CN107841553A - 用于检测妊娠高血压患病风险的snp标志物及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于检测高血压尿病患病风险的SNP标志物,所述SNP标志物包括人基因组的13个SNP位点,所述13个SNP位点是rs1799983、rs5050、rs699、rs1501299、rs1063539、rs2228570、rs699947、rs2010963、rs5186、rs11646213、rs2681472、rs7579169、rs1801133。本发明的有益效果:本发明一方面可以填补目前妊娠高血压早期筛查方法的空白,建立一种基于基因分子分型的妊娠高血压早期筛查方法,另一方面借助基因科技及早发现妊娠高血压发病隐患,提高患者的主动预防疾病的意识和医从性,降低妊娠高血压发病率,保障围产期母胎健康,这具有很大的社会意义。
Description
技术领域
本发明涉及基因检测技术领域,具体来说,涉及一种用于检测妊娠高血压患病风险的SNP标志物及试剂盒。
背景技术
妊娠高血压是妊娠期导致不良妊娠结局的第二大疾病,是在孕20周后出现的高血压、水肿、蛋白尿等一系列症状的综合征。突发性妊娠高血压可以发生在孕早期或孕晚期,目前无有效处理方法,一旦发生对孕产妇和胎儿危害巨大,必须终止妊娠血压才能恢复。妊娠高血压的发病机制复杂,目前有四种学说,分别是:免疫失调学说、胎盘缺血学说、氧化应激学说和遗传易感学说。其中遗传易感学说强调了个体先天遗传因素和体质特点在妊娠高血压的发生发展中有重要且决定性的影响。
基因检测可以预测妊娠高血压的风险,实现早发现、早预防,因此,提供一种有效的、准确的早期筛查方法对控制妊娠高血压患病率,提高我国母婴健康水平有重要的意义。
单核苷酸多态性(SNP)是在人类基因组中普遍存在的个体间差异的表现,也是决定了每个人个体表型特征的重要遗传学基础。研究表明,特定SNP组合与疾病的发病和预后存在显著的关联,具有不同基因型的个体,即使处在在相同的环境中,罹患疾病的情况也存在显著的个体差异。这构成了精准医疗的基础,将人的基因遗传和环境因素差异考虑在内的个体化精准医疗是目前医疗行业的大势所趋。利用SNP来预测和评估疾病的患病风险、辅助诊断和预后评估等,目前在医疗行业的诸多领域已经被广泛接受,但是在妊娠高血压的遗传风险筛查方面还没有类似方法出现。
针对相关技术中的问题,目前尚未提出有效的解决方案。
发明内容
针对相关技术中的上述技术问题,本发明提出一种用于检测妊娠高血压患病风险的SNP标志物,通过所述SNP标志物可以建立一种妊娠高血压的早期精准预测方法,实现早发现、早预防,高风险孕妇可以在妇产医生的指导下提前采取措施,主动预防妊娠高血压,保障围产期的母胎健康。另一方面,本发明还提供了一种用于检测妊娠高血压患病风险的试剂盒。
妊娠高血压是多基因遗传的复杂疾病,通过易感基因特定位点的检测能够科学评价患病风险。飞行时间质谱SNP分型是一种高准确性、高通量、经济的基因检测方法,其检测原理是:分子量大小不同的DNA片段在相同的电场作用下飞行时间不同而得以区分。该方法技术上非常成熟,是SNP分型的金标准。本发明的关键是易感基因及其位点的选择和引物设计,这也是该方法能否达到临床符合率和临床实用性的关键。因此,本发明确立了妊娠高血压所检测的基因和SNP位点,并设计了一套13个位点的扩增引物和单碱基延伸引物。
为实现上述技术目的,本发明的技术方案是这样实现的:
一种用于检测妊娠高血压患病风险的SNP标志物,其特征在于,所述SNP标志物包括人基因组的13个SNP位点,所述13个SNP位点是rs1799983、rs5050、rs699、rs1501299、rs1063539、rs2228570、rs699947、rs2010963、rs5186、rs11646213、rs2681472、rs7579169、rs1801133。
进一步地,
所述检测rs1799983的PCR扩增引物序列为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2,单碱基延伸引物的序列为SEQ ID NO:27;
所述检测rs5050的PCR扩增引物序列为SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4,单碱基延伸引物的序列为SEQ ID NO:28;
所述检测rs699的PCR扩增引物序列为SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6,单碱基延伸引物的序列为SEQ ID NO:29;
所述检测rs1501299的PCR扩增引物序列为SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8,单碱基延伸引物的序列为SEQ ID NO:30;
所述检测rs1063539的PCR扩增引物序列为SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10,单碱基延伸引物的序列为SEQ ID NO:31;
所述检测rs2228570的PCR扩增引物序列为SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12,单碱基延伸引物的序列为SEQ ID NO:32;
所述检测rs699947的PCR扩增引物序列为SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14,单碱基延伸引物的序列为SEQ ID NO:33;
所述检测rs2010963的PCR扩增引物序列为SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16,单碱基延伸引物的序列为SEQ ID NO:34;
所述检测rs5186的PCR扩增引物序列为SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18,单碱基延伸引物的序列为SEQ ID NO:35;
所述检测rs11646213的PCR扩增引物序列为SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20,单碱基延伸引物的序列为SEQ ID NO:36;
所述检测rs2681472的PCR扩增引物序列为SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22,单碱基延伸引物的序列为SEQ ID NO:37;
所述检测rs7579169的PCR扩增引物序列为SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24,单碱基延伸引物的序列为SEQ ID NO:38;
所述检测rs1801133的PCR扩增引物序列为SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26,单碱基延伸引物的序列为SEQ ID NO:39。
本发明的另一方面,提供了一种用于检测妊娠高血压患病风险的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包括检测人基因组的13个SNP位点的PCR扩增引物和单碱基延伸引物,所述13个SNP位点是rs1799983、rs5050、rs699、rs1501299、rs1063539、rs2228570、rs699947、rs2010963、rs5186、rs11646213、rs2681472、rs7579169、rs1801133。
进一步地,
所述检测rs1799983的PCR扩增引物序列为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2,单碱基延伸引物的序列为SEQ ID NO:27;
所述检测rs5050的PCR扩增引物序列为SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4,单碱基延伸引物的序列为SEQ ID NO:28;
所述检测rs699的PCR扩增引物序列为SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6,单碱基延伸引物的序列为SEQ ID NO:29;
所述检测rs1501299的PCR扩增引物序列为SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8,单碱基延伸引物的序列为SEQ ID NO:30;
所述检测rs1063539的PCR扩增引物序列为SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10,单碱基延伸引物的序列为SEQ ID NO:31;
所述检测rs2228570的PCR扩增引物序列为SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12,单碱基延伸引物的序列为SEQ ID NO:32;
所述检测rs699947的PCR扩增引物序列为SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14,单碱基延伸引物的序列为SEQ ID NO:33;
所述检测rs2010963的PCR扩增引物序列为SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16,单碱基延伸引物的序列为SEQ ID NO:34;
所述检测rs5186的PCR扩增引物序列为SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18,单碱基延伸引物的序列为SEQ ID NO:35;
所述检测rs11646213的PCR扩增引物序列为SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20,单碱基延伸引物的序列为SEQ ID NO:36;
所述检测rs2681472的PCR扩增引物序列为SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22,单碱基延伸引物的序列为SEQ ID NO:37;
所述检测rs7579169的PCR扩增引物序列为SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24,单碱基延伸引物的序列为SEQ ID NO:38;
所述检测rs1801133的PCR扩增引物序列为SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26,单碱基延伸引物的序列为SEQ ID NO:39。
本发明的有益效果:有临床研究证实,有妊娠高血压及先兆子痫家族史的孕妇,其妊高症及先兆子痫的发生率显著高于无家族史的孕妇。已知和妊娠高血压相关的基因主要有:内皮细胞功能失调相关的基因、与脂类代谢异常有关的基因、与免疫调节功能失调有关的基因、参与血压和体液量调节的基因、血栓形成有关的基因。针对这些基因特定位点进行基因检测可以实现对妊娠高血压易感人群的早期精准预测,弥补目前临床上依赖临床表现和个体特征表型的疾病结局诊断的不足。因此,本发明一方面可以填补目前妊娠高血压早期筛查方法的空白,建立一种基于基因分子分型的妊娠高血压早期筛查方法,另一方面借助基因科技及早发现妊娠高血压发病隐患,提高患者的主动预防疾病的意识和医从性,降低妊娠高血压发病率,保障围产期母胎健康,这具有很大的社会意义。
附图说明
下面对本发明实施例中所使用的附图进行说明。
图1是rs5050位点TT型分型结果的质谱图;
图2是rs1501299位点TG型分型结果的质谱图;
图3是rs699947位点AC型分型结果的质谱图;
图4是rs5186位点AA型分型结果的质谱图;
图5是rs2681472位点GG型分型结果的质谱图。
具体实施方式
下面将结合具体实施方式对本方面实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中所涉及到的各种试剂、机械未经特殊说明均可通过商业途径获得。
为了验证本发明所述的SNP标志物和试剂盒是否有效及准确程度,申请人对44名已经确诊的高血压患者进行基因检测,具体试验过程如下。
实施例一:DNA提取
1.1唾液DNA提取
利用口腔拭子基因组DNA提取试剂盒(品牌:康为世纪,货号:CW0530M)进行唾液DNA提取。
在Buffer GW1和Buffer GW2中加入一定量的无水乙醇。从采样管中取500μl唾液样本,加入300μl Buffer GR、20μlProteinase K和300μl Buffer GL,震荡混匀,56℃震荡孵育15min,加入300μl无水乙醇,震荡混匀;将750μl该混匀溶液加入到收集管的吸附柱中,12000rpm离心1min,弃液;向吸附柱中加入400μl Buffer GW1,12000rpm离心1min,弃液;向吸附柱中加入400μl Buffer GW2,12000rpm离心1min,弃液;12000rpm离心2min,静置晾干;将吸附柱置于新的1.5ml离心管中,悬空加入40μl Buffer GE,静置5min,12000rpm离心1min,收集DNA溶液,质检,于4℃保存。
其中,Buffer GW1、Buffer GW2、Buffer GR、Proteinase K、Buffer GL、BufferGE、收集管、采样管、吸附柱均由康为世纪口腔拭子基因组DNA提取试剂盒直接提供。
1.2血卡DNA提取
使用打孔器在干血卡上血斑较厚区域打孔,取2片1mm大小的血片于1.5mL离心管中;加入200μl ddH2O,室温震荡10min,弃液;加入50μl Buffer B2,95℃孵育15min,弃液;加入40μl BufferB3,室温震荡10min,质检,4℃保存。
其中,BufferB2、BufferB3由血液DNA提取试剂盒康为血液基因组柱式小量提取试剂盒(CW2087)提供。
实施例二:PCR扩增
将实施例一中1.1或1.2提取的待测样本的DNA加入到384孔板中,进行多重PCR扩增。按照多重PCR扩增的反应体系(共5μl)加入到每个反应孔中,反应体系:
模板DNA:1μl,
引物mix:1μl,
10×PCR缓冲液:0.5μl,
25mM MgCl2:0.4μl,
25mM dNTP:0.1μl,
ddH2O 1.8μL,
余量为HotstarTaq酶(5U/μl)。
反应体系配制好后使用PCR封口膜封紧,防止样品蒸发,震荡混匀,离心;将密封的384孔板置于ABI9700PCR仪上进行如下反应:
95℃条件下预变性2min;
95℃30s,56℃30s,72℃1min,45个循环;
72℃5min,4℃保持;
得到PCR扩增产物,离心备用。
实施例三:SAP消化反应
利用Sequenom平台配套试剂和操作步骤,完成待测样本SNP位点分型结果。实施例二中得到的PCR扩增产物,按照SAP消化的反应体系(2μl)加入到每个反应孔中,反应体系:
SAP×Buffer:0.17μl,
SAP Enzyme(1U/μl):0.3μl,
ddH2O:1.53μl;
反应体系配制好后使用PCR封口膜封紧,防止样品蒸发,震荡混匀,离心;将密封的384孔板置于ABI9700PCR仪上进行如下反应:
37℃,40min;85℃,5min;4℃保持;
得到碱性磷酸化酶处理后的PCR产物,离心备用。
实施例四:单碱基延伸反应
利用Sequenom平台配套试剂和操作步骤,完成待测样本SNP位点分型结果。将步骤实施例三中得到的碱性磷酸化酶处理后的PCR产物,按照单碱基延伸反应体系(2μl)加入到对应的每个反应孔中,反应体系:
延伸引物mix:0.94μl,
Gold×Buffer(iPlexTermination mix,终止混合物):0.2μl,
Extension mix(延伸缓冲液):0.2μl,
Iplex Enzyme(延伸酶):0.041μl,
ddH2O:0.619μl;
反应体系配制好后使用PCR封口膜封紧,防止样品蒸发,震荡混匀,离心;将密封的384孔板置于ABI9700PCR仪上进行如下反应:
94℃30s;
【94℃5s,(52℃5s,80℃5s,5个内部循环)】40个外部循环;
72℃3min,4℃保持;
得到单碱基延伸产物,离心备用。
实施例五:树脂纯化
利用Sequenom平台配套试剂和操作步骤,完成待测样本SNP位点分型结果。将实施例四中的单碱基延伸产物的384孔板,轻轻撕下封口膜后,每孔加入16μl ddH2O;取干净的A4纸将6MG 384板置于其上,用小勺取适量纯化树脂;用塑料板反复左右推平纯化树脂,压实,使每孔树脂含量均匀;将384板倒置压在6MG 384板上,两板对调,6MG板在上,敲打6MG板背面,使树脂落入装有单碱基延伸产物的384孔板中;封口膜封好后,15rpm上下颠倒混匀30min,充分纯化。
实施例六:芯片点样
将实施例五中的384孔板离心,启动MassARRAYNanodispenser RS1000点样仪,将树脂纯化后的延伸产物移至384孔SpectroCHIP芯片上;点样后的芯片使用MALDI-TOF分析,检测结果使用TYPER4.0软件分型并输出结果。根据该结果得到妊娠高血压患病风险的诊断结果。
实施例七:结果分析
对44名已经确诊的患者进行进行13个SNP位点的分型。结果显示13个位点的基因型在44例样本中都能稳定检出。部分分型结果如图1~5所示。可见本发明所述的SNP标志物在检测妊娠高血压患病风险上效果显著。
所述13个SNP位点及作为检测靶点风险基因位点如表1所示。
所述13个SNP位点的PCR扩增引物序列如表2所示。
所述13个SNP位点的单碱基延伸引物序列如表3所示。
表1.SNP位点及作为检测靶点的风险基因位点
表2.PCR扩增引物
表3.单碱基延伸引物
综上所述,本发明提供了一种用于检测妊娠高血压患病风险的SNP标志物和试剂盒,填补了目前临床对妊娠高血压筛查方法的不足,女性在备孕期和孕早期都可以做此检测,经济效益相当可观。
Claims (4)
1.一种用于检测妊娠高血压患病风险的SNP标志物,其特征在于,所述SNP标志物包括人基因组的13个SNP位点,所述13个SNP位点是rs1799983、rs5050、rs699、rs1501299、rs1063539、rs2228570、rs699947、rs2010963、rs5186、rs11646213、rs2681472、rs7579169、rs1801133。
2.根据权利要求1所述的一种用于检测妊娠高血压患病风险的SNP标志物,其特征在于,
所述检测rs1799983的PCR扩增引物序列为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2,单碱基延伸引物的序列为SEQ ID NO:27;
所述检测rs5050的PCR扩增引物序列为SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4,单碱基延伸引物的序列为SEQ ID NO:28;
所述检测rs699的PCR扩增引物序列为SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6,单碱基延伸引物的序列为SEQ ID NO:29;
所述检测rs1501299的PCR扩增引物序列为SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8,单碱基延伸引物的序列为SEQ ID NO:30;
所述检测rs1063539的PCR扩增引物序列为SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10,单碱基延伸引物的序列为SEQ ID NO:31;
所述检测rs2228570的PCR扩增引物序列为SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12,单碱基延伸引物的序列为SEQ ID NO:32;
所述检测rs699947的PCR扩增引物序列为SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14,单碱基延伸引物的序列为SEQ ID NO:33;
所述检测rs2010963的PCR扩增引物序列为SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16,单碱基延伸引物的序列为SEQ ID NO:34;
所述检测rs5186的PCR扩增引物序列为SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18,单碱基延伸引物的序列为SEQ ID NO:35;
所述检测rs11646213的PCR扩增引物序列为SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20,单碱基延伸引物的序列为SEQ ID NO:36;
所述检测rs2681472的PCR扩增引物序列为SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22,单碱基延伸引物的序列为SEQ ID NO:37;
所述检测rs7579169的PCR扩增引物序列为SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24,单碱基延伸引物的序列为SEQ ID NO:38;
所述检测rs1801133的PCR扩增引物序列为SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26,单碱基延伸引物的序列为SEQ ID NO:39。
3.一种用于检测妊娠高血压患病风险的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包括检测人基因组的13个SNP位点的PCR扩增引物和单碱基延伸引物,所述13个SNP位点是rs1799983、rs5050、rs699、rs1501299、rs1063539、rs2228570、rs699947、rs2010963、rs5186、rs11646213、rs2681472、rs7579169、rs1801133。
4. 根据权利要求3所述的一种用于检测妊娠高血压患病风险的试剂盒,其特征在于,所述检测rs1799983的PCR扩增引物序列为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2,单碱基延伸引物的序列为SEQ ID NO:27;
所述检测rs5050的PCR扩增引物序列为SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4,单碱基延伸引物的序列为SEQ ID NO:28;
所述检测rs699的PCR扩增引物序列为SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6,单碱基延伸引物的序列为SEQ ID NO:29;
所述检测rs1501299的PCR扩增引物序列为SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8,单碱基延伸引物的序列为SEQ ID NO:30;
所述检测rs1063539的PCR扩增引物序列为SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10,单碱基延伸引物的序列为SEQ ID NO:31;
所述检测rs2228570的PCR扩增引物序列为SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12,单碱基延伸引物的序列为SEQ ID NO:32;
所述检测rs699947的PCR扩增引物序列为SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14,单碱基延伸引物的序列为SEQ ID NO:33;
所述检测rs2010963的PCR扩增引物序列为SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16,单碱基延伸引物的序列为SEQ ID NO:34;
所述检测rs5186的PCR扩增引物序列为SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18,单碱基延伸引物的序列为SEQ ID NO:35;
所述检测rs11646213的PCR扩增引物序列为SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20,单碱基延伸引物的序列为SEQ ID NO:36;
所述检测rs2681472的PCR扩增引物序列为SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22,单碱基延伸引物的序列为SEQ ID NO:37;
所述检测rs7579169的PCR扩增引物序列为SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24,单碱基延伸引物的序列为SEQ ID NO:38;
所述检测rs1801133的PCR扩增引物序列为SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26,单碱基延伸引物的序列为SEQ ID NO:39。
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