求項２
   に記載のプローブ作成方法。