CN103981279A - 低出生体重儿基因变异检测用引物及其检测试剂盒、检测方法和应用 - Google Patents

低出生体重儿基因变异检测用引物及其检测试剂盒、检测方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及低出生体重儿基因变异检测用引物及其检测试剂盒、检测方法和应用，该引物包括分别对应3个待检变异位点的3对共6条引物，3个待检变异位点分别为基因片段rs900400、rs1482853和rs900399，6条引物分别简写为：G1F、G1R、G2F、G2R、G3F和G3R；其中，引物G1F和G1R扩增位点为rs900400，G2F和G2R扩增位点为rs1482853，G3F和G3R扩增位点为rs900399。该引物能满足3个待检变异位点在同一个反应条件下扩增，引物特异性好。本发明的试剂盒包括上述引物，该试剂盒能检测出待检者生育低出生体重儿的风险性。

Description

低出生体重儿基因变异检测用引物及其检测试剂盒、检测方法和应用
技术领域
 本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及低出生体重儿基因变异检测用引物及其检测试剂盒、检测方法和应用。
背景技术
低出生体重儿（low birth weight，LBW）是指新生儿出生时体重不足2500g，它包括不足37孕周出生的早产和足月但是体重不到2500g的新生儿。联合国儿童基金会2000年公布的世界儿童状况数据表明全球每年低出生体重儿的出生率占新生儿的17%，约有2400万。在我国，低出生体重儿的出生率为5.87% ，在部分地区仍在10%以上。低出生体重，不仅直接对新生儿和婴儿死亡率和疾病发生率产生影响，而且与小儿长期预后如身体发育、智力发育、残疾、成人疾病等密切相关。研究表明，低出生体重所面临的疾病风险、死亡率都比正常出生体重的孩子高，1998年全国低出生体重调查群体资料表明，低出生体重儿早期新生儿死亡率是正常体重儿的45倍。
近年的研究表明，遗传因素是影响低出生体重儿的重要因素，2010年， Freathy等发表的文章“Variants in ADCY5 and near CCNL1 are associated with fetal growth and birth weight”报道了欧洲人群中第3号染色体长臂上的ADCY5基因当中以及CCNL1基因附近的两个变异（rs9883204与rs900400）与低出生体重相关，该研究采用meta分析GWAS病例对照的方法比较病例组和对照组微效基因频率的差异性。但该研究只选取了欧洲人种作为研究对象，且只对rs9883204和rs900400这两个变异位点进行检测。
由于遗传变异具有明显的种族和地域等异质性，因此，有必要研发一种针对亚洲地区中国人群的低出生体重儿基因变异检测试剂盒，且该试剂盒不仅只对rs9883204和rs900400这两个变异位点进行检测，还应该对更多的变异位点进行检测，以增强检测的准确性。
本申请人首次采用Sanger测序的方法研究了rs1482853、rs900399变异位点与低出生体重儿相关性，并验证了rs900400变异位点在亚洲人群低出生体重儿中的关联性，并将这3个变异位点的检测首次研制成检测试剂盒，该试剂盒可同时对低出生体重遗传因素被证实是影响低出生体重儿的重要因素，且目前临床上还没有试剂盒检测低出生体重儿的相关基因应用。
发明内容
为了克服现有技术中存在的缺点和不足，本发明的目的在于提供一种低出生体重儿基因变异检测用引物，该引物能满足3个待检变异位点在同一个反应体系和反应条件下扩增，引物特异性好。
本发明的另一目的在于提供一种低出生体重儿基因变异检测试剂盒，该试剂盒针对中国人群低出生体重儿相关基因3个变异位点而开发，能阐明低出生体重儿的遗传分子病理机制和预警、预防的作用，提高出生缺陷救治水平，降低由低出生体重引发的相关疾病的发病率。
本发明的另一目的在于提供一种低出生体重儿基因变异检测试剂盒的检测方法，该检测方法准确性高、特异性强，能检测出待检者生育低出生体重儿的风险性以及预测低出生体重儿后期引发的相关疾病的风险性。
本发明的另一目的在于提供一种低出生体重儿基因变异检测试剂盒在检测低出生体重儿基因变异的应用，可以减少低出生体重儿的发病率，预防由低出生体重引发的相关疾病。
本发明的目的通过下述技术方案实现：低出生体重儿基因变异检测用引物，包括分别对应3个待检变异位点的3对共6条引物，3个待检变异位点分别为基因片段rs900400、rs1482853和rs900399，6条引物分别简写为：G1F、G1R、G2F、G2R、G3F和G3R；其中，引物G1F和G1R扩增位点为rs900400，G2F和G2R扩增位点为rs1482853，G3F和G3R扩增位点为rs900399。3个待检变异位点位于人基因组DNA中待检的ADCY5基因、CCNL1基因当中及附近。
优选的，所述6条引物的序列分别为：
G1F：5’-ATTACATCAATGTCCTTTACTTGC-3’
G1R：5’-AAAAGTCATTTTCCCCAAAGAAAC-3’
G2F：5’-ATTACATCAATGTCCTTTACTTGC-3’
G2R：5’-AAAAGTCATTTTCCCCAAAGAAAC-3’
G3F：5’-TACATCAATGTCCTTTACTTGCAT-3’
G3R：5’-CAAAAGTCATTTTCCCCAAAGAAA-3’。
本发明的另一目的通过下述技术方案实现：一种用于检测低出生体重儿基因变异的试剂盒，该试剂盒包括上述的引物。
本发明的另一目的通过下述技术方案实现：一种使用上述的试剂盒检测低出生体重儿基因变异的检测方法，依次包括如下步骤：
A、提取模板DNA：从待检者的血液中提取基因组DNA，作为PCR扩增的模板DNA；
B、PCR扩增：以上述提取的基因组DNA为模板，采用所述引物进行PCR扩增，得到DNA扩增产物；
C、PCR产物纯化：采用纯化板对上述DNA扩增产物进行纯化，得到纯化DNA；
D、测序反应：采用Sanger方法对纯化DNA进行测序；
E、结果分析：采用测序峰图分析软件对测序结果进行分析。
优选的，所述步骤B中，PCR扩增的反应体系以30μL计为：
10X rTaq缓冲液                3μL
2.5mM dNTP                   2μL
10mM引物F                  1μL
10mM引物R                  1μL
10~30ng/μL模板DNA          2μL
rTaq聚合酶                   0.2μL
ddH2O                       20.8μL。
优选的，所述步骤B中，PCR扩增的反应条件为：1）95℃预变性5min；2）95℃变性30s，56℃退火30s、72℃延伸45s，共35个循环；3）72℃后延伸10min；4）12℃保藏。
优选的，所述步骤C中，PCR产物纯化的步骤具体为：向96孔纯化板孔中加入100μL ddH2O，将上述DNA扩增产物加入96孔纯化板中室温静置10min，真空抽滤10min至抽干；向96孔纯化板中加入40μL ddH2O，室温溶解10min，取出对应的孔中的纯化产物至另一个96孔PCR板中，回收纯化产物，得到纯化DNA。
优选的，所述步骤D中，测序的反应体系以6μL计为：
30~50ng /μL纯化 DNA         2μL
3pM测序引物                 1μL
Bigdye                        2μL
DMSO                        1μL。
Bigdye包含Taq聚合酶以及标记了大荧光染料的ddNTP等，在DNA聚合酶催化的测序反应中需要测序引物，不论是单链DNA模板，还是双链DNA模板，都可通过使用克隆位点两侧的载体序列互补的通用引物，本发明的测序引物采用Bigdye的通用引物。
优选的，所述步骤D中，测序的反应条件为：1）95℃预变性2min；2）95℃变性30s，55℃退火30s、60℃延伸45s，共30个循环；3）12℃保藏。
所述步骤E中，结果分析的步骤具体为：使用测序峰图分析软件，对测序结果进行分析，得到每个测试样本相应位点的碱基信息，从而分析待检者生育低出生体重儿的风险性以及预测低出生体重儿后期引发的相关疾病的风险性。
本发明的另一目的通过下述技术方案实现：一种上述的试剂盒在检测低出生体重儿基因变异的应用。
本发明的有益效果在于：本发明首次根据3个待检变异位点设计了6条引物，这些引物能满足3个待检变异位点在同一个反应体系和反应条件下扩增，引物特异性好。
本发明首次通过测序技术平台针对低出生体重儿遗传基因开发一种检测试剂盒，对相关的基因3个风险变异位点（rs900400、rs1482853、rs900399）进行检测分析，以达到阐明低出生体重儿的遗传分子病理机制和预警、预防的作用，提高出生缺陷救治水平，降低由低出生体重引发的相关疾病的发病率。
本发明的检测方法准确性高、特异性强，能检测出待检者生育低出生体重儿的风险性以及预测低出生体重儿后期引发的相关疾病的风险性。
本发明的试剂盒在检测低出生体重儿基因变异的应用，可以减少低出生体重儿的发病率，预防由低出生体重引发的相关疾病。
附图说明：
图1是本发明实施例的测试样本与对照样本在rs900400变异位点的测序比对图。
图2是本发明实施例的测试样本与对照样本在rs1482853变异位点的测序比对图。
 
图3是本发明实施例的测试样本与对照样本在rs900399变异位点的测序比对图。
具体实施方式：
为了便于本领域技术人员的理解，下面结合实施例及附图1~3对本发明作进一步的说明，实施方式提及的内容并非对本发明的限定。
低出生体重儿基因变异检测用引物，包括分别对应3个待检变异位点的3对共6条引物，3个待检变异位点分别为基因片段rs900400、rs1482853和rs900399，6条引物分别简写为：G1F、G1R、G2F、G2R、G3F和G3R；其中，引物G1F和G1R扩增位点为rs900400，G2F和G2R扩增位点为rs1482853，G3F和G3R扩增位点为rs900399。
所述6条引物的序列分别为：
G1F：5’-ATTACATCAATGTCCTTTACTTGC-3’
G1R：5’-AAAAGTCATTTTCCCCAAAGAAAC-3’
G2F：5’-ATTACATCAATGTCCTTTACTTGC-3’
G2R：5’-AAAAGTCATTTTCCCCAAAGAAAC-3’
G3F：5’-TACATCAATGTCCTTTACTTGCAT-3’
G3R：5’-CAAAAGTCATTTTCCCCAAAGAAA-3’。
本发明首次根据3个待检变异位点设计了6条引物，这些引物能满足3个待检变异位点在同一个反应体系和反应条件下扩增，引物特异性好。
一种用于检测低出生体重儿基因变异的试剂盒，该试剂盒包括上述的引物。
本发明首次通过测序技术平台针对低出生体重儿遗传基因开发一种检测试剂盒，对相关的基因3个风险变异位点（rs900400、rs1482853、rs900399）进行检测分析，以达到阐明低出生体重儿的遗传分子病理机制和预警、预防的作用，提高出生缺陷救治水平，降低由低出生体重引发的相关疾病的发病率。
一种使用上述的试剂盒检测低出生体重儿基因变异的检测方法，依次包括如下步骤：
A、提取模板DNA：从待检者的血液中提取基因组DNA，作为PCR扩增的模板DNA；
B、PCR扩增：以上述提取的基因组DNA为模板，采用所述引物进行PCR扩增，得到DNA扩增产物；所述步骤B中，PCR扩增的反应体系以30μL计为：
10X rTaq缓冲液                3μL
2.5mM dNTP                   2μL
10mM引物F                  1μL
10mM引物R                  1μL
10~30ng/μL模板DNA          2μL
rTaq聚合酶                   0.2μL
ddH2O                       20.8μL。
所述步骤B中，PCR扩增的反应条件为：1）95℃预变性5min；2）95℃变性30s，56℃退火30s、72℃延伸45s，共35个循环；3）72℃后延伸10min；4）12℃保藏。
C、PCR产物纯化：采用纯化板对上述DNA扩增产物进行纯化，得到纯化DNA；所述步骤C中，PCR产物纯化的步骤具体为：向Millipore 96孔纯化板孔中加入100μL ddH2O，将上述DNA扩增产物加入96孔纯化板中室温静置10min，真空抽滤10min至抽干；向96孔纯化板中加入40μL ddH2O，室温溶解10min，取出对应的孔中的纯化产物至另一个96孔PCR板中，回收纯化产物，得到纯化DNA。
D、测序反应：采用Sanger方法对纯化DNA进行测序；所述步骤D中，测序的反应体系以6μL计为：
30~50ng /μL纯化 DNA         2μL
3pM测序引物                 1μL
Bigdye                        2μL
DMSO                        1μL。
所述步骤D中，测序的反应条件为：1）95℃预变性2min；2）95℃变性30s，55℃退火30s、60℃延伸45s，共30个循环；3）12℃保藏。
E、结果分析：采用测序峰图分析软件对测序结果进行分析。所述步骤E中，结果分析的步骤具体为：使用Applied Biosystems Inc.公司自带的测序峰图分析软件，对测序结果进行分析，得到每个测试样本相应位点的碱基信息，从而分析待检者生育低出生体重儿的风险性以及预测低出生体重儿后期引发的相关疾病的风险性。如图1~3所示，如果测试样本的基因在3个风险变异位点（rs900400、rs1482853、rs900399）中的任意一个变异位点的碱基发生突变，即可判断待检者为生育低出生体重儿的高危人群。
本发明的检测方法准确性高、特异性强，能检测出待检者生育低出生体重儿的风险性以及预测低出生体重儿后期引发的相关疾病的风险性。
一种上述的试剂盒在检测低出生体重儿基因变异的应用。本发明的试剂盒在检测低出生体重儿基因变异的应用，可以减少低出生体重儿的发病率，预防由低出生体重引发的相关疾病。
上述实施例为本发明较佳的实现方案，除此之外，本发明还可以其它方式实现，在不脱离本发明构思的前提下任何显而易见的替换均在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.低出生体重儿基因变异检测用引物，其特征在于：包括分别对应3个待检变异位点的3对共6条引物，3个待检变异位点分别为基因片段rs900400、rs1482853和rs900399，6条引物分别简写为：G1F、G1R、G2F、G2R、G3F和G3R；其中，引物G1F和G1R扩增位点为rs900400，G2F和G2R扩增位点为rs1482853，G3F和G3R扩增位点为rs900399。
2.根据权利要求1所述的低出生体重儿基因变异检测用引物，其特征在于：所述6条引物的序列分别为：
G1F：5’-ATTACATCAATGTCCTTTACTTGC-3’
G1R：5’-AAAAGTCATTTTCCCCAAAGAAAC-3’
G2F：5’-ATTACATCAATGTCCTTTACTTGC-3’
G2R：5’-AAAAGTCATTTTCCCCAAAGAAAC-3’
G3F：5’-TACATCAATGTCCTTTACTTGCAT-3’
G3R：5’-CAAAAGTCATTTTCCCCAAAGAAA-3’。
3.一种用于检测低出生体重儿基因变异的试剂盒，其特征在于：该试剂盒包括权利要求1~2任一项所述的引物。
4.一种使用权利要求 3所述的试剂盒检测低出生体重儿基因变异的检测方法，其特征在于：依次包括如下步骤：
A、提取模板DNA：从待检者的血液中提取基因组DNA，作为PCR扩增的模板DNA；
B、PCR扩增：以上述提取的基因组DNA为模板，采用所述引物进行PCR扩增，得到DNA扩增产物；
C、PCR产物纯化：采用纯化板对上述DNA扩增产物进行纯化，得到纯化DNA；
D、测序反应：采用Sanger方法对纯化DNA进行测序；
E、结果分析：采用测序峰图分析软件对测序结果进行分析。
5.根据权利要求4所述的一种检测低出生体重儿基因变异的检测方法，其特征在于：所述步骤B中，PCR扩增的反应体系以30μL计为：
10X rTaq缓冲液                3μL
2.5mM dNTP                   2μL
10mM引物F                  1μL
10mM引物R                  1μL
10~30ng/μL模板DNA          2μL
rTaq聚合酶                   0.2μL
ddH2O                       20.8μL。
6.根据权利要求4所述的一种检测低出生体重儿基因变异的检测方法，其特征在于：所述步骤B中，PCR扩增的反应条件为：1）95℃预变性5min；2）95℃变性30s，56℃退火30s、72℃延伸45s，共35个循环；3）72℃后延伸10min；4）12℃保藏。
7.根据权利要求4所述的一种检测低出生体重儿基因变异的检测方法，其特征在于：所述步骤C中，PCR产物纯化的步骤具体为：向96孔纯化板孔中加入100μL ddH2O，将上述DNA扩增产物加入96孔纯化板中室温静置10min，真空抽滤10min至抽干；向96孔纯化板中加入40μL ddH2O，室温溶解10min，取出对应的孔中的纯化产物至另一个96孔PCR板中，回收纯化产物，得到纯化DNA。
8.根据权利要求4所述的一种检测低出生体重儿基因变异的检测方法，其特征在于：所述步骤D中，测序的反应体系以6μL计为：
30~50ng /μL纯化 DNA         2μL
3pM测序引物                 1μL
Bigdye                        2μL
DMSO                        1μL。
9.根据权利要求4所述的一种检测低出生体重儿基因变异的检测方法，其特征在于：所述步骤D中，测序的反应条件为：1）95℃预变性2min；2）95℃变性30s，55℃退火30s、60℃延伸45s，共30个循环；3）12℃保藏。
10.一种权利要求 3所述的试剂盒在检测低出生体重儿基因变异的应用。
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