CN105256015A - 一组基于str技术用于检测遗传综合征的检测引物、检测试剂盒及其检测方法 - Google Patents
一组基于str技术用于检测遗传综合征的检测引物、检测试剂盒及其检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一组基于STR技术用于检测遗传综合征的检测引物、检测试剂盒及其检测方法。本发明在已有研究基础上在疾病相关染色体区域15q11-13选择6个常用STR位点和3个备用STR位点利用多重荧光PCR技术用于检测该区域患儿等位基因情况,结合该区域患儿父亲以及母亲的相应位点检测就可以有效发现可能存在的突变情况。为了提高检测准确性,本发明选择比以往方法更多的STR位点,并用毛细管电泳的高分辨率技术替代了琼脂糖电泳技术,提高了分辨率和可重复性。
Description
技术领域:
本发明属于基因诊断领域,具体涉及一组基于STR技术用于检测遗传综合征的检测引物、检测试剂盒及其检测方法。
背景技术:
Prader-Willi综合征(PWS)和Angelman综合症(AS)是两种与基因组印迹相关的遗传综合征,发病率约为1/22,000~1/10,000。PWS患者主要临床表现为肥胖、智力低下、肌张力减退、性腺功能减退;Angelman综合症主要表现为特殊面容、智力低下。这两种疾病尽管发病率不高,但是每位患儿都会给家庭及社会带来沉重的负担,前者往往伴随越来越严重的肥胖、代谢综合征、无法自理生活和智力低下,后者则以天使般笑容伴随日常生活但却无法自理生活,因此,每个患儿的出现都将导致高额的经济负担和家庭心理负担。
早期诊断对于PWS和Angelman综合症患儿的早期有效治疗、改善生活质量、延长其寿命具有极重要的意义。目前,基因诊断是确诊的唯一方法,尤其在早期以及症状不典型患者的诊断中具有重要作用。
自从上世纪中叶被发现以来,逐渐完善详细的临床表现评分表被用于临床诊断,生长激素等生化指标也被用于辅助诊断,但是均不能达到非常有效的早期诊断和鉴别诊断。
鉴于PWS和Angelman综合症同为遗传印迹疾病,父源的15q11-13缺失或不表达导致PWS;母源的15q11-13缺失或不表达导致Angelman综合症。因此准确区分患儿体内父源和母源的15q11-13染色体区段,确定各自的拷贝数及表达情况对于确诊具有重要意义。
从早期的甲基化PCR-琼脂糖电泳、FISH到MLPA以及arrayCGH等多种技术都被用于进行PWS和Angelman综合症的基因诊断。每种方法均有其优缺点,目前公认的基因诊断策略为逐级鉴别,甲基化PCR为一线手段,MLPA和CGH等手段为二线技术,基因测序为最后手段。
由于PWS和Angelman综合症最多见的基因突变类型为父源或母源缺失,而父源基因与母源基因序列的甲基化状况差别较大,所以可以利用甲基化PCR技术对其进行鉴定。据统计,甲基化PCR可以检测约95%的PWS和Angelman综合症患儿。
虽然在15q11-13区域有数十个STR位点,但是疾病相关的两个核心基因SNRPN和UBE3A附近却仅有为数不多的10个位点。以往的甲基化PCR技术往往仅仅选择2-3个位点作为检测目标,原因是为了不同的检测位点同时检测具有一定技术难度,需要区分不同位点扩增片段长度的差异,需要优化PCR体系。
此外传统的甲基化PCR结合琼脂糖电泳虽然可以检测PWS和Angelman综合症,但有两个明显缺陷:一是琼脂糖电泳分辨率低,结果稳定性相对较差;二是手工操作多,效率低下。Prader-willi综合症/Angelman综合症被发现以来,多种诊治手段被用于疾病的干预。早期确诊对于疾病的有效治疗和预后有较大影响。在多种诊断方法中基因诊断适用于确诊疾病,然而由于Prader-willi综合症/Angelman综合症属于遗传印迹疾病,其致病的分子基础是关键基因的基因缺失、点突变、不表达或者单亲二倍体,各种突变均可能导致疾病表型。以往多种分子检测技术用于诊断疾病时均有各自不同的不足之处。
STR是国内外常用的PWS诊断方法,其原理是基于人群中不同个体之间微卫星位点(STR)的短串联重复次数不同,进而区分PWS患儿的15号染色体致病区域的来源及缺失与否。此检测方法高效、特异、灵敏、快速,能对大于80%的PWS突变类型进行检测(父源性大片段缺失(70-75%)、母源性同源性单亲二倍体(低于20%))。
发明内容:
为了解决甲基化PCR-琼脂糖电泳技术分辨率低、重复性差以及操作繁琐效率低下等问题,本发明的目的是提供一组基于STR技术用于检测遗传综合征的检测引物、检测试剂盒及其检测方法。本发明在已有研究基础上增加15q11-13区域STR检测位点,提高检测准确率,采用多重PCR结合荧光标记技术实现多个位点同时检测,结合毛细管电泳技术,实现提高检测效率和可重复性以及检测分辨率。
本发明的基于STR技术用于检测Prader-Willi综合征(PWS)和Angelman综合症(AS)的检测引物,其特征在于,所述的检测引物如下:
针对D15S659位点:Forward引物5’-TGGTAGTCTGGACACCTATTGC-3’
Reverse引物5’-AGGCAGTAATGGTTAGTGGAGAA-3’
针对D15S817位点:Forward引物5’-GAACCGTTCATACTACCAAAG-3’
Reverse引物5’-TACTGAGGGTTTAACCAAGG-3’
针对D15S646位点:Forward引物5’-AGGACAGGAGAAAGGAATTAGGAT-3’
Reverse引物5’-GCTAGATGACGGGTTAGTGGGT-3’
针对D15S822位点:Forward引物5’-GTGTGAAGTGACAGAAGAGAGCA-3’
Reverse引物5’-TCCTATTGAGAGTCCATTGAGATT-3’
针对D15S1513位点:Forward引物5’-ACATCCTCCACGTACGAATAATA-3’
Reverse引物5’-CAGGATATGTTTTTTGGGGAT-3’
针对FES位点:Forward引物5’-CCCCATCTCTACTGAAAAAGCAA-3’
Reverse引物5’-GGGTCACTCTGGGGATTTGG-3’
针对GABRB3位点:Forward引物5’-CCAACACCTTCCCAAATCCTCTT-3’
Reverse引物5’-TGGGGTGGGAATGCTGATAAGT-3’
针对D15S128位点:Forward引物5’-CTGGTCTGTTCACGCTATTATTT-3’
Reverse引物5’-ATTTCCCACACCTAAAACCAA-3’
针对D15S11位点:Forward引物5’-CCAAACTTCAACTCCACAGATA-3’
Reverse引物5’-ACCTGATATATACCTCCACCTTC-3’
Forward引物的5’端带有荧光标记基因。
所述的荧光标记基因,优选为FAM、JOE或TAM。
本发明的基于STR技术用于检测Prader-Willi综合征和Angelman综合症的检测试剂盒,包括Taq-Mix反应液和检测引物,其特征在于,所述的检测引物包括:
针对D15S659位点:Forward引物5’-TGGTAGTCTGGACACCTATTGC-3’
Reverse引物5’-AGGCAGTAATGGTTAGTGGAGAA-3’
针对D15S817位点:Forward引物5’-GAACCGTTCATACTACCAAAG-3’
Reverse引物5’-TACTGAGGGTTTAACCAAGG-3’
针对D15S646位点:Forward引物5’-AGGACAGGAGAAAGGAATTAGGAT-3’
Reverse引物5’-GCTAGATGACGGGTTAGTGGGT-3’
针对D15S822位点:Forward引物5’-GTGTGAAGTGACAGAAGAGAGCA-3’
Reverse引物5’-TCCTATTGAGAGTCCATTGAGATT-3’
针对D15S1513位点:Forward引物5’-ACATCCTCCACGTACGAATAATA-3’
Reverse引物5’-CAGGATATGTTTTTTGGGGAT-3’
针对FES位点:Forward引物5’-CCCCATCTCTACTGAAAAAGCAA-3’
Reverse引物5’-GGGTCACTCTGGGGATTTGG-3’
针对GABRB3位点:Forward引物5’-CCAACACCTTCCCAAATCCTCTT-3’
Reverse引物5’-TGGGGTGGGAATGCTGATAAGT-3’
针对D15S128位点:Forward引物5’-CTGGTCTGTTCACGCTATTATTT-3’
Reverse引物5’-ATTTCCCACACCTAAAACCAA-3’
针对D15S11位点:Forward引物5’-CCAAACTTCAACTCCACAGATA-3’
Reverse引物5’-ACCTGATATATACCTCCACCTTC-3’
Forward引物的5’端带有荧光标记基因。
本发明的基于STR技术用于检测Prader-Willi综合征和Angelman综合症的检测方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)、分别采集EDTA或柠檬酸钠抗凝的患儿及其父母的外周血并提取基因组DNA,保证基因组DNA浓度和纯度达到较好水平;
(2)、以步骤(1)的基因组DNA为模板,利用上述检测引物,进行多重荧光PCR,得到多重荧光PCR产物;
(3)、将步骤(2)的PCR产物进行毛细管电泳;
(4)、根据电泳结果判读患儿是否属于PWS或者AS基因型,如果患儿仅携带母亲等位基因而丢失了父亲在该位点的等位基因,则为PWS基因型,如果如果患儿仅携带父亲等位基因而丢失了母亲在该位点的等位基因,则为AS基因型。
步骤(1)所述的DNA浓度,优选为30~150ng/μL。
步骤(1)所述的DNA纯度,优选为OD260/280=1.7~2.0。
步骤(2)所述的利用权利要求1所述的检测引物进行多重荧光PCR,是将权利要求1所述的检测引物组合后进行多重荧光PCR。
所述的将权利要求1所述的检测引物组合,具体为:将DS15S659、DS15S817、DS15S1513位点引物组合后进行多重荧光PCR,将DS15S646、DS15S822、FES位点引物组合后进行多重荧光PCR,将D15S11,D15S128,GABRB3位点引物组合后进行多重荧光PCR。
所述的组合后进行多重荧光PCR,其扩增体系优选为:对于扩增D15S659、D15S817和D15S1513位点,其扩增体系共25μL,包括Taq-Mix12.5μL,D15S659Forward引物0.4μL,D15S817Forward引物0.7μL,D15S1513Forward引物1.1μL,D15S659Reverse引物0.4μL,D15S817Reverse引物0.7μL,D15S1513Reverse引物1.1μL,模板DNA1.5μL,ddH2O6.6μL;
对于D15S646、D15S822和FES位点,其扩增体系共25μL,包括Taq-Mix12.5μL,D15S646Forward引物0.6μL,D15S822Forward引物0.9μL,FESForward引物0.3μL,D15S646Reverse引物0.6μL,D15S822Reverse引物0.9μL,FESReverse引物0.3μL,模板DNA1.5μL,ddH2O7.4μL;
对于D15S11、D15S128和GABRB3位点,其扩增体系共25μL,包括Taq-Mix12.5μL,D15S11Forward引物0.7μL,D15S128Forward引物1.2μL,GABRB3Forward引物0.3μL,D15S11Reverse引物0.7μL,D15S128Reverse引物1.2μL,GABRB3Reverse引物0.3μL,模板DNA1.5μL,ddH2O6.8μL。
步骤(2)所述的多重荧光PCR,其扩增体系优选为:94℃5min,循环数1;94℃30s,61℃30s,72℃30s,循环数26;72℃20min,循环数1;4℃保温。
本发明在已有研究基础上在疾病相关染色体区域15q11-13选择6个常用STR位点和3个备用STR位点利用多重荧光PCR技术用于检测该区域患儿等位基因情况,结合该区域患儿父亲以及母亲的相应位点检测就可以有效发现可能存在的突变情况。为了提高检测准确性,本发明选择比以往方法更多的STR位点,并用毛细管电泳的高分辨率技术替代了琼脂糖电泳技术,提高了分辨率和可重复性。本发明利用多重荧光PCR结合毛细管电泳技术选择Prader-willi综合症/Angelman综合症疾病相关染色体区域的9个STR位点对患儿及其父母进行等位基因检测,分析患儿是否存在父源或者母源基因的缺失或者不表达,从而准确诊断疑似的Prader-willi综合症/Angelman综合症病例。
本发明使用短串联重复序列技术(STR),可以有效提高检测结果的分辨率和检测效率。对于早诊断进而积极早期的干预治疗、再发风险估计和产前基因诊断具有重要意义。STR检测需要进行患儿与父母基因型比较,因此需要同时检测父母子三人,检测患儿是否缺失父源基因。
附图说明:
图1是PWS基因型先证者(即患儿)的多重荧光PCR电泳结果,其中,P为先证者,F为父亲,M为母亲,红色圆圈区域内为五个阳性位点,先证者仅携带母亲等位基因,而丢失了父亲在该位点的等位基因,患儿为PWS基因型;
图2是AS基因型先证者(即患儿)的多重荧光PCR电泳结果,其中,P为先证者,F为父亲,M为母亲,红色圆圈区域内为四个阳性位点,先证者仅携带父亲等位基因,而丢失了母亲在该位点的等位基因,患儿为AS基因型;
图3是PWS阳性对照图(只显示阳性位点)。
具体实施方式:
以下实施例是对本发明的进一步说明,而不是对本发明的限制。
实施例1:
本发明的PWS和AS阳性对照DNA为临床PWS以及AS患者外周血基因组DNA。
所用的检测引物如下:
1、EDTA或柠檬酸钠抗凝管分别采集PWS患儿、AS患儿以及父母外周静脉血各1mL;
2、利用试剂盒(Lab-Aid820核酸提取Mini试剂,购自厦门致善生物科技股份有限公司)或者核酸自动提取仪(Lab-Aid820核酸提取仪,购自厦门致善生物科技股份有限公司)提取所采集的患儿以及父母外周静脉血基因组DNA并测定DNA浓度、260/280和260/230,保证核酸浓度为30~150ng/μL,纯度为OD260/280=1.7~2.0;
3、配制多重荧光PCR反应体系如下:
体系(1):D15S659,D15S817,D15S1513
体系(2):D15S646,D15S822,FES
体系(3):D15S11,D15S128,GABRB3(当所做位点不能提供足够信息时,即,无法判断是否存在缺失或者只有一个位点提示存在缺失的情况,需要加做)
4、扩增反应程序如下:
5、毛细管电泳
3500XL核酸分析仪按照使用说明进行操作。将前述PCR产物各加入1ul混合(DS15S659、DS15S817、DS15S1513各1ul混合为一管,DS15S646、DS15S822、FES各1ul混合为一管,D15S11,D15S128,GABRB3各1ul混合为一管)进行电泳。
6、结果判读
本实施例PWS基因型先证者(即患儿)的多重荧光PCR电泳结果如图1所示,P为先证者,F为父亲,M为母亲,红色圆圈区域内为五个阳性位点(D15S817,D15S646,D15S822,D15S11和GABRB3),先证者仅携带母亲等位基因,而丢失了父亲在该位点的等位基因,患儿为PWS基因型;AS基因型先证者(即患儿)的多重荧光PCR电泳结果如图2所示,P为先证者,F为父亲,M为母亲,红色圆圈区域内为四个阳性位点(D15S817,D15S822,D15S128和GABRB3),先证者仅携带父亲等位基因,而丢失了母亲在该位点的等位基因,患儿为AS基因型;图3是PWS阳性对照图(只显示阳性位点)。
Claims (10)
1.一组基于STR技术用于检测Prader-Willi综合征和Angelman综合症的检测引物,其特征在于,所述的检测引物如下:
针对D15S659位点:Forward引物5’-TGGTAGTCTGGACACCTATTGC-3’
Reverse引物5’-AGGCAGTAATGGTTAGTGGAGAA-3’
针对D15S817位点:Forward引物5’-GAACCGTTCATACTACCAAAG-3’
Reverse引物5’-TACTGAGGGTTTAACCAAGG-3’
针对D15S646位点:Forward引物5’-AGGACAGGAGAAAGGAATTAGGAT-3’
Reverse引物5’-GCTAGATGACGGGTTAGTGGGT-3’
针对D15S822位点:Forward引物5’-GTGTGAAGTGACAGAAGAGAGCA-3’
Reverse引物5’-TCCTATTGAGAGTCCATTGAGATT-3’
针对D15S1513位点:Forward引物5’-ACATCCTCCACGTACGAATAATA-3’
Reverse引物5’-CAGGATATGTTTTTTGGGGAT-3’
针对FES位点:Forward引物5’-CCCCATCTCTACTGAAAAAGCAA-3’
Reverse引物5’-GGGTCACTCTGGGGATTTGG-3’
针对GABRB3位点:Forward引物5’-CCAACACCTTCCCAAATCCTCTT-3’
Reverse引物5’-TGGGGTGGGAATGCTGATAAGT-3’
针对D15S128位点:Forward引物5’-CTGGTCTGTTCACGCTATTATTT-3’
Reverse引物5’-ATTTCCCACACCTAAAACCAA-3’
针对D15S11位点:Forward引物5’-CCAAACTTCAACTCCACAGATA-3’
Reverse引物5’-ACCTGATATATACCTCCACCTTC-3’
Forward引物的5’端带有荧光标记基因。
2.根据权利要求1所述的基于STR技术用于检测Prader-Willi综合征和Angelman综合症的检测引物,其特征在于,所述的荧光标记基因为FAM、JOE或TAM。
3.一种基于STR技术用于检测Prader-Willi综合征和Angelman综合症的检测试剂盒,包括Taq-Mix反应液和检测引物,其特征在于,所述的检测引物包括:
针对D15S659位点:Forward引物5’-TGGTAGTCTGGACACCTATTGC-3’
Reverse引物5’-AGGCAGTAATGGTTAGTGGAGAA-3’
针对D15S817位点:Forward引物5’-GAACCGTTCATACTACCAAAG-3’
Reverse引物5’-TACTGAGGGTTTAACCAAGG-3’
针对D15S646位点:Forward引物5’-AGGACAGGAGAAAGGAATTAGGAT-3’
Reverse引物5’-GCTAGATGACGGGTTAGTGGGT-3’
针对D15S822位点:Forward引物5’-GTGTGAAGTGACAGAAGAGAGCA-3’
Reverse引物5’-TCCTATTGAGAGTCCATTGAGATT-3’
针对D15S1513位点:Forward引物5’-ACATCCTCCACGTACGAATAATA-3’
Reverse引物5’-CAGGATATGTTTTTTGGGGAT-3’
针对FES位点:Forward引物5’-CCCCATCTCTACTGAAAAAGCAA-3’
Reverse引物5’-GGGTCACTCTGGGGATTTGG-3’
针对GABRB3位点:Forward引物5’-CCAACACCTTCCCAAATCCTCTT-3’
Reverse引物5’-TGGGGTGGGAATGCTGATAAGT-3’
针对D15S128位点:Forward引物5’-CTGGTCTGTTCACGCTATTATTT-3’
Reverse引物5’-ATTTCCCACACCTAAAACCAA-3’
针对D15S11位点:Forward引物5’-CCAAACTTCAACTCCACAGATA-3’
Reverse引物5’-ACCTGATATATACCTCCACCTTC-3’
Forward引物的5’端带有荧光标记基因。
4.一种基于STR技术用于检测Prader-Willi综合征和Angelman综合症的检测方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)、分别采集EDTA或柠檬酸钠抗凝的患儿及其父母的外周血并提取基因组DNA,保证基因组DNA浓度和纯度达到较好水平;
(2)、以步骤(1)的基因组DNA为模板,利用权利要求1所述的检测引物,进行多重荧光PCR,得到多重荧光PCR产物;
(3)、将步骤(2)的PCR产物进行毛细管电泳;
(4)、根据电泳结果判读患儿是否属于PWS或者AS基因型,如果患儿仅携带母亲等位基因而丢失了父亲在该位点的等位基因,则为PWS基因型,如果如果患儿仅携带父亲等位基因而丢失了母亲在该位点的等位基因,则为AS基因型。
5.根据权利要求4所述的基于STR技术用于检测Prader-Willi综合征和Angelman综合症的检测方法,其特征在于,步骤(1)所述的DNA浓度为30~150ng/μL。
6.根据权利要求4所述的基于STR技术用于检测Prader-Willi综合征和Angelman综合症的检测方法,其特征在于,步骤(1)所述的DNA纯度为OD260/280=1.7~2.0。
7.根据权利要求4所述的基于STR技术用于检测Prader-Willi综合征和Angelman综合症的检测方法,其特征在于,步骤(2)所述的利用权利要求1所述的检测引物进行多重荧光PCR,是将权利要求1所述的检测引物组合后进行多重荧光PCR。
8.根据权利要求7所述的基于STR技术用于检测Prader-Willi综合征和Angelman综合症的检测方法,其特征在于,所述的将权利要求1所述的检测引物组合,具体为:将DS15S659、DS15S817、DS15S1513位点引物组合后进行多重荧光PCR,将DS15S646、DS15S822、FES位点引物组合后进行多重荧光PCR,将D15S11,D15S128,GABRB3位点引物组合后进行多重荧光PCR。
9.根据权利要求8所述的基于STR技术用于检测Prader-Willi综合征和Angelman综合症的检测方法,其特征在于,所述的组合后进行多重荧光PCR,其扩增体系为:
对于扩增D15S659、D15S817和D15S1513位点,其扩增体系共25μL,包括Taq-Mix12.5μL,D15S659Forward引物0.4μL,D15S817Forward引物0.7μL,D15S1513Forward引物1.1μL,D15S659Reverse引物0.4μL,D15S817Reverse引物0.7μL,D15S1513Reverse引物1.1μL,模板DNA1.5μL,ddH2O6.6μL;
对于D15S646、D15S822和FES位点,其扩增体系共25μL,包括Taq-Mix12.5μL,D15S646Forward引物0.6μL,D15S822Forward引物0.9μL,FESForward引物0.3μL,D15S646Reverse引物0.6μL,D15S822Reverse引物0.9μL,FESReverse引物0.3μL,模板DNA1.5μL,ddH2O7.4μL;
对于D15S11、D15S128和GABRB3位点,其扩增体系共25μL,包括Taq-Mix12.5μL,D15S11Forward引物0.7μL,D15S128Forward引物1.2μL,GABRB3Forward引物0.3μL,D15S11Reverse引物0.7μL,D15S128Reverse引物1.2μL,GABRB3Reverse引物0.3μL,模板DNA1.5μL,ddH2O6.8μL。
10.根据权利要求4所述的基于STR技术用于检测Prader-Willi综合征和Angelman综合症的检测方法,其特征在于,步骤(2)所述的多重荧光PCR,其扩增体系为:94℃5min,循环数1;94℃30s,61℃30s,72℃30s,循环数26;72℃20min,循环数1;4℃保温。
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CN107937495A (zh) * | 2017-12-27 | 2018-04-20 | 上海五色石医学研究股份有限公司 | 一种人染色体15q11‑13遗传变异检测试剂盒及其应用 |
CN109811049A (zh) * | 2019-02-01 | 2019-05-28 | 广东省妇幼保健院 | 基于str技术用于检测遗传综合征的检测引物和检测试剂盒 |
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CN103014142A (zh) * | 2011-09-26 | 2013-04-03 | 复旦大学 | 用于诊、查染色体微缺失综合征的分子组合探针 |
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2015
- 2015-09-29 CN CN201510642063.1A patent/CN105256015B/zh active Active
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