CN107354211A - 林麝四碱基微卫星遗传标记位点及其筛选方法 - Google Patents

林麝四碱基微卫星遗传标记位点及其筛选方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了林麝四碱基微卫星遗传标记位点及其筛选方法，具体涉及林麝基因组多态性四碱基微卫星遗传标记的筛选方法及17个中高度多态性四碱基微卫星标记特征。本发明使用生物信息学方法搜索林麝全基因组中四碱基微卫星序列，设计引物，经过引物PCR条件优化、多色荧光标记、基因分型扫描等步骤，筛选得到17个中高度多态性四碱基微卫星遗传标记位点。具有实验快捷，操作简便，成功率高，节约成本的优点。

Description

林麝四碱基微卫星遗传标记位点及其筛选方法
技术领域
本发明属于生物技术和遗传学领域，尤其涉及林麝四碱基微卫星遗传标记位点及其筛选方法。
背景技术
林麝(Moschus berezovskii)隶属于偶蹄目，麝科麝属。成体雄麝香腺囊分泌的麝香具有较高的经济价值和药用价值。在巨大经济利益驱动下，野外乱捕滥猎猖獗，加之其栖息地不断遭到破坏，林麝种群数量急剧下降，现存麝类已经濒危。为了有效保护林麝，海内外做出了不懈努力，在积极保护野生林麝的同时鼓励林麝的人工养殖，圈养麝类曾在20世纪80年代达到3000只之多。虽然林麝的人工饲养取得了可喜成果，但也一直存在着不可忽略的缺陷如近亲繁殖，野生与圈养种群之间缺乏基因交流，饲养管理粗放等。再者，对林麝的保护不只是局限在增长其种群数量，精确估计林麝野外种群数量，比较、评估野外与圈养种群遗传多样性，基因交流分析等工作的深入才是林麝得到有效的长期的保护的前提和基础，他们为及时评估反馈保护工作进度与成效，制定生态保护策略等提供系统的理论指导。因此，应用遗传标记对林麝进行以上生态保护研究已经刻不容缓。
微卫星标记具有多态性高，共显性遗传，在基因组中广泛分布，重复性和稳定性良好，分析方法简单等优点，是目前分子遗传标记的首选，被广泛用于个体识别，亲子鉴定，种群遗传结构分析，系统进化分析等不同水平的分子遗传学研究。因此，利用微卫星标记解决林麝保护方面的问题越来越被使用。传统微卫星标记的筛选方法是磁珠富集法，此方法耗时耗力耗钱。近年来，基因组学和生物信息学飞速发展，加上林麝全基因组序列的获得，使得我们可以利用微卫星搜索软件直接搜索和筛选符合条件的微卫星序列，这种方法不仅更加快捷，简单，高效，节约成本，还可以获得基因组不同位置的微卫星序列。近年来，陆续有林麝基因组微卫星位点被开发和公布。然而，已公布的微卫星标记数量不足50个，且目前所有已公布的林麝微卫星标记都是二碱基微卫星。前期研究表明与单碱基、二碱基相比，四碱基微卫星相对能产生更稳定，更精确的基因分型结果。因此，开发四碱基微卫星标记解决林麝保护方面的问题至关重要。
发明内容
为解决上述问题，本发明的目的是提供一种高效，便捷，经济地筛选林麝多态性四碱基微卫星位点的方法，本发明的另一个目的是提供林麝四碱基微卫星遗传标记位点。
在第一个方面，本发明提林麝基因组多态性四碱基微卫星遗传标记位点，应用生物信息学方法，使用MSDBv2.4软件搜索林麝全基因组四碱基微卫星序列，在此基础上筛选出适合设计引物的四碱基原始序列，利用软件Primer3对选定进行引物设计，然后进行引物条件优化，筛选出17个具有中高度多态性的四碱基微卫星位点。
在第二个方面，本发明提供林麝基因组多态性四碱基微卫星遗传标记位点引物对，所述引物对选自：SEQ ID NO:1+SEQ ID NO:2，SEQ ID NO:3+SEQ ID NO:4，SEQ ID NO:5+SEQ ID NO:6，SEQ ID NO:7+SEQ ID NO:8，SEQ ID NO:9+SEQ ID NO:10，SEQ ID NO:11+SEQ ID NO:12，SEQ ID NO:13+SEQ ID NO:14，SEQ ID NO:15+SEQ ID NO:16，SEQ ID NO:17+SEQ ID NO:18，EQ ID NO:19+SEQ ID NO:20，SEQ ID NO:21+SEQ ID NO:22，SEQ ID NO:23+SEQ ID NO:24，SEQ ID NO:25+SEQ ID NO:26，SEQ ID NO:27+SEQ ID NO:28，SEQ ID NO:29+SEQ ID NO:30，SEQ ID NO:31+SEQ ID NO:32，SEQ ID NO:33+SEQ ID NO:34。
第三个方面，本发明提供林麝基因组多态性四碱基微卫星遗传标记的筛选方法，其特征在于：该方法包括以下步骤：a.标本获取和DNA制备；b.使用MSDBv2.4软件，在默认搜索条件下搜索获得林麝基因组四碱基微卫星序列；c.筛选出适合设计引物的四碱基原始序列；d.利用软件Primer3对选定序列进行引物设计；e.微卫星引物条件筛选；f.引物荧光标记、基因分型及数据分析。
进一步的，所述的步骤c中，适合设计引物的四碱基原始序列筛选原则为：
1)微卫星重复拷贝数不小于7，且不大于20；
2)选取重复单元构成和分布是完美型的四碱基微卫星序列；
3)选取侧翼序列完整的微卫星序列。
进一步的，所述的步骤d中，引物设计原则如下：
1)引物长度在18bp-23bp之间，最佳引物长度为20bp；
2)退火温度范围50℃-60℃，最佳退火温度为55℃；
3)GC含量范围在40％-60％之间，最佳GC含量为50％。
进一步的，所述的步骤e中，PCR反应体系，PCR程序设置具体操作步骤为：
优化微卫星引物时采用的PCR体系：
25μL反应体系：
PCR扩增反应程序步骤：95℃预变性5分钟；然后95℃变性30秒；55℃-61℃退火50秒；72℃延伸15-30秒，以上进行35个循环，再72℃延伸10分钟，最后4℃保存；
为了提高微卫星引物的筛选效率，筛选实验通过三次PCR扩增程序来进行，第一次PCR，使用2个不同的DNA模板在上述PCR程序和体系下通过55℃的退火温度，72℃延伸15-30秒进行扩增，PCR扩增产物经浓度为2.0％的琼脂糖电泳、凝胶成像系统分析，根据凝胶成像的检测的三种结果：(1)有目的扩增产物且没有非特异性扩增的引物；(2)有目的扩增产物但有非特异性扩增的引物；(3)无扩增产物条带的引物；对于产生(1)结果的引物，直接进行第三步PCR实验，对于产生(2)和(3)结果的引物继续优化，进行第二次PCR；
第二次PCR，以第一次PCR中两个DNA模板，PCR条件调整为Tm＝53℃-63℃梯度温度，每隔两摄氏度设置一个梯度，其中55℃不需要做，再根据凝胶成像的检测的结果，确定扩增出的有目的扩增产物且无杂带的引物，留做第三步PCR，对于继续没有扩增结果的引物以及有目的扩增产物但有杂带的引物，舍弃；
第三次PCR，将上述两次PCR结果中所有有目的扩增产物且没有杂带的引物，在其第一步或第二步PCR扩增时的条件下，对10个不同DNA模板进行PCR扩增，根据凝胶成像的检测的两种结果：(1)10个模板DNA扩增后都有目的扩增产物且无杂带；(2)10个模板DNA并不都能有目的扩增产物且无杂带。产生(1)结果的引物将其确定为筛选优化好条件的引物，其Tm温度与延伸时长为此PCR条件下的温度与时长，留备用进一步实验，产生(2)结果的引物舍弃。
本发明的优点
1.本发明使用生物信息学方法搜索林麝全基因组中四碱基微卫星序列，设计引物，经过引物PCR条件优化、多色荧光标记、基因分型扫描等步骤，筛选得到17个多态性四碱基微卫星遗传标记位点。
2.本发明具有实验快捷，操作简便，成功率高，节约成本的优点。
3.本发明降低四碱基多态性微卫星位点的开发成本，提高四碱基多态性微卫星位点的开发效率，为后续研究如种群遗传多样性、性别鉴定、人工繁殖策略制定等奠定基础。
4.与单碱基、二碱基相比，本发明所述四碱基微卫星相对能产生更稳定，更精确的基因分型结果。
附图说明
图1：提取的林麝DNA样品琼脂糖凝胶电泳图
图2：LS-14的PCR条件优化琼脂糖凝胶电泳图
具体实施方式
1材料和方法
1.1实验材料
1.11标本获取和DNA制备
本章中用于微卫星标记筛选的26个圈养林麝血液样本来自四川省米亚罗养殖场，-20℃保存。使用试剂盒提取林麝血液样本中的基因组DNA，-20℃保存。
1.12林麝四碱基微卫星序列来源
微卫星引物设计的原始序列来源于对林麝基因组的浅测序序列。
1.2主要试剂和仪器设备
1.21实验主要试剂
DNA提取试剂盒(天根生物科技公司，北京)，Taq酶、核酸分子量标准物DL2000、琼脂糖和dNTPs均购于擎科生物科技有限公司。
1.22实验主要仪器
(1)恒温水箱，DKB-8A，上海精宏实验设备有限公司，中国；
(2)离心机，Centurion6000Series，Series LtD.UK；
(3)PCR扩增仪(PCR system 9700)，Appliedbiosystem LtD.USA；
(4)电子天平，Denver M-120，Denver Instrument CO.，Denmark；
(5)电泳仪Bio-Rad，USA；
(6)凝胶成像系统，Bio-Rad，Gel Doc 2000,USA；
1.3实验方法
1.31统计方法和引物设计
筛选适合设计引物的四碱基原始序列，选取条件如下:
(1)微卫星重复次数不小于7，且不大于20；
(2)选取重复单元构成和分布是完美型的四碱基微卫星序列；
(3)选取侧翼序列完整的微卫星序列。
适宜序列选定之后，利用软件Primer3(Rozen et al，2000)对选定序列进行引物设计，引物设计原则如下：
(1)引物长度在18bp-23bp之间，最佳引物长度为20bp；
(2)退火温度范围50℃-60℃，最佳退火温度为55℃；
(3)GC含量范围在40％-60％之间，最佳GC含量为50％。
设计的引物送到成都擎科梓熙生物技术有限公司合成，合成的引物浓度稀释至25μmol使用。
1.32微卫星引物筛选
25μL反应体系：
PCR扩增步骤：95℃预变性5分钟；然后95℃变性30秒；55℃-61℃退火50秒；72℃延伸15-30秒(根据产物长度，每分钟/1000bp计算扩增时间)，循环35次，再72℃延伸10分钟，最后4℃保存。
筛选实验按三步PCR扩增步骤进行。
第一次PCR，使用2个不同的DNA模板在上述PCR程序和体系下通过55℃的退火温度，72℃延伸15-30秒进行扩增，因为所有引物设计、合成时的参考Tm退火温度基本为55℃。PCR扩增产物经凝胶成像系统的检测后有三种结果：(1)有目的扩增产物且无杂带的引物；(2)有目的扩增产物但有杂带的引物；(3)无扩增产物条带的引物。对于产生(1)结果的引物，直接进行第三步PCR实验。对于产生(2)和(3)结果的引物继续优化，进行第二次PCR。
第二次PCR，以第一次PCR中两个DNA模板，PCR条件调整为Tm＝53℃—63℃梯度温度，每隔两摄氏度设置一个梯度，其中55℃不需要做。再根据凝胶成像的检测的结果，确定扩增出的有目的扩增产物且无杂带的引物，留做第三步PCR。对于继续没有扩增结果的引物以及有目的扩增产物但有杂带的引物，舍弃；
第三次PCR，将上述两次PCR结果成功筛选的引物，对10个不同DNA模板进行扩增。照胶结果：(1)10个模板DNA都有目的条带且无杂带；(2)10个模板DNA并不都能有目的条带且无杂带。产生(1)结果的引物将其确定为筛选优化好条件的引物，其Tm温度与延伸时长为此PCR条件下的温度与时长，留备用进一步实验。产生(2)结果的引物舍弃。
1.33引物荧光标记、基因分型及数据分析
使用已筛选好PCR扩增条件的17对四碱基微卫星标记位点，将其上游引物重新合成，并在其5’端进行荧光标记(FAM或HEX)。根据筛选时每对引物各自所优化好的PCR扩增条件，用所有荧光标记的上游引物结合原有的下游引物对全部26个林麝DNA样品进行PCR扩增。PCR扩增产物经浓度为2.0％的琼脂糖凝胶电泳检测，将检测合格的产物按FAM标记与HEX标记交叉混合的原则混合样品，避光保存，送样到成都擎科梓熙生物技术有限公司，使用ABI PRISM3730毛细管电泳法进行基因分型扫描，扫描结果使用Genescan和Genotyper软件分析。
等位基因数、观察杂合度、期望杂合度和多态信息含量使用Cervus 3.0软件(Marshall et al.，1998)计算；Hardy-Weinberg平衡检验使用Genepop 3.4软件(Raymondet al.，1995)进行分析。
2结果
2.1林麝DNA质量检测及微卫星引物筛选检测
本研究首先对26个林麝DNA样品进行琼脂糖凝胶电泳检测其质量和完整性，结果如图1所示，图中的DNA marker为marker 2000，图片DNA条带从上到下分别为2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp及100bp,结果表明样品DNA质量优良，可以用于进一步实验。微卫星引物的筛选及PCR条件的优化结果如图2所示，图2的DNA marker为marker 5000，图片DNA条带从上到下分别为5000bp，3000bp，2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp及100bp，实验表明在57℃时，LS-14的PCR优化结果优良，可以进一步实验。荧光标记引物多态性扩增26个个体，均能扩增出来，由于实验结果众多，仅列出部分实验结果。
2.2微卫星标记的筛选结果
本研究筛选出符合实验目标的微卫星标记共17对。对筛选出的17对引物进行双色荧光标记(FAM或HEX)，利用荧光标记引物扩增所有26个林麝DNA样品，然后对扩增产物进行基因分型。根据基因分型结果，17个位点的条带全部具多态性，具有多态性的微卫星标记的筛选信息见表1，SEQ ID NO:1+SEQ ID NO:2对应表中的LS-2-1，SEQ ID NO:3+SEQ ID NO:4对应表中的LS-6-1,以此类推至SEQ ID NO:33+SEQ ID NO:34对应表中的LS-56-1。
表1具有多态性的微卫星标记筛选信息
2.3微卫星标记的多态性初步评估
筛选出的17个具有多态性的微卫星位点通过在26个林麝样本中进行多态性参数评估，其多态性信息如表2所示。衡量微卫星位点变异程度的重要指标是多态信息含量(PIC)：(1)PIC>0.5，该位点为高度多态性，具有大量的可提供的信息性；(2)0.5>PIC>0.25，位点为中度多态性，能够提供较为合理的信息；(4)PIC<0.25，位点为低多态性，标记可提供的信息量较差。
本研究筛选的17个多态性位点的等位基因数的范围是3-7，总数为72个，平均值是4.24。其中等位基因数大于等于4的微卫星标记为11个，占多态性微卫星总数的64.71％。期望杂合度(He)的变异范围是0.278～0.776；观察杂合度(Ho)的变异范围是0.192～0.962。多态信息含量(PIC)的变异范围是0.255～0.726，平均值是0.490。17个多态性位点在26个林麝样品中，有9对引物的基因分型结果表现出高度多态性，占筛选引物的52.94％。
表2具有多态性的微卫星标记的多态性参数
2.4Hardy-Weinberg平衡检验(HW)和Linkage disequilibrium位点连锁不平衡检验(LD)
根据表2所示，Hardy-Weinberg平衡中的P-value值，17个多态性微卫星标记中，15个标记符合HW平衡(P>0.05)，LS-2-1偏离HW平衡(0.01<P<0.05)，LS-55-1极显著偏离HW平衡(P<0.01)。
LD分析表明：LS-6-和LS-14-2，LS-14-2和LS-18-1，LS-6-1和LS-27-1，LS-14-2和LS-27-1，(P<0.01)之间存在连锁不平衡，其余位点之间都不存在连锁不平衡。
SEQUENCE LISTING
<110> 四川好医生攀西药业有限责任公司
<120> 林麝四碱基微卫星遗传标记位点及其筛选方法
<130> 2017
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Claims (6)

1.林麝基因组多态性四碱基微卫星遗传标记位点，其特征在于：应用生物信息学方法，使用MSDBv2.4软件搜索林麝全基因组四碱基微卫星序列，在此基础上筛选出适合设计引物的四碱基原始序列，利用软件Primer3对选定进行引物设计，然后进行引物条件优化，筛选出17个具有中高度多态性的四碱基微卫星位点。
2.林麝基因组多态性四碱基微卫星遗传标记位点引物对，所述引物对选自：SEQ IDNO:1+SEQ ID NO:2，SEQ ID NO:3+SEQ ID NO:4，SEQ ID NO:5+SEQ ID NO:6，SEQ ID NO:7+SEQ ID NO:8，SEQ ID NO:9+SEQ ID NO:10，SEQ ID NO:11+SEQ ID NO:12，SEQ ID NO:13+SEQ ID NO:14，SEQ ID NO:15+SEQ ID NO:16，SEQ ID NO:17+SEQ ID NO:18，EQ ID NO:19+SEQ ID NO:20，SEQ ID NO:21+SEQ ID NO:22，SEQ ID NO:23+SEQ ID NO:24，SEQ ID NO:25+SEQ ID NO:26，SEQ ID NO:27+SEQ ID NO:28，SEQ ID NO:29+SEQ ID NO:30，SEQ ID NO:31+SEQ ID NO:32，SEQ ID NO:33+SEQ ID NO:34。
3.根据权利要求1所述的林麝基因组多态性四碱基微卫星遗传标记的筛选方法，其特征在于：该方法包括以下步骤：
a.标本获取和DNA制备；
b.使用MSDBv2.4软件，在默认搜索条件下搜索获得林麝基因组四碱基微卫星序列；
c.筛选出适合设计引物的四碱基原始序列；
d.利用软件Primer3对选定序列进行引物设计；
e.微卫星引物条件筛选；
f.引物荧光标记、基因分型及数据分析。
4.根据权利要求3所述的林麝基因组多态性四碱基微卫星遗传标记的筛选方法，其特征在于：所述的步骤c中，适合设计引物的四碱基原始序列筛选原则为：
1)微卫星重复拷贝数不小于7，且不大于20；
2)选取重复单元构成和分布是完美型的四碱基微卫星序列；
3)选取侧翼序列完整的微卫星序列。
5.根据权利要求3所述的林麝基因组多态性四碱基微卫星遗传标记的筛选方法，其特征在于：所述的步骤d中，引物设计原则如下：
1)引物长度在18bp-23bp之间，最佳引物长度为20bp；
2)退火温度范围50℃-60℃，最佳退火温度为55℃；
3)GC含量范围在40％-60％之间，最佳GC含量为50％。
6.根据权利要求3所述的林麝基因组多态性四碱基微卫星遗传标记的筛选方法，其特征在于：所述的步骤e中，PCR反应体系，PCR程序设置具体操作步骤为：
优化微卫星引物时采用的PCR体系：
25μL反应体系：
PCR扩增反应程序步骤：95℃预变性5分钟；然后95℃变性30秒；55℃-61℃退火50秒；72℃延伸15-30秒，以上进行35个循环，再72℃延伸10分钟，最后4℃保存；
为了提高微卫星引物的筛选效率，筛选实验通过三次PCR扩增程序来进行，第一次PCR，使用2个不同的DNA模板在上述PCR程序和体系下通过55℃的退火温度，72℃延伸15-30秒进行扩增，PCR扩增产物经浓度为2.0％的琼脂糖电泳、凝胶成像系统分析，根据凝胶成像的检测的三种结果：(1)有目的扩增产物且没有非特异性扩增的引物；(2)有目的扩增产物但有非特异性扩增的引物；(3)无扩增产物条带的引物；对于产生(1)结果的引物，直接进行第三步PCR实验，对于产生(2)和(3)结果的引物继续优化，进行第二次PCR；
第二次PCR，以第一次PCR中两个DNA模板，PCR条件调整为Tm＝53℃-63℃梯度温度，每隔两摄氏度设置一个梯度，其中55℃不需要做，再根据凝胶成像的检测的结果，确定扩增出的有目的扩增产物且无杂带的引物，留做第三步PCR，对于继续没有扩增结果的引物以及有目的扩增产物但有杂带的引物，舍弃；
第三次PCR，将上述两次PCR结果中所有有目的扩增产物且没有杂带的引物，在其第一步或第二步PCR扩增时的条件下，对10个不同DNA模板进行PCR扩增，根据凝胶成像的检测的两种结果：(1)10个模板DNA扩增后都有目的扩增产物且无杂带；(2)10个模板DNA并不都能有目的扩增产物且无杂带。产生(1)结果的引物将其确定为筛选优化好条件的引物，其Tm温度与延伸时长为此PCR条件下的温度与时长，留备用进一步实验，产生(2)结果的引物舍弃。
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