CN116144788B - 一种评估四指马鲅群体遗传多样性的ssr标记引物、方法及应用 - Google Patents
一种评估四指马鲅群体遗传多样性的ssr标记引物、方法及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种评估四指马鲅种群遗传多样性的SSR标记引物，所述引物分别为引物对1、引物对2、引物对3、引物对4、引物对5、引物对6、引物对7、引物对8、引物对9和引物对10，所述引物对1~10的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：1~20所示，该引物扩增稳定，多态性强，杂合度高；还公开了一种评估四指马鲅群体遗传多样性的方法。以及上述引物或方法在四指马鲅种群遗传多样性分析、品种鉴定、遗传图谱构建或分子辅助育种中的应用。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种评估四指马鲅群体遗传多样性的SSR标记引物、方法及应用，尤其是涉及一种基于四指马鲅简易基因组测序获得的评估四指马鲅群体遗传多样性的SSR标记引物、方法及其在野生四指马鲅群体的遗传多样性中的应用。
背景技术
四指马鲅（Eleutheronematetradactylum）属于辐鳍鱼纲（Actinopterygii）鲻形目(Perciformes)马鲅亚目(Percoidei)马鲅科(Polynemidae)，是一种暖水性中小型肉食性鱼类，喜欢栖息于近海、河口以及海床地带，主要分布于热带海域，如印度、印度尼西亚、新加坡、菲律宾、澳洲西部和北部等地，在我国渤海、黄海、东海、南海等地区也有分布，其肉质鲜美，营养价值高，很受消费者欢迎，是我国重要的海水养殖名贵鱼类。近年来，由于人类的过度捕捞、水体污染、种质资源的保护意识不强等因素，野生四指马鲅数量急剧下降，但关于四指马鲅种群遗传多样性的研究进展却十分缓慢，未见文献报道，所以对我国四指马鲅的遗传多样性研究刻不容缓。
简单重复序列（Simple Sequence Repeats，SSR），即微卫星标记。微卫星标记是由核心序列和侧翼序列组成，核心序列由1-6个核苷酸组成单元，单元重复次数不低于5次的简单重复序列。SSR广泛分布于真核生物基因组和转录组中，因此成为真核生物基因组水平遗传多样性评估的有效方法。SSR是共显性标记，可直接反应物种的遗传信息。由于在DNA复制过程中滑链导致错配概率大，所以SSR相比于双等位基因标记SNP（Single NucleotidePolymorphism）和AFLP（Amplified Fragment Length Polymorphism）具有更高的多态性和杂合性。微卫星标记两端的侧翼序列在亲缘关系比较近的物种基因组中具有保守性，所以某一物种已经开发的微卫星标记可以应用到近缘物种的相关研究，即SSR具有通用性，这一特性大大的减少了开发微卫星标记的工作量。微卫星标记具有分布广泛、共显性标记、通用性等优点，所以开发四指马鲅微卫星标记可以为我国四指马鲅野生资源调查和种质资源保护提供技术支撑和理论依据，为四指马鲅分子标记辅助育种打下基础。
发明内容
本发明的目的在于提供一种评估四指马鲅群体遗传多样性的SSR标记引物，该引物扩增稳定，多态性强，杂合度高。
本发明的目的还在于提供一种评估四指马鲅群体遗传多样性的方法，该方法基于10重荧光PCR反应体系，准确度高。
本发明的最后一个目的在于提供上述引物或方法在四指马鲅群体遗传多样性分析、品种鉴定、遗传图谱构建或分子辅助育种方面的应用。
本发明的上述第一个目的可以通过以下技术方案来实现：一种评估四指马鲅群体遗传多样性的SSR标记引物，所述引物分别为引物对1、引物对2、引物对3、引物对4、引物对5、引物对6、引物对7、引物对8、引物对9和引物对10，所述引物对1~10的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：1~20所示。
10对引物的序列具体如下所示：
引物对1：
F:AGAAACCGACAGAGTATAAG；
R:ACTTCGACATACACTTCACG。
引物对2：
F:TCACTTTGGGAAAAAGTTGGTG；
R:AATGAACTGCGAGATTAGTT。
引物对3：
F:AGCCGGGGTCTCAGTGGGTC；
R:TCCAGACAATCAGCGGTGGT。
引物对4：
F:TGCTTCTGGGTTGGCTGTGG；
R:GCCATAACAAATCCGGTACT。
引物对5：
F:TCTGTAATGGCCGGAGCTGG；
R:AGCATTTGAAGGAATAAGCT。
引物对6：
F:ACCATTGGAAATGGAGTGGC；
R:TGAGTATAGCAGAGTTGTTA。
引物对7：
F:TTGTGTGCCCCTGCACGTTC；
R:ACACGGGGCTATGTCTTAGC。
引物对8：
F:CATTCACATGGCATTGCTGGC；
R:CTGGTAAGACGGTGAGAAC。
引物对9：
F: GGATTCTGCCGGTGCCGCGACCC；
R: CACAC GCTGA ATTCT TCTGGGAAT。
引物对10：
F: AAAGTCTGAAGATGTGATGT；
R: CCATACTTCATGTGTGTTCT。
本发明的上述第二个目的可以通过以下技术方案来实现：一种评估四指马鲅群体遗传多样性的方法，包括以下步骤：
（1）取四指马鲅鳍条组织，提取DNA，进行简易基因组高通量测序，提取高质量序列，对基因组序列区进行搜索，预测微卫星分子标记，并合成标记引物，在四指马鲅DNA中进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测，筛选出微卫星标记引物；
（2）根据步骤（1）中获得的有效微卫星分子标记引物，进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，筛选出权利要求1中的10对SSR标记引物；
（3）根据步骤（2）中筛选得到的10对SSR标记引物，在每对引物的正向引物5’端分别用不同的荧光基团进行修饰，开发一个10重荧光PCR反应体系；
（4）收集四指马鲅群体样本，提取DNA，利用步骤（3）中的10重荧光PCR反应体系进行扩增，然后进行基因分型，评估四指马鲅群体遗传多样性。
在上述评估四指马鲅群体遗传多样性的方法中：
优选的，步骤（1）和步骤（4）中采用醋酸铵法提取组织DNA。
优选的，步骤（1）中在基因组序列上开发微卫星标记。
优选的，步骤（1）中筛选出扩增稳定、条带清晰且单一的有效微卫星标记引物。
优选的，步骤（2）中筛选10对SSR标记引物的过程是：根据基因组测序筛选的微卫星标记，合成引物，并分别对四指马鲅个体进行PCR扩增，电泳检测扩增产物大小，收集数据，分析SSR的遗传学参数，筛选出扩增稳定、多态性强、杂合度高的10对SSR标记引物。
优选的，步骤（3）中在每对引物的正向引物5’端标记荧光物质时，其中引物对1、引物对7和引物对10标记荧光物质FAM；引物对2、引物对4、引物对6和引物对8标记荧光物质HEX；引物对引物对3、引物对5和引物对9标记荧光物质TAMRA。
优选的，步骤（3）中所述10重荧光PCR反应体系如下：
优选的，步骤（4）中采用ABI 3730XL进行基因型分型，对四指马鲅遗传多样性进行分析包括：利用软件Cervus计算微卫星标记在群体中的等位基因数（Na）、观测杂合度（Ho）、期望杂合度（He）和哈代温伯格平衡显著性（P）等遗传多样性参数。
本发明的上述第三个目的可以通过以下技术方案来实现：上述SSR标记引物或方法在四指马鲅群体遗传多样性分析、品种鉴定、遗传图谱构建或分子辅助育种中的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
（1）本发明基于基因组数据开发的SSR标记引物，该开发的SSR标记引物具有特异性扩增、多态性好、共显性且易于检测等优点，同时这些SSR标记均来自四指马鲅基因组序列上，能够直接反应基因组的遗传信息，从而更好的分析四指马鲅群体的遗传多样性，丰富了四指马鲅的SSR标记资源库；
（2）本发明开发的SSR分子标记引物，可以组成一种10重PCR反应体系，高效快速，节约成本，可用于四指马鲅种质鉴定、遗传多样性分析等领域，为今后四指马鲅种质资源调查、开发和保护提供理论基础，并为我国四指马鲅主要产地的资源状况、人工养殖及品种培育提供技术支持。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步说明本发明。下述实施例仅用于示例性说明，不能理解为对本发明的限制。除非特别说明，下述实施例中使用的试剂原料为常规市购或商业途径获得的生化试剂原料，使用的实验仪器均为实验室常规仪器，除非特别说明，下述实施例中使用的方法和设备为本领域常规使用的方法和设备。
实施例1
本实施例提供的评估四指马鲅群体遗传多样性的SSR标记引物及评估四指马鲅群体遗传多样性的方法，包括以下步骤：
（1）提取四指马鲅鳍条组织的基因组DNA，利用ddRAD-seq方法进行高通量测序；
（2）SSR标记开发和多态性SSR标记筛选
采用MISA软件对基因组（四指马鲅的基因组序列号为PRJNA576868）的所有序列进行搜索，寻找SSR位点。设置的参数为：二碱基、三碱基、四碱基、五碱基、六碱基重复单元的重复次数分别为8、4、4、5、4次；
从四指马鲅基因组SSR数据中挑选2碱基＞10重复的微卫星标记50个；3碱基＞7重复51个；4碱基＞6重复30个，PCR产物大小介于150bp到420bp之间，总共获得131个微卫星标记；
采用Primer3软件进行SSR引物设计，引物设计参数为引物序列长度18-27bp，PCR扩增产物长度150-420bp，GC含量55％-65％；
提取15个四指马鲅总DNA，PCR扩增验证SSR的有效性、特异性和多态性。
提取DNA利用天根生化科技有限公司的海洋动物DNA提取试剂盒，按照试剂盒说明书步骤。
反应体系为10 μL：2×PCR Mix 5 μL，正反引物（10μmol/L）各0.5μL（每对引物单独使用），DNA模板（100ng/μL）1μL，ddH2O 3μL。
PCR扩增程序为：94℃预变性5分钟，然后94℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸30秒，共32个循环，最后72℃延伸10分钟。通过1%琼脂糖凝胶电泳淘汰无条带、无主带、无单一条带的SSR。剩下的SSR用8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测多态性，硝酸银进行染色，银染显色；
对15个四指马鲅个体进行PCR扩增，筛选出扩增稳定性好和多态性高的10对引物。
本发明筛选的10对微卫星标记引物命名为：引物对1、引物对2、引物对3、引物对4、引物对5、引物对6、引物对7、引物对8、引物对9和引物对10，具体如下表1所示。
表1四指马鲅10对SSR标记引物信息
非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳具体步骤为：
（2.1）将方板和耳朵板对齐固定在配套的制胶架上，旋紧制胶架底座两侧的螺旋，然后用长尾夹夹紧两玻璃板左右两侧，达到密封效果；
（2.2）将配置好的40 mL 8%聚丙烯酰胺凝胶溶液注入两玻璃板之间，待液面到达耳朵板最高处时插入梳子，在未凝固之前应随时观察是否渗漏，静置至完全凝固；
（2.3）胶凝固之后，将玻璃板从制胶架取下，固定到电泳槽两侧，旋紧螺旋，旋紧程度不宜太紧，太紧容易导致胶变形，也不宜太松，太松导致电泳槽上方的缓冲液漏到下方。在电泳槽上方倒入0.5×的TBE缓冲液，在点样孔加入2μL的PCR产物，在中间及最左边胶孔分别点50bp DNA Ladder和PBR322DNA Maker；
（2.4）盖上电泳槽的上盖，先用电压200V跑10min，再用电压600V跑1h20min。电泳结束后断开电源，将胶取出后至AgNO3染色液中染色5min，随后将凝胶放清水漂洗10s，接着将凝胶转移到显色液中显色，直至观察到清晰条带出现，拍照记录。
（3）10重荧光PCR体系开发
将步骤（2）中筛选的10对多态性SSR标记引物，组成一个10重荧光PCR体系，每一对引物的正向引物5’端标记荧光物质，其中，引物对1、引物对7和引物对10标记荧光物质FAM（蓝色）；引物对2、引物对4、引物对6和引物对8标记荧光物质HEX（绿色）；引物对引物对3、引物对5和引物对9标记荧光物质TAMRA（粉红）。10重PCR体系总体系具体见表2：
表2 四指马鲅10重PCR反应体系
（4）群体遗传多样性评估
利用步骤（3）中的获得的10重PCR反应体系对四指马鲅群体进行遗传多样性分析：收集我国多个海域的3个四指马鲅群体，其中广东珠海群体35尾、广东湛江群体30和福建福州群体30尾，共95个个体。
提取其DNA为模板进行10重荧光PCR扩增，将得到的PCR扩增产物进行毛细管电泳基因分型，读取毛细管电泳数据，利用软件Cervus3.0计算SSR在三个群体中的等位基因数（Na）、观测杂合度（Ho）、期望杂合度（He）、哈代温伯格平衡（P）等遗传学参数，进行遗传多样性分析。
分析结果如表3所示，广东湛江群体平均等位基因数为11.1，广东珠海群体平均等位基因数为12.5，福建福州群体平均等位基因数为10，说明广东珠海群体具有最多的等位基因位点。广东湛江群体、广东珠海群体和福建福州群体的平均观测杂合度分别为0.684、0.701和0.659，平均期望杂合度分别为0.719、0.737和0.689。以上，说明广东珠海群体遗传多样性最高。
表310个SSR在3个四指马鲅群体中的统计遗传学信息
A:等位基因数目；He:期望杂合度；H0:观测杂合度；P:哈代温伯格平衡显著性。
通过软件Arlequin 3.11分析得到的pairwise Fst值总体显示三个群体之间呈现中度遗传分化，福州群体和湛江群体总体分化程度最大，Fst为0.189，珠海群体和湛江群体遗传分化程度最小（Fst=0.135）。湛江群体和福州群体之间遗传距离最大（0.668），湛江群体和珠海群体之间遗传距离最小（0.548）。
表4 三个群体基于10个微卫星标记引物的遗传分化系数Fst（对角线下)及其群体遗传距离（对角线上）
以上结果表明，本发明中微卫星标记引物可以准确评估四指马鲅多个群体之间的遗传多样性，对研究四指马鲅的生物多样性和系统地理学具有重要作用。
以上所述仅是本发明的非限定实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进，这些都视为本发明的保护范围。
Claims (6)
1.一种评估四指马鲅群体遗传多样性的SSR标记引物，其特征是所述引物分别为引物对1、引物对2、引物对3、引物对4、引物对5、引物对6、引物对7、引物对8、引物对9和引物对10，所述引物对1~10的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：1~20所示。
2.一种评估四指马鲅群体遗传多样性的方法，其特征是包括以下步骤：
（1）取四指马鲅鳍条组织，提取DNA，进行简易基因组高通量测序，提取高质量序列，对基因组序列区进行搜索，预测微卫星分子标记，并合成标记引物，在四指马鲅DNA中进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测，筛选出微卫星标记引物；
（2）根据步骤（1）中获得的有效微卫星分子标记引物，进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，筛选出权利要求1中的10对SSR标记引物；
（3）根据步骤（2）中筛选得到的10对SSR标记引物，在每对引物的正向引物5’端分别用不同的荧光基团进行修饰，开发一个10重荧光PCR反应体系；
（4）收集四指马鲅群体样本，提取DNA，利用步骤（3）中的10重荧光PCR反应体系进行扩增，然后进行基因分型，评估四指马鲅群体遗传多样性。
3.根据权利要求2所述的评估四指马鲅群体遗传多样性的方法，其特征是：步骤（3）中在每对引物的正向引物5’端标记荧光物质时，其中引物对1、引物对7和引物对10标记荧光物质FAM；引物对2、引物对4、引物对6和引物对8标记荧光物质HEX；引物对3、引物对5和引物对9标记荧光物质TAMRA。
4.根据权利要求2所述的评估四指马鲅群体遗传多样性的方法，其特征是：步骤（3）中所述10重荧光PCR反应体系如下：
。
5.根据权利要求2所述的评估四指马鲅群体遗传多样性的方法，其特征是：步骤（4）中采用ABI 3730XL进行基因型分型，对四指马鲅遗传多样性进行分析包括：利用软件Cervus计算微卫星标记在群体中的等位基因数Na、观测杂合度Ho、期望杂合度He和哈代温伯格平衡显著性P。
6.权利要求1所述SSR标记引物或权利要求2-5任一项所述方法在四指马鲅群体遗传多样性分析中的应用。
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