CN1303223C - 法医昆虫蝇类特异性扩增引物及鉴定方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种蝇类鉴定种特异性扩增引物，利用该引物对特定蝇种进行鉴定的方法以及含有该种特异性扩增引物的鉴定用检测试剂盒。利用本发明的蝇类种特异性扩增引物可以在三小时内完成鉴定，因此可以用于特定蝇种的快速鉴定。

Description

法医昆虫蝇类特异性扩增引物及鉴定方法

技术领域

本发明属于生物检测及法医鉴定技术领域，具体地说，是关于法医昆虫蝇类特异性扩增引物及鉴定方法。

背景技术

法医昆虫学是近年来研究得较多的一门新兴交叉学科，利用某些蝇类嗜尸性的特点，通过研究其发生规律、发育历期及地理分布特点为法医鉴定提供必要的线索和依据。昆虫在死亡尸体的物质循环中担任重要的角色，根据它们在尸体上的生长发育和演替规律可以比较准确的推断尸体死亡的时间。在破案的过程中，死亡时间是划分嫌疑犯范围的重要依据，此种方法将协助刑事侦察中法医快速并精确鉴定死亡时间，从而缩小嫌疑者的范围，提高破案的效率。近年国际上的法医昆虫学研究有很大发展，无论是在广度还是在深度上都有广泛的应用。

在法医鉴定中，死亡时间(post-mortem interval，PMI)的推断是首要解决的问题之一。死后间隔时间的准确推断，取决于案发现场昆虫标本采集及准确的种类鉴定，传统的方法是通过形态特征来进行分类，这样的工作只有少数专家在自己熟悉的领域中可以做到，一般的研究人员无法完成。而且许多案发现场采集的都是幼虫标本，靠形态特征鉴定相对比较困难，有时采到的是蛹，鉴定的结果需待其发育为成虫后进行确认，这样无疑会延误刑事案件的侦破，给实际工作带来很大的困难。因此，迫切需要寻找一种快速，准确的鉴定方法来解决这个问题。如何将昆虫学的知识直接、快速、有效应用到法医检验工作中去，是法医昆虫学科发展更新的必然趋势，在这门应运而起的交叉学科中，资源互补，优势共享将有助于提高侦查的科技含量。

Zietkiewicz等(Zietkiewicz，E.，Rafalski，A.，Genomics 20：176-183.1994)提出了锚定SSR的新策略ISSR(Inter-Simple Sequence Repeat)，即简单序列重复区间扩增多态性分子标记。这个方法是基于SSR(simlpe sequence repeat)微卫星标记的一种简便易行的操作方法，适合于对基因组背景没有了解的物种，根据散布在真核生物基因组中的微卫星本身设计通用引物，经PCR扩增后检测扩增片段长度多态性来区分鉴别不同的材料。由于引物具有通用性，所以在工作量和费用这两个方面都有较大的优势。利用在基因组中常出现的SSR本身设计引物，通常为16-18个碱基序列，由l-4个碱基组成的串联重复或是在串联重复的3’或5’端加1-3个非重复的锚定碱基组成，从而保证引物与基因组DNA中SSR的5’或3’末端结合，扩增重复序列间间隔不太大的区段。SSR在DNA复制的过程中存在滑动和不均等交换现象，使得它们在不同品种或个体间的重复次数存在较大差异，从而易导致引物结合位点和两结合位点间的片段长度产生差异。与其它的常规的分子标记RAPD、AFLP、SSR等相比，ISSR标记具有简便、快捷、成本低、多态性高等特点，现已在种质资源鉴定、遗传作图、基因定位、遗传多样性、进化、系统发育、分子标记等研究方面被广泛应用(Kebebew Assefa，Arnulf Merker and Hailu Tefera，Hereditas 139：174-183.2003)。

发明内容

本发明的首要目的在于提供一类法医昆虫蝇类鉴定的特异性扩增引物。

本发明的另一个目的在于提供一种利用所述蝇类特异性扩增引物进行快速分子鉴定的方法。

本发明的又一个目的在于提供一种含有所述蝇类特异性扩增引物的鉴定用试剂盒。

为此，本发明立足昆虫学研究的最新进展，采用锚定微卫星方法ISSR(inter simplesequence repeat)，对上海地区经常涉案的五种嗜尸性蝇类进行研究分析，并由此获得可以鉴定相关蝇种的三对种特异性引物，其序列如下：

(1)SCAR标记C(大头金蝇Chrysomya megacephala)

正向引物  5′-AATCGGTTACTTGCAATCTCA-3′

反向引物  5′-CGACAGTTGATGTTGTTTTCGTTTA-3′

(2)SCAR标记D(肥须尻麻蝇Parasarcophaga crassipalpis)

正向引物  5′-CCACTGAACAAAGCGACG-3′

反向引物  5′-TTTTCTTCGCACGGCTTT-3′

(3)SCAR标记E(家蝇Musca domestica)

正向引物  5′-AATGCTATCTGCCCCTCTTG-3′

反向引物  5′-CATTCCCACTTGTACTTTCGTT-3′

本发明的法医快速分子鉴定方法包括以下步骤：

A、对现场采集的标本进行常规的DNA抽提，得到的DNA为待鉴定样品；

B、利用以下三对蝇类特异性扩增引物对待鉴定样品进行PCR扩增：

(1)SCAR标记C(大头金蝇Chrysomya megacephala)

正向引物  5′-AATCGGTTACTTGCAATCTCA-3′

反向引物  5′-CGACAGTTGATGTTGTTTTCGTTTA-3′

(2)SCAR标记D(肥须尻麻蝇Parasarcophaga crassipalpis)

正向引物  5′-CCACTGAACAAAGCGACG-3′

反向引物  5′-TTTTCTTCGCACGGCTTT-3′

(3)SCAR标记E(家蝇Musca domestica)

正向引物  5′-AATGCTATCTGCCCCTCTTG-3′

反向引物  5′-CATTCCCACTTGTACTTTCGTT-3′

C、对扩增产物进行凝胶电泳，根据200-500bp之间扩增条带的有无判断是否为相应种类。

其中，所述PCR扩增的条件为：

94℃预变性3分钟，然后进入循环，94℃变生30秒，50℃退火30秒，72℃延伸1分钟，共35个循环；最后72℃延伸5分钟。

所述凝胶电泳采用1.0％Agarose凝胶，电压为100V电泳30分钟，在紫外光成像系统拍照检测即可。

本发明的蝇类种特异性检测试剂盒包括以下组分：

溶液A：ddH₂O∶10×PCR buffer∶dNTPs＝40∶6∶1；

溶液B：Taq DNA聚合酶5U/μl；

溶液C：以下三对蝇类种特异性扩增引物中的任意一对、两对或三对：

(1)SCAR标记C(大头金蝇Chrysomya megacephala)

正向引物  5′-AATCGGTTACTTGCAATCTCA-3′

反向引物  5′-CGACAGTTGATGTTGTTTTCGTTTA-3′

(2)SCAR标记D(肥须尻麻蝇Parasarccphaga crassipalpis)

正向引物  5′-CCACTGAACAAAGCGACG-3′

反向引物  5′-TTTTCTTCGCACGGCTTT-3′

(3)SCAR标记E(家蝇Musca domestica)

正向引物  5′-AATGCTATCTGCCCCTCTTG-3′

反向引物  5′-CATTCCCACTTGTACTTTCGTT-3′

检测时，将溶液A与溶液B按照470∶6的比例混和均匀，取11μl然后加入2μl溶液C(稀释至10pmol)和2μl待鉴定的DNA样品(稀释为10ng/μl)，组成15μl反应体系按照上述PCR热循环程序进行扩增即可。

利用本发明的种特异性扩增引物可以在3小时内完成鉴定，因此可以用于特定蝇种的快速鉴定。

本发明的嗜尸性蝇类快速分子鉴定技术具有以下优点：

1、能够利用特异性引物对蝇类进行扩增并克服了其他方法如RAPD和RFLP等的稳定性差的缺陷；在此之前尚没有用锚定微卫星筛选SCAR标记用于检测鉴定的报道；

2、筛选出的引物是嗜尸性蝇类种特异性引物，只有在相应种才能扩增出相应大小的片段，根据条带的有无来作出鉴定；

3、该方法可以对一头蝇类幼虫进行鉴定，单个幼虫提取的DNA就可以达到很好的鉴定效果，大大克服了蝇类幼虫形态鉴定的困难，缩短了法医鉴定的周期；

4、本发明的方法可以同时对多个样本进行分析，提高工作效率；

5、试剂盒产品将把不同种的特异性标记扩增产物转化为大小不同的片段，做成像DNA Marker一样的标准化产品。

附图说明

图1为一条ISSR引物(CA)₆GT在五个科的成虫及幼虫材料中的PCR扩增图谱，其中M为Marker，泳道1-6为一个种是丝光绿蝇，泳道7、8为巨尾阿丽蝇，泳道9-12为大头金蝇，泳道13、14为大头金蝇，泳道15、16为肥须尻麻蝇。

图2为由ISSR引物筛选到的SCAR标记，即上面给出的三对引物进行PCR扩增的图谱，其中M为Marker，泳道1、2为丝光绿蝇，泳道3、4为巨尾阿丽蝇，泳道5、6为大头金蝇，泳道7、8为肥须尻麻蝇，泳道9、10为家蝇。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明作进一步说明，应理解，以下实施例仅用于说明本发明而不用于限定本发明的范围。

上海地处我国东部，位于北亚热带东亚季风盛行的地区，属亚热带海洋性季风气候。气候特点温和、湿润，雨量适中，已经有记载的法医昆虫种类达到十几种之多，并具有一定的地域性特点。其中，经常涉案的嗜尸性蝇种有：丝光绿蝇(Lucilia sericata)，巨尾阿丽蝇(Aldrichina grahami)，大头金蝇(Chrysomya megacephala)，肥须尻麻蝇(Parasarcophagacrassipalpis)和家蝇(Musca domestica)等；这些昆虫在案发现场经常出现。结合国内外已有研究和本地区特点，我们选定以上五种蝇类为研究对象，采用ISSR方法对其DNA样本进行分析。

实施例1、种特异性引物的获得

使用ISSR通用引物对丝光绿蝇(Lucilia sericata)，巨尾阿丽蝇(Aldrichina grahami)，大头金蝇(Chrysomya megacephala)，肥须尻麻蝇(Parasarcophaga crassipalpis)和家蝇(Muscadomestica)五个蝇种的DNA样品在PCR仪(Flexigene Thermal Cycler)上进行PCR扩增，其中DNA样品的采集采用参考Zheng Z-M等的方法(Zheng Z-M，Huang G，Journal ofShanghai Normal University(Natural Science Edition).No.1，Vol.30，2002)；

引物1：CACACACACACAGT

PCR扩增的反应体系(15μl)如下：

10×PCR buffer             1.5μl

引物                       0.6μl(10pmol/μl)

10mM dNTPs                 0.25μl

ddH₂O                     10.0μl

Taq DNA聚合酶              0.15μl(5U/μl)

模板DNA                    2.0μl(10ng/μl)

其中10×PCR反应缓冲液的组成如下：

200mM Tris-HCl；

100mM (NH₄)₂SO₄；

100mM KCl；

1％Triton X-100；

20mM MgCl₂；

pH 9.0。

PCR反应按以下条件进行：

94℃预变性3分钟，然后进入循环，94℃变性30秒，50℃退火30秒，72℃延伸1分钟，共35个循环；最后72℃延伸5分钟。

得到的扩增产物于2.0％Agarose凝胶上电泳，30分钟后用EB染色，在紫外光下观察并照相，其结果如图1所示，引物在不同蝇种间扩增出不同的带型模式，有的条带只出现在大头金蝇中扩增产物中(图1中红色框选定的片段)，而在其它蝇种中则无扩增结果。

切胶回收上述种特异性DNA片段，经测序得到大头金蝇种的一段DNA序列，根据这段种特异性DNA序列应用Primer Premier 5软件( http：//www.bioon.com/Soft/Class1/ Class12/Index.html)设计大头金蝇(Chrysomya megacephala)的特异性引物如下：

SCAR标记C(大头金蝇Chrysomya megacephala)：

正向引物  5′-AATCGGTTACTTGCAATCTCA-3′

反向引物  5′-CGACAGTTGATGTTGTTTTCGTTTA-3′。

分别采用以下ISSR通用引物：

引物2：AGAGAGAGAGAGAGAGTA

引物3：CACACACACACAGG

以与上述相同的方法获得肥须尻麻蝇Parasarcophaga crassipalpis和家蝇Muscadomestica的特异性扩增引物如下：

SCAR标记D(肥须尻麻蝇Parasarcophaga crassipalpis)

正向引物  5′-CCACTGAACAAAGCGACG-3′

反向引物  5′-TTTTCTTCGCACGGCTTT-3′

SCAR标记E(家蝇Musca domestica)

正向引物  5′-AATGCTATCTGCCCCTCTTG-3′

反向引物  5′-CATTCCCACTTGTACTTTCGTT-3′。

由于这样的引物来自于某个特异性的种，因此该引物理论上只能在相应的种内才能扩增出相应大小的片段，因此被称为序列特异性扩增区域(SCAR，sequence-characterizedamplified region)标记。

实施例2、引物种特异性的验证

采用实施例1得到的三对嗜尸性蝇类特异性扩增引物，分别对大头金蝇、肥须尻麻蝇和家蝇三个蝇种的DNA样品(采集方法同实施例1)在PCR仪(Flexigene Thermal Cycler)上进行PCR扩增(扩增的具体条件同实施例1)。

得到的PCR扩增产物于1.0％Agarose凝胶上电泳检测，在紫外光下观察并照相，其结果如图2所示。

从图2的结果(图中100bp以下的微弱条带为引物二聚体，对鉴定结果无碍)可见，引物C只在大头金蝇中扩增出相应大小的DNA片段，在其它蝇种中则没有(A)；同样，引物D只在肥须尻麻蝇中扩增出相应大小的DNA片段(B)，虽然B图中在3、4及9、10泳道出现较大的微弱条带，但由于我们的目的片段应该在200-500bp之间(本发明所涉及的三对SCAR标记的片段大小依次为：247bp，227bp，366bp。由于我们选用的DNAMark为DL2000(Takara公司)，标记片段大小中500bp处有标志，而我们的目的片段又都大于200bp，所以就确定预期扩增片段的范围为200-500bp)，所以这些弱带视为非特异性扩增带；而引物E则只在家蝇中扩增出相应大小的DNA片段(C)。

因此，本发明的三对种特异性扩增引物均可以用于特定蝇种的鉴定，且整个过程(扩增与电泳)的时间较短，在3个小时内即可完成，且经过反复验证，因而可以用于快速鉴定。

实施例3、检测试剂盒的制备

根据实施例2的结果，以实施例1得到的以下三对种特异性扩增引物：

SCAR标记C(大头金蝇Chrysomya megacephala)：

正向引物  5′-AATCGGTTACTTGCAATCTCA-3′

反向引物  5′-CGACAGTTGATGTTGTTTTCGTTTA-3′

SCAR标记D(肥须尻麻蝇Parasarcophaga crassipalpis)

正向引物  5′-CCACTGAACAAAGCGACG-3′

反向引物  5′-TTTTCTTCGCACGGCTTT-3′

SCAR标记E(家蝇Musca domestica)

正向引物  5′-AATGCTATCTGCCCCTCTTG-3′

反向引物  5′-CATTCCCACTTGTACTTTCGTT-3′

制备针对大头金蝇、肥须尻麻蝇和家蝇的快速检测试剂盒。

制备试剂盒采用以下常规PCR中的常用试剂：

10×PCR buffer

dNTPs(10mM)

ddH₂O

Taq DNA聚合酶(5U/μl)

其中，10×buffer的组成如下：

200mM Tris-HCl；

100mM (NH₄)₂SO₄；

100mM KCl；

1％Triton X-100；

20mM MgCl₂；

pH 9.0。

试剂盒配方如下，将上述试剂按照一定的比例混和分别配制为A、B、C三种溶液，具体比例和浓度如下：

溶夜A：ddH₂O∶10×PCR buffer∶dNTPs＝40∶6∶1；

溶液B：Taq DNA聚合酶5U/μl；

溶液C：实施例1得到的三对种特异性扩增引物对中的任意一对、两对或三对。

检测时，以Zheng Z-M等的方法(Zheng Z-M，Huang G，Journal of Shanghai NormalUniversity(Natural Science Edition).No.1，Vol.30，2002)采集待检测DNA样品，制成10ng/μl的模板DNA；

将溶液A与溶液B按照470∶6的比例混和均匀，取11μl，然后加入2μl溶液C(稀释至10pmol)和2μl待鉴定的DNA样品(稀释为10ng/μl)，组成15μl PCR反应体系，接着按照实施例1的条件进行PCR扩增，最后将扩增产物于1.0％Agarose凝胶上电泳检测，在紫外光下观察，根据扩增片段的有无即可对特定蝇种进行鉴定。

                                   序列表

<110>中国科学院上海生命科学研究院

<120>法医昆虫蝇类特异性扩增引物及鉴定方法

<160>6

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>21

<212>DNA

<213>蝇类

<400>1

aatcggttac ttgcaatctc a

<210>2

<211>25

<212>DNA

<213>蝇类

<400>2

cgacagttga tgttgttttc gttta

<210>3

<211>18

<212>DNA

<213>蝇类

<400>3

ccactgaaca aagcgacg

<210>4

<211>18

<212>DNA

<213>蝇类

<400>4

ttttcttcgc acggcttt

<210>5

<211>20

<212>DNA

<213>蝇类

<400>5

aatgctatct gcccctcttg

<210>6

<211>22

<212>DNA

<213>蝇类

<400>6

cattcccact tgtactttcg tt

Claims (8)

1、一种蝇类鉴定种特异性扩增引物，其特征在于，选自以下任意一对引物：

I、正向引物    5′-AATCGGTTACTTGCAATCTCA-3′

反向引物       5′-CGACAGTTGATGTTGTTTTCGTTTA-3′；

II、正向引物   5′-CCACTGAACAAAGCGACG-3′

反向引物       5′-TTTTCTTCGCACGGCTTT-3′；

III、正向引物  5′-AATGCTATCTGCCCCTCTTG-3′

反向引物       5′-CATTCCCACTTGTACTTTCGTT-3′。

2、如权利要求1所述的蝇类鉴定特异性扩增引物，其特征在于，其中引物对I对应的特定蝇种为大头金蝇。

3、如权利要求1所述的蝇类鉴定特异性扩增引物，其特征在于，其中引物对II对应的特定蝇种为肥须尻麻蝇。

4、如权利要求1所述的蝇类鉴定特异性扩增引物，其特征在于，其中引物对III对应的特定蝇种为家蝇。

5、一种特定蝇类快速分子鉴定的方法，其特征在于，包括以下步骤：

A、利用以下三对蝇类种特异性扩增引物中的任意一对、两对或三对引物对待鉴定蝇种的DNA样品进行PCR扩增：

I、正向引物    5′-AATCGGTTACTTGCAATCTCA-3′

反向引物       5′-CGACAGTTGATGTTGTTTTCGTTTA-3′；

II、正向引物   5′-CCACTGAACAAAGCGACG-3′

反向引物       5′-TTTTCTTCGCACGGCTTT-3′；

III、正向引物  5′-AATGCTATCTGCCCCTCTTG-3′

反向引物       5′-CATTCCCACTTGTACTTTCGTT-3′；

其中，引物对I对应的特定蝇种为大头金蝇，引物对II对应的特定蝇种为肥须尻麻蝇，引物对III对应的特定蝇种为家蝇；

B、扩增产物进行凝胶电泳，根据200-500bp之间扩增条带的有无鉴定特定的蝇种。

6、如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述A步骤中PCR扩增的条件如下：

PCR扩增的反应体系，总体积15ul：

10×PCR buffer          1.5μl

10pmol/μl引物对        各0.6μl

10mM dNTPs              0.25μl

ddH₂O                 10.0μl

5U/μl Taq DNA聚合酶    0.15μl

10ng/μl模板DNA         2.0μl

其中10×buffer的组成如下：

200mM Tris-HCl；

100mM(NH₄)₂SO₄；

100mM KCl；

1％Triton X-100；

20mM MgCl₂；

pH 9.0；

PCR反应按以下条件进行：

94℃预变性3分钟，然后进入循环，94℃变性30秒，50℃退火30秒，72℃延伸1分钟，共35个循环；最后72℃延伸5分钟。

7、如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤B中凝胶电泳采用1.0％Agarose凝胶电泳。

8、一种特定蝇类快速鉴定的检测试剂盒，其特征在于，含有以下组分：

溶液A：ddH₂O∶10×PCR buffer∶dNTPs＝40∶6∶1；

溶液B：Taq DNA聚合酶5U/μl；

溶液C：以下三对蝇类种特异性扩增引物中的任意一对、两对或三对：

I、正向引物     5′-AATCGGTTACTTGCAATCTCA-3′

反向引物        5′-CGACAGTTGATGTTGTTTTCGTTTA-3′；

II、正向引物    5′-CCACTGAACAAAGCGACG-3′

反向引物        5′-TTTTCTTCGCACGGCTTT-3′；

III、正向引物   5′-AATGCTATCTGCCCCTCTTG-3′

反向引物        5′-CATTCCCACTTGTACTTTCGTT-3′；

其中，引物对I对应的特定蝇种为大头金蝇，引物对II对应的特定蝇种为肥须尻麻蝇，引物对III对应的特定蝇种为家蝇。