CN109536621A

CN109536621A - 一种林麝麝香产量性状的微卫星位点及其选择方法

Info

Publication number: CN109536621A
Application number: CN201910030218.4A
Authority: CN
Inventors: 杨营; 张明; 付文龙; 蔡永华; 郑程丽; 朱苹
Original assignee: Sichuan Institute Of Musk Deer Breeding
Current assignee: Sichuan Institute Of Musk Deer Breeding
Priority date: 2019-01-14
Filing date: 2019-01-14
Publication date: 2019-03-29

Abstract

本发明公开了一种林麝麝香产量性状的微卫星位点及其选择方法，所述的微卫星位点为Mb116H或Mb43，其中位点Mb116H的NCBI编号为DQ852334，位点Mb43的NCBI编号为EF599347。用于PCR扩增所述微卫星位点Mb116H或Mb43的引物如SEQ ID NO.1～4所示。同时还提供了林麝麝香产量性状微卫星分子标记选择方法，通过PCR扩增产物的多态性分析，高产麝香亲本个体的选择等步骤工艺完成。本发明依据基因型进行林麝麝香性状选择，精度高，操作简单；可以在林麝早期开始选择麝香产量性状，缩短世代间隔，加速林麝育种进程，每代可缩短选择时间12个月左右。

Description

一种林麝麝香产量性状的微卫星位点及其选择方法

技术领域

本发明属于微卫星标记技术领域，具体涉及一种林麝麝香产量性状的微卫星位点及其选择方法。

背景技术

林麝雄性麝香产量是林麝生产中的重要经济性状，在林麝育种中越来越受重视。由于麝香产量只能在雄麝达到性成熟后度量，传统的麝香产量性状选择方法主要为：(1)根据系谱资料选择，即将父系血缘优良雄性后代的选留作种用，血缘差的淘汰；(2)根据半同胞成绩选择，即根据公麝前期与其他母麝交配获得半同胞的麝香产量性状，间接评估产香量；(3)公麝性成熟开始产香后，直接活体采香获得自身的产香量。由此可见，上述方法都是根据麝香产量的表型来进行选择，而选择的真正目的却在于选出优良的基因型。由于表型选择是一个长期的积累过程，其影响因素较多多，如选择强度、选择群体变异程度、世代间距和环境条件等，都会对表型选择发生作用，其变异呈连续性，加之性状的表型与其基因型之间的关系复杂，在大多数情况下并不完全吻合，因而选择往往难以准确，只有多次重复同一方法，连续数代定向选择才能取得显著效果。为此，许多研究者正在不断探索新的更为有效的林麝产香性状选择技术，以改变传统选择方法的不足。

林麝的麝香性状属于数量性状。传统的数量遗传学认为，数量性状优势是由微效多基因控制的，它对数量性状有较大影响但又难以识别和分离，因而可以通过选择与数量性状相连锁的分子遗传标记来实现对基因型的选择，这动物育种过程中的一种重要手段和方法。分子遗传标记是以物种基因突变造成DNA片段长度多态性为基础的，具有许多优点：(1)可以直接探测DNA水平的差异，不受时空的限制；(2)标记数量丰富、多态性高；(3)共显性标识，可以区分纯合子与杂合子；(4)可以解释家系内某些个体的遗传变异；(5)可以鉴定不同性别、不同年龄的个体；同时，采用标记辅助选择可以在林麝的生命早期开始而不必等待生产性状完全表现出来；并在两性中同时选择任何生产性状，突破了限性性状只能从单种性状选择的局限；在选择麝香产量性状的过程中，不必等到公麝成熟时候，对林麝进行取麝香直接检测。

由此可见，利用分子遗传标记改良林麝麝香生产性能是一门较为理想的新型学科，可以缩短世代间隔，提高选择强度，增加选择的准确性，从而加速林麝的遗传进展。目前，国内外对于林麝麝香产量性状的标记辅助选择还鲜有报道，也不曾提出林麝麝香产量性状的有效评定选择方法，在林麝麝香产量性状的分子标记选择领域尚属空白。因此建立一种评定林麝麝香产量性状的有效分子标记方法非常必要，同时也可为具有优良麝香产量性状的林麝个体选择提供可靠的依据。

发明内容

本发明的目的在于，针对传统林麝麝香产量性状表型选择方法易受多种因素影响，表型与其基因型之间不完全吻合，因而选择准确性低、周期长等缺陷，提供一种在林麝的生命早期即可进行林麝麝香产量性状选择的微卫星位点及其引物。

本发明具体通过以下技术方案实现：

一种林麝麝香产量性状的微卫星位点，所述的微卫星位点为Mb116H或Mb43，其中位点Mb116H的NCBI编号为DQ852334，核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，位点Mb43的NCBI编号为EF599347，核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

用于PCR扩增所述的微卫星位点Mb116H或Mb43的引物如SEQID NO.1～4所示。具体的，用于PCR扩增微卫星位点Mb116H的引物为SEQ ID NO.1～2，用于PCR扩增微卫星位点Mb43的引物为SEQ IDNO.3～4。

本发明的另一目的在于提供一种林麝麝香产量性状微卫星分子标记选择方法，包括以下步骤：

1)根据位点Mb116H或Mb43设计引物，并在每对引物的上游序列5’端添加HEX荧光标记；

2)提取林麝股动脉液基因组DNA，采用上述引物进行PCR扩增反应，取扩增产物于1.6％溴化乙锭染色的琼脂糖凝胶电泳检测；

3)利用PCR扩增产物，以ROX标记的等位基因Ladder为分型标准物，进行毛细管电泳，以等位基因分型标准物ROX分子量为标准确认等位基因型，Mb116H位点筛选出AE、BC、BD、BE、BI、BK、CC、CD、CE、CF、CK、DE、DI、EE、EF、EH、EJ和GH共18种基因型林麝个体；Mb43位点筛选出AA、AB、AE、AH、BB、BC、BE、BF、BH、CC、CE、CF、DD、DH、EE、EF、EG、EH和HH种基因型林麝个体；

4)Mb116H位点选留CF和BK基因型的个体作为雄性选择亲本，淘汰AE、BC、BD、BE、BI、CC、CD、CE、CK、DE、DI、EE、EF、EH、EJ和GH基因型的个体；在Mb43位点EE、DH和EF基因型的个体作为雄性选择亲本，淘汰AA、AB、AE、AH、BB、BC、BE、BF、BH、CC、CE、CF、DD、DH、EE、EF、EG、EH和HH基因型的个体。

进一步的，步骤(1)中所述的引物如SEQ ID NO.1～4所示。

进一步的，步骤(2)中PCR反应体系为25μL：10×buffer 15μL、25mmol/L Mg²⁺1.2μL、2mmol/L dNTPs各1μL、10μmol/L上下游引物各1μL、模板DNA 1μL、Tap DNA聚合酶(Promega)1U，ddH₂O 4.8μL。

进一步的，步骤(2)中PCR反应程序为：95℃预变性5min，94℃变性30s，退火50s，72℃延伸50s，35个循环；72℃延伸10min，4℃保存。

在本发明的另一方面，上述所述的微卫星位点引物在分子标记辅助育种方面的应用也在本发明的保护范围之内。

本发明的有益效果为：

所提出的林麝麝香产量性状相关的微卫星分子标记在应用于林麝麝香产量性状的选择工作中，具有以下的有益效果：

第一，本发明是根据基因型进行林麝麝香产量性状选择，精确度高，操作简单，费用低，在大规模选择条件下选择成本约为0.5元/头，并可以进行自动化规模检测；

第二，利用本发明的微卫星分子标记方法可以在林麝的生命早期(出生后l周内)即开始选择麝香产量性状，而不必等林麝性成熟后麻醉保定活体取麝香的试验，可以缩短世代间隔，提高选择强度，能够较早地选择出优良的种麝亲本，从而加速林麝的育种进程，与传统选择方法比较每代可缩短选择时间16-24个月左右；

第三，利用本发明的微卫星分子标记方法对林麝麝香性状进行选择，不仅可为林麝育种工作中标记辅助选择提供一个更为有效、简便易行的分子标记方法，同时可以克服常规屠体性状选择方法工作量大、易受环境影响和育种周期长等缺点，为林麝麝香产量性状改良提供一种有效的分子标记育种手段，从而加速肉鹅的遗传进展。

具体实施方式

下面将结合本发明具体的实施例，对本发明技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明所述的林麝麝香产量性状微卫星分子标记选择方法，是在完成下列基础工作后取得的：

(1)林麝麝香微卫星分子标记的筛选

根据文献报道，从NCBI数据库中初步获得36个微卫星序列片段。对于林麝微卫星分子标记的筛选，首先对上述36个微卫星引物5’序列添加HEX荧光标记；然后对每投适龄的雄性林麝个体血样基因组DNA分别进行PCR扩增反应；最后将扩增产物进行毛细管电泳检测，从中选择有明显多态性的引物进行微卫星多态性分析；所采用的PCR扩增反应体系为反应体系PCR反应总体系为25μL，包括10×buffer15μL、Mg²⁺(25mmol/L)1.2μL、dNTPs(各2mmol/L)1μL、上下游引物(10μmol/L)各1μL、模板DNA 1μL、Tap DNA聚合酶(Promega)1U，ddH₂O 4.8μL。扩增反应均在PE9700型PCR仪(PE公司)上完成。PCR反应程序为：95℃预变性5min，94℃变性30s，退火温度(表1)50s，72℃延伸50s，35个循环；72℃延伸10min，4℃保存；取5μLPCR扩增产物于1.6％溴化乙锭染色的琼脂糖凝胶电泳检测；利用全自动遗传分析仪ABI 3100进行毛细管电泳测序；运用用Genotyperversion3.7软件分析确定微卫星片断长度和识别微卫星基因型。

(2)林麝麝香产量性状测定

林麝麝香生产性能的指标有：麝香重量参照《中国药典质量标准》(2010年版)，麝香评分，参照《种用林麝评分标准》(2017年)。

(3)林麝麝香生产性状与微卫星标记的关联性分析

采用SAS软件应用一般线形模型(general linear modela，GLM)对麝香产量与初步筛选微卫星位点的关联性进行最小二乘分析，经分析差异显著的位点，再使用Duncan法对同一位点的各基因型进行多重比较。分析结果均以平均值±标准偏差(mean±SD)表示。

结果发现在位点Mb116H，基因型CF和BK的麝香产量明显高于其他基因型，且与基因型AE、DI、EH、BI、BD、EF、CD和CE的差异达到显著(P<0.05)，与AE、DI和EH差异极显著(P<0.01)，由此可推测基因B、C、F和K与林麝产香量呈正相关，而基因A、D、E、H和I与林麝产香量呈负相关。

在位点Mb43，基因型EE、DH和EF的麝香产量明显高于其他基因型，且基因型EE、DH与基因型AA、EG、BH、AE、CF、CE、CC的差异达到显著水平(P<0.05)，基因型EF除了与BF、EE和DH三种基因型以外的所有基因型的差异均达到显著水平(P<0.05)；基因型EE与基因型AA和EG的差异达到了极显著水平(P<0.01)；基因型DH与基因型AA、EG及BH的差异极显著(P<0.01)；基因型EF与基因型AA、EG、BH、AE、CF、CE、CC、AH和DD的差异极显著(P<0.01)。

以微卫星位点的某一基因型的生长相关性状均值显著高于其他基因型的均值，且高于群体生长性状的均值作为群体优势基因型的评定标准，集合Duncan法多重比较结果，筛选Mb116H位点CF、BK、EE、DH和EF共5种基因型作为高产香个体优势基因型，作为亲本选留；Mb43位点AA、EG、AE、DI和EH共5种基因型为低产香个体，作为淘汰个体。根据麝香评分及产量间的相关系数，由此筛选出的基因型具有很好的产香优势，可以作为良种选育的理想基因型。

实施例1马尔康林麝亲本群麝香产量性状的选择

(1)设计Mb116H和Mb43位点的特异性荧光引物：

根据NCBI微卫星位点Mb116H位点(NCBI编号DQ852334)和Mb43(NCBI编号EF599347)两端的侧翼序列的一对特异性引物，在每对引物的上游序列5’加上HEX荧光标记，Mb116H位点上游引物序列为Mb116HF：5’-HEX-TGCGTATTGAAGTGATGAGA-3’，其下游引物序列为Mb116HR：5’-HEX-GCTGTCAAGCACCAACCT-3’；Mb43位点上游引物序列为Mb43F：5’-TGGTGGCTGTTACCCTAT-3’，其下游引物序列为Mb43R：5’-AAACCTGCATCTCCTGAA-3’。

(2)林麝麝香生产性能的指标有：麝香重量参照《中国药典质量标准》(2010年版)，麝香评分，参照《种用林麝评分标准》(2017年)。

(3)PCR扩增反应：先人工保定林麝，用一次性针管对雄性林麝股动脉采血，每次采血量不少于1ml，血液样品经ACD抗凝后于-80℃保存。采取酚-氯仿法抽提基因组DNA，-20℃保存备用。按常规酚-氯仿方法提取血液基因组DNA，并采用上述引物和基因组DNA模板进行PCR扩增反应，PCR反应总体系为25μL，包括10×buffer 15μL、Mg²⁺(25mmol/L)1.2μL、dNTPs(各2mmol/L)1μL、上下游引物(10μmol/L)各1μL、模板DNA 1μL、Tap DNA聚合酶(Promega)1U，ddH₂O 4.8μL。扩增反应均在ABI 9700型PCR仪(ABI公司)上完成。PCR反应程序为：95℃预变性5min，94℃变性30s，退火温度(表1)50s，72℃延伸50s，35个循环；72℃延伸10min，4℃保存；取5μLPCR扩增产物于1.6％溴化乙锭染色的琼脂糖凝胶电泳检测。

(4)PCR扩增产物的多态性分析：利用全自动遗传分析仪ABI3700进行毛细管电泳测序，PCR反应体系15uL，PCR反应条件同前。在ABI3100型测序仪上做基因扫描，取2μL PCR产物，0.5μL以ROX标记的等位基因Ladder为分型标准物，0.5μL loading buffer及3μL去离子甲酰胺，混匀，94℃变性3min后迅速置于冰上，在ABI 3100测序仪(Applied BiosystemsInc.)上进行毛细管电泳。然后以等位基因分型标准物(ROX)分子量为标准，用GenotyperV3.7软件(Applied Biosystems Inc.)读取数据，根据DNA片段长度变异范围和峰形特征确认等位基因型，Mb116H位点筛选出AE、BC、BD、BE、BI、BK、CC、CD、CE、CF、CK、DE、DI、EE、EF、EH、EJ和GH共18种基因型林麝个体；Mb43位点筛选出AA、AB、AE、AH、BB、BC、BE、BF、BH、CC、CE、CF、DD、DH、EE、EF、EG、EH和HH种基因型林麝个体。

表1Mb116H和Mb43位点不同基因型林麝的麝香产量性能均值和多重比较

(5)高产香林麝亲本个体的选择：选择Mb116H位点CF、BK、EE、DH和EF共5种基因型作为高产香个体优势基因型，作为亲本选留；Mb43位点AA、EG、AE、DI和EH共5种基因型为低产香个体，作为淘汰个体。

实施例2都江堰林麝后代群麝香产量性状的选择

(1)根据NCBI微卫星位点Mb116H位点(NCBI编号DQ852334)和Mb43(NCBI编号EF599347)两端的侧翼序列的一对特异性引物，在每对引物的上游序列5’加上HEX荧光标记，Mb116H位点上游引物序列为Mb116HF：5’-HEX-TGCGTATTGAAGTGATGAGA-3’，其下游引物序列为Mb116HR：5’-HEX-GCTGTCAAGCACCAACCT-3’；Mb43位点上游引物序列为Mb43F：5’-TGGTGGCTGTTACCCTAT-3’，其下游引物序列为Mb43R：5’-AAACCTGCATCTCCTGAA-3’。

(3)PCR扩增反应：先人工保定林麝，用一次性针管对雄性林麝股动脉采血，每次采血量不少于1ml，血液样品经ACD抗凝后于-80℃保存。采取酚-氯仿法抽提基因组DNA，-20℃保存备用。按常规酚-氯仿方法提取血液基因组DNA，并采用上述引物和基因组DNA模板进行PCR扩增反应，PCR反应总体系为25μL，包括10×buffer 15μL、Mg²⁺(25mmol/L)μL、dNTPs(各2mmol/L)1μL、上下游引物(10μmol/L)各1μL、模板DNA 1μL、Tap DNA聚合酶(Promega)1U，ddH₂O 4.8μL。扩增反应均在ABI 9700型PCR仪(ABI公司)上完成。PCR反应程序为：95℃预变性5min，94℃变性30s，退火温度(表1)50s，72℃延伸50s，35个循环；72℃延伸10min，4℃保存；取5μLPCR扩增产物于1.6％溴化乙锭染色的琼脂糖凝胶电泳检测。

(5)个体选择：选择Mb116H位点CF、BK、EE、DH和EF共5种基因型作为高产香个体优势基因型，作为亲本选留；Mb43位点AA、EG、AE、DI和EH共5种基因型为低产香个体，作为淘汰个体。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

序列表

<110> 四川养麝研究所

<120> 一种林麝麝香产量性状的微卫星位点及其选择方法

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tgcgtattga agtgatgaga 20

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gctgtcaagc accaacct 18

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tggtggctgt taccctat 18

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

aaacctgcat ctcctgaa 18

<210> 5

<211> 290

<212> DNA

<213> Mb116H位点(Mb116H)

<400> 5

gatcatgtgt atgtgtgtgc gtattgaagt gatgagaatc aggacgggag tcatgtaaga 60

gagaggacct gtaatgcaga agctaaagag tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg 120

tgtgtgtgtg tgtgtgagaa atgaggggga gtgacgcgga ggttggtgct tgacagcagc 180

agtgagggga gaggatgaca gggcctgatg acaagagact gaagactggg gagttggagg 240

gaagaaggag ggagagtcac ctggagcagg cggcaaggag cttggtgatc 290

<210> 6

<211> 511

<212> DNA

<213> Mb43位点(Mb43)

<400> 6

aatcctatca cccaaggtag catccctcct ctgctatttt cctctagaaa tgttacttgt 60

tgagcaattt gaaattcatt tcccacattc ttatatcatc atgggctcag gaatgttagc 120

ctgcccccag aaattgcagt gtacacccct aggcctcaaa gtaaacacat tctttctctt 180

tctctctctg gatttatttc ccttaggact tgcatgtgtg gttttttatt tcttttgagt 240

aatgaatcgg agatttgggt ttgaatgtga aaaggaggcc atttaggcct atagtttgta 300

caaaaaaagc tacatagctc agcatatttg aacttttcca aaaggggcca aaaactacaa 360

gtaatgatga cacactacat ggtggctgtt accctatgtg catatgtgtg tgtgtgtgtg 420

tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgta tgggcttcgc tcctggttca atggtagcaa 480

atctgcctgc caattcagga gatgcaggtt t 511

Claims

1.一种林麝麝香产量性状的微卫星位点，其特征在于，所述的微卫星位点为Mb116H或Mb43，其中位点Mb116H的NCBI编号为DQ852334，位点Mb43的NCBI编号为EF599347。

2.根据权利要求1所述的一种林麝麝香产量性状的微卫星位点，其特征在于，用于PCR扩增微卫星位点Mb116H的引物为SEQ ID NO.1～2，用于PCR扩增微卫星位点Mb43的引物为SEQ ID NO.3～4。

3.权利要求2所述的用于扩增微卫星位点Mb116H的引物，其特征在于，所述的引物如SEQ ID NO.1～2所示。

4.权利要求2所述的用于扩增微卫星位点Mb43的引物，其特征在于，所述的引物如SEQID NO.3～4所示。

5.一种林麝麝香产量性状早期微卫星分子标记选择方法，其特征在于，包括以下步骤：

3)利用PCR扩增产物，以ROX标记的等位基因Ladder为分型标准物，进行毛细管电泳，以等位基因分型标准物ROX分子量为标准确认等位基因型，Mb116H位点筛选出AE、BC、BD、BE、BI、BK、CC、CD、CE、CF、CK、DE、DI、EE、EF、EH、EJ和GH共18种基因型林麝个体；Mb43位点筛选出AA、AB、AE、AH、BB、BC、BE、BF、BH、CC、CE、CF、DD、DH、EE、EF、EG、EH和HH共19种基因型林麝个体；

6.根据权利要求5所述的一种林麝麝香产量性状微卫星分子标记选择方法，其特征在于，步骤(1)中所述的引物如SEQ ID NO.1～4所示。

7.根据权利要求5所述的一种林麝麝香产量性状微卫星分子标记选择方法，其特征在于，步骤(2)中PCR反应程序为：95℃预变性5min，94℃变性30s，退火50s，72℃延伸50s，35个循环；72℃延伸10min，4℃保存。

8.权利要求3或4所述的微卫星位点引物在分子标记辅助育种方面的应用。