CN114736972A - 一种用于评估四指马鲅生长相关性状的试剂 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于评估四指马鲅生长相关性状的试剂，本发明通过对四指马鲅基因组DNA进行提取、PCR扩增、扩增产物测序和测序结果分析，发现位于SST基因第一内含子区域的两个突变位点(g.205G>A和g.210G>A)与四指马鲅生长显著相关，突变位点的AG基因型个体的生长性状优于其他基因型个体。可通过突变位点g.205G>A和突变位点g.210G>A进行分子标记辅助育种，且不受四指马鲅的年龄和性别限制，可用于四指马鲅的早期选育，显著促进四指马鲅的育种过程。
Description
技术领域
本发明涉及遗传育种技术领域，具体地，涉及一种用于评估四指马鲅生长相关性状的试剂。
背景技术
四指马鲅(Elentheronema tetradactylum)隶属鲻形目、马鲅亚目、马鲅科、四指马鲅属，俗称马友、午鱼、祭鱼，是一种暖温、广盐性鱼类，多生活在浅海、河口附近，以印度洋和太平洋西部和中国沿海南部分布为主。四指马鲅生长迅速、味道鲜美、营养丰富，是我国著名的经济鱼类和可食用性渔业资源，具有良好的发展前景。近年来，四指马鲅已发展为一种新兴的经济鱼类，是我国重要的水产资源和优良的水产养殖品种。但是，四指马鲅在国内外的研究起步较晚，这将对四指马鲅进行人工饲养和发展带来一定的难度。因此，对四指马鲅的种质性状及群体遗传进行系统的研究，有助于深入理解四指马鲅的种质特性及苗种选育工作具有一定的指导作用。
生长激素抑制素(somatostatin,SST)又名生长抑素，是一种能够抑制垂体分泌生长激素(growth hormone，GH)的蛋白质类激素，在动物的甲状腺、大脑、前列腺等组织中都有表达，生长抑素的水平在动物生长调控中具有重要的影响。因SST除了具有调节鱼生长的功能外，还参与了鱼类的生殖和营养代谢，因而基于鱼类的SST的研究在近年来受到了广泛关注。然而有关四指马鲅生长激素抑制素基因的研究还不见多。因此，开展四指马鲅生长激素抑制素基因的相关研究对四指马鲅进行人工选育工作和功能基因开发等提供基础参考。
单核苷酸多态性标记(single nucleotide polymorphism，SNP)是一种DNA序列的多态性，其多态性多局限于一个碱基的突变且一般以碱基转化为主；SNP技术是一种高精度、高通量、低成本的检测手段，在医药、生物学、制药等领域有着广阔的应用前景。在水产动物中，利用SNP标记与生长性状进行关联分析已有一些报道，而用于四指马鲅的遗传性状标记的研究还很少，且目前也尚未见到有关于四指马鲅生长性状抑制素基因SNP位点进行相关研究的报道。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术的上述不足，提供一种用于评估四指马鲅生长相关性状的试剂。
本发明的第一目的是提供一种用于评估四指马鲅生长相关性状的试剂。
本发明的第二目的是提供上述试剂在制备评估四指马鲅生长相关性状的试剂盒中的应用。
本发明的第三目的是提供一种用于评估四指马鲅生长相关性状的试剂盒。
本发明的第四目的是提供上述试剂在四指马鲅选育中的应用。
本发明的第五目的是提供上述试剂盒在四指马鲅选育中的应用。
本发明的第六目的是提供一种评估四指马鲅生长性状的方法。
为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：
一种用于评估四指马鲅生长相关性状的试剂，其特征在于，所述试剂检测以下SNP分子标记中的至少一个的的基因型：分子标记1位于核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的基因的第205个碱基，分子标记2位于核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的基因的第210个碱基；四指马鲅个体分子标记1的基因型为AG时，其鱼体质量和/或鱼体长显著大于GG或AA基因型个体；四指马鲅分子标记2的基因型为AG时，其鱼体质量和/或鱼体长显著大于AA或GG基因型个体。
优选地，所述试剂为引物对。
更优选地，所述引物对的上游引物的核苷酸序列为
5-’ATGCTTCGCTCTCAGGTGCAG-3’(SEQ ID NO：2)，下游引物核苷酸序列为
5-’TTAACACGAGGTGAACGAACGTCTTCC-3’(SEQ ID NO：3)。
一种用于评估四指马鲅生长相关性状的试剂盒，所述试剂盒包括上述用于检测四指马鲅SNP分子标记基因型的试剂。
优选地，所述生长相关性状为鱼体质量和/或鱼体长。
更优选地，所述试剂为引物对。
进一步优选的，所述引物对的上游引物序核苷酸列为
5-’ATGCTTCGCTCTCAGGTGCAG-3’(SEQ ID NO：2)，下游引物核苷酸序列为
5-’TTAACACGAGGTGAACGAACGTCTTCC-3’(SEQ ID NO：3)。
一种评估四指马鲅生长性状的方法，所述方法为通过上述试剂检测上述的SNP分子标记。
优选地，所述生长性状包括鱼体质量和鱼体长。
优选地，所述评估四指马鲅生长性状的方法包括以下步骤：
S1.选取同一批次，生长速度具有差异的四指马鲅，分别用游标卡尺和电子天平记录四指马鲅的生长记录指标，测量其鱼体质量和鱼体长，剪取四指马鲅的鱼体尾鳍置于无水乙醇中－20℃保存；
S2.剪取步骤S1中保存的四指马鲅的鱼体尾鳍组织样品30mg并进行DNA的提取；
S3.利用琼脂糖凝胶检测步骤S2中提取得到的四指马鲅的DNA；
S4.基于上述用于检测与四指马鲅生长性状相关的SNP分子标记的引物对，对步骤S3中检测后的四指马鲅的DNA进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；
S5.对步骤S4得到的PCR扩增产物直接进行序列测定，获得测序结果，确定SNP分子标记的基因型；
S6.将步骤S5确定的SNP分子标记的基因型与步骤S1测量的四指马鲅的体质量和体长做相关性分析。
本发明还要求保护上述用于评估四指马鲅生长相关性状的试剂在四指马鲅生长相关的遗传育种中的应用。
本发明还要求保护上述用于评估四指马鲅生长相关性状的试剂盒在四指马鲅生长相关性状的遗传育种中的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明提供了一种用于评估四指马鲅生长相关性状的试剂，以四指马鲅SST基因上的单核苷酸多态位点为研究目标，发现位于SST基因第一内含子区域的两个突变位点(g.205G>A和g.210G>A)与四指马鲅生长显著相关，突变位点的AG基因型个体的生长性状优于其他基因型个体。可通过突变位点g.205G>A和突变位点g.210G>A进行分子标记辅助育种，且不受四指马鲅的年龄和性别限制，可用于四指马鲅的早期选育，显著促进四指马鲅的育种过程。
附图说明
图1为7个月大的47尾四指马鲅自5‘端第205位突变位点测序峰图：其中a为AA基因型，b为GG基因型，c为AG基因型；
图2为7个月大的47尾四指马鲅自5‘端第210位突变位点测序峰图：其中a为GG基因型，b为AA基因型，c为AG基因型；
图3为11个月大的56尾四指马鲅自5‘端第205位突变位点测序峰图：其中a为AG基因型，b为GG基因型，c为AA基因型；
图4为11个月大的56尾四指马鲅自5‘端第210位突变位点测序峰图：其中a为AG基因型，b为AA基因型，c为GG基因型。
具体实施方式
下面结合说明书附图及具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
本发明实验所用四指马鲅群体取自广东省湛江市。
实施例1 SNP标记位点(g.205G>A和g.210G>A)与四指马鲅生长性状的关系
1、实验方法
(1)四指马鲅群体的获得
选取同一批次，养殖时间均为7个月的47尾四指马鲅个体作为实验对象，分别用游标卡尺和电子天平记录每尾四指马鲅的生长记录指标，测量其鱼体质量和鱼体长这两项生长性状。
剪取每尾四指马鲅鱼体尾鳍于无水乙醇-20℃保存。
(2)四指马鲅DNA的提取
①分别剪取步骤(1)保存的鱼体尾鳍组织样品30mg用干净的纸巾吸干无水乙醇后放入离心管中，标记样品编号，加入200μL组织裂解液(10mmol/L Tris-Cl，pH 8.0；100mmol/L EDTA，pH8.0；100mmol/L NaCl；0.5％SDS)，随后加入20μL的RNAse溶液(10mg/mL)和20μL蛋白酶K(10mg/mL)。溶液充分摇匀混合后，在55℃水浴锅中消化至鱼体尾巴完全溶解，得到消化溶解后的样品。
②在裂解好的样品中加入600μL酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)混合液，晃动10min后12000rpm离心10min，取上清液。重复操作②一次。
③在上清液中加入2倍上清液体积的-20℃预冷的无水乙醇沉淀，然后用枪头将絮状沉淀挑出，用70％酒精洗涤两次。待酒精挥发完全后，用80μL灭菌的超纯水溶解。即得高质量的基因组DNA。
(3)1％琼脂糖凝胶电泳检测步骤③得到的基因组DNA样品，紫外分光光度计检测浓度及纯度。
(4)PCR扩增
采用特定的PCR引物对步骤(3)检测后的基因组DNA进行PCR扩增，PCR引物如表1所示。
表1 PCR引物序列
| 上游引物 | 5-’ATGCTTCGCTCTCAGGTGCAG-3’(SEQ ID NO：2) |
| 下游引物 | 5-’TTAACACGAGGTGAACGAACGTCTTCC-3’(SEQ ID NO：3) |
PCR反应体系如表2所示
表2 PCR反应体系
| 物质 | 体积/μL |
| 2×Taq Master Max | 20 |
| 上游引物 | 1.5 |
| 下游引物 | 1.5 |
| DNA模板 | 2 |
| 灭菌水 | 15 |
PCR反应条件：PCR反应共30个循环，循环前95℃预变性3min，每个循环包括95℃变性30s，59℃退火30s，72℃延伸45s，循环结束后于72℃延伸5min。
PCR扩增结束后得到PCR扩增产物，PCR扩增产物即为带SNP分子标记，即核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的基因的第205个碱基(g.205G>A)和第210个碱基(g.210G>A)。
(5)电泳检测
①称取琼脂糖0.40g放入锥形瓶中，加入40ml 1×TAE缓冲液，置于微波炉中加热溶解，每30s取出摇匀一次直至溶液透明澄清，得到琼脂糖溶液。
②待步骤①得到的琼脂糖溶液冷却到约为60℃时加入3μL的Gold ViewTM核酸染料混匀，然后缓慢倒入有机玻璃槽中，等待数分钟，在玻璃槽中形成一块均匀光滑的胶，缓缓拔出梳子，将胶放入电泳槽中。
③将1μL 6×Loading buffer和5μL步骤(1)得到的扩增产物(DNA样品)混匀后点入凝胶孔中，最后取5μL Maker点入凝胶孔中，接通电泳槽与电泳仪的电源，在150V的电压下，进行20min的电泳。
④电泳结束后，从电泳槽中取出胶板放置在成像仪中观察DNA条带，DNA条带明亮且无明显拖带现象，则证明DNA纯度较好。
⑤将上述检测结果较好的PCR扩增产物于-20℃保存。
(6)对步骤(3)得到的检测结果较好的PCR扩增产物直接进行序列测定，获得测序结果，确定SNP分子标记的基因型。
(7)将步骤(6)确定SNP分子标记的基因型与步骤(1)测定得到的的四指马鲅的鱼体质量和体长进行相关性分析。
2、实验结果
PCR扩增产物的测序结果如图1和图2所示，在核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的基因中的第205位点(g.205G>A)的基因型为AA、AG和GG；在核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的基因中的第210位点(g.210G>A)的基因型为AA、AG和GG。
实验获得的数据如表3所示，表3为47尾四指马鲅个体的SNP位点基因型、鱼体质量和鱼体长。根据表3的数据，结合性状及试验群体的特点，利用SPSS(26.0)的Duncan多重比较对g.205G>A和g.210G>A的基因型与生长性状进行关联分析，通过对各个基因型的个体进行统计分析可得到该位点的基因型频率和等位基因频率，结果如表4和表5所示。
表4为47尾四指马鲅生长激素抑制素基因(SST基因)SNP位点等位基因型频率和等位基因频率，表5为47尾四指马鲅生长激素抑制素基因(SST基因)突变位点基因型与生长性状的关联分析。
表3四指马鲅47尾个体SNP位点基因型、鱼体质量和鱼体长
表4四指马鲅SST基因SNP位点等位基因型频率和等位基因频率
表5 SST基因突变位点基因型与生长性状的关联分析
注：同列中标有不同字母者表示同一位点不同基因型组间有显著性差异(P<0.05)，标有相同字母者表示组间无显著性差异(P>0.05)
表5中的鱼体质量和鱼体长的表达方式均为均值±标准误差。
根据表4和表5的数据所示，可以看出：在本实施例所述的7个月大的47尾四指马鲅中，突变位点g.205G>A的等位基因A的频率显著高于等位基因G的频率，说明在突变位点g.205G>A中等位基因A为优势基因，AG等位基因型个体的鱼体质量和鱼体长显著优于GG基因型个体(P＜0.05)，且明显优于AA基因型个体，说明不同基因型的体重和体长具有显著差异，且突变位点g.205G>A是一个与生长显著相关的SNP位点。
突变位点g.210G>A的等位基因G的频率显著高于等位基因A的频率，说明在突变位点g.210G>A中等位基因G为优势基因，AG基因型个体的鱼体质量和鱼体长显著优于AA基因型个体(P＜0.05)，且明显优于GG基因型个体，说明突变位点g.210G>A是一个与生长显著相关的SNP位点。
实施例2 SNP标记位点(g.205G>A和g.210G>A)与四指马鲅生长性状的关系
1、实验方法
选取同一批次，养殖时间均为11个月的56尾四指马鲅个体作为实验对象，分别用游标卡尺和电子天平记录每尾四指马鲅的生长记录指标，测量其鱼体质量和鱼体长这两项生长性状。
其余实验步骤同实施例1中处理7个月大的47尾四指马鲅的DNA步骤一致。
2、实验结果
实验获得的数据如表6所示，表6为56尾四指马鲅个体的SNP位点基因型、鱼体质量和鱼体长。根据表6的数据，结合性状及试验群体的特点，利用SPSS(26.0)的Duncan多重比较对g.205G>A和g.210G>A的基因型与生长性状进行关联分析，通过对各个基因型的个体进行统计分析可得到该位点的基因型频率和等位基因频率，结果如表7和表8所示。
表7为56尾四指马鲅生长激素抑制素基因(SST基因)SNP位点等位基因型频率和等位基因频率，表8为56尾四指马鲅生长激素抑制素基因(SST基因)突变位点基因型与生长性状的关联分析。
表6四指马鲅56尾个体SNP位点基因型、鱼体质量和鱼体长
表7四指马鲅SST基因SNP位点等位基因型频率和等位基因频率
表8 SST基因突变位点基因型与生长性状的关联分析
注：同列中标有不同字母者表示同一位点不同基因型组间有显著性差异(P<0.05)，标有相同字母者表示组间无显著性差异(P>0.05)
表8中的鱼体质量和鱼体长的表达方式均为均值±标准误差。
根据表7和表8的数据所示，可以看出：在本实施例所述的11个月大的56尾四指马鲅中，突变位点g.205G>A的等位基因A的频率显著高于等位基因G的频率，说明在突变位点g.205G>A中等位基因A为优势基因，AG等位基因型个体的鱼体质量和鱼体长显著优于GG基因型个体(P＜0.05)，且明显优于AA基因型个体，说明不同基因型的体重和体长具有显著差异，且突变位点g.205G>A是一个与生长显著相关的SNP位点。
突变位点g.210G>A的等位基因G的频率显著高于等位基因A的频率，说明在突变位点g.210G>A中等位基因G为优势基因，AG基因型个体的鱼体质量和鱼体长显著优于AA基因型个体(P＜0.05)，且明显优于GG基因型个体，说明突变位点g.210G>A是一个与生长显著相关的SNP位点。
综上所述，根据实施例1和实施例2的结果可以知道，在四指马鲅的SST基因上，突变位点g.205G>A的AG杂合基因型个体的鱼体质量和鱼体长两个生长性状显著优于GG基因型个体，且明显优于AA基因型个体；突变位点g.210G>A的AG杂合基因型个体的鱼体质量和鱼体长两个生长性状显著优于AA基因型个体，且明显优于GG基因型个体，且上述影响不受四指马鲅的年龄和性别限制。因此可以选择突变位点g.205G>A和突变位点g.210G>A的基因型均为AG的个体作为育种亲本，选育四指马鲅优良品种。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。
序列表
<110> 岭南师范学院
<120> 一种用于评估四指马鲅生长相关性状的试剂
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 521
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgcttcgct ctcaggtgca ggtttttctc atggctgttt tttcctccgt gctgctggtg 60
gaggccggcg gtgctccagg cagagacgca tggacagaaa cactgagagc agacctcaca 120
aacaacaagg taattcactt attttattta attttgcaga tatttaacta gttaaaatgg 180
aatgaaatag ataaaataca aactattttg gttttcagca gctgatttta atgattttga 240
gcttaaatct tttctttttc tttcatatag aacaaattta aacgtgccac agctgtaact 300
cccttccttt tccgttctcc attcaggatc tcgctcactt gctcttactg aagtttgtgt 360
cagagctgat ggctgcgaga gtagagccgg cgctacccga gctggaggag gaagacgtgg 420
gagtcgggga ggaggtgagg aggcgacacc ttcccgtctc tcagagagaa cgtaaagcag 480
gctgccgcaa cttcttctgg aagacgttca cctcgtgtta a 521
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atgcttggct ctcaggtgca g 21
<210> 3
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ttaacacgag gtgaacgaac gtcttcc 27
Claims (10)
1.一种用于评估四指马鲅生长相关性状的试剂，其特征在于，所述试剂检测以下SNP分子标记中的至少一个的基因型：分子标记1位于核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的基因的第205个碱基，分子标记2位于核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的基因的第210个碱基；四指马鲅个体分子标记1的基因型为AG时，其鱼体质量和/或鱼体长显著大于GG或AA基因型个体；四指马鲅分子标记2的基因型为AG时，其鱼体质量和/或鱼体长显著大于AA或GG基因型个体。
2.根据权利要求1所述的试剂，其特征在于，所述试剂为引物对。
3.根据权利要求2所述的试剂，其特征在于，所述引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示。
4.权利要求1～3所述的试剂在制备评估四指马鲅生长相关性状的试剂盒中的应用，所述生长相关性状为鱼体质量和/或鱼体长。
5.一种用于评估四指马鲅生长相关性状的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求1所述的试剂，所述生长相关性状为鱼体质量和/或鱼体长。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂为引物对。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示。
8.权利要求1～3任一所述的试剂在四指马鲅生长相关性状的遗传育种中的应用。
9.权利要求5～7任一所述的试剂盒在四指马鲅生长相关性状的遗传育种中的应用。
10.一种评估四指马鲅生长性状的方法，其特征在于，使用权利要求1所述的试剂检测权利要求1中所述的SNP分子标记。
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