CN115786473B

CN115786473B - 基于枣基因组多态性ssr位点的筛选方法及条形码的生成

Info

Publication number: CN115786473B
Application number: CN202211108149.2A
Authority: CN
Inventors: 杨猛; 刘孟军; 李斌; 韩露; 张书峰
Original assignee: Hebei Agricultural University
Current assignee: Hebei Agricultural University
Priority date: 2022-09-13
Filing date: 2022-09-13
Publication date: 2023-07-04
Anticipated expiration: 2042-09-13
Also published as: CN115786473A

Abstract

本发明公开了一种基于枣基因组多态性SSR位点的筛选在条形码中的应用，其步骤如下：S1、基于枣基因组搜索SSR位点；S2、对步骤S1搜索到的SSR位点按条件进行初步筛选，保证SSR两端序列在枣基因组中的唯一性；S3、进一步筛选步骤S2得到的SSR位点，保证对应SSR存在多态性；S4、对步骤S3获得的SSR位点进行引物设计及验证；S5、对SSR位点赋值并生成条形码。本发明采用上述的一种基于枣基因组多态性SSR位点的筛选在条形码中的应用，可以更高效、更系统的在基因组中筛选多态性SSR位点，更精准的对不同枣品种进行分类，提高了工作效率，缩短了试验时间。

Description

基于枣基因组多态性SSR位点的筛选方法及条形码的生成

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，尤其是涉及一种基于枣基因组多态性SSR位点的筛选在条形码中的应用。

背景技术

近些年来，枣树产业获得了快速发展，逐渐实现从零散到成体系研究，大量优良的果树品种被应用于生产。建立一套简便、快速、可靠的果树品种分子鉴别系统，用于不同枣树品种鉴定，对于提高育种效率，加速育种进程，保障产业健康发展，具有重要而独特的意义。

简单重复序列(simple sequence repeats，SSR)是一类由1～6个核苷酸为基本重复单元并在基因组中多次串联重复的一段DNA序列，SSR标记具有影响转录、基因调节、蛋白质功能以及基因组构的功能，被认为是遗传学研究中最理想的分子标记手段之一。

基于简单重复序列(SSR)在枣亲缘关系和遗传多样性分析方面已有相关报道，如2022年，通过26对SSR引物分析了甘肃沿黄灌区80份枣材料的亲缘关系；2021年，为了解山西主要栽培枣树品种的相对亲缘关系，利用20对多态性高的SSR引物分析了37个山西主要栽培枣树品种的遗传多样性；2019年，以李府贡枣不同处理枣果实的转录组序列为基础开发简单重复序列(SSR)和单核苷酸多态性标记(SNP)。

目前，基于枣SSR研究主要侧重遗传育种方面，在不同枣品种鉴定方面研究较少，而且没有公开系统的从全基因组的角度筛选SSR用于研究分析的技术，导致基于SSR枣品种鉴定相关应用罕见且不够灵活。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于枣基因组多态性SSR位点的筛选在条形码中的应用，可以更高效、更系统的在基因组中筛选多态性SSR位点，更精准的对不同枣品种进行分类，提高了工作效率，缩短了试验时间。

为实现上述目的，本发明提供了一种基于枣基因组多态性SSR位点的筛选在条形码中的应用，其步骤如下：

S1、基于枣基因组搜索SSR位点；

S2、对步骤S1搜索到的SSR位点按条件进行初步筛选，保证SSR两端序列在枣基因组中的唯一性；

S3、进一步筛选步骤S2得到的SSR位点，保证对应SSR存在多态性；

S4、对步骤S3获得的SSR位点进行引物设计及验证；

S5、对SSR位点赋值并生成条形码。

优选的，在步骤S1中，基于枣树基因组信息，使用MAS软件按照设置的条件参数搜索合适的SSR位点。

优选的，在步骤S2中，对获得的SSR位点进行初步筛选，其具体操作如下：

(1)截取包含SSR位点在内的两端各300bp碱基；

(2)分别Blast比对到其他品种枣树基因组中按筛选条件选取合适SSR序列。

优选的，步骤S3中，以筛选出的符合标准SSR位点序列为基础，进一步筛选SSR位点，筛选出在不同枣品种中对应SSR位点处存在碱基突变或者重复次数变化的位点。

优选的，步骤S4中，使用primer premier 6软件围绕SSR区域设计引物，并对设计引物进行差异性检测，保证电泳检测目的片段附近无杂带；

使用获得的引物对不同枣品种进行PCR扩增，PCR扩增产物经电泳检测后，选择在不同品种中含有差异性的引物。

优选的，步骤S5中，统计不同品种枣在各SSR位点的扩增分子量，将各SSR位点的分子量按升序进行排序，并为每个SSR位点设置2位字符编号；

如果没有PCR扩增产物，则编号赋值为“00”，其余基因型编号按照升序方式依次从01向99赋值，将各品种对应的各SSR位点的编号按照预定的SSR位点顺序串联，从而生成SSR条形码。

因此，本发明采用上述一种基于枣基因组多态性SSR位点的筛选在条形码中的应用，其具体技术效果如下：

(1)填补了枣树SSR分子标记在品种鉴定方面的空白。

(2)更高效且系统的在基因组中筛选多态性SSR位点，通过先筛选少数几个品种中确定有多态性的SSR位点，再在更多品种中进行验证缩短了试验时间和工作量。

(3)分子量赋值和SSR排列组合使能够更简便的区分不同枣树品种，以00-99的2位制排列方式可以使SSR位点多态性可视化。

下面通过实施例和附图，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。

附图说明

图1是部分引物与样品的毛细管电泳图谱。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明的技术方案作进一步说明。

除非另外定义，本发明使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域内具有一般技能的人士所理解的通常意义。

此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其它实施方式。这些其它实施方式也涵盖在本发明的保护范围内。

还应当理解，以上所述的具体实施例仅用于解释本发明，本发明的保护范围并不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明/发明的保护范围之内。

本发明说明书中引用的现有技术文献所公开的内容整体均通过引用并入本发明中，并且因此是本发明公开内容的一部分。

实施例一

一、基于枣基因组搜索SSR位点

基于已完成测序的“冬枣”基因组，使用MISA软件按照一定条件参数筛选SSR位点。其中，参数设置条件为：(1)SSR核心单元重复3次及以上；(2)重复次数3次及以上。

二、对搜索到的SSR位点按条件进行初步筛选，保证SSR两端序列在3个枣基因组中的唯一性。

将获得的SSR进行处理：

(1)截取包含SSR在内的两端各300bp碱基；

(2)分别Blast比对到“骏枣”、“酸枣”基因组中按筛选条件选取合适SSR序列，其中筛选条件如下：

a、删除相似度小于98％的结果；

b、删除比对内容不包括SSR区域结果；

c、删除比对包含SSR在内两端长度小于100bp结果；

d、删除比对内容包含SSR在内且有多个对比结果的序列。

三、进一步筛选SSR位点，以保证对应SSR存在多态性

以筛选出的符合标准SSR序列为基础，进一步筛选SSR位点。筛选出在3个枣品种对应SSR序列中存在多态性的SSR位点，SSR位点为在不同枣品种中对应SSR位点处存在碱基突变或者重复次数变化的位点。筛选流程如下：

(1)删除SSR相同的序列；

(2)删除只在两个品种中SSR发生变化的序列；

(3)删除SSR只含有碱基突变情况的序列。

四、设计引物及验证

使用primer premier 6软件围绕SSR区域设计引物，并对设计引物进行差异性检测，保证电泳检测目的片段附近无杂带。

(1)引物设计在50-300bp范围内设计；

(2)设计后使用NCBI上的PCR-BLAST功能检验引物差异性；

(3)删除可以扩增出与目的片段长度相近的引物。

使用获得的引物对不同枣品种进行PCR扩增，PCR扩增产物经电泳检测后，选择含有差异性的引物。

五、为SSR位点赋值并生成条形码

SSR位点赋值并生成条形码的操作步骤如下：

(1)统计不同品种枣在各SSR位点的扩增分子量，将各SSR位点的分子量按升序进行排序.

(2)为每个SSR位点设置2位字符编号，所述基因型编号依次按照升序方式进行赋值。如果是没有PCR扩增产物的，则编号赋值为“00”，其余基因型编号按照升序方式依次从01向99赋值。

(3)当00～99共100个编号用完后，还可引入字母从AA向ZZ增加。

(4)将不同枣品种对应的各SSR位点的编号按照预定的SSR位点顺序排列组合，从而生成SSR条形码。

实施例二

按照实施例一的方法筛选出21对SSR引物，如表1。样品名称以样品1-样品24代替，并进行分子量赋值，见表2。

表1筛选出的21对SSR引物名称及序列表

表2 SSR引物的分子量赋值表

将各品种的所有分子量赋值按照预定的SSR位点顺序，例如按照LSSR-2、LSSR-3、LSSR-4、LSSR-6、LSSR-7、LSSR-8、LSSR-9、LSSR-10、LSSR-11、LSSR-12、LSSR-16、LSSR-17、LSSR-18、LSSR-19、LSSR-21、LSSR-22、LSSR-24、LSSR-25、LSSR-26、LSSR-27、LSSR-30的顺序进行串联，生成枣品种SSR条形码。

表3枣品种SSR条形码表

实施例三

随机挑选部分引物与样品进行毛细管电泳检测，从而验证上述结果的准确性，结果如图1。

本发明的条形码方法主要针对枣树品种，对其他多倍体作物也有借鉴作用。除了SSR标记，其他共显性标记的数据也可以进行。

因此，本发明采用上述一种基于枣基因组多态性SSR位点的筛选在条形码中的应用，可以更高效、更系统的在基因组中筛选多态性SSR位点，更精准的对不同枣品种进行分类，提高了工作效率，缩短了试验时间。

最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其进行限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而这些修改或者等同替换亦不能使修改后的技术方案脱离本发明技术方案的精神和范围。

Claims

1.一种基于枣基因组多态性SSR位点筛选的方法在开发条形码中的应用，其特征在于，其步骤如下：

S1、基于枣基因组搜索SSR位点；

基于已完成测序的冬枣基因组,使用MISA软件按照参数筛选SSR位点,参数设置条件为：（1）SSR核心单元重复3次及以上；（2）重复次数3次及以上；

S2、对步骤S1搜索到的SSR位点按条件进行初步筛选；

将获得的SSR进行处理：

（1）截取包含SSR在内的两端各300bp碱基；

（2）分别Blast比对到酸枣、骏枣基因组中按筛选条件选取合适SSR序列，其中筛选条件如下：

a、删除相似度小于98%的结果；

b、删除比对内容不包括SSR区域结果；

c、删除比对包含SSR在内两端长度小于100bp结果；

d、删除比对内容包含SSR在内且有多个比对结果的序列；

S3、进一步筛选步骤S2得到的SSR位点；

筛选流程如下：

（1）删除SSR相同的序列；

（2）删除只在两个品种中SSR发生变化的序列；

（3）删除SSR只含有碱基突变情况的序列；

S4、对步骤S3获得的SSR位点进行引物设计及验证；

S5、对SSR位点赋值并生成条形码；

步骤S3中，以筛选出的符合标准SSR位点序列为基础，进一步筛选SSR位点，筛选出在不同枣品种中对应SSR位点处存在碱基突变或者重复次数变化的位点；

步骤S4中，使用软件围绕SSR区域设计引物，并对设计引物进行差异性检测，保证电泳检测目的片段附近无杂带；

2.根据权利要求1所述的一种基于枣基因组多态性SSR位点筛选的方法在开发条形码中的应用，其特征在于：步骤S5中，统计不同品种枣在各SSR位点的扩增分子量，将各SSR位点的分子量按升序进行排序，并为每个SSR位点设置2位字符编号。

3.根据权利要求2所述的一种基于枣基因组多态性SSR位点筛选的方法在开发条形码中的应用，其特征在于：对于没有PCR扩增产物的SSR位点编号赋值为“00”，其余基因型编号按照升序方式依次从01向99赋值，将各品种对应的各SSR位点的编号按照预定的SSR位点顺序串联，从而生成SSR条形码。