CN114317764A - 林麝微卫星位点组合、引物组合、试剂盒及亲权鉴定应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及林麝微卫星标记技术，具体涉及一种林麝微卫星位点组合、引物组合、试剂盒及亲权鉴定应用，其目的是解决现有采用微卫星标记位点技术进行林麝基因鉴定中存在鉴定结果不够准确的技术问题，提供一种林麝微卫星位点组合、引物组合、试剂盒及亲权鉴定应用，通过采用四碱基重复的合适的位点组合，实现了基于基因鉴定的林麝准确亲权鉴定。本发明采用筛选出的最能反映林麝基因特点的11个微卫星位点，并给出了相应的引物组合、试剂盒，利用引物组合、试剂盒，实现了林麝的高精度亲权鉴定，精确度达到99.99％，具有快速、准确、简便和实现成本较低的优点。

Description

林麝微卫星位点组合、引物组合、试剂盒及亲权鉴定应用

技术领域

本发明涉及林麝微卫星标记技术，具体涉及一种林麝微卫星位点组合、引物组合、试剂盒及亲权鉴定应用。

背景技术

林麝(Moschus berezovskii)隶属偶蹄目(Artiodactyla)、反刍亚目(Ruminantia)、麝属(Moschus)、麝种(Moschus berezovskii)，是麝属中体型最小的动物，因成年雄性林麝分泌珍贵麝香而闻名。由于麝香具有巨大的经济价值，导致林麝被大规模偷盗捕杀，林麝种群数量锐减，2002年，林麝被列为国家一级重点保护动物，在2008年的世界自然保护联盟(IUCN)濒危物种红色名录中，林麝被评为濒危物种。自1958年开始驯养林麝，经过60余年的发展，林麝驯养已成为具有一定规模的产业，实现了圈养及繁殖，并于驯养初期实现了可持续的人工活体取香，从而使林麝驯养成为麝香可持续供应的合法基础，也是林麝物种保护的重要途径。

人工养殖林麝虽为林麝资源的有效保护手段之一，依然存在很多问题。比如，谱系不清，近交繁殖导致的种群遗传多样性降低、种群退化、体质下降、疾病频发等问题日益凸显。因此，准确的谱系管理是科学繁育工作的基础。例如，对种群退化问题的解决，首选要考虑避免近交衰退，这就需要准确判定个体间的遗传关系远近。对于有准确谱系记录的麝场，可以做到本场内有效的繁育调配控制，但是对于麝场间林麝个体的繁育调配，就需要更高一级、更准确的谱系管理。如果这个高级谱系数据管理缺失或者数据不准确，就需要进行遗传鉴定，来判断林麝个体之间的遗传关系，避免近亲交配发生。

微卫星DNA也称为短串联序列重复(short tandem repeat，STR)或者简单序列重复(simple sequence repeat，SSR)，是一类简单的以核苷酸为基本单位的串联重复序列，微卫星DNA由核心序列和两侧的保守序列组成，其中侧翼序列将微卫星DNA特异的定位于染色体的某一区域，而核心序列的重复数则形成了微卫星DNA的多态性。通常核心序列重复单元长2-6碱基，如(CA)n、(GAG)n、(GACA)n，n为重复次数，为10-60次，由于重复次数不同使其呈现丰富的长度多态性。微卫星DNA多位于编码区附近，也可位于基因内的间隔区、外显子、内含子和调控区域，且分布均匀。微卫星在基因组中数目巨大，据估计，真核基因组中平均每6kb就存在一个微卫星序列。微卫星位点的多态性越高，标记位点数量越多，亲权鉴定的准确性就越高。微卫星标记符合孟德尔遗传特征，世代传承，变异频率较慢，但是每个个体又有差异，因此是一种可靠的遗传标记，现生产实践发现林麝的空香、白香、膏状香频频出现，谱系混乱、近交严重等现象。鉴于迄今仍未有针对林麝特定种群的亲权鉴定的试剂盒。为了实现科学有效地管理，为麝场选种育种提供指导，为种质资源的调配和遗传谱系管理提供准确可靠技术支持，为防止麝场圈养林麝群体近亲交配提供理论依据，必须尽快开发一种方法和监测试剂盒，来对林麝种群进行个体遗传标记。

综上，目前亟需一种能够对林麝进行准确亲权鉴定的微卫星位点组合、引物组合、试剂盒，以便于林麝的遗传管理等方面的应用。

发明内容

本发明的目的是解决现有采用微卫星位点标记技术进行林麝亲权鉴定中存在鉴定结果不够准确的技术问题，提供一种林麝微卫星位点组合、引物组合、试剂盒及亲权鉴定应用，通过采用四碱基重复的合适的位点组合，实现了基于基因鉴定的林麝准确亲权鉴定。

为解决上述技术问题，本发明提供的技术解决方案如下：

一种林麝微卫星位点组合，其特殊之处在于：

包括11个微卫星位点，依次为基因序列表的SEQ ID NO1～SEQ ID NO11核苷酸序列。

本发明还提供一种林麝微卫星引物组合，其特殊之处在于：

包括上述林麝微卫星位点组合中11个微卫星位点分别对应的11个引物对，每个引物对包括1个上游引物和1个下游引物。

进一步地，微卫星位点SEQ ID NO1的上游引物核苷酸序列F为tgttcctgggattcttgaag，下游引物核苷酸序列R为cataattgccaaagtgctgt；

微卫星位点SEQ ID NO2的上游引物核苷酸序列F为ttgatccagttcagcaaagt，下游引物核苷酸序列R为tttgcaacttcaatccactg；

微卫星位点SEQ ID NO3的上游引物核苷酸序列F为gccaccagatacacaggttaaaa，下游引物核苷酸序列R为aactgactgaaagaccaggaaca；

微卫星位点SEQ ID NO4的上游引物核苷酸序列F为ccggcctaaagtttaaggtgtat，下游引物核苷酸序列R为atggctataggtggcagaagttt；

微卫星位点SEQ ID NO5的上游引物核苷酸序列F为acacaaacacagggaattctgtt，下游引物核苷酸序列R为agacaagtcatgctgccatttat；

微卫星位点SEQ ID NO6的上游引物核苷酸序列F为aggggtgaaaattagttgcctat，下游引物核苷酸序列为R为tatttcaaaggctcaatctgctc；

微卫星位点SEQ ID NO7的上游引物核苷酸序列F为gaactgaaatcccacaggtcac，下游引物核苷酸序列R为ggcatgttgattttaccaatctg；

微卫星位点SEQ ID NO8的上游引物核苷酸序列F为agttgcagctaccagaattcatc，下游引物核苷酸序列R为gattgaagccagattctcctctt；

微卫星位点SEQ ID NO9的上游引物核苷酸序列F为attcctgtatgtcctccatccat，下游引物核苷酸序列R为agtgtctaggacagtgcctggta；

微卫星位点SEQ ID NO10的上游引物核苷酸序列F为gctgggtttgatccctactct，下游引物核苷酸序列R为gaggagagctgaccattcttttt；

微卫星位点SEQ ID NO11的上游引物核苷酸序列F为cgtcttaggaagatcaccatgaa，下游引物核苷酸序列R为ggtttcttctctgttccctcatt。

本发明还提供一种林麝微卫星试剂盒，其特殊之处在于：

包括上述林麝微卫星引物组合。

本发明还提供一种林麝微卫星引物组合的应用，其特殊之处在于：

将上述林麝微卫星引物组合，应用于林麝亲权鉴定。

同时，本发明还提供一种林麝微卫星试剂盒的应用，其特殊之处在于：

将上述林麝微卫星试剂盒，应用于林麝亲权鉴定。

同时，本发明还提供一种上述林麝微卫星引物组合在制备林麝亲权鉴定试剂中的应用。

本发明相比现有技术具有的有益效果如下：

本发明提供的林麝微卫星位点组合、引物组合、试剂盒及亲权鉴定应用，通过长期、大量的试验，筛选出了最能反映林麝基因特点的11个微卫星位点，并给出了相应的引物组合、试剂盒，利用引物组合、试剂盒，通过对林麝的DNA进行PCR扩增，实现了林麝的高精度亲权鉴定，精确度达到99.99％，具有快速、准确、简便和实现成本较低的优点。

附图说明

图1为实施例中林麝DNA琼脂糖凝胶电泳图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步地说明。

本发明提供了一种林麝微卫星位点组合，包括11个微卫星位点，依次为基因序列表的SEQ ID NO1～SEQ ID NO11核苷酸序列；还提供了一种林麝微卫星引物组合，包括林麝微卫星位点组合中11个微卫星位点分别对应的11个引物对，每个引物对包括1个上游引物和1个下游引物；还提供了一种林麝微卫星试剂盒，包括上述林麝微卫星引物组合，以及上述林麝微卫星引物组合，或林麝微卫星试剂盒的亲权鉴定应用；还提供一种上述林麝微卫星引物组合在制备林麝亲权鉴定试剂中的应用。

试剂盒是由SEQ ID NO1～SEQ ID NO11微卫星位点对应的引物组合而成，该试剂盒基于基因型鉴定的林麝亲权鉴定精确度达到99.99％。

林麝亲权鉴定包括以下步骤：

1)DNA模板提取

收集样本，从林麝毛发样本中提取林麝DNA，作为模板；

2)PCR扩增

利用上述林麝微卫星引物组合，或者上述林麝微卫星试剂盒，和步骤1)所得DNA模板，进行PCR扩增反应，得到扩增产物；

3)扩增产物检测

对扩增产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，得到条带单一、清晰且长度在相应碱基范围之内的电泳条带；

4)将扩增产物送至上海生工公司，进行荧光毛细管电泳检测；

5)利用Gene Mapper ID V3.2软件，对荧光毛细管电泳检测结果进行基因分型，然后利用Cervus 3.0软件，对基因分型结果进行分析。

具体过程如下：

1.实验部分

1.1试剂与材料

毛样DNA微量提取试剂盒，10000×Gene Green均购自天根公司(Tian Gen公司)，2×SanTaq PCR Mix，Agarose(琼脂糖)，灭菌双蒸水(ddH₂O)，DL2000 DNA Marker，6×DNALoading Buffer均购自上海生工公司。11对荧光引物(即本发明中的11个引物对，具体信息见表1的林麝微卫星引物序列(即林麝微卫星引物核苷酸序列))由上海生工公司合成。二硫苏糖醇(DTT)及其他试剂，均为分析纯级别。所有实验用水均为经Milli-Q纯水系统(美国Millipore公司)处理的超纯水。

表1：林麝微卫星引物序列

1.2实验仪器

电热鼓风干燥箱：上海一恒科学仪器有限公司；立式高压灭菌器LDZX-50KBS：上海申安医疗器械厂；超速冷冻离心机Centrifuge 5810R：德国Eppendorf公司；PCR仪Veriti96-well：美国Applied Biosystems公司；离心机Centrifuge 5425：德国Eppendorf公司；超净工作台：美国Thermo Scientific公司；GIS凝胶成像处理系统GBOX F3：基因有限公司。恒温金属浴CHB-100：杭州博日科技有限公司；电泳仪DYY-6C型：北京市六一仪器厂；电泳装置DYCZ-24A：北京六一生物科技有限公司；涡旋振荡器QL-901：海门市其林贝尔仪器制造有限公司；核酸蛋白仪Nanodrop分光光度计(即超微分光光度计)：美国丹诺尔(DeNovix)公司。

1.3研究对象和毛样采集

在陕西省圈养林麝公司及麝厂采集林麝毛发样品，将毛干端固定在不干胶标签上，使毛囊端游离，最后将毛发样品封入信封袋在室温下避光保存，并利用变色硅胶干燥。

1.4遗传样本DNA的提取及检测

对所采集的林麝毛发样本进行DNA提取。用Tian Gen公司的毛样DNA微量提取试剂盒(TIANamp Micro DNA Kit，China)提取毛发样品DNA，将成功提取的DNA模板分装，置于-80℃环境保存。

所得DNA分别用核酸蛋白仪Nanodrop分光光度计和1.5％琼脂糖凝胶电泳检测浓度和质量。相同条件下的琼脂糖凝胶电泳结果中，DNA条带距离加样点越近，说明其片段越大；DNA条带亮度越高，说明其浓度越大。DNA提取工作结束后，为了检验从林麝提取的DNA质量，取2μL DNA模板，0.4μL6×DNALoading Buffer混合后，将琼脂糖凝胶用天根Gene Green染色，于电压160V条件下在浓度为1.5％的琼脂糖凝胶中电泳20min，电泳完毕后使用紫外凝胶成像仪拍照，观察PCR电泳效果。如图1所示，图中1-14代表14个林麝DNA样本的DNA模板，M为DL 2000DNA marker(用来DNA长度的标记)。

1.5 PCR反应及PCR扩增产物检测

利用11个微卫星位点分别对应的引物对，与林麝毛发样品的DNA模板进行PCR反应，PCR反应体系总体积为25μL，DNA 模板2μL、上游引物1μL(10μmol/L)、下游引物1μL(10μmol/L)、12μL PCR Mix(即SanTaq PCR Mix)、6μL dd H₂O。配制好后加入少量液体石蜡液防止液体挥发。PCR反应程序是95℃预变性5min；95℃变性45s，50-61℃退火45s，72℃延伸1min30s；30个循环(即包括变性、退火和延伸在内的三个步骤做30个循环)，最后72℃再延伸10min；4℃保存。

将11个PCR扩增产物经1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。具体操作：用移液枪取2μL PCR扩增产物加入样孔内。取2.5μL2000bp的DNA Marker加入样孔内。点样结束后，将电泳槽盖盖严，接通电源，电压160V，电泳20min。电泳结果放在凝胶成像系统中紫外透射观察，样本的扩增产物对应的电泳条带清晰且条带在预定范围内，将扩增产物送至上海生工进行荧光毛细管电泳检测。

1.6数据分析

(1)微卫星分型

使用Gene Mapper ID V3.2软件，自动判读毛细管电泳结果，获取等位基因长度，得到的等位基因长度为实数，由于选取的均为四碱基重复的位点，对大部分的情况，可以以4为基进行舍入，而舍入前后相差超过1bp的等位基因，则需要人工检查峰图，修改错误的判读。为了防止基因分型错误，针对假纯合子和假等位基因，需对杂合子进行至少3次独立重复试验，对纯合子至少进行2次独立重复试验。

(2)亲权鉴定数据分析

亲权鉴定又称亲子鉴定，亲子鉴定的基本原理是应用遗传规律即子代的遗传标记一定是一半来自父方，一半来自母方。亲子鉴定以排除法为基础。经典的亲子鉴定方法首先参照母子的基因型，按孟德尔遗传定律逐个检查各个可疑父亲的基因型。只要有一个基因座的基因型不合、该可疑父亲就被排除。最后所剩的惟一可疑父亲就被判为真正的父亲。因此，在Cervus软件中计算非父排除率，非父排除率即能够将没有亲子关系个体排除掉，留下真正的父亲。它是衡量遗传标记鉴定“能力”大小的最常用的重要指标，反映了该遗传标记在亲子鉴定中的应用价值。

使用Cervus 3.0中的parentage analysis程序对林麝进行亲子鉴定，亲子鉴定是在以下条件下进行：10000个模拟周期，100％位点输入，1％误差率和80％、95％的置信水平。该程序计算每个候选父母相对于每个后代的亲生父母的LOD值。Delta值对应于最可能候选父母和第二候选父母LOD值的差异。LOD值越大，真实父权的可能性越大。

2.结果部分

该试剂盒开发使用软件Cervus 3.0和SHEsis计算每个位点的哈迪-温伯格平衡、连锁不平衡检验，以保证每个位点在亲权鉴定中都具有作用。通过Gene Mapper ID V3.2软件获取基因型数据，使用Cervus 3.0中的Identity analysis程序对个体进行亲权鉴定。本试剂盒使用11个微卫星位点对陕西省林麝进行亲权鉴定，在给定候选父母双方基因型的情况下，11个位点的结合非父排除概率为99.99％。

使用本发明的微卫星引物组合或试剂盒时，每次测定收集相同环境下的陕西省圈养林麝的样本，尽可能排除其他因素，将测定的样本重复三次，以确定基因型的准确性。

最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制，对于本领域的普通专业技术人员来说，可以对前述实施例所记载的具体技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换，而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所保护技术方案的范围。

Claims (7)

1.一种林麝微卫星位点组合，其特征在于：

包括11个微卫星位点，依次为基因序列表的SEQ ID NO1～SEQ ID NO11核苷酸序列。

2.一种林麝微卫星引物组合，其特征在于：

包括权利要求1所述林麝微卫星位点组合中11个微卫星位点分别对应的11个引物对，每个引物对包括1个上游引物和1个下游引物。

3.根据权利要求2所述的林麝微卫星引物组合，其特征在于：

微卫星位点SEQ ID NO1的上游引物核苷酸序列F为tgttcctgggattcttgaag，下游引物核苷酸序列R为cataattgccaaagtgctgt；

微卫星位点SEQ ID NO2的上游引物核苷酸序列F为ttgatccagttcagcaaagt，下游引物核苷酸序列R为tttgcaacttcaatccactg；

微卫星位点SEQ ID NO3的上游引物核苷酸序列F为gccaccagatacacaggttaaaa，下游引物核苷酸序列R为aactgactgaaagaccaggaaca；

微卫星位点SEQ ID NO4的上游引物核苷酸序列F为ccggcctaaagtttaaggtgtat，下游引物核苷酸序列R为atggctataggtggcagaagttt；

微卫星位点SEQ ID NO5的上游引物核苷酸序列F为acacaaacacagggaattctgtt，下游引物核苷酸序列R为agacaagtcatgctgccatttat；

微卫星位点SEQ ID NO6的上游引物核苷酸序列F为aggggtgaaaattagttgcctat，下游引物核苷酸序列为R为tatttcaaaggctcaatctgctc；

微卫星位点SEQ ID NO7的上游引物核苷酸序列F为gaactgaaatcccacaggtcac，下游引物核苷酸序列R为ggcatgttgattttaccaatctg；

微卫星位点SEQ ID NO8的上游引物核苷酸序列F为agttgcagctaccagaattcatc，下游引物核苷酸序列R为gattgaagccagattctcctctt；

微卫星位点SEQ ID NO9的上游引物核苷酸序列F为attcctgtatgtcctccatccat，下游引物核苷酸序列R为agtgtctaggacagtgcctggta；

微卫星位点SEQ ID NO10的上游引物核苷酸序列F为gctgggtttgatccctactct，下游引物核苷酸序列R为gaggagagctgaccattcttttt；

微卫星位点SEQ ID NO11的上游引物核苷酸序列F为cgtcttaggaagatcaccatgaa，下游引物核苷酸序列R为ggtttcttctctgttccctcatt。

4.一种林麝微卫星试剂盒，其特征在于：

包括权利要求2或3所述林麝微卫星引物组合。

5.一种林麝微卫星引物组合的应用，其特征在于：

将权利要求2或3所述林麝微卫星引物组合，应用于林麝亲权鉴定。

6.一种林麝微卫星试剂盒的应用，其特征在于：

将权利要求4所述林麝微卫星试剂盒，应用于林麝亲权鉴定。

7.一种权利要求2或3所述的林麝微卫星引物组合在制备林麝亲权鉴定试剂中的应用。

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