发明内容
本发明的目的就是针对目前临床的需求,提供一种可同时进行15号染色体单亲二倍体和15q11-13微缺失的检测试剂盒及其应用。
本发明首先建立一个可在PCR反应中对分布于人15号染色体上的16个STR基因座同时进行基因分型的复合PCR扩增系统。根据每一STR基因座在15号染色体上的分布,将所述16个STR基因座分为三组,其对应PCR扩增引物分别:
第一组:为分布于15q11-13区带第一断裂点(BP1)与第三断裂点(BP3)之间的9个STR基因座:其对应的PCR扩增引物容器依次为D15SM01、D15SM02、D15SM03、D15SM04、D15SM05、D15SM06、D15SM07、D15SM08和D15SM09;相应的引物核苷酸序列及荧光素依次为:SEQ IDNo.1、SEQ ID No.2,SEQ ID No.3、SEQ ID No.4,SEQ ID No.5、SEQ ID No.6,SEQ ID No.7、SEQ ID No.8,SEQ ID No.9、SEQ ID No.10,SEQ ID No.11、SEQ ID No.12,SEQ ID No.13、SEQ ID No.14,SEQ ID No.15、SEQ ID No.16,SEQ ID No.17、SEQ ID No.18所示;
第二组:为分布于15q11-13区带第三断裂点(BP3)与第四断裂点(BP4)之间的3个STR基因座:其对应的PCR扩增引物容器依次为D15SM010、D15SM11和D15SM012;相应的引物核苷酸序列及荧光素依次为:SEQ ID No.19、SEQ ID No.20,SEQ ID No.21、SEQ ID No.22,SEQ IDNo.23和SEQ ID No.24所示;
第三组:为分布于15号染色体长臂远端的4个STR基因座:其对应的PCR扩增引物容器依次为D15SM013、D15SM014、D15SM15和D15SM016;相应的引物核苷酸序列及荧光素依次为SEQID No.25、SEQ ID No.26,SEQ ID No.27、SEQ ID No.28,SEQ ID No.29、SEQ ID No.30,SEQ ID No.31和SEQ ID No.32所示;
上述16个STR基因座对应的复合PCR扩增引物及荧光素修饰特征序列如下表
。
本发明中,每一组STR基因座PCR扩增产物长度相互不重叠。调整各STR基因座PCR引物工作浓度,使同一组内纯合子间或杂合子间片段峰高相差在40%以内。其PCR扩增引物的工作浓度为100〜350nmol/L。
本发明中,引物组合物由SEQ ID No.1- SEQ ID No.32所示核苷酸序列的PCR引物的干粉或溶液组成。
本发明还提供上述复合PCR扩增系统的应用,即用于DNA样品16个短串联重复多态性遗传标记基因分型及连锁的非诊断分析:使用所述的复合PCR扩增系统检测人DNA样本,所述人DNA样本选自人血液、血斑、精液、精斑、唾液、唾液斑、羊水、毛发、肌肉组织、骨骼中的一种或多种。
本发明提供的人染色体15q11-13遗传变异测试剂盒,其包含引物组合物容器、PCR反应母液容器。其中:
引物组合物容器内有如SEQ ID No.1-SEQ ID No.32所示的上述16个STR基因座的复合PCR扩增系统的引物组合物的贮存液,贮存液中各引物的浓度为相应引物工作液浓度的10倍;
PCR反应母液容器内有进行PCR反应的2倍反应浓度的PCR反应母液,PCR反应母液包含DNA聚合酶、镁离子、dNTP等。
本发明检测试剂盒的使用方法,具体如下:
(1)提取人基因组DNA,紫外分光定量基因组DNA浓度为1〜10ng/μL;
(2)多重PCR扩增:总反应体系为20μL,反应体系组成如下:
2×PCR反应母液 10μL
引物SEQ ID No.1~SEQ ID No.32组合物 2μL
样本DNA模板 1μL
ddH2O 7μL;
(3)PCR反应在普通PCR仪上( 如ABI9700、ABI9600、Bio-Rad C1000 等)进行,PCR反应条件如下:95℃10分钟启动后,95℃ 30秒、60℃ 60秒、72℃ 60秒,共28个循环,然后72℃保温60分钟,然后4℃保温;
(4)PCR产物取1μL,按常规操作在遗传分析仪上进行毛细管电泳;
(5)对电泳后的数据利用专用数据分析软件(如GeneMapper等)分析,可以得到每一个STR 基因座的分型图谱和数据;
(6)通过生物学母子或父子样本检测结果的连锁分析,分析人染色体15q11-13遗传变异。
本发明中,所述DNA模板是指人类基因组DNA。人类基因组DNA可采用各种常规方法(如Chelex-100法、磁珠法、酚氯仿法以及各种商品化的人基因组DNA提取试剂盒等)从以下组织或检材中提取得到:人血液、血斑、精液、精斑、唾液、唾液斑、羊水、毛发、肌肉组织、骨骼等。较佳地,20μL的PCR扩增体系中,DNA 模板量在0.5ng 至5ng 的范围内能够得到较好的扩增与分型结果。
本发明中,所提供的16个STR基因座复合PCR扩增系统的PCR扩增产物可采用遗传分析仪(如AB3130XL、AB3500Genetic Analyzer)进行毛细管电泳分析,电泳后的数据可以在GeneMapper等数据分析软件上分析,得到每一个STR 基因座的分型图谱和数据。
本发明中,所述通过连锁分析,分析人染色体15q11-13遗传变异,其流程为:
(1)判断检测样本是否存在15号染色体的母源或父源单亲二倍体,具体如下:通过对比检测样本与其生物学母亲或父亲样本的每一个遗传标记分型图谱和数据,分析检测样本每一个遗传标记的生物学来源,以及是否存在母源/父源单亲二倍体(即检测样本所有遗传标记的分型结果均与其生物学母亲或父亲完全一致);
(2)判读检测样本是否存在15q11-13区域的母源/父源缺失,具体如下:通过所述的第一组9个遗传标记的分型结果,并结合步骤(1)中分析的结果,判读其是否存在15q11-13区域的母源或父源缺失(即上诉9个遗传标记均显示为纯合,且均仅来源于其生物学母亲或父亲)。
本发明的有益效果:
在建立多重PCR扩增系统过程中,随着所检测STR基因座个数的增加,各对引物间的相互干扰也会增加。本发明通过优化的设计,实现了对16个STR基因座的单管扩增,各荧光通道内以及不同荧光通道内的STR基因座扩增均衡,分型图谱良好。
通过检测样本与其生物学母亲/父亲的遗传连锁分析,可以同步检测15号染色体的单亲二倍体以及15q11-13区域的微缺失情况,为PWS和AS的临床诊治提供了一个快速、便捷的技术工具。
本发明的有益效果还在于,利用STR基因座的遗传特点,可以清晰判读样本污染情况,有效避免母源污染及无关样本之间的污染。
实施例4:毛细管电泳分型检测
(1)取(1μL内标+10μL Hi-Di)×(样品数+1)配成混合液,混合后按每管10μL分装在96孔板板孔中。其中一孔中加入1μL等位基因阶梯(Ladder);
(2)取1μL PCR产物按样本编号加入相应的96孔板板孔中;
(3)样品95℃变性4 分钟,然后迅速冰上冷却4 分钟;
(4)将样品放入基因分析仪的样品托盘中,按常规参数进行毛细管电泳(参见遗传分析仪厂商操作说明书);
(5)毛细管电泳结束,用GeneMapper 软件分析实验数据得到分型图谱,参见图1和图2所示。
图1为一例父源15q11-13微缺失样本采用本发明所提供试剂盒得到的16个STR基因座分型图谱;图2上诉父源15q11-13微缺失样本的生物学母亲样本采用本发明所提供试剂盒得到的16个STR基因座分型图谱。依据图1所示,D15SM01~D15SM09均为纯合子,且D15SM10~D15SM16存在多个杂合子,提示该样本存在15q11-13区域的微缺失;经与其生物学母亲样本的每一个STR基因座的对比分析,D15SM01~D15SM09这9个STR基因座的位点均与其生物学母亲一致,提示15q11-13区域的STR基因座来源于其生物学母亲。综合两点,提示图1所示样本为15q11-13区域的父源缺失,即为PWS综合征。
本发明所提出的人染色体15q11-13遗传变异检测试剂盒可,在具有PCR仪以及遗传分析的实验室稳定实施,检测时间为3-4小时。同时,本发明所提供的试剂可以方便地在生物技术公司生产以及在生物医学检测机构、法医DNA检测机构用于检测,具备产业化以及推广应用的条件。
本发明已参照其特定的实施例作了描述。对于本领域技术人员而言,依据前面的描述,可能对本发明做各种修改或变换,包括(但不仅限于):改变不同组别的荧光素标记,改变荧光素标记的引物(如由标记上游引物改变为标记下游引物),依据各STR基因座等位基因范围改变基因组的分组排布,依据其它的PCR反应母液对PCR扩增条件、引物反应浓度进行优化,以及改变所推荐的反应体系等。很显然,上述修改或变换对于本领域技术人员而言都是可能的,但这些修改和变换并不背离本发明的精神和范围。
序列表
<110> 上海五色石医学研究股份有限公司
<120> 一种人染色体15q11-13遗传变异检测试剂盒及其应用
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