CN101063677A - 一种预测妊娠不良结局发生风险的试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种试剂盒，利用血管和内皮功能调节通路上的重要酶脯氨酸羧肽酶基因的单核苷酸多态性位点E112D基因型与妊娠不良结局发生率之间的关系，来预测妊娠不良结局的发生风险：当基因型为112EE纯合野生型时，妊娠不良结局发生率较低；当基因型为112ED杂合型或者112DD纯合突变型时，妊娠不良结局发生率较高。该试剂盒含有用于检测生物样品中脯氨酸羧肽酶基因的E112D多态性位点基因型的多态性分型寡核苷酸，以及相关试剂。本发明可指导医生早期识别妊娠不良结局的高危妇女，从进入育龄妊娠到生产各期尽早采取预防措施、医疗随诊和适时分娩，能最大限度减少妊娠不良结局的发病率、并发症和病死率。
Description
技术领域
本发明涉及一种利用血管和内皮功能调节通路上的重要酶基因多态性预测妊娠不良结局发生风险的试剂盒，包括先兆早产和早产、宫内发育迟缓和低出生体重、妊娠高血压综合症以及先兆子痫和子痫等妊娠不良结局，属于医药生物技术领域。
背景技术
生殖生育健康是涉及母婴健康、家庭幸福和人口社会可持续发展的世界性问题。妊娠期间发生先兆早产和早产(Preterm)、胎儿宫内发育迟缓(Uterus GrowthRetardation，UGR)和出生低体重(Low Birth Weight，LBW)、以及妊娠高血压综合症(pregnancy induced hypertension syndrome，PIHs)和其重度临床表现的先兆子痫和子痫等三大妊娠不良结局，是损害围产期母子健康、影响孕产妇和新生儿、婴儿死亡和相关疾患地的最常见和最主要的原因。在孕前、孕中早期预防最常见和主要的生殖健康问题，对提供围产期母婴健康水平意义十分重要。
早产(Preterm delivery)指在妊娠28-37足周(196-258日)之间终止而分娩者。先兆早产指在妊娠28-37周之间出现临产前兆，伴有宫颈管展平和宫口扩张。伴有见红和胎膜早破的早产一般较难控制，而一旦出现宫口扩张，颈管展平，则往往发展至早产分娩。全国2002～2003年早产儿回顾调查表明，77所城市医院一年6179名新生儿中，产科出生的早产发生率7.8％，住院病人中早产儿占19.7％，性比1.67∶1。胎龄32-36周占63.5％。出生低体重(＜1500g)占32.3％。早产的高危因素依次为母亲流产史(36.8％)、多胎(20.1％)、胎膜早破(19.8％)和妊高症(12.6％)。【中华医学会儿科学分会新生儿学组，中国城市早产儿流行病学初步调查报告，中国当代儿科杂志，2005，7(1)：25-28】其他引发早产的临床常见因素还有母亲的急性感染性疾病、生殖器异常和胎儿本身的疾病。约30％的早产无明显原因。
低出生体重指足月出生的新生儿体重低于2500克。极低出生体重儿＜1500克。早产和低出生体重儿是围产儿死亡和疾病的主要原因。低出生体重儿发病率为4.52％(476/10522)，各年间没有明显变化，其中早产发生率达到一半(53.57％)，足月产和过期产分别为36.13％和10.29％。【王刚琴，袁蜀豫，出生体重儿发生的相关因素分析与结局，中华现代妇产科学杂志，2006，3(1)：14】临床观察发现，低出生体重的发病因素与早产、胎膜早破、妊娠高血压综合征、多胎妊娠等有关。既往早产次数越多，本次妊娠发生早产的可能越大。第一次妊娠分娩新生儿体重≤1.5kg的产妇，第二次妊娠发生早产的机会为50％。
妊娠期女性人群高血压最常见的是妊娠期高血压综合症(简称妊高症)。孕前有原发性高血压者，定义为慢性高血压合并妊娠。孕前血压正常，孕中期才开始血压升高，定义为妊娠高血压综合症。妊高症多发生在妊娠20周后至产后2周，发展为重度妊高症，则为先兆子痫(Preeclampsia)和子痫(Eclampsia)。我国参照WHO的建议分类标准，1983年制定了现行分类法(见表1)【余振球等主编，《实用高血压学》科学出版社，1998年第二版，609-23页】：
表1.妊娠高血压综合症分类
| 分类 | 定义 |
| 轻度妊娠高血压综合症 | 血压为130/90～140/90mmhg(17.3/12.0～18.7/13.3kpa)，或较基础血压升高30/15mmhg(4.0/2.0kpa)，可伴轻度蛋白尿及水肿 |
| 中度妊娠高血压综合症 | 血压＞140/90、＜160/110mmhg(＞17.3/12.0、＜21.3/14.7kpa)，蛋白尿在“+”或伴有水肿及轻度自觉症状如头昏等 |
| 重度妊娠高血压综合症(先兆子痫及子痫) | 1.先兆子痫：血压≥160/110mmhg(21.3/14.7kpa)，或蛋白尿“++”→“++++”，24小时蛋白尿定量≥5g，伴水肿及头痛等自觉症状者2.子痫：在妊高征基础上出现抽搐 |
| 未分类：1.妊娠水肿2.妊娠蛋白尿3.慢性高血压合并妊娠 | 水肿延及大腿部及以上者孕前无蛋白尿，妊娠期蛋白尿“+”及以上而产后恢复正常者包括各种原因所致的高血压者 |
注：血压如不符合以上标准时，则以其收缩压或舒张压之高者为标准，例如血压为150/110或170/100均按重度妊高症计之。
妊高症是孕产妇人群特有的一种全身性疾病，临床上主要表现为水肿、高血压、蛋白尿三大症候群。患者伴有头痛、眼花、甚至抽搐、昏迷。妊高症总体发病率为5-15％，我国的发病率为9-10％。我国妊高症科研协作组90年代370万人群调查显示，妊高症平均发病率9.2％，轻中重度先兆子痫和子痫的发病率分别为4.7％、2.6％、1.7％和0.2％，慢性高血压合并妊娠仅为0.2％【全国妊高症科研协作组，全国妊高症流行病学调查，中华妇产科杂志，1991，26：67-70】。妊娠妇女患有妊娠高血压综合征、特别是伴有慢性，使胎儿子宫内生长迟缓、低氧血症、酸中毒、早产、新生儿低出生体重；还可使母亲出现子痫、脑出血、胎盘早剥、弥漫性血管内凝血、肝出血、肾衰、肺水肿、中风，甚至危及生命。调查表明，轻度先兆子痫随诊病人，早产率显著高于普通人群，达13-54％。惊厥和胎盘早剥发生率分别为0.2％和1％，胎儿或新生儿死亡率约1％，胎儿生长迟缓出现率5-13％。
妊娠不良结局的病因深层机制尚不清楚。既往研究已知，妊娠妇女患有妊娠高血压综合征、特别是伴有慢性，是引起早产、胎儿宫内发育迟缓和低出生体重的重要因素之一。目前认为，妊高症最具特征性的病理改变是子宫-胎盘单位缺血缺氧和全身广泛小血管内皮损伤。子宫-胎盘缺血可能是妊高症及发生先兆子痫的起始环节，胎盘血灌注不足导致其代谢改变，释放某种因子进入外周血循环，引起广泛血管内皮细胞损伤，继而导致血管收缩痉挛、凝血系统功能变化、体液重新分流；可能是妊高症临床表现及其多器官功能障碍，以及由妊高症进一步发展导致多种不良妊娠结局的早产、胎儿宫内发育迟缓和低出生体重相关病理机制的基础。有报道，先兆子痫病人的HELLP综合症(溶血、肝酶升高、血小板计数下降)和妊娠34周前母婴病死率明显增加。另有研究提示，妊娠期滥用中枢神经兴奋剂可卡因，造成局部的麻醉和缩血管作用，可致离体胎盘强烈收缩，加强一种缓激酞诱导的缩血管物的作用，可明显降低胎儿血供，而致缺氧，导致胎儿宫内发育迟缓。妊娠期间生活过度紧张或有严重生活事件打击，可导致早产。由此提示了，子宫-胎盘缺血和血管内皮细胞损伤，可能多组妊娠不良结局的共有的重要深层病因机制线索。
要发现并早期预测先兆早产和早产、以及宫内发育迟缓或低出生体重等妊娠不良结局，早期发现高危妇女人群给予预防和治疗，目前在内在病因尚不完全清楚情况下，早期识别高危人群，目前仍依赖于临床流行病的一些危险因素。如：年轻初孕妇、高龄初产妇、有妊高症或先兆子痫病、或先兆早产、或低出生体重史、高体重指数者，家族高血压、肾炎、或糖尿病病史者，多胎妊娠、羊水过多、葡萄胎患者，经济条件差，营养不良，重度贫血者；妊娠期心理社会压力大，对妊娠恐惧、精神过分紧张或受刺激者，生活卫生状况差，伴有急性或慢性生殖系统炎症；母亲本人为低出生体重儿、早产儿，或有慢性高血压病史、糖尿病、凝血异常和脂代谢异常者。但这些指标还不够敏感和特异。寒冷季节、气压升高时妊娠不良结局的发病也会增多。
既往研究提示，妊高症、早产和低出生体重等妊娠不良结局都称为复杂遗传疾病，是环境与遗传共同作用导致的复杂疾病特征，都有家族遗传倾向。有妊高症家族史的孕妇要比无家族史者发病率高8倍，表明孕妇对妊高症的易感性具有遗传特性【王志坚，余艳红。妊娠高血压综合症合并胎儿生长受限胎盘组织血管细胞粘附因子1的表达。中华围产医学杂志，2003；6：75-7】。
妊娠不良结局都倾向于多基因遗传，确切的遗传基础尚不十分清楚。目前研究较多发病相关基因有：1、调节血压和体液量的易感基因：血管紧张素原基因(angiotensinogen，AGT)、Ag-II 1型受体基因(angiotensin I receptor，AT-1)、血管紧张素转化酶基因(angiotensin-converting enzyme，ACE)；2、血栓形成的易感基因：凝血因子V leiden突变、亚甲基四氢叶酸还原酶(methylenetetrahydrofolate，MTHFR)、凝血酶原基因、凝血酶原调节蛋白(thrombomodulin，TM)；3、与内皮细胞功能相关的基因：一氧化氮合酶基因(endothelial nitric oxide sythase gene，eNOS)；4、参与脂质代谢的易感基因：脂蛋白脂肪酶基因(lipoprotein lipase gene，LPL)、载脂蛋白E基因(apolipoprotein E，apo E)；5、与免疫相关的基因：人类白细胞抗原(HLA)易感基因、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor-α，TNF-α)基因和启动子；6、与线粒体相关的易感基因：细胞色素C氧化酶和长链-3-羟乙酰-辅酶A脱氢酶。7、印迹基因。
疾病相关的候选基因多态性是疾病发生风险个体差异性的重要遗传学基础。功能基因组学是基于的DNA检测疾病发生相关候选基因多态性手段。妊高症易感基因的遗传特征，还表现为单核苷酸点变异形成人群中在基因多态性，即不同个体间在基因水平上的单核苷酸变异特征。生物学通路上重要酶基因上SNP突变，可以是无意义的、隐性的，也可能会造成重要酶活性和整个生物学功能改变，甚至影响整个生物学通路功能，直接与临床个体发病差异有关。据估算，平均每1000对基因碱基会出现一个SNP，而两个无关个体间大约有300万个SNP。这种个体间遗传学上的差别造成的发病风险差异可以达上百倍之多。如对一些疾病相关基因的单核苷酸多态性(SNP)在患病人群中进行SNP检测，能够预测患者发生某一特定疾病特征的可能程度，从而为疾病诊断提供新的辅助依据。另外，还可帮助认识疾病或其某症状的发生和控制机制。
妊高症易感基因的遗传特征，还可以帮助推测与妊高症相关的染色体片段。目前已发现与妊高症相关的染色体片段包括：6号染色体；17号染色体(血管紧张素转化酶)；21号染色体(超氧化物歧化酶基因)；3号染色体(血管紧张素I型受体)【Brought PF.What is the place of genetics in the pathogenesis of preeclampia.Biol Neonate，1999，76：325-330】。
2004年6月30日授权公告的专利(授权公开号：CN 1155722C；发明名称：孕前基因报警诊断试剂盒及其检测方法)中所谓的报警基因包括了N5，N10-亚甲基四氢叶酸还原酶和甲硫氨酸合成酶还原酶基因，可用于在孕前诊断子代是否会发生神经管畸形。
为了克服临床预测妊娠不良结局依赖临床经验、灵敏和特异指标低下之不足，需要利用生物样本的遗传标记特征信息，建立一种预测妊娠不良的发生风险的方法，帮助提高预测效率。这将有助于更早期有效保护妊娠不良结局的高危人群，减少临床不良预后风险，降低医疗治疗的盲目性和高成本，提高围产期母婴生活质量。
发明内容
本发明的目的就是提供一种早期、安全、方便、快速且灵敏的试剂盒，利用脯氨酸羧肽酶(Prolylcarboxypeptidase，PRCP)基因的多态性位点E112D(rs2298668)基因型与妊娠不良结局，包括先兆子痫及子痫、先兆早产和早产、宫内发育迟缓和低出生体重、以及妊娠高血压综合症和子痫等妊娠发生率之间的相关性来预测妊娠不良结局的发生风险，从而可在孕前预测母亲妊娠不良结局的发生风险，减低临床预防和控制妊娠不良结局上的盲目性和滞后性，改善公共卫生和临床辅助诊断水平，早期发现个体差异和高危人群，减少孕产期间的妊娠不良结局发病率、并发症和病死率。
为实现上述发明目的，采取以下技术方案：
本发明的试剂盒，利用了血管和内皮功能调节通路上的重要酶脯氨酸羧肽酶(Prolylcarboxypeptidase，PRCP)基因的单核苷酸多态性位点E112D(rs2298668)基因型与妊娠不良结局发生率之间的关系，来预测妊娠不良结局的发生风险：当基因型为112EE纯合野生型时，妊娠不良结局发生率较低；当基因型为112ED杂合型或者112DD纯合突变型时，妊娠不良结局发生率较高。
本发明的试剂盒至少包括一种用于检测生物样品中脯氨酸羧肽酶基因的E112D多态性位点基因型的多态性分型寡核苷酸，以及，任选的，用于检测反应的合适的缓冲体系和显色体系，测定受检者核酸模板的多态性位点基因型的试剂。
其中，所述的多态性分型寡核苷酸可以是：(1)等位基因特异性核酸引物，用于扩增含有所述多态性位点的脯氨酸羧肽酶基因片断；或者(2)用于检测脯氨酸羧肽酶基因的多态性位点基因型的寡核苷酸探针，其能特异地与含有脯氨酸羧肽酶基因的多态性位点的核酸杂交，优选地，寡核苷酸探针的长度为15-50个核苷酸。
具体而言，按照上述技术方案设计的试剂盒主要有两种：
(一)基于核酸限制性内切酶能够识别并切割特异性位点原理设计的试剂盒，包括：用于扩增含E112D多态性位点的脯氨酸羧肽酶基因片断的特异性引物，能够特异性识别并切断所述位点处的野生型序列或突变型序列的限制性内切酶及其缓冲液。
上述引物序列可以是：
正向引物：5’ATGGTTTGCCAAAAGGTTCA 3’(SEQ ID No.1)
反向引物：5’TGTCACCAAAGGGGAGAGAC 3’(SEQ ID No.2)
上述限制性内切酶优选AVaII，其识别片断为G/GWCC其中W为A或T。
利用上述试剂盒预测妊娠不良结局的步骤包括：(a)从取自受检者的生物样品中提取核酸模板；(b)用PCR方法扩增PRCP基因上的特异片断；(c)用限制性内切酶对PCR产物进行酶切；(d)同时用阳性对照模板进行(b)(c)步骤；(e)电泳分离酶切产物，根据阳性模板的带型特点鉴定并且判断结果。
(二)基于核酸杂交原理的试剂盒，包括：用于扩增含E112D多态性位点的脯氨酸羧肽酶基因片断的特异性引物，检测脯氨酸羧肽酶基因E112D多态性位点的野生型探针和/或突变型探针。
上述引物可以是：
正向引物：5’GTTTGCCAAAAGGTTCAGTGACTT 3’(SEQ ID No.3)
反向引物：5’TCTCCATAGTATCGATGTTCAGCAAAC 3’(SEQ ID No.4)
上述探针优选Taqman探针，如：
VIC-5’CATAGCTTTCAGTTCCTCA 3’-NFQ(SEQ ID No.5)
对应于“T(或Glu)”等位基因，携带VIC荧光报告集团。
FAM-5’ATAGCTTTCAGGTCCTCA 3’-NFQ(SEQ ID No.6)
对应于“G(或Asp)”等位基因，携带FAM荧光报告集团。
利用上述试剂盒预测妊娠不良结局的检测步骤，包括：(a)从取自受检者的生物样品中提取核酸模板；(b)用Taqman方法扩增PRCP基因上的特异片断；(c)鉴定并判断结果。
为了方便使用，这两种试剂盒还可以进一步包括核酸提取试剂、PCR反应试剂(含有四种脱氧单核苷酸、耐热DNA聚合酶及其反应缓冲液)和阳性对照模板。
其中，核酸提取试剂用于提取来自受试者的生物样品中的核酸模板。所述的生物样品选自：血液样品、体液样品、组织样品、组织样分泌物、排泄物样本和培养细胞，优选的，所述样品为血液样品。其中血液样品包括外周血细胞、白细胞、血清等，体液样品包括尿液、唾液、组织液、脑脊液、体腔渗出液等，组织样品包括口腔粘膜试子、毛发、皮肤、活检组织等。
以含有脯氨酸羧肽酶基因E112D多态性位点的核酸作为阳性对照模板。所述阳性对照模板包括含有脯氨酸羧肽酶基因E112D多态性位点的纯合野生型、杂合型和纯合突变型序列的PCR产物、克隆核酸、克隆质粒、直接合成的核酸序列或基因组DNA。
此外，本发明的试剂盒还可以是一种基因芯片，其中包含本发明所述的用于测定血管和内皮功能调节通路上的关键酶基因PRCP的多态性位点基因型的多态性分型寡核苷酸。优选的，所述基因芯片是DNA芯片的形式。
在本发明的试剂盒中，所述脯氨酸羧肽酶基因的多态性位点E112D的基因型还可以通过与该多态性位点存在连锁不平衡的其它多态性位点的基因型来确定，所述的其它多态性位点包括无义突变位点、错义突变位点以及位于基因内含子部位、基因调节部位的多态性位点。
在本发明所述的试剂盒中，涉及利用血管和内皮功能调节通路的关键酶基因PRCP基因的多态性位点基因型预测妊娠不良结局发生风险的预测方法，其预测步骤包括：1)利用上述多态性分型寡核苷酸试剂盒检测来自个体的生物样品中所述关键酶基因的多态性位点基因型；2)建立含有检测样品PRCP多态性位点基因型的预测模型；3)根据所述多态性位点基因型预测妊娠不良结局的风险，或合并伴随慢性高血压者发生妊娠不良结局的风险。
本发明所述的试剂盒中，所述的PRCP E112D(rs2298668)多态性位点和妊娠不良结局的发生有关，具有显著预测效果。具体的，当
(1)所述PRCP位点基因型为112EE纯合野生型时，预测妊娠不良结局发生率较低；
(2)所述的PRCP位点基因型为112ED杂合型或者112DD纯合突变型时，预测妊娠不良结局发生率较高；
(3)当妊娠妇女合并慢性高血压且PRCP基因型为112EE杂合型时，上述预测效果更加明显，即预测PRCPEE纯合野生型基因型的无高血压的妊娠妇女发生妊娠不良结局概率，低于伴有慢性高血压的妊娠妇女。
(4)预测PRCP基因型为112ED杂合型或者112DD纯合突变型的妊娠妇女，若合并慢性高血压时，妊娠不良结局发生率极高于其他PRCP基因型的妊娠妇女。
本发明所述妊娠不良结局包括先兆早产和早产、宫内发育迟缓和低出生体重、妊娠高血压综合症以及先兆子痫和子痫等妊娠不良结局，这些不同阶段的妊娠不良结局，可能在子宫-胎盘缺血和血管内皮细胞损伤上具有共同的发病发展的病理机制。
本发明适用于正常人群、妊娠和待产人群、妊娠伴有血压异常人群和妊高症患者人群，也适用于存在患先兆子痫高危因素人群，特别适用于年轻初孕妇、高龄初产妇、有先兆子痫病史、高体重指数者，家族高血压、肾炎、或糖尿病病史者，多胎妊娠、羊水过多、葡萄胎患者，经济条件差，营养不良，重度贫血者；妊娠期心理社会压力大，对妊娠恐惧、精神过分紧张或受刺激者；母亲本人为低出生体重儿、早产儿，糖尿病、凝血异常和脂代谢异常者，尤其有慢性高血压病史、或者合并高血压的妊高症人群。
本发明所述的试剂盒，其特征在于：测定的多态性位点基因型为脯氨酸羧肽酶基因的多态性位点E112D(rs2298668)基因型。实际上在本发明中，可利用的多态性位点还可以进一步包含与PRCP多态性位点E112D存在连锁不平衡的其它多态性位点，包括无义突变位点、错义突变位点以及位于基因内含子部位、基因调节部位的多态性位点。因此，本发明所述试剂盒还可以进一步包括测定上述的PRCP的其它多态性位点中的一个或者多个，也包括上述多态性位点的不同的排列组合，用于预测妊娠不良结局发生的风险。所述试剂盒除了包含测定上述多态性位点所需要的特定引物和/或探针之外，还包含运用PCR扩增而进行检测的试剂盒的常规组件、试剂、缓冲液等，或者包含运用芯片、微检测系统等方法进行检测的试剂盒的常规组件、试剂、缓冲液等，本领域技术人员熟悉这些常规组件和检测方法。
基于PRCP基因，针对其不同的多态性位点，可以设计并且获得各种诊断剂和试剂盒以用于预测妊娠不良结局发生的风险。基于本发明的预测方法和用途获得的各种诊断剂和试剂盒也属于本发明范围。
本发明中的“试剂盒”不限于试剂盒的固有形式，可以表现为微芯片、微检测系统或者依赖于各种载体的检测系统，以及包括前述检测系统的统一包装形式，如微孔板系统、纸质载体、玻璃载体、尼龙膜载体，塑料载体、硅胶载体、凝胶载体、膜质载体等。
本发明的PRCP的多态性位点基因型检测预测试剂盒主要通过检测PRCP的多态性位点基因型，通过把检测结果加入含有PRCP多态性位点基因型的预测模型分析，可以比临床现有经验性的对就诊患者预测拓展到育龄妇女发生子痫高危个体的分类和识别，最终为开展妊娠不良结局的早期良好预防和有效控制提供可综合流行病学史和临床表现的客观依据。
本发明涉及的研究发现：
发现并早期预测先兆早产和早产、以及宫内发育迟缓或低出生体重等妊娠不良结局，早期发现高危妇女人群给予预防和治疗，在内在病因尚不完全清楚情况下，早期识别高危人群，目前仍依赖于临床流行病的一些危险因素。但这些指标还不够敏感和特异。既往研究提示，妊高症、早产和低出生体重等妊娠不良结局都称为复杂遗传疾病，是环境与遗传共同作用导致的复杂疾病特征，都孕妇对妊娠不良结局的易感性具有遗传特性家族遗传倾向。
妊娠不良结局的病因深层机制尚不清楚。既往研究已知，妊娠妇女患有妊娠高血压综合征、特别是伴有慢性高血压，是引起早产、胎儿宫内发育迟缓和低出生体重的重要因素之一。目前认为，妊高症最具特征性的病理改变是子宫-胎盘单位缺血缺氧和全身广泛小血管内皮损伤。子宫-胎盘缺血可能是妊高症及发生先兆子痫的起始环节，胎盘血灌注不足导致其代谢改变，释放某种因子进入外周血循环，引起广泛血管内皮细胞损伤，继而导致血管收缩痉挛、凝血系统功能变化、体液重新分流；可能是妊高症临床表现及其多器官功能障碍，以及由妊高症进一步发展导致多种不良妊娠结局的早产、胎儿宫内发育迟缓和低出生体重相关病理机制的基础。有报道，先兆子痫病人的HELLP综合症(溶血、肝酶升高、血小板计数下降)和妊娠34周前母婴病死率明显增加。另有研究提示，妊娠期滥用中枢神经兴奋剂可卡因，造成局部的麻醉和缩血管作用，可致离体胎盘强烈收缩，加强一种缓激酞诱导的缩血管物的作用，可明显降低胎儿血供，而致缺氧，导致胎儿宫内发育迟缓。妊娠期间生活过度紧张或有严重生活事件打击，可导致早产。由此提示了，子宫-胎盘缺血和血管内皮细胞损伤，可能多组妊娠不良结局的共有的重要深层病因机制线索。
流行病学资料提示，妊娠不良结局有家族遗传倾向，有妊高症家族史的孕妇要比无家族史者发病率高8倍，表明孕妇对妊高症的易感性具有遗传特性，但目前该病确切的遗传基础还不十分清楚，能调节血压、体液量、胎盘生长、血栓形成、血管重铸、血管内皮细胞功能的基因都可能是妊高症的易感基因。因此，建立能预测妊娠不良结局发生相关遗传特征的试剂盒，可能使识别妊娠不良结局的高危妇女的更早更准确，使从进入育龄妊娠到生产各期能够尽早采取预防措施和处理措施，能最大限度减少发病率、并发症和病死率，是挽救和治疗妊娠不良结局的关键。
妊娠不良结局是一组多基因疾病。肾素-血管紧张素-醛固酮系统(renin-angiotension system，RAAS)基因可能在妊娠不良结局的发病机制上是主要深层次的病因候选基因。RAAS是一种激素内分泌系统，循环RAAS即肾脏来源的肾素，在外周血中使肝脏合成的血管紧张素原，转变为血管紧张素I，再在肺脏经血管紧张素转换酶的作用，转变成血管紧张素II(Ang II)；Ang II分泌到血液中，随血流至远端靶器官(血管、心脏、脑、肾脏、肾上腺等)，与靶器官上的特异性受体结合，调节心血管系统和水电解质平衡。很多外周靶器官(如血管、心脏、脑、肾脏、肾上腺、胎盘、子宫、卵巢、睾丸等)存在局部RAAS的成分。RAAS的主要成分包括肾素、血管紧张素转换酶、血管紧张素酶原、血管紧张素I、血管紧张素II和它们的受体，都存在于胎盘。
脯氨酸羧肽酶(PRCP)是一种重要的血管紧张素II降解酶。由Yang HYT等于1968年首先发现。PRCP在pH等于5时，具有最佳的酶活性，当pH升高到7时酶活性只剩下最大时的20-50％。PRCP属于丝氨酸蛋白酶家族，活性能被苯甲基磺酰氟(PMSF)抑制。大量研究表明，PRCP能在内皮细胞的外膜表达。PRCP是RAAS和激肽-缓激肽系统(KKS)之间的调节剂，是血管和内皮功能的另一种重要的调节系统。PRCP降解血管紧张素II，使得具有强烈缩血管活性的血管紧张素II转变成具有舒血管活性的血管紧张素1-7，参与RAAS系统功能的调节。此外，PRCP还是一种独立于XIIa之外的血浆激肽酶原激活物，能够使得激肽酶原激活生成缓激肽。由于PRCP既能降解血管紧张素II，增加血管紧张素1-7的生成又能促进缓激肽的释放，两种作用都能使得NO的生成增多，进而舒张血管，起到降低血压和减低血管内皮细胞损害的作用，此外，在妊娠过程中可能细胞对胎盘局部和母亲全身的供血和血压调节或内皮保护上。
脯氨酸羧肽酶(Prolylcarboxypeptidase，PRCP)基因于1993年被克隆，定位于人类11号常染色体的长臂上(11q14)，编码一种溶酶体酶，作用是酶切如血管紧张素II、血管紧张素III和缓激肽等肽类与脯氨酸连接的C末端氨基酸。位于其外显子上的一个A-C的碱基突变，导致了第112位氨基酸由谷氨酸(Glu)变成天门冬氨酸(Asp)。我们研究发现，该多态性位点与PRCP的mRNA的表达及活性等有关。鉴于PRCP对RAAS系统和血压的重要调节作用，该功能性单核苷酸多态性位点很有可能会影响到ACEI类药物的药物作用。但与妊高症、早产和宫内发育迟缓和低出生体重的关系及其预测试剂方法尚无文献报道。
本发明依次发现并证明：在综合分析妊娠不良结局层面上，观察妊娠分娩妇女中，PRCP 112DD纯合突变型的比例(3％)在妊娠不良结局患者中比无妊娠不良结局的妊娠妇女比例明显增高(21％)。经过矫正调整了妊娠年龄、孕龄、经产次数、吸烟、BMI等因素后，发现PRCP 112DD纯合突变型基因型与PRCP 112EE纯合野生型基因型的妊娠不良结局发生率的OR值为4(95％ CI：1-12，p＝0.031)。结果提示PRCP基因可以预测妊娠不良结局的发生，PRCP E112D多态性位点基因型可以预测妊娠不良结局的发生。
本发明依次发现并证明：在各案分析先兆早产和早产层面上，在妊娠妇女中，PRCP112DD纯合突变型的比例(3％)在先兆早产和早产患者中比无先兆早产和早产的妊娠妇女比例明显增高(21％)。经过矫正调整了妊娠年龄、孕龄、经产次数、吸烟、BMI等因素后，发现PRCP 112DD纯合突变型基因型与PRCP 112EE纯合野生型基因型的先兆早产和早产发生率的OR值为4(95％ CI：1-12，p＝0.031)。结果提示PRCP基因可以预测先兆早产和早产的发生，PRCP E112D多态性位点基因型可以预测先兆早产和早产的发生。
本发明依次发现并证明：在各案分析胎儿宫内发育迟缓和低出生体重层面上，在妊娠妇女中，PRCP 112DD纯合突变型的比例(3％)在胎儿宫内发育迟缓和低出生体重患者中比无先兆早产和早产的胎儿宫内发育迟缓和低出生体重比例明显增高(21％)。经过矫正调整了妊娠年龄、孕龄、经产次数、吸烟、BMI等因素后，发现PRCP 112DD纯合突变型基因型与PRCP 112EE纯合野生型基因型的胎儿宫内发育迟缓和低出生体重发生率的OR值为4(95％ CI：1-12，p＝0.031)。结果提示PRCP基因可以预测胎儿宫内发育迟缓和低出生体重的发生，PRCP E112D多态性位点基因型可以预测胎儿宫内发育迟缓和低出生体重的发生。
本发明依次发现并证明：在各案分析妊高症和子痫层面上，在妊娠妇女中，PRCP112DD纯合突变型的比例(3％)在妊高症和子痫患者中比无妊高症和子痫的妊娠妇女比例明显增高(21％)。经过矫正调整了妊娠年龄、孕龄、经产次数、吸烟、BMI等因素后，发现PRCP 112DD纯合突变型基因型与PRCP 112EE纯合野生型基因型的妊高症发生率的OR值为4(95％ CI：1-12，p＝0.031)。结果提示PRCP基因可以预测妊高症的发生，PRCP E112D多态性位点基因型可以预测妊高症的发生。
本发明以慢性高血压进行分层后进一步相关分析，发现并证实：与未合并慢性高血压的PRCP 112EE纯合野生型基因型的妊娠妇女相比较，慢性高血压单独增加了11倍患妊高症的风险，而PRCP E112D杂合型基因型妊娠妇女合并慢性高血压增加了120倍患妊高症的风险。结果提示PRCP E112D(rs2298668)多态性位点基因型可以预测妊娠妇女妊高症的发生(见表2)，尤其对于合并慢性高血压的妊娠妇女预测作用更加明显。
因此，本发明选择PRCP作为妊娠不良结局的预测基因。本发明用于预测妊娠不良结局的试剂盒包括测定受检者核酸模板的多态性位点基因型的试剂和检测方法，测定多态性位点基因型的基因为PRCP，测定的多态性位点基因型为PRCP E112D(rs2298668)多态性位点基因型。该试剂盒中采用测定受检者核酸模板的PRCP E112D(rs2298668)多态性位点基因型的试剂和检测方法来预测妊娠不良结局的发生，是本发明最重要的组成成分。在此基础上增加预测基因及所有的预测基因的相应表达产物如mRNA和多肽、蛋白及其引物或者探针序列仍在本发明的范围内。
应用本发明成果，选择PRCP作为妊娠不良结局的预测基因，增强了目前传统开展的育龄妇女、孕产妇针对妊娠不良结局的预防水平和控制能力。便于社区妇女保健咨询时和/或临床医生对初诊孕妇通过测定PRCP基因多态性位点基因型，为就诊者更科学地提供预测妊娠不良结局和高血压防治的咨询服务，发现和保护高危人群。
本发明的试剂盒，采用了Taqman方法或者PCR、PCR-RFLP方法进行基因多态性分析，方法成熟，操作简便，结果稳定可靠，操作人员经过简单培训后，在配备了Taqman检测仪器或者普通PCR仪的分子生物学实验室均可完成。本发明提供的试剂盒预测妊娠不良结局的检测方法的基本反应模式为PCR、PCR-RFLP方法或者Taqman方法，选用的预测基因为PRCP，选用的核酸模板为外周微量全血或者血细胞采用核酸提取法提取的核酸，选用的阳性对照模板为PRCP纯合野生型、杂合型和纯合突变型的PCR产物或者直接合成的核酸序列。特异性野生型和纯合型探针优先为Taqman探针。检测快速、安全、方便、灵敏，可提供妊娠不良结局的早期预测，有利于早期干预、处理，而且对于受检者无副作用。
附图说明
图1是实施例1检测PRCP基因的E112D多态性位点基因型的凝胶电泳图。
图2是实施例2检测PRCP基因的E112D多态性位点基因型的荧光图谱。
其中：
1——167bp片断； 2——101bp片断； 3——66bp片断；
4——发出FAM荧光区域； 5——发出两种荧光区域；
6——发出VIC荧光区域。
具体实施方式
实施例1：试剂盒(1)及其实施方法(以PCR-RFLP检测方法为基础)
一种预测妊娠不良结局发生风险的试剂盒，由以下组分组成：
(1)红细胞裂解液：含有NH4Cl，KHCO3，EDTA；
(2)白细胞裂解液：含有蛋白酶K、RNase A、NaCl、Tris、EDTA、SDS；
(3)蛋白沉淀液：7.5M乙酸胺(pH 7.4)
(4)核酸储存液：1M三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl，pH8.0)；
(5)PCR反应混合液：1.0ml[100mM Tris-HCl，100mM KCl，pH8.3(20℃)]；5.0μMMgCl2；各0.4mM dATP，dCTP，dGTP，dTTP，无菌双蒸水配制，pH 7.0；PRCP基因的多态性位点基因型检测引物；
(6)Taq DNA聚合酶(5U/μl)：保存缓冲液：20mM Tris-HCl(pH 8.0)，100mM KCl，0.1mM EDTA，1mM DTT，0.5％NP40，0.5％(v/v)Tween 20，50％甘油；
(7)阳性质粒：含有PRCP基因的多态性位点杂合基因型个体全血标本，或者含有PRCP基因的多态性位点杂合基因型的质粒；
(8)阴性对照：经DNAase I处理的双蒸水；
(9)内切酶缓冲体系(10×)；
(10)限制性内切酶；
(11)PCR用水；
(12)10×电泳上样缓冲液：0.25％溴酚兰，40％(w/v)蔗糖水溶液。
利用上述试剂盒测定PRCP基因的E112D(rs2298668)多态性位点基因型：
(1)提取宿主细胞的基因组DNA：按照常规的分子生物学方法操作。
(a)在全血中加入30ml红细胞裂解液，缓慢摇匀，室温静置10分钟，期间，摇动数次，彻底裂解红细胞；
(b)于4℃、2000转离心/分，10分钟，去上清，将沉淀之白细胞在旋转震荡器上打散，加蛋白酶40μl、RNA酶50μl，摇匀，加白细胞裂解液置15ml，混匀37℃水浴20分钟后取出，置冷水中；
(c)加冷的蛋白沉淀液4ml，混匀后放在-20℃冰箱5分钟，取出于4℃、3000转/分离心10分钟。将上清液倒入已加好15ml异丙醇的50ml离心管中缓慢摇动数次，至DNA絮状物析出；
(d)将析出的DNA絮状物移至另一1.5ml已装入75％乙醇的滤纸上，使液体挥发干。
(e)加DNA水化液1.5ml，置摇床，摇动过夜，备用；
(f)DNA浓度的测定采用紫外分光光度法，分别测定260nm及280nm两个波长下的OD值，以OD260nm×50所得值为DNA浓度。并以OD260nm/OD280nm比值估计DNA纯度；
(2)使用PCR和限制性酶切片段长度多态性分析方法(PCR-RFLP)检测PRCPE112D多态性位点
根据PRCP E112D基因序列设计PCR特异性引物，包括PCR正向引物和PCR反向引物，按如下条件进行常规PCR扩增。
引物序列：
正向引物：5’ATGGTTTGCCAAAAGGTTCA 3’(SEQ ID No.1)
反向引物：5’TGTCACCAAAGGGGAGAGAC 3’(SEQ ID No.2)
PCR反应体系：
基因组DNA 15ng/ul，上下游引物10pmol(20μmol/L)，dNTPs 1.25mmol/l，10×buffer 1.0μl，Gold Taq DNA聚合酶3U，dH2O补足总体积至6.55μl。
PCR反应条件：
94℃预变性3min后；94℃变性45sec，62℃退火45sec，72℃延伸1sec，38个循环周期；最后72℃延伸7min。；得到167bp的扩增片段。
酶切条件及体系(15μl)：
PRCP E112D位点PCR产物目的片段长度为167bp，总的酶切体系为15μl，其中PCR产物10μl，10×NEBuffer#2 1.5μl，AVaII内切酶4U(0.4μl)，和3.1μl ddH2O，37℃过夜。
基因型结果判定：
将DNA酶切后的产物点样在2.5％琼脂糖胶上，37℃酶切过夜后，在紫外灯下读取胶图并进行基因型分析。如图1所示，个体基因型鉴定如下：
酶切片段为167bp，PRCP基因型为112EE(野生型)；
酶切片段为167+101+66bp，PRCP基因型为112ED(杂合子)；
酶切片段为101+66bp，PRCP基因型为112DD(突变型纯合子)。
实施例2：试剂盒(2)及其实施方法(以Taqman方法为基础)
一种预测妊娠不良结局发生风险的试剂盒，由以下组分组成：
(1)红细胞裂解液：含有NH4Cl，KHCO3，EDTA；
(2)白细胞裂解液：含有蛋白酶K、RNase A、NaCl、Tris、EDTA、SDS；
(3)蛋白沉淀液：7.5M乙酸胺(pH7.4)
(4)核酸储存液：1M三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl，pH8.0)；
(5)PCR反应混合液：Taq DNA聚合酶及其反应缓冲液；各0.4mM dATP，dCTP，dGTP，dTTP；
(6)PRCP基因的多态性位点基因型检测引物和Taqman探针；
(7)阳性质粒：含有PRCP基因的多态性位点杂合基因型个体全血标本，或者含有PRCP基因的多态性位点杂合基因型的质粒；
(8)阴性对照：经DNAase I处理的双蒸水；
(9)PCR用水。
利用上述试剂盒测定PRCP基因的E112D(rs2298668)多态性位点基因型：
(1)在标准的操作方法和操作规程上采用同实施例1中所述的常规方法提取宿主细胞的基因组DNA
(2)使用Taqman方法检测PRCP基因的Glu112Asp(E112D)多态性位点基因型
(a)用PCR仪扩增PRCP功能基因多态位点及其侧翼序列，在5μl PCR反应体系中含有基因组DNA 10ng，2.5μl的Taqman 2X Universal PCR Master Mix NoAmpErase UNG(组成成份包括：AmpliTaq Gold DNA Polymerase，dNTPs with Dutp，Passive Reference，以优化的缓冲液)，及0.90μM的正向引物，0.90μM的反向引物及两段带荧光报告集团的等位基因特异性探针各0.25μM.
引物序列为
正向引物：5’GTTTGCCAAAAGGTTCAGTGACTT 3’(SEQ ID No.3)
反向引物：5’TCTCCATAGTATCGATGTTCAGCAAAC 3’(SEQ ID No.4)
等位基因特异性探针的序列为：
VIC-5’CATAGCTTTCAGTTCCTCA 3’-NFQ(SEQ ID No.5)
对应于“T(或Glu)”等位基因，携带VIC荧光报告集团。
FAM-5’ATAGCTTTCAGGTCCTCA 3’-NFQ(SEQ ID No.6)
对应于“G(或Asp)”等位基因，携带FAM荧光报告集团。
PCR反应条件：
95℃ 10min， 1个循环；
92℃ 15s，
60℃ 1min，
50个循环。
(b)在ABI Primer 7900型荧光定量PCR仪上检测荧光信息进行基因型的鉴定
将完成PCR反应的PCR板放入7900型荧光定量PCR仪上，选用SDS 2.1软件中“Allelic Discrimination”程序，进行扫描与结果的判断(结果见图2)：
发出FAM荧光者的基因型为Asp/Asp纯合子；
发出VIC荧光者的基因型为Glu/Glu纯合子；
发出两种荧光者的基因型为Asp/Glu杂合子。
实施例3.发生妊娠不良结局风险的预测
利用本发明的试剂盒测定PRCP基因的E112D(rs2298668)多态性位点基因型，PRCP基因型为112ED杂合型或者112DD纯合突变型时，预测妊娠不良结局发生率较高；基因型为112EE纯合型时，预测妊娠不良结局发生率较低。
当妊娠妇女合并慢性高血压时，上述预测效果更加明显。即慢性高血压的妊娠妇女的PRCP基因型为112ED杂合型或者112DD纯合突变型时，预测妊娠不良结局发生率更高。
以上方法通过临床验证，先将妊娠不良结局病人分为三组：纯合野生型组、杂合型组、纯合突变型组。采用临床流行病学病例对照方法，对三组人群进行PRCP多态性位点基因型和妊娠不良结局总危险性的相关分析。按是否伴随慢性高血压分层分析孕产妇发生妊高症情况，结果表明(表2)：在妊娠前无慢性高血压、携带PRCP基因DD纯合突变基因型的妊娠妇女中，妊娠不良结局发生比例较高(52.6％)，经过矫正调整了妊娠年龄、孕龄、经产次数、吸烟、BMI等因素后，发现PRCP DD纯合突变型基因型，相对EE纯合野生型基因型，OR值为2.7，95％CI为1.1-11.6，p＝0.035。
表2.PRCP基因E112D多态性基因型与妊娠不良结局危险性的相关分析
| 基因型 | 妊娠人数(％) | 相关分析 | 矫正结果§ | |||
| 有不良结局 | 无不良结局 | OR | 95％CI | OR | 95％CI | |
| EEEDDD | 301(34.3)77(34.2)11(52.6) | 577(65.7)155(65.8)8(48.4) | #0.952.63* | -(0.49，1.70)(1.03，9.84) | #0.962.68* | -(0.54，1.62)(1.10，11.61) |
*p＜0.05，**p＜0.0001；#对照组；§调整了性别、妊娠年龄、孕龄、经产次数、吸烟、糖尿病、BMI、教育程度等因素。EE代表纯合野生型；ED代表杂合型；DD代表纯合突变型(95％CI：95％可信区间)。
实施例4：发生先兆早产和早产风险的预测
利用本发明的试剂盒测定PRCP基因的E112D(rs2298668)多态性位点基因型，PRCP基因型为112ED杂合型或者112DD纯合突变型时，预测先兆早产和早产发生率较高；基因型为112EE纯合型时，预测先兆早产和早产发生率较低。
当妊娠妇女合并慢性高血压时，上述预测效果更加明显。即慢性高血压的妊娠妇女的PRCP基因型为112ED杂合型或者112DD纯合突变型时，预测先兆早产和早产发生率更高。
以上方法通过临床验证，先将先兆早产和早产病人分为三组：纯合野生型组、杂合型组、纯合突变型组。采用临床流行病学病例对照方法，对三组人群进行PRCP多态性位点基因型和先兆早产和早产总危险性的相关分析。按是否伴随慢性高血压分层分析孕产妇发生妊高症情况，结果表明(表3)：在妊娠前无慢性高血压、携带PRCP基因DD纯合突变基因型的妊娠妇女中，先兆早产和早产发生比例较高(36.1％)，经过矫正调整了妊娠年龄、孕龄、经产次数、吸烟、BMI等因素后，发现PRCP DD纯合突变型基因型，相对EE纯合野生型基因型，OR值为1.6，95％CI为1.1-10.6，p＝0.041。
表3.PRCP基因E112D多态性基因型与先兆早产和早产危险性相关分析
| 基因型 | 妊娠人数(％) | 相关分析 | 矫正结果§ | |||
| 有(先兆)早产 | 无(先兆)早产 | OR | 95％CI | OR | 95％CI | |
| EEEDDD | 239(27.2)45(19.7)7(36.8) | 639(72.8)183(80.3)12(63.2) | #0.751.56* | -(0.21，1.57)(1.03，7.84) | #0.731.59* | -(0.22，1.63)(1.06，10.55) |
*p＜0.05，**p＜0.0001；#对照组；§调整了性别、妊娠年龄、孕龄、经产次数、吸烟、糖尿病、BMI、教育程度等因素。EE代表纯合野生型；ED代表杂合型；DD代表纯合突变型(95％CI：95％可信区间)。
实施例5：发生宫内发育迟缓和低出生体重风险的预测
利用本发明的试剂盒测定PRCP基因的E112D(rs2298668)多态性位点基因型，PRCP基因型为112ED杂合型或者112DD纯合突变型时，预测宫内发育迟缓和低出生体重发生率较高；基因型为112EE纯合型时，预测宫内发育迟缓和低出生体重发生率较低。
当妊娠妇女合并慢性高血压时，上述预测效果更加明显。即慢性高血压的妊娠妇女的PRCP基因型为112ED杂合型或者112DD纯合突变型时，预测宫内发育迟缓和低出生体重发生率更高。
以上方法通过临床验证，先将宫内发育迟缓和低出生体重病人分为三组：纯合野生型组、杂合型组、纯合突变型组。采用临床流行病学病例对照方法，对三组人群进行PRCP多态性位点基因型和宫内发育迟缓和低出生体重总危险性的相关分析。按是否伴随慢性高血压分层分析孕产妇发生妊高症情况，结果表明(表4)：在妊娠前无慢性高血压、携带PRCP基因DD纯合突变基因型的妊娠妇女中，宫内发育迟缓和低出生体重发生比例较高(47.4％)，经过矫正调整了妊娠年龄、孕龄、经产次数、吸烟、BMI等因素后，发现PRCP DD纯合突变型基因型，相对EE纯合野生型基因型，OR值为1.7，95％CI为1.2-11.2，p＝0.036。
表4.PRCP基因E112D多态性基因型与宫内发育迟缓和低出生体重危险性相关分析
| 基因型 | 妊娠人数(％) | 相关分析 | 矫正结果§ | |||
| 有发育迟缓低体重 | 无发育迟缓低体重 | OR | 95％CI | OR | 95％CI | |
| EEEDDD | 301(34.3)60(36.3)9(47.4) | 577(65.7)168(69.3)10(52.6) | #0.681.73* | -(0.11，1.43)(1.09，9.92) | #0.691.72* | -(0.12，1.55)(1.18，11.23) |
*p＜0.05，**p＜0.0001；#对照组；§调整了性别、妊娠年龄、孕龄、经产次数、吸烟、糖尿病、BMI、教育程度等因素。EE代表纯合野生型；ED代表杂合型；DD代表纯合突变型(95％CI：95％可信区间)。
实施例6：发生妊高症和子痫风险的预测
利用本发明的试剂盒测定PRCP基因的E112D(rs2298668)多态性位点基因型，PRCP基因型为112ED杂合型或者112DD纯合突变型时，预测妊高症和子痫发生率较高；基因型为112EE纯合型时，预测妊高症和子痫发生率较低。
当妊娠妇女合并慢性高血压时，上述预测效果更加明显。即慢性高血压的妊娠妇女的PRCP基因型为112ED杂合型或者112DD纯合突变型时，预测妊高症和子痫发生率更高。
以上方法通过临床验证，先将妊高症和子痫病人分为三组：纯合野生型组、杂合型组、纯合突变型组。采用临床流行病学病例对照方法，对三组人群进行PRCP多态性位点基因型和妊高症和子痫总危险性的相关分析。按是否伴随慢性高血压分层分析孕产妇发生妊高症情况，结果表明(表5)：在妊娠前无慢性高血压、携带PRCP基因DD纯合突变基因型的妊娠妇女中，妊高症和子痫发生比例较高(15.8％)，经过矫正调整了妊娠年龄、孕龄、经产次数、吸烟、BMI等因素后，发现PRCP DD纯合突变型基因型，相对EE纯合野生型基因型，OR值为2.9，95％CI为1.2-10.1，p＝0.035。
携带PRCP基因EE基因型的孕妇，妊娠前伴有慢性高血压者与不伴有慢性高血压者相比，患妊高症和子痫的风险显著增加，OR值为8.8，95％CI为3.6-12.7；而妊娠前伴有慢性高血压同时具有PRCP ED杂合基因型的孕产妇，患妊高症和子痫的风险较EE基因型且不伴有慢性高血压者更为显著，OR值为138.。以上结果提示，PRCP E112D(rs2298668)多态性位点基因型和妊高症和子痫发生有很显著的预测关联关系。
表5.PRCP基因E112D多态性基因型和慢性高血压与妊高症和子痫危险性相关分析
| 是否合并慢性高血压 | 基因型 | 妊娠人数(％) | 相关分析 | 矫正结果§ | |||
| 有妊高症 | 无妊高症 | OR | 95％CI | OR | 95％CI | ||
| 否 | EEEDDD | 70(8.2)15(7.1)4(15.8) | 808(91.8)213(92.9)16(74.2) | #0.812.89* | -(0.51，1.58)(1.01，8.83) | #0.892.92* | -(0.56，1.50)(1.18，10.12) |
| 是 | EEEDDD | 23(44.2)12(100.0)0 | 29(55.8)0(0.0)0 | 9.15**138.5**- | (7.64，16.33)(22.62，∝)- | 8.82**-- | (3.56，12.72)-- |
*p＜0.05，**p＜0.0001；#对照组；§调整了性别、妊娠年龄、孕龄、经产次数、吸烟、糖尿病、BMI、教育程度等因素。EE代表纯合野生型；ED代表杂合型；DD代表纯合突变型(95％CI：95％可信区间)。
实施例7：试剂盒的应用
采用病例-对照研究方法并应用小试生产的试剂盒，对先兆子痫的孕妇和正常妊娠的孕妇的PRCP基因型进行检测，随访其发生子痫结果：如表3所示，患先兆子痫孕产妇中PRCP基因的EE基因型者比例较低，而PRCP基因的ED和DD基因型比例较高。非先兆子痫孕产妇的EE基因型者比例较高。
表3.先兆子痫组和无先兆子痫妊娠组PRCP基因E112D多态性位点基因型的检测
| 基因型 | EE(％) | ED(％) | DD(％) |
| 先兆子痫人数非先兆子痫人数 | 18(71.7％)173(80.0％) | 7(24.5％)40(19.0％) | 1(3.8％)3(1.0％) |
注：EE，代表纯合野生型；ED，代表杂合型；DD，代表纯合突变型。p值＝0.042
序列表(SEQUENCE LISTING)
<110> 安徽省生物医学研究所
<120> 一种预测妊娠不良结局发生风险的试剂盒
<130> JSP060091
<160> 6
<170> PatentIn version 3.1
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
atggtttgcc aaaaggttca 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
tgtcaccaaa ggggagagac 20
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gtttgccaaa aggttcagtg actt 24
<210> 4
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
tctccatagt atcgatgttc agcaaac 27
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
catagctttc agttcctca 19
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
atagctttca ggtcctca 18
Claims (13)
1.一种用于预测妊娠不良结局发生风险的试剂盒，利用脯氨酸羧肽酶基因的E112D单核苷酸多态性位点基因型与妊娠不良结局发生率之间的关系，预测妊娠不良结局的发生风险：当基因型为112EE纯合野生型时，妊娠不良结局发生率较低；当基因型为112ED杂合型或者112DD纯合突变型时，妊娠不良结局发生率较高；该试剂盒包括用于检测生物样品中脯氨酸羧肽酶基因的E112D多态性位点基因型的多态性分型寡核苷酸，以及相应的反应体系。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的多态性分型寡核苷酸是(1)等位基因特异性核酸引物，用于扩增含有所述多态性位点的脯氨酸羧肽酶基因片断，和/或(2)用于检测所述脯氨酸羧肽酶基因的多态性位点基因型的寡核苷酸探针，其能特异地与含有所述脯氨酸羧肽酶基因的多态性位点的核酸杂交。
3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述寡核苷酸探针的长度为15-50个核苷酸。
4.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：用于扩增含E112D多态性位点的脯氨酸羧肽酶基因片断的特异性引物，能够特异性识别并切断所述位点处的野生型序列或突变型序列的限制性内切酶及其缓冲液。
5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述特异性引物序列为：
正向引物：5’ATGGTTTGCCAAAAGGTTCA 3’，
反向引物：5’TGTCACCAAAGGGGAGAGAC 3’。
6.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述限制性内切酶为AVaII。
7.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：用于扩增含E112D多态性位点的脯氨酸羧肽酶基因片断的特异性引物，检测脯氨酸羧肽酶基因E112D多态性位点的野生型探针和/或突变型探针。
8.如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述特异性引物序列为：
正向引物：5’GTTTGCCAAAAGGTTCAGTGACTT 3’，
反向引物：5’TCTCCATAGTATCGATGTTCAGCAAAC 3’；
9.如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述探针为Taqman探针，其序列为：
VIC-5’CATAGCTTTCAG
TTCCTCA 3’-NFQ
对应于“T”等位基因，携带VIC荧光报告集团，
FAM-5’ATAGCTTTCAG
GTCCTCA 3’-NFQ
对应于“G”等位基因，携带FAM荧光报告集团。
10.如权利要求4或7所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒进一步包括核酸提取试剂、PCR反应试剂和/或阳性对照模板。
11.如权利要求10所述的试剂盒，其特征在于，所述PCR反应试剂含有四种脱氧单核苷酸、耐热DNA聚合酶及其反应缓冲液。
12.如权利要求10所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性对照模板包括含有脯氨酸羧肽酶基因E112D多态性位点的纯合野生型、杂合型和/或纯合突变型序列的PCR产物、克隆核酸、克隆质粒、直接合成的核酸序列或基因组DNA。
13.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的妊娠不良结局包括先兆早产、早产、宫内发育迟缓、低出生体重、妊娠高血压综合症以及先兆子痫和子痫。
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