JP5272268B2 - 遮断プライマーを使用する改善された多重核酸増幅 - Google Patents
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Description
本発明は、2以上の標的核酸の増幅に特異的な試薬が存在する反応において、サンプル中の選択された第1標的核酸の特異的転写依存的増幅反応を行うための方法を提供し、
この方法は、
(1)該サンプルを、
(a)5’末端および3’末端を有する第1プロモーターオリゴヌクレオチド(第1プロモーターオリゴヌクレオチドは5’末端にRNAポリメラーゼプロモーター配列を含み、該RNAポリメラーゼプロモーター配列の3’側に、第1標的核酸の第1標的部分に相補的な配列を含む。)および
(b)5’末端および3’末端を有する第2プロモーターオリゴヌクレオチド(第2プロモーターオリゴヌクレオチドは5’末端にRNAポリメラーゼプロモーター配列を含み、該RNAポリメラーゼプロモーター配列の3’側に、第2標的核酸の第1標的部分に相補的な配列を含み、ここで更に、第2プロモーターオリゴヌクレオチドは3’末端に遮断部分を含んでいて、それからの伸長が実質的に阻止される。)
と接触させること、ならびに
(2)選択された試薬および条件を転写依存的増幅に供すること
を含んでなる。
この方法は、
(1)該サンプルを、
(a)5’末端および3’末端を有する第1プロモーターオリゴヌクレオチド(第1プロモーターオリゴヌクレオチドは5’末端にRNAポリメラーゼプロモーター配列を含み、該RNAポリメラーゼプロモーター配列の3’側に、第1標的核酸の第1標的部分に相補的な配列を含む。)および
(b)5’末端および3’末端を有する第2プロモーターオリゴヌクレオチド(第2プロモーターオリゴヌクレオチドは5’末端にRNAポリメラーゼプロモーター配列を含み、該RNAポリメラーゼプロモーター配列の3’側に、第2標的核酸の第1標的部分に相補的な配列を含み、ここで更に、第2オリゴヌクレオチドは3’末端に遮断部分を含んでいて、それからの伸長が実質的に阻止される。)
と接触させること、ならびに
(2)選択された試薬および条件を転写依存的増幅に供することを
含んでなる。
一般に、本発明は、増幅反応の性能を増強するための方法、より詳しくは、転写依存的増幅アッセイ、例えばNASBA、TMAおよび3SRにおいて、1以上がその3’末端において遮断されている(すなわち、遮断部分を付加することにより遮断されている。)、選択された標的に特異的なプライマーを増幅反応において使用することにより、増幅反応の性能を向上させるための方法に関する。該遮断プライマーは伸長不可能であり、標的に特異的である(すなわち、それは非特異的オリゴdTプライマーとの使用のためのものではない。)。また、この増幅反応においては、高い増幅レベルを得るために、第2の、典型的には遮断されていない逆鎖標的特異的プライマー(しばしば、「P2」と称される。)が使用される。該遮断プライマーはP1(すなわち、T7 Pol部位含有)プライマーである。転写依存的増幅反応における遮断プライマーはP1の逆転写酵素媒介伸長を遮断し、おそらく、これらの反応の代替的開始をもたらすであろう。
プライマーの合成
P1および/またはP2プライマーまたはプローブとして使用するオリゴヌクレオチドを、当技術分野で公知の標準的な自動DNA合成法により合成した。プライマーをPAGEおよびHPLCにより精製した。dabcyl−、dabsyl−およびアミノ−遮断プライマーの製造手段を考慮すると、実施例において使用する実質的に全てのプライマーは、結合した遮断部分を有するはずである。すべてのP1プライマーに関して、該プライマーのT7ポリメラーゼプロモーター(5’)領域として以下の配列を使用した:AATTTAATACGACTCACTATAGGG(配列番号1);AATTCTAATACGACTCACTATAGGG(配列番号2)。Dabcylを使用した場合、それは、dabcyl化3’制御孔ガラス(CPG)支持体を使用する自動DNA合成中、該オリゴヌクレオチドの3’末端に結合された。Dabsylも同様に結合される。アミノを使用した場合、それは、dabcyl遮断プライマー合成と同様に、プライマー合成の第1工程中に結合された。ついでプライマーをPAGEおよび/またはHPLCにより精製した。
サンプル中の選択された標的の存在または非存在を決定するために、実施例に記載されているいずれかの特定の修飾を伴う標準的なNASBAアッセイを行った。
遮断p1プライマーの効果を試験するために、HSVおよびエンテロウイルスの多重NASBAを行った。標準的なNASBA試薬(40mM Tris−HCl pH 8.5、12mM MgCl2、90mM KCl、15%v/v DMSO、5mM DTT、1mMの各dNTP、2mM ATP、2mM CTP、2mM UTP、1.5mM GTP、0.5mM ITP、0.2μMの各プライマー(フォワードプライマー(Pl)およびリバースプライマー(P2),表1)、0.1μM 分子ビーコンプローブ(表1)および1単位のSal1制限酵素)を使用して、増幅を行った。該混合物を41℃で15分間温置して、HSV標的の制限酵素消化を行い、95℃で5分間、該標的を変性させ、Sal1酵素を不活性化し、41℃で3分間、P1プライマーを該標的にハイブリド形成させた。ついでNASBA酵素(0.88M ソルビトール(最終濃度)の存在下の、0.08単位のRNアーゼH、32単位のT7 RNAポリメラーゼ、6.4単位のAMV逆転写酵素、2.1μgのBSA)を加え、該反応混合物を、穏やかな渦巻撹拌および短時間の遠心分離により混合し、増幅およびリアルタイム検出を開始した。NucliSens EasyQ Analyzer(NucliSens,BioMerieux)において、30秒ごとの蛍光モニターを行いながら該反応混合物を41℃で150分間温置した。該反応を485nm(FAM)および578nm(ROX)で励起させ、発光シグナルを518nm(FAM)および604nm(ROX)で測定した。
既に行った多重NASBA実験から、第2プライマーセットのみの添加は該反応の抑制を引き起こしうることが判明している。遮断p1プライマーの効果を試験するために、エンテロウイルスとのHIVの多重増幅を行った。標準的なHIV p2プライマーおよび非遮断または遮断HIV p1プライマーの存在下、エンテロウイルス増幅を行った。
細胞溶解バッファー(NucliSens Extraction reagents,BioMerieux)で細胞溶解された細胞培養からのHIV粒子を増幅のための投入物質として使用した。亜型Bサンプルを使用した:国際単位(IU)で定められる、500、50および10 IUの投入量のWRS(Working Reference Standard)を使用した。標準的なNASBA試薬(40mM Tris−HCl pH 8.5、12mM MgCl2、70mM KCl、15%v/v DMSO、5mM DTT、1mMの各dNTP、2mM ATP、2mM CTP、2mM UTP、1.5mM GTP、0.5mM ITP、0.2μMの各プライマー(フォワードプライマー(Pl)およびリバースプライマー(P2))および0.01μM 分子ビーコンプローブ)を使用して、増幅を行った。該混合物を65℃で2分間温置して、該RNAを変性させ、41℃で2分間、P1プライマーを該標的にハイブリド形成させた。ついでNASBA酵素(0.08単位のRNアーゼH、32単位のT7 RNAポリメラーゼ、6.4単位のAMV逆転写酵素および2.1μgのBSA)を加え、該反応混合物を、穏やかな渦巻撹拌および短時間の遠心分離により混合し、増幅およびリアルタイム検出を開始した。NucliSens EasyQ Analyzer(NucliSens,BioMerieux)において、30秒ごとの蛍光モニターを行いながら該反応混合物を41℃で60分間温置した。該反応を485nmで励起させ、発光シグナルを518nmで測定した。
エンテロプライマーの存在下においてもHIVが増幅されうるかどうかを調べるために、追加的実験を行った。前記の標準的なエンテロプライマー、3’DabSyl遮断HIV参照p1、標準的なHIV参照p2およびHIV特異的分子ビーコン(HIV WT MB、表1)を使用して、多重増幅を行った。HIV亜型Bの投入量50 IUのWRS(5サンプル)を投入体として使用した。結果は、3’遮断p1プライマーを使用するHIV増幅が該エンテロプライマーの存在下で行われうることを示している(図5)。このことは、遮断p1プライマーの使用が多重NASBAを改善しうる追加的用途を提供する。
Claims (25)
- (1)サンプルを、
(a)5’末端および3’末端を有する第1プロモーターオリゴヌクレオチド(第1プロモーターオリゴヌクレオチドは5’末端にRNAポリメラーゼプロモーター配列を含み、該RNAポリメラーゼプロモーター配列の3’側に、第1標的核酸の第1標的部分に相補的な配列を含む。)および
(b)5’末端および3’末端を有する第2プロモーターオリゴヌクレオチド(第2プロモーターオリゴヌクレオチドは5’末端にRNAポリメラーゼプロモーター配列を含み、該RNAポリメラーゼプロモーター配列の3’側に、第2標的核酸の第1標的部分に相補的な配列を含み、ここで更に、第2プロモーターオリゴヌクレオチドは3’末端に遮断部分を含んでいて、それからの伸長が阻止される。)と接触させること、ならびに
(2)選択された試薬および条件を転写依存的増幅に供すること
を含んでなる、2以上の標的核酸の増幅に特異的な試薬が存在する反応において、サンプル中の選択された第1標的核酸の特異的転写依存的増幅反応を行うための方法。 - 第1標的核酸の増幅が、第2プロモーターオリゴヌクレオチドが遮断部分を欠く場合の第2プロモーターオリゴヌクレオチドの存在下、最低限度で検出可能であるまたは検出不可能である、請求項1に記載の方法。
- 該遮断部分が、いずれかの選択された増幅反応温度において、第2プロモーターオリゴヌクレオチドの3’末端に尚も存在する、請求項1および2のいずれか1項に記載の方法。
- 転写依存的増幅のための条件が第1標的核酸に関して最適化される、請求項1から3のいずれか1項に記載の方法。
- 転写依存的増幅のための条件が第2標的核酸に関して最適化される、請求項1から3のいずれか1項に記載の方法。
- 選択された試薬が、第1標的核酸の第2標的部分(該第2標的部分は第1標的核酸の第1標的部分の5’側に存在する。)に相同な配列を含む第1プライマーオリゴヌクレオチドと、第2標的核酸の第2標的部分(該第2標的部分は第2標的核酸の第1標的部分の5’側に存在する。)に相同な配列を含む第2プライマーオリゴヌクレオチドとを含む、請求項1から5のいずれか1項に記載の方法。
- 第1プロモーターオリゴヌクレオチドが更に、3’末端に遮断部分を含んでいて、それからの伸長が阻止される、請求項1から6のいずれか1項に記載の方法。
- 第1プロモーターオリゴヌクレオチドの遮断部分が、いずれかの選択された増幅反応温度において、第1プロモーターオリゴヌクレオチドの3’末端に尚も存在する、請求項7に記載の方法。
- 第1および第2の両方のプロモーターオリゴヌクレオチド上の遮断部分が、いずれかの選択された増幅反応温度において、それらのオリゴヌクレオチドの3’末端に尚も存在する、請求項7および8のいずれか1項に記載の方法。
- サンプルを、5’末端および3’末端を有する第3プロモーターオリゴヌクレオチド(第3プロモーターオリゴヌクレオチドは5’末端にRNAポリメラーゼプロモーター配列を含み、該RNAポリメラーゼプロモーター配列の3’側に、第3標的核酸の第1標的部分に相補的な配列を含む。)と接触させることを更に含む、請求項1から9のいずれか1項に記載の方法。
- 該遮断部分がdabsylである、請求項1から10のいずれか1項に記載の方法。
- 該遮断部分がdabcylである、請求項1から10のいずれか1項に記載の方法。
- 該遮断部分がアミノ基である、請求項1から10のいずれか1項に記載の方法。
- 該遮断部分がホスファートである、請求項1から10のいずれか1項に記載の方法。
- サンプルを更に、第1標的核酸の第3標的部分(第3標的部分は第1標的部分と第2標的部分との間に位置する。)に相同な検出可能な様態で標識された第1プローブオリゴヌクレオチドと接触させる、請求項1から14のいずれか1項に記載の方法。
- サンプルを更に、第2標的核酸の第3標的部分(第3標的部分は第1標的部分と第2標的部分との間に位置する。)に相同な検出可能な様態で標識された第2プローブオリゴヌクレオチドと接触させる、請求項15に記載の方法。
- 第1および第2標的核酸が同一生物の2つの株の核酸である、請求項1から16のいずれか1項に記載の方法。
- 第1および第2標的核酸が、異なる生物の核酸である、請求項1から16のいずれか1項に記載の方法。
- 該標的核酸がDNAまたはRNAである、請求項1から18のいずれか1項に記載の方法。
- 転写のための選択された試薬が、
i)逆転写酵素活性を有する酵素、
ii)RNアーゼH活性を有する少なくとも1つの酵素、
iii)RNAポリメラーゼ活性を有する酵素、および
iv)十分な量のdNTPおよびrNTP
を含む、請求項1から19のいずれか1項に記載の方法。 - 第2プロモーターが、第1プロモーターオリゴヌクレオチドのプロモーターと同じポリメラーゼで機能的である、請求項1から20のいずれか1項に記載の方法。
- 第1標的核酸がメチシリン耐性スタヒロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus)の第1株に存在し、第2標的核酸がメチシリン耐性スタヒロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus)の第2株に存在する、請求項1から21のいずれか1項に記載の方法。
- 第2標的核酸がHIV−1に存在する、請求項1から21のいずれか1項に記載の方法。
- (1)サンプルを、
(a)5’末端および3’末端を有する第1プロモーターオリゴヌクレオチド(第1プロモーターオリゴヌクレオチドは5’末端にRNAポリメラーゼプロモーター配列を含み、該RNAポリメラーゼプロモーター配列の3’側に、第1標的核酸の第1標的部分に相補的な配列を含む。)および
(b)5’末端および3’末端を有する第2プロモーターオリゴヌクレオチド(第2プロモーターオリゴヌクレオチドは5’末端にRNAポリメラーゼプロモーター配列を含み、該RNAポリメラーゼプロモーター配列の3’側に、第2標的核酸の第1標的部分に相補的な配列を含み、ここで更に、第2オリゴヌクレオチドは3’末端に遮断部分を含んでいて、それからの伸長が阻止される。)と接触させること、ならびに
(2)選択された試薬および条件を転写依存的増幅に供することを含んでなる、
2以上の標的核酸がサンプル中に存在する場合にそれらを増幅する反応において、サンプル中の選択された第1標的核酸の特異的転写依存的増幅反応を行うための方法。 - 第1プロモーターオリゴヌクレオチドが5’末端にRNAポリメラーゼプロモーター配列を含み、該RNAポリメラーゼプロモーター配列の3’側に、第1標的核酸の第1標的部分に相補的な配列を含み、第2プロモーターオリゴヌクレオチドが5’末端および3’末端を有し、5’末端にRNAポリメラーゼプロモーター配列を含み、該RNAポリメラーゼプロモーター配列の3’側に、第2標的核酸の第1標的部分に相補的な配列を含み、ここで更に、第2プロモーターオリゴヌクレオチドが3’末端に遮断部分を含んでいて、それからの伸長が阻止される、5’末端および3’末端をそれぞれが有する2以上のプロモーターオリゴヌクレオチドを含んでなる、2以上の標的核酸に対する多重ハイブリド形成および該標的核酸の増幅を行うための組成物。
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