CN106191292A - 一种培育大黄鱼苗种的方法及其所使用的筛选分子标记 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种培育大黄鱼苗种的方法及其所使用的筛选分子标记，包括如下依次进行的步骤：1)筛选大黄鱼生长轴相关基因及其连锁SSR；2)引物合成；3)SSR引物扩展多态性检测；4)生长相关SSR标记筛选；5)大黄鱼亲鱼的标记与筛选；6)大黄鱼苗种培育。该发明克服了现有技术中缺乏快速筛选和培育优质大黄鱼苗种的缺点，具有快速、便捷、有效、能加速大黄鱼育种进程的优点。
Description
技术领域
本发明涉及一种培育大黄鱼苗种的方法及其所使用的筛选分子标记，应用在培育生产快的优良大黄鱼品种上。
背景技术
大黄鱼(Larimichthys crocea)是我国特有海水经济鱼类，素有“国鱼”美誉，其2014年我国的育苗量和年产量分别为21.49亿尾和12.79万吨，占全国海水鱼类育苗总量和养殖产量的33.15％和10.75％，年产值达100多亿元，是我国最大规模的海水养殖鱼类和八大优势出口养殖水产品之一。但由于在长期粗放式养殖过程中缺乏科学有效的管理措施，大黄鱼的种质正面临生长趋缓、性成熟过早、个体小型化和抗病性下降等诸多问题，迫切需要进行种质改良，以培育出生长快、存活率高、抗病力强、适合集约化养殖的优良大黄鱼品种。
鱼体的生长状况是水产养殖中备受关注的重要经济性状。众所周知，硬骨鱼的生长是由生长轴(GH/IGH-I)控制的。生长激素(GH)从脑垂体分泌后，通过GH受体(GHR)的介导进而刺激肝脏和其他组织合成并分泌胰岛素样生长因子(IGF-I)，后者通过IGF受体的介导直接作用于动物体内的多种组织，促进蛋白质的合成，促进细胞增殖，从而促进肌肉、内脏和骨骼的生长。生长激素的分泌受下丘脑分泌的生长抑素(SS)和生长激素释放激素(GHRH)所控制，前者抑制GH分泌，后者促进GH分泌。此外，肌肉抑制素基因(myostatin,MSTN)，瘦素及其受体(LEP和LEPR)等也在生长调控轴中起重要作用。
大多数经济动物的重要经济性状(生长、抗病、抗逆等)受许多数量性状座位(Quantitative Trait Locus，QTL)和环境因子的共同作用而表现出数量性状的遗传特点，由众多微效基因控制，遗传基础复杂，传统的遗传育种研究方法往往无法区别一个重要性状的产生是由哪一个具体的基因控制的，难以快速准确地改良目标性状，因而借助DNA分子标记对育种材料从DNA水平上进行选择，可以大大提高选择的准确性，并可在早期鉴定出具有优良性状的个体，筛选优良亲本，从而缩短育种周期，实现动物产量、品质和抗性等综合性状的高效遗传改良目的，加快育种进程。
微卫星多态性(Simple Sequence Repeats polymorphism，SSRP)是分子标记中较为稳定的一种辅助选择育种标记方法，在物种生长、抗性、性别等性状中被普遍应用。通过研究与生长性状相关基因的微卫星多态性并应用于猪、牛、羊等高等动物的育种实践中已有诸多成功的报道。近10年来关于鱼类SSRP研究正引起重视，已有许多关于鱼类生长控制轴基因的SSRP与生长相关的报道，在鱼类遗传育种上有重要的应用价值。如Streelman和Kocher等发现了罗非鱼催乳激素基因的表达调控区有一个SSR序列，该序列的多态性影响催乳激素基因的表达，其表达量与其生长呈明显负相关；鲁翠云等利用大样本群体分析和验证8个生长相关SSR标记与镜锂体质量和体长性状的相关性，发现4个QTL位点与体质量或体长性状具明显相关性；Reid等研究证实北极红点鲑、大西洋鲑和虹鳟等鱼类的体重量和体长等性状与其QTL呈显著相关；刘福平等用65个微卫星标记获得了8个对罗非鱼生长性状有显著效应的微卫星位点。这些工作均为研究鱼类生长性状的分子标记辅助育种提供了有价值的遗传标记，也为我们开展分子标记研究奠定了理论基础。
目前研究大黄鱼经济性状相关遗传标记的分析报道尚不多见，尤其在分子水平上的遗传选育仍处于理论研究阶段，而在生产实践中的应用研究仍较为薄弱。已见的报道有刘贤德等研究了1个大黄鱼F1家系22个微卫星位点的基因型分布，找到3种对生长有利的基因型；后期研究中进一步发现了2个与大黄鱼生长性状紧密相关的微卫星标记(LYC0088和LYC0143)；Zhou和谢芳靖等前期利用构建的大黄鱼线性化cDNA文库筛选出3535个高质量的EST，并经测序筛选出150个微卫星位点，为进一步开发新的微卫星分子标记和基因编码区微卫星的功能研究提供有价值的信息。分子育种和种业自主科技创新均以列入我国“十二五”和“十三五”规划中，足见其对科技、经济和社会发展的作用。大黄鱼的全基因组已经测序完成，因而基于全基因组水平筛选与其生长性状相关的功能基因及其紧密连锁的多态性遗传标记，并由此选育出高产新品系，必将提升大黄鱼育种的科技含量，大幅度提高大黄鱼的产量，具有重要的理论意义和应用前景。
因此提供一种操作快速、便捷且有效的能筛选并培育出生长快速的大黄鱼品种的培育大黄鱼苗种的方法及其所使用的筛选分子标记己成为当务之亟。
发明内容
为了克服现有技术中缺乏快速筛选和培育优质大黄鱼苗种的缺点，本发明提供一种培育大黄鱼苗种的方法及其所使用的筛选分子标记，具有快速、便捷、有效、能加速大黄鱼育种进程的优点。
本发明的技术方案如下：
(一)一种培育大黄鱼苗种的方法，包括如下依次进行的步骤：
1)筛选大黄鱼生长轴相关基因及其连锁SSR：根据已报道的其他物种的生长相关基因和已公布的大黄鱼全基因遗传信息，在基因数据库中筛选大黄鱼生长轴相关基因，并获取基因主要调控区，筛选出携带有重复序列SSR标记的大黄鱼生长轴相关功能基因；
2)引物合成：对步骤1)筛选的大黄鱼生长轴相关基因的连锁SSR序列进行引物设计，并合成SSR引物；
3)SSR引物扩展多态性检测：用步骤2)所合成的SSR引物对随机挑选大黄鱼随机群体DNA样本进行PCR扩增及电泳检测，筛选得到扩展结果呈现多态性的SSR引物，其中每对SSR引物多态性中表现出单一条带的基因型命名为AA型，表现出多条带的基因型命名为AB型，每对SSR引物各有AA、AB两种基因型；
4)生长相关SSR标记筛选：用步骤3)中筛选出的SSR引物对随机挑选大黄鱼随机群体DNA样本进行PCR扩增及电泳检测，根据PCR扩增检测结果，统计不同引物基因型及基因型组合方式对应的大黄鱼样本数量及平均体重，筛选出以下几种体重比所有样本平均体重重且具有显著性差异P＜0.05的引物基因型或引物基因型组合：
①引物igf1-11AB型；
②引物ghr2AA型、引物igf2-4AA型、引物igf1-10AB型、引物igf1-11AB型的引物基因型组合，以上引物基因型组合须依次使用以进行筛选；
③引物igf2-4AA型和引物igf1-11AB型的组合，以上引物基因型组合须依次使用以进行筛选；
④引物ghr2AA型、引物igf2-4AA型和引物igf1-11AB型的组合，以上引物基因型组合须依次使用以进行筛选；
其中，引物序列如下：
引物igf1-11：上游序列：5'CGCCGACCATAGAAACACTC 3'
下游序列：5'GGCATCTTCACGTTGTCAAAT 3'
引物ghr2：上游序列：5'CTTTCTTTGTTTCTGCTGGACT 3'
下游序列：5'CTGACTACTGGATGGCTCTAATG 3'
引物igf2-4：上游序列：5'GACTATCTGTGCTGTCTGTGGC 3'
下游序列：5'CTCTTGGGGTGCTATTACTTTACT 3'
引物igf1-10：上游序列：5'AGCCCTACCAAGGTCTGTCT 3'
下游序列：5'CGTGGGATTTGTCCTTAGTTAC 3'
引物igf1-11：上游序列：5'CGCCGACCATAGAAACACTC 3'
下游序列：5'GGCATCTTCACGTTGTCAAAT 3'；
5)大黄鱼亲鱼的标记与筛选：用步骤4)所筛选出的SSR标记引物基因型或引物基因型组合对大黄鱼亲鱼进行分子标记检测，筛选出携带目的基因型或基因型组合的大黄鱼亲鱼，用以培育子代大黄鱼苗；
6)大黄鱼苗种培育：用步骤5)所筛选的大黄鱼亲鱼按照大黄鱼苗种培育技术规范进行子代大黄鱼苗的培育。
本申请培育大黄鱼苗种的方法通过筛选出大黄鱼生长轴相关基因连锁SSR序列，设计出相应SSR引物，挑选出扩展结果有多态性能的引物基因型。通过与生长性状的相关性分析，挑选出体重比大黄鱼实验总样本的平均体重重且与其有明显差异的引物基因型或引物基因型组合。之后，利用挑选出的引物基因型或引物基因型组合用于大黄鱼亲鱼的筛选，可筛选出带有生长轴相关基因连锁目的SSR标记的大黄鱼(即具有体重优势基因型的大黄鱼亲鱼)，以用于子代大黄鱼的培育。该方法利用生长功能基因连锁的分子标记，并配合多重标记技术，其操作方便、效果稳定有效、能大大加速大黄鱼优良品种的选育，提升大黄鱼鱼苗的品质。本申请共筛选出4种引物基因型或引物基因型组合。
所述步骤3)、4)、5)中PCR扩增反应体系如下：
0.5μL gDNA模板，0.5μL浓度为10μM的上游引物，0.5μL浓度为10μM的下游引物，2μL 10×buffer，0.4μL 10mMdNTP，0.4μL浓度为5U/μL份Taq DNA聚合酶，加双蒸水至20μL。
该优选的PCR扩增反应体系能达到最佳的扩增效果。
所述步骤3)、4)、5)中PCR扩增条件如下：95℃3min；95℃30s，55℃30s，72℃30s，35个循环；72℃，10min；4℃，5min。
该优选的PCR扩增条件能达到最佳的扩增效果。
所述步骤3)、4)、5)中电泳检测的方法如下：取5μL扩增产物溶解于1μL loadingbuffer中，在电压为150V，电流为120mA条件下，用2.2％的琼脂糖凝胶电泳60min用以检测扩增产物。
该优选的电泳检测参数能达到最佳的电泳分离检测效果。
所述步骤5)中将大黄鱼亲鱼以每6尾为1组分组暂养，以剪取大黄鱼亲鱼背鳍和尾鳍的不同位置对其进行编号区分。
在分子标记的同时利用剪取不同鳍条位置进行标号以及小组暂养的方法，使得操作方便、成本低廉、亲鱼应激性小且成活率高。
步骤6)大黄鱼苗种培育过程中每天都要换新水，当投放入养殖池中的大黄鱼亲鱼所产的受精卵孵化后生长鱼苗至22-28日龄时，每日根据养殖池换水情况向养殖池中添加经130-170目筛绢网过滤的新鲜小球藻水，使水体透明度维持在30-50cm；待鱼苗体色由透明开始转黑时，逐日向养殖池中泼洒底泥以替代小球藻水的使用并同时相应逐日减少新鲜小球藻水的添加量直至零，使调整过程中养殖池中的底泥的浓度以1ppm、2ppm、5ppm、10ppm、20ppm、30ppm的比例逐日变化，之后每日继续泼洒底泥将养殖池中的底泥浓度保持在30ppm，维持水体透明度30-40cm；之后待鱼苗转移至海区进行暂养时，使用活水船将其运至海上渔排，此时在活水船的船舱中继续泼洒底泥，以保持底泥在水中的比例为30ppm，所述底泥为桡足类养殖环境中的池塘底泥或海区底泥，该底泥经60-100目筛绢网过滤。
利用向养殖池中注入小球藻水和泼洒底泥的方式控制水质环境，可大大提高饵料利用率、调节水质、保持苗种生活环境的稳定性，并大大提高了苗种的成活率和生长速度，使大黄鱼快速有效育苗成为可能。
(二)所述培育大黄鱼苗种的方法中所使用的筛选分子标记的引物基因型均为SSR引物igf1-11AB型，该SSR引物igf1-11的序列如下：
上游序列：5'CGCCGACCATAGAAACACTC 3'
下游序列：5'GGCATCTTCACGTTGTCAAAT 3'。
(三)所述培育大黄鱼苗种的方法中所使用的筛选分子标记的引物基因型为依次采用的SSR引物ghr2AA型、SSR引物igf2-4AA型、SSR引物igf1-10AB型、SSR引物igf1-11AB型，所述SSR引物序列如下：
引物ghr2：上游序列：5'CTTTCTTTGTTTCTGCTGGACT 3'
下游序列：5'CTGACTACTGGATGGCTCTAATG 3'
引物igf2-4：上游序列：5'GACTATCTGTGCTGTCTGTGGC 3'
下游序列：5'CTCTTGGGGTGCTATTACTTTACT 3'
引物igf1-10：上游序列：5'AGCCCTACCAAGGTCTGTCT 3'：
下游序列：5'CGTGGGATTTGTCCTTAGTTAC 3'
引物igf1-11：上游序列：5'CGCCGACCATAGAAACACTC 3'
下游序列：5'GGCATCTTCACGTTGTCAAAT 3'。
(四)所述培育大黄鱼苗种的方法中所使用的筛选分子标记的引物基因型为依次采用的SSR引物igf2-4AA型和SSR引物igf1-11AB型，所述SSR引物序列如下：
引物igf2-4：上游序列：5'GACTATCTGTGCTGTCTGTGGC 3'
下游序列：5'CTCTTGGGGTGCTATTACTTTACT 3'
引物igf1-11：上游序列：5'CGCCGACCATAGAAACACTC 3'
下游序列：5'GGCATCTTCACGTTGTCAAAT 3'。
(五)所述培育大黄鱼苗种的方法中所使用的筛选分子标记的引物基因型为依次采用的SSR引物ghr2AA型、SSR引物igf2-4AA型和SSR引物igf1-11AB型，所述SSR引物序列如下：
引物ghr2：上游序列：5'CTTTCTTTGTTTCTGCTGGACT 3'
下游序列：5'CTGACTACTGGATGGCTCTAATG 3'
引物igf2-4：上游序列：5'GACTATCTGTGCTGTCTGTGGC 3'
下游序列：5'CTCTTGGGGTGCTATTACTTTACT 3'
引物igf1-11：上游序列：5'CGCCGACCATAGAAACACTC 3'
下游序列：5'GGCATCTTCACGTTGTCAAAT 3'。
与现有技术相比，本发明申请具有以下优点：
1)本申请根据现有其他鱼类生长轴基因研究报道和大黄鱼全基因组遗传信息中直接筛选大黄鱼生长轴相关基因及其连锁的SSR标记，目的性明确，对结果具有较强的可预测性，所述方法稳定、可靠且有效，操作方便、快速。
2)本申请基于SSR分子标记技术，并配合多重分子标记技术，设计并快捷筛选出具有大黄鱼生长优势基因型的大黄鱼亲鱼，使大黄鱼快速育种成为可能，并已在苗种培育阶段进行了验证；
3)本申请利用剪取不同鳍条位置进行标号以及小组暂养和筛选大黄鱼亲本的方法与其他标记技术相比操作方便、成本低廉，亲鱼应激性小、成活率高；
4)本申请利用添加小球藻水和泼洒底泥的方式来进行调节水质，可提高饵料成活率和利用率、调节和保持水质稳定性，并利用小球藻和底泥可吸附水中漂浮的粪便等细小颗粒并沉淀至水底的特点，方便了养殖池的日常吸污清除，以保持苗种生活环境的稳定性，可大大提高苗种的成活率和生长速度。
附图说明
图1是本发明所述的培育大黄鱼苗种的方法及其所使用的筛选分子标记的引物gh对大黄鱼随机群体DNA样本进行PCR扩增的部分电泳图；
图2是本发明所述的培育大黄鱼苗种的方法及其所使用的筛选分子标记的引物ghr2对大黄鱼随机群体DNA样本进行PCR扩增的部分电泳图；
图3是本发明所述的培育大黄鱼苗种的方法及其所使用的筛选分子标记的引物ghrhr1对大黄鱼随机群体DNA样本进行PCR扩增的部分电泳图；
图4是本发明所述的培育大黄鱼苗种的方法及其所使用的筛选分子标记的引物ghrhr3对大黄鱼随机群体DNA样本进行PCR扩增的部分电泳图；
图5是本发明所述的培育大黄鱼苗种的方法及其所使用的筛选分子标记的引物igf1-5对大黄鱼随机群体DNA样本进行PCR扩增的部分电泳图；
图6是本发明所述的培育大黄鱼苗种的方法及其所使用的筛选分子标记的引物igf1-10对大黄鱼随机群体DNA样本进行PCR扩增的部分电泳图；
图7是本发明所述的培育大黄鱼苗种的方法及其所使用的筛选分子标记的引物igf1-11对大黄鱼随机群体DNA样本进行PCR扩增的部分电泳图；
图8是本发明所述的培育大黄鱼苗种的方法及其所使用的筛选分子标记的引物igf1-12对大黄鱼随机群体DNA样本进行PCR扩增的部分电泳图；
图9是本发明所述的培育大黄鱼苗种的方法及其所使用的筛选分子标记的引物igf2-2对大黄鱼随机群体DNA样本进行PCR扩增的部分电泳图；
图10是本发明所述的培育大黄鱼苗种的方法及其所使用的筛选分子标记的引物igf2-4对大黄鱼随机群体DNA样本进行PCR扩增的部分电泳图。
具体实施方式
实验动物：
本实验大黄鱼为宁德市富发水产有限公司自繁自育的。
实验试剂：
Generay公司细胞/组织基因组DNA提取试剂盒：离心柱型GK0222，Generay公司生产；
DNA marker试剂盒：GsDL2501-100，上海捷瑞生物工程有限公司生产；
Taq酶：上海捷瑞生物工程有限公司生产。
下面结合说明书附图1-10对本发明的技术方案进行详细说明。
本发明所述的一种培育大黄鱼苗种的方法，包括如下依次进行的步骤：
1)筛选大黄鱼生长轴相关基因及其连锁SSR：根据现已报道的其他物种的生长相关基因功能和已公布的大黄鱼全基因组遗传信息，以growth hormone、follistatin、insulin-like growth factor、ghrelin、growth differentiation factor、leptin、MyoD、myogenic factor、myostatin、somatostatin为关键词，在Genebank基因数据库中筛选出部分大黄鱼生长轴相关基因，经SSR Hunter软件筛选初步获得携带重复序列SSR的基因6个，所述6个大黄鱼生长轴相关功能基因携带SSR位点共55个；
所筛选出的6个大黄鱼生长轴相关功能基因信息如表1所示。
表1选取的大黄鱼生长轴功能基因列表
2)引物合成：对以上6个大黄鱼生长轴相关基因连锁的55个SSR位点进行引物设计及合成，
共计合成37对SSR引物，引物扩增片段中包含SSR位点50个，引物序列如下：
①引物gh：上游序列：5'ATACAGCGGGGCGACTTC 3'
下游序列：5'ACAGACAGCAGGACCAGAACC 3'
②引物ghr1：上游序列：5'TGGTTCTTAACTTAACAGCAATG 3'
下游序列：5'GCAGTGTCAGAGCCTGTTTGT 3'
③引物ghr2：上游序列：5'CTTTCTTTGTTTCTGCTGGACT 3'
下游序列：5'CTGACTACTGGATGGCTCTAATG 3'
④引物ghr3：上游序列：5'ACTTCCCTGGCTTCAGTGTTT 3'
下游序列：5'GGGTAGTAGTGGATGGGGTTGTA 3'
⑤引物ghr4：上游序列：5'ATGCCCTTGGAAGATTGATTG 3'
下游序列：5'AATGCTGTCTGGCTCACTTCTT 3'
⑥引物ghr5：上游序列：5'CCAATAGCATTCATACGGTAAACTG 3'
下游序列：5'GGATGATTCACAACCAAAACCTG 3'
⑥引物ghr6：上游序列：5'TAGGCAGTGGTAGTCGTTTGT 3'
下游序列：5'CACCCACTGCTTGTCTTTGA 3'
⑧引物ghr7：上游序列：5'GTAACTGGAAGGAAAGGAAGAA 3'
下游序列：5'GGGGAGAAAGGTGAAATACTG 3'
⑨引物ghr8：上游序列：5'GCTCCCCTGTATGGACTGATG 3'
下游序列：5'GGGCTTTGCTCCCTATTTTC 3'
⑩引物ghr9：上游序列：5'CTGACCAGATGAGCCTGCTTT 3'
下游序列：5'CTGGATACAATTTCCCTGATGC 3'
引物ghrhr1：上游序列：5'GCCACTGAGCAGTTGTTTGA 3'
下游序列：5'CAATCACAGTTTCCCAGAGC 3'
引物ghrhr2：上游序列：5'CCCTATTTGCAGCCTCAAT 3'
下游序列：5'CCAGAGCCGATAATAACCAA 3'
引物ghrhr3：上游序列：5'ATTTTGGAGACTGGTCTTTGTG 3'
下游序列：5'ACGACGGAGACAGTAAACAGAG 3'
引物ghrhr4：上游序列：5'TCAATAACAAGCAATAACTTCCTG 3'
下游序列：5'CGAGGGTTGACTTTCAGGATTA 3'
引物ghrhr5：上游序列：5'GTTCAGCGTATGATACACCCCA 3'
下游序列：5'GGAGAAGACCGCAGGACAAG 3'
引物ghrhr6：上游序列：5'ACTGTAGACCCCACGAAGCAAG 3'
下游序列：5'GTCCATCTGGCTGCCTTTTG 3'
引物igf2-1：上游序列：5'GGTTTGAGCGGTGTTTTGTTG 3'
下游序列：5'GCTTCAGTTACTCTTGGTGTCGTG 3'
引物igf2-2：上游序列：5'TATCGAGCAGCCGGTCTTG 3'
下游序列：5'TGTGCTGGTCTCGTGTTGATGT 3'
引物igf2-3：上游序列：5'GATTTCTATCCGTGTCATCACTTCT 3'
下游序列：5'ATTTCCACAACATAGAGCGTCAG 3'
引物igf2-4：上游序列：5'GACTATCTGTGCTGTCTGTGGC 3'
下游序列：5'CTCTTGGGGTGCTATTACTTTACT 3'
引物igf2-5：上游序列：5'GTGTGCCACCTACTGCTTTTC 3'
下游序列：5'AGCCCTGCACCCAATAGAG 3'
引物igf2-6：上游序列：5'CAAACAATGCCTTTATCGGTC 3'
下游序列：5'AGGAGAAATGGGATCAGTGGA 3'
引物igf2-7：上游序列：5'GAAACCCACGCAAAGACGA 3'
下游序列：5'GAGCTTGCTGTTCCGTGACTA 3'
引物igf1-1：上游序列：5'TTTTGCTGGTGCGTTTCA 3'
下游序列：5'CATCCCTGTCTGCCTGTG 3'
引物igf1-2：上游序列：5'CGCCTCGGGTCCTCTTTCT 3'
下游序列：5'GTCAGAGTGTTGGATTTAGTGGC 3'
引物igf1-3：上游序列：5'GCTGACATGCAGGCGACAC 3'
下游序列：5'CTGGGTAAATAAACACTGGCTCTA 3'
引物igf1-4：上游序列：5'TAGCAGCGGTGAACATAACATAA 3'
下游序列：5'AAAGCCTGGATTCAAACCACA 3'
引物igf1-5：上游序列：5'GTTCAGATAACCCCGTCCTTT 3'
下游序列：5'CAGGGAGAAGGGTTGTGGAC 3'
引物igf1-6：上游序列：5'CTGACCCAATGACCAGAACCCT 3'
下游序列：5'CGTTTCCAGCCAGTGACGTAG 3'
引物igf1-7:上游序列：5'TAAATGTTTTGCGTCGCTCCA 3'
下游序列：5'CTGACAGAAACAAAACGCACAAG 3'
引物igf1-8：上游序列：5'CGCACGCTTTAAGATCATACT 3'
下游序列：5'CTCTTTAGGTCGGAGGGAAC 3'
引物igf1-9：上游序列：5'AAGGTGGTAAGGGTTTGCTC 3'
下游序列：5'CTTGGTAGGGCTGTTCTGC 3'
引物igf1-10：上游序列：5'AGCCCTACCAAGGTCTGTCT 3'：
下游序列：5'CGTGGGATTTGTCCTTAGTTAC 3'
引物igf1-11：上游序列：5'CGCCGACCATAGAAACACTC 3'
下游序列：5'GGCATCTTCACGTTGTCAAAT 3'
引物igf1-12：上游序列：5'TATTGGCTTGTCGGTAGGAA 3'
下游序列：5'ATCGGAGCTGTAGAAGAAACTG 3'
引物fst-1：上游序列：5'CCGAGTGTCGAATACTTGCTG 3'
下游序列：5'CACCTGTTTTATGGACGCTTTAC 3'
引物fst-2：上游序列：5'CCTCCAGCCACTGACTCTGAATA 3'
下游序列：5'CACTTCCCTGTTTCGCTCTTTT 3'；
设计的37对SSR引物序列具体信息如表2所示。
表2大黄鱼SSR引物序列
3)SSR引物扩展多态性检测：利用所合成的37对SSR引物对24个大黄鱼随机样品DNA样本进行PCR扩增及电泳检测，筛选得到扩展结果呈现多态性的gh、ghr2、ghrhr1、ghrhr3、igf1-5、igf1-10、igf1-11、igf1-12、igf2-2、igf2-4共10对SSR引物，其中每对SSR引物多态性中表现出单一条带的基因型为AA型，表现出多条带的基因型命名为AB型，每对SSR引物各有AA、AB两种基因型，其PCR扩增及电泳检测详见附图1-10；其余27对引物扩增结果均呈单一条带，故无附图。
4)大黄鱼SSR位点与生长相关性分析：用步骤3)中筛选出的10对SSR引物的共20种基因型中的单种引物基因型和由多个单种引物基因型组成的引物基因型组合对314尾大黄鱼随机群体DNA样本进行PCR扩增及电泳检测，统计得到PCR扩增有多态性的大黄鱼样本数量及平均体重，筛选出以下几种体重比所有样本平均体重重且与所有样本平均体重有显著性差异P＜0.05(*表示)的引物基因型或基因型组合：
①单引物igf1-11AB型；
②引物ghr2AA型、引物igf2-4AA型、引物igf1-10AB型、引物igf1-11AB型的引物基因型组合1，以上引物基因型组合须依次使用以进行筛选；
③引物igf2-4AA型和引物igf1-11AB型的组合2，以上引物基因型组合须依次使用以进行筛选；
④引物ghr2AA型、引物igf2-4AA型和引物igf1-11AB型的组合3，以上引物基因型组合须依次使用以进行筛选；
引物基因型与引物基因型组合与生长相关性分析结果如下：
表3大黄鱼单一SSR位点与生长相关性分析
表4多重SSR标记组合1后与生长相关性分析
| 类别 | SSR位点 | 基因型 | 个体数(尾) | 平均体重(g) |
| 基础群体 | \ | \ | 314 | 68.57±33.10 |
| 步骤1 | ghr2 | AA | 218 | 69.29±35.24 |
| 步骤2 | igf2-4 | AA | 178 | 71.39±34.28 |
| 步骤3 | igf1-10 | AB | 112 | 71.25±35.61 |
| 步骤4 | igf1-11 | AB | 55 | 81.98±33.02* |
表5多重SSR标记组合2后与生长相关性分析
| 类别 | SSR位点 | 基因型 | 个体数(尾) | 平均体重(g) |
| 基础群体 | \ | \ | 314 | 68.57±33.10 |
| 步骤1 | igf2-4 | AA | 215 | 69.25±33.36 |
| 步骤2 | igf1-11 | AB | 121 | 74.78±30.38* |
表6多重SSR标记组合3后与生长相关性分析
| 类别 | SSR位点 | 基因型 | 个体数(尾) | 平均体重(g) |
| 基础群体 | \ | \ | 314 | 68.57±33.10 |
| 步骤1 | ghr2 | AA | 218 | 69.29±35.24 |
| 步骤2 | igf2-4 | AA | 178 | 71.39±34.28 |
| 步骤3 | igf1-11 | AB | 68 | 75.12±33.52* |
从表3、4、5、6可知4种引物基因型或引物基因型组合可有效筛选出具有体重优势的优良品质的大黄鱼品种，其分别是：①引物igf1-11AB型，②依次采用的引物ghr2AA型、引物igf2-4AA型、引物igf1-10AB型、引物igf1-11AB型的组合，③依次采用的引物igf2-4AA型和引物igf1-11AB型的组合，④依次采用的引物ghr2AA型、引物igf2-4AA型和引物igf1-11AB型的组合。
5)大黄鱼苗的培育：用步骤4)所筛选出的SSR标记引物基因型或引物基因型组合对大黄鱼亲鱼进行分子标记检测，筛选出携带目的基因型或基因型组合的大黄鱼亲鱼，用以培育子代大黄鱼苗；由于生长性状属于数量性状，是由多个基因共同作用的结果，因此用步骤4)所筛选出的引物基因型组合对大黄鱼亲鱼进行筛选具有较高的准确性。
6)大黄鱼苗种培育：用步骤5)所筛选的大黄鱼亲鱼按照大黄鱼苗种培育技术规范进行子代大黄鱼苗的培育。
大黄鱼苗种的培育实验具体方法如下：
1.大黄鱼分子标记新品系的培育
根据亲鱼数量，将亲鱼分别以6尾为一个小组分组暂养，剪取不同位置的大黄鱼亲背鳍和尾鳍的不同位置以标记亲鱼，根据上述筛选出的大黄鱼生长相关的SSR标记引物基因型组合，利用多重SSR标记技术筛选出携带目的SSR基因型组合的亲鱼，用于繁育大黄鱼分子标记新品系。其中，基础群体为同批次大黄鱼全部亲鱼样本，标记后剩余亲鱼作为对照组培育对照组鱼苗。
2.苗种培育
按照大黄鱼苗种繁育技术规范(富发水产公司规定)进行培育。
3.数据统计
利用SPSS 13.0软件中的独立样本T-检验进行分析，所得数据以平均值±标准误差(M±SE)来表示。
4.亲鱼标记筛选情况
4.1第一批次亲鱼标记筛选情况
第一批选取了127尾大黄鱼亲鱼，依次采用引物igf2-4AA型和引物igf1-11AB型进行筛选，其生物学测量数据如表7所示。
表7第一批次亲鱼筛选数据
可见，从标记群体的亲鱼平均体重比对照群体提高了2.06％，比基础群体提高了1.12％。4.2第二批次亲鱼标记筛选情况
第二次标记亲鱼，共选择196尾大黄鱼亲鱼，依次采用了引物ghr2AA型、引物igf2-4AA型和引物igf1-11AB型的组合进行筛选，其生物学测量如表8所示。
表8第二批次亲鱼筛选数据
可见，标记群体的亲鱼平均体重比对照群体提高了9.22％，比基础群体提高了6.56％。4.3第三批次亲鱼标记筛选情况
第三批选取了150尾大黄鱼亲鱼，依次采用引物ghr2AA型、引物igf2-4AA型、引物igf1-10AB型、引物igf1-11AB型进行筛选，其生物学测量数据如表9所示。
表9第三批次亲鱼筛选数据
可见，从标记群体的平均体重比对照群体提高了10.97％，比基础群体提高了7.67％。
5.大黄鱼苗种的培育：
大黄鱼苗种的培育按照按照大黄鱼苗种繁育技术规范(富发水产公司规定)进行培育。其中，2-10日龄苗种投喂轮虫，8-16日龄苗种投喂丰年虫，13-35日龄苗种投喂丰年虫，30日龄以后开始给苗种投喂人工配合饲料，根据鱼苗生长情况和气候情况，约55日龄时鱼苗开始下到海区暂养。在投喂的同时注意水质调控，即大黄鱼苗种培育过程中每天都要换新水，当投放入养殖池中的大黄鱼亲鱼所产的受精卵孵化后生长鱼苗至22-28日龄时，每日根据养殖池换水情况向养殖池中添加经130-170目筛绢网过滤的新鲜小球藻水，使水体透明度维持在30-50cm；待鱼苗体色由透明开始转黑时，逐日向养殖池中泼洒底泥以替代小球藻水的使用并同时相应逐日减少新鲜小球藻水的添加量直至零，使调整过程中养殖池中的底泥的浓度以1ppm、2ppm、5ppm、10ppm、20ppm、30ppm的比例逐日变化，之后每日继续泼洒底泥将养殖池中的底泥浓度保持在30ppm，维持水体透明度30-40cm；之后待鱼苗转移至海区进行暂养时，使用活水船将其运至海上渔排，此时在活水船的船舱中继续泼洒底泥，以保持底泥在水中的比例为30ppm，所述底泥为桡足类养殖环境中的池塘底泥或海区底泥，该底泥经60-100目筛绢网过滤。
6.三批次分子标记新品系苗种的培育情况
如表10所示，经过对标记的亲鱼及其对照组分别催产，测量其子代卵径、油球径以及鱼苗55日龄转移至海区养殖时的平均体重数据，具体实验数据如下。
表10分子标记新品系苗种的培育情况
由上表可知，第一批标记群体苗种在55日龄的时候，其平均体重比对照群体提高14.95％；
第二批标记群体苗种在55日龄的时候，其平均体重比对照群体提高17.66％；
第三批标记群体苗种在55日龄的时候，其平均体重比对照群体提高19.96％。
由此可见，采用本申请的方法可以实现快速、有效的筛选和培育优质体重的大黄鱼品种。
所述基因数据库为NCBI GeneBank数据库，获取基因主要调控区采用的是同源比对软件BLAST，查找基因连锁SSR采用的是SSR Hunter软件，引物设计采用的是primer 5.0软件。
所述大黄鱼随机群体DNA样本的获取方法如下：
剪取大黄鱼鳍条保存于无水乙醇中，利用DNA提取试剂盒提取DNA。
所述步骤3)、4)、5)中PCR扩增反应体系如下：0.5μL gDNA模板，0.5μL浓度为10μM的上游引物，0.5μL浓度为10μM的下游引物，2μL 10×buffer，0.4μL 10mMdNTP，0.4μL浓度为5U/μL份Taq DNA聚合酶，加双蒸水至20μL。
所述步骤3)、4)、5)中PCR扩增条件如下：95℃3min；95℃30s，55℃30s，72℃30s，35个循环；72℃，10min；4℃，5min。
所述步骤3)、4)、5)中电泳检测的方法如下：取5μL扩增产物溶解于1μL loadingbuffer中，在电压为150V，电流为120mA条件下，用2.2％的琼脂糖凝胶电泳60min用以检测扩增产物。
所使用的筛选分子标记的引物基因型为SSR引物igf1-11AB型，该SSR引物igf1-11的序列如下：
上游序列：5'CGCCGACCATAGAAACACTC 3'
下游序列：5'GGCATCTTCACGTTGTCAAAT 3'。
所使用的筛选分子标记的引物基因型为依次采用的SSR引物ghr2AA型、SSR引物igf2-4AA型、SSR引物igf1-10AB型、SSR引物igf1-11AB型，所述SSR引物序列如下：
引物ghr2：上游序列：5'CTTTCTTTGTTTCTGCTGGACT 3'
下游序列：5'CTGACTACTGGATGGCTCTAATG 3'
引物igf2-4：上游序列：5'GACTATCTGTGCTGTCTGTGGC 3'
下游序列：5'CTCTTGGGGTGCTATTACTTTACT 3'
引物igf1-10：上游序列：5'AGCCCTACCAAGGTCTGTCT 3'：
下游序列：5'CGTGGGATTTGTCCTTAGTTAC 3'
引物igf1-11：上游序列：5'CGCCGACCATAGAAACACTC 3'
下游序列：5'GGCATCTTCACGTTGTCAAAT 3'。
所使用的筛选分子标记的引物基因型为依次采用的SSR引物igf2-4AA型和SSR引物igf1-11AB型，所述SSR引物序列如下：
引物igf2-4：上游序列：5'GACTATCTGTGCTGTCTGTGGC 3'
下游序列：5'CTCTTGGGGTGCTATTACTTTACT 3'
引物igf1-11：上游序列：5'CGCCGACCATAGAAACACTC 3'
下游序列：5'GGCATCTTCACGTTGTCAAAT 3'。
所使用的筛选分子标记的引物基因型为依次采用的SSR引物ghr2AA型、SSR引物igf2-4AA型和SSR引物igf1-11AB型，所述SSR引物序列如下：
引物ghr2：上游序列：5'CTTTCTTTGTTTCTGCTGGACT 3'
下游序列：5'CTGACTACTGGATGGCTCTAATG 3'
引物igf2-4：上游序列：5'GACTATCTGTGCTGTCTGTGGC 3'
下游序列：5'CTCTTGGGGTGCTATTACTTTACT 3'
引物igf1-11：上游序列：5'CGCCGACCATAGAAACACTC 3'
下游序列：5'GGCATCTTCACGTTGTCAAAT 3'。
本发明所述的培育大黄鱼苗种的方法及其所使用的筛选分子标记并不只仅仅局限于上述实施例，凡是依据本发明原理的任何改进或替换，均应在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种培育大黄鱼苗种的方法，其特征在于：包括如下依次进行的步骤：
1)筛选大黄鱼生长轴相关基因及其连锁SSR：根据已报道的其他物种的生长相关基因和已公布的大黄鱼全基因遗传信息，在基因数据库中筛选大黄鱼生长轴相关基因，并获取基因主要调控区，筛选出携带有重复序列SSR标记的大黄鱼生长轴相关功能基因；
2)引物合成：对步骤1)筛选的大黄鱼生长轴相关基因的连锁SSR序列进行引物设计，并合成SSR引物；
3)SSR引物扩展多态性检测：用步骤2)所合成的SSR引物对随机挑选大黄鱼随机群体DNA样本进行PCR扩增及电泳检测，筛选得到扩展结果呈现多态性的SSR引物，其中每对SSR引物多态性中表现出单一条带的基因型命名为AA型，表现出多条带的基因型命名为AB型，每对SSR引物各有AA、AB两种基因型；
4)生长相关SSR标记筛选：用步骤3)中筛选出的SSR引物对随机挑选大黄鱼随机群体DNA样本进行PCR扩增及电泳检测，根据PCR扩增检测结果，统计不同引物基因型及基因型组合方式对应的大黄鱼样本数量及平均体重，筛选出以下几种体重比所有样本平均体重重且具有显著性差异P＜0.05的引物基因型或引物基因型组合：
①引物igf1-11 AB型；
②引物ghr2 AA型、引物igf2-4 AA型、引物igf1-10 AB型、引物igf1-11 AB型的引物基因型组合，以上引物基因型组合须依次使用以进行筛选；
③引物igf2-4 AA型和引物igf1-11 AB型的组合，以上引物基因型组合须依次使用以进行筛选；
④引物ghr2 AA型、引物igf2-4 AA型和引物igf1-11 AB型的组合，以上引物基因型组合须依次使用以进行筛选；
其中，引物序列如下：
引物igf1-11：上游序列：5'CGCCGACCATAGAAACACTC 3'
下游序列：5'GGCATCTTCACGTTGTCAAAT 3'
引物ghr2：上游序列：5'CTTTCTTTGTTTCTGCTGGACT 3'
下游序列：5'CTGACTACTGGATGGCTCTAATG 3'
引物igf2-4：上游序列：5'GACTATCTGTGCTGTCTGTGGC 3'
下游序列：5'CTCTTGGGGTGCTATTACTTTACT 3'
引物igf1-10：上游序列：5'AGCCCTACCAAGGTCTGTCT 3'
下游序列：5'CGTGGGATTTGTCCTTAGTTAC 3'
引物igf1-11：上游序列：5'CGCCGACCATAGAAACACTC 3'
下游序列：5'GGCATCTTCACGTTGTCAAAT 3'；
5)大黄鱼亲鱼的标记与筛选：用步骤4)所筛选出的SSR标记引物基因型或引物基因型组合对大黄鱼亲鱼进行分子标记检测，筛选出携带目的基因型或基因型组合的大黄鱼亲鱼，用以培育子代大黄鱼苗；
6)大黄鱼苗种培育：用步骤5)所筛选的大黄鱼亲鱼按照大黄鱼苗种培育技术规范进行子代大黄鱼苗的培育。
2.根据权利要求1所述的培育大黄鱼苗种的方法，其特征在于：所述步骤3)、4)、5)中PCR扩增反应体系如下：
0.5μL gDNA模板，0.5μL浓度为10μM的上游引物，0.5μL浓度为10μM的下游引物，2μL 10×buffer，0.4μL 10mMdNTP，0.4μL浓度为5U/μL份Taq DNA聚合酶，加双蒸水至20μL。
3.根据权利要求1所述的培育大黄鱼苗种的方法，其特征在于：所述步骤3)、4)、5)中PCR扩增条件如下：95℃3min；95℃30s，55℃30s，72℃30s，35个循环；72℃，10min；4℃，5min。
4.根据权利要求1所述的培育大黄鱼苗种的方法，其特征在于：所述步骤3)、4)、5)中电泳检测的方法如下：取5μL扩增产物溶解于1μL loading buffer中，在电压为150V，电流为120mA条件下，用2.2％的琼脂糖凝胶电泳60min用以检测扩增产物。
5.根据权利要求1所述的培育大黄鱼苗种的方法，其特征在于：所述步骤5)中将大黄鱼亲鱼以每6尾为1组分组暂养，以剪取大黄鱼亲鱼背鳍和尾鳍的不同位置对其进行标记区分。
6.根据权利要求1所述的培育大黄鱼苗种的方法，其特征在于：步骤6)大黄鱼苗种培育过程中每天都要换新水，当投放入养殖池中的大黄鱼亲鱼所产的受精卵孵化后生长鱼苗至22-28日龄时，每日根据养殖池换水情况向养殖池中添加经130-170目筛绢网过滤的新鲜小球藻水，使水体透明度维持在30-50cm；待鱼苗体色由透明开始转黑时，逐日向养殖池中泼洒底泥以替代小球藻水的使用并同时相应逐日减少新鲜小球藻水的添加量直至零，使调整过程中养殖池中的底泥的浓度以1ppm、2ppm、5ppm、10ppm、20ppm、30ppm的比例逐日变化，之后每日继续泼洒底泥将养殖池中的底泥浓度保持在30ppm，维持水体透明度30-40cm；之后待鱼苗转移至海区进行暂养时，使用活水船将其运至海上渔排，此时在活水船的船舱中继续泼洒底泥，以保持底泥在水中的比例为30ppm，所述底泥为桡足类养殖环境中的池塘底泥或海区底泥，该底泥经60-100目筛绢网过滤。
7.根据权利要求1-6任一项所述培育大黄鱼苗种的方法中所使用的筛选分子标记，其特征在于：所使用的筛选分子标记的引物基因型均为SSR引物igf1-11 AB型，该SSR引物igf1-11的序列如下：
上游序列：5'CGCCGACCATAGAAACACTC 3'
下游序列：5'GGCATCTTCACGTTGTCAAAT 3'。
8.根据权利要求1-6任一项所述培育大黄鱼苗种的方法中所使用的筛选分子标记，其特征在于：所使用的筛选分子标记的引物基因型为依次采用的SSR引物ghr2 AA型、SSR引物igf2-4 AA型、SSR引物igf1-10 AB型、SSR引物igf1-11 AB型，所述SSR引物序列如下：
引物ghr2：上游序列：5'CTTTCTTTGTTTCTGCTGGACT 3'
下游序列：5'CTGACTACTGGATGGCTCTAATG 3'
引物igf2-4：上游序列：5'GACTATCTGTGCTGTCTGTGGC 3'
下游序列：5'CTCTTGGGGTGCTATTACTTTACT 3'
引物igf1-10：上游序列：5'AGCCCTACCAAGGTCTGTCT 3'
下游序列：5'CGTGGGATTTGTCCTTAGTTAC 3'
引物igf1-11：上游序列：5'CGCCGACCATAGAAACACTC 3'
下游序列：5'GGCATCTTCACGTTGTCAAAT 3'。
9.根据权利要求1-6任一项所述培育大黄鱼苗种的方法中所使用的筛选分子标记，其特征在于：所使用的筛选分子标记的引物基因型为依次采用的SSR引物igf2-4 AA型和SSR引物igf1-11 AB型，所述SSR引物序列如下：
引物igf2-4：上游序列：5'GACTATCTGTGCTGTCTGTGGC 3'
下游序列：5'CTCTTGGGGTGCTATTACTTTACT 3'
引物igf1-11：上游序列：5'CGCCGACCATAGAAACACTC 3'
下游序列：5'GGCATCTTCACGTTGTCAAAT 3'。
10.根据权利要求1-6任一项所述培育大黄鱼苗种的方法中所使用的筛选分子标记，其特征在于：所使用的筛选分子标记的引物基因型为依次采用的SSR引物ghr2 AA型、SSR引物igf2-4 AA型和SSR引物igf1-11 AB型，所述SSR引物序列如下：
引物ghr2：上游序列：5'CTTTCTTTGTTTCTGCTGGACT 3'
下游序列：5'CTGACTACTGGATGGCTCTAATG 3'
引物igf2-4：上游序列：5'GACTATCTGTGCTGTCTGTGGC 3'
下游序列：5'CTCTTGGGGTGCTATTACTTTACT 3'
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